CN104262455A - 肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物及其制备和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物及其制备方法和用途，所述紫杉醇衍生物如下列结构式：其中，为紫杉醇。R₁为Ala，Thr，Val或Ile；R₂为Ala，Thr，Val或Asn；n＝1～300。本发明提供的肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物与紫杉醇相比，具有抗肿瘤靶向性，特异的激活特性和免疫促进的特性，对抑制肿瘤生长和转移的药效有很大的提高，并且毒性大大降低，具有较好的临床应用前景。

Description

肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物及其制备和用途

技术领域

本发明涉及药物化学，具体涉及紫杉醇抗肿瘤药物，尤其涉及肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物及其制备和用途

背景技术

紫杉醇是目前广泛使用的一种有效的抗肿瘤药物，主要用于各种实体肿瘤如卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。然而，由于紫杉醇药物具有严重的毒副作用和不良反应，如骨髓毒性造成中性粒细胞减少、神经毒性、心血管毒性以及引发过敏反应、局部的炎症，脱发，乏力和肝脏毒性等，这样就限制了该类药物在临床上的使用。因此，为更好地利用紫杉醇，需要研究能降低紫杉醇毒性，并可提高药物使用剂量和具有高度药效的靶向性激活药物是医药专业关注的重点问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计低毒性、高药效的紫杉醇药物,其由于紫杉醇结合了恰当的化合物而减弱了毒性，同时由于化合物在肿瘤部位聚集和专一性激活而释放紫杉醇。

本发明所述“肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物”是指本发明紫杉醇衍生物所述化合物在肿瘤部位聚集和专一性激活而释放紫杉醇。

本发明提供了一种肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物，该衍生物以下列结构式表示：

其中，为紫杉醇；

R₁选自Ala(丙氨酸)，Thr(苏氨酸)，Val(缬氨酸)或Ile(异亮氨酸)中的任意一种氨基酸；R₂选自Ala(丙氨酸)，Thr(苏氨酸)，Val(缬氨酸)或Asn(天门冬酰胺)中的任意一种氨基酸；n选自1～300中的任意整数。

本发明所述肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物，其中n＝1，R₁为Ala，R₂为Ala时，所述的紫杉醇衍生物为化合物S1，以下列结构式表示:

本发明所述肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物，其中n＝5，R₁为Ala，R₂为Ala时，所述的紫杉醇衍生物为化合物S2，以下列结构式表示:

本发明所述肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物，其中n＝11，R₁为Ala，R₂为Ala时，所述的紫杉醇衍生物为化合物S3，以下列结构式表示:

本发明所述肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物，其中n＝300，R₁为Ala，R₂为Ala时，所述的紫杉醇衍生物为化合物S4，以下列结构式表示：

本发明所述肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物，其中，所述的紫杉醇衍生物包括本发明提供的化合物S10-S24为实施例10-24制得，其n为1,R₁和R₂结构分别为下列化合物：

编号	R1	R2	n
				S10	丙氨酸	苏氨酸	1
S11	丙氨酸	缬氨酸	1
				S12	丙氨酸	天门冬酰胺	1
S13	苏氨酸	丙氨酸	1

S14	苏氨酸	苏氨酸	1
				S15	苏氨酸	缬氨酸	1
S16	苏氨酸	天门冬酰胺	1
				S17	缬氨酸	丙氨酸	1
S18	缬氨酸	苏氨酸	1
				S19	缬氨酸	缬氨酸	1
S20	缬氨酸	天门冬酰胺	1
				S21	异亮氨酸	丙氨酸	1
S22	异亮氨酸	苏氨酸	1
				S22	异亮氨酸	缬氨酸	1
S24	异亮氨酸	天门冬酰胺	1

本发明提供的肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物，由于在紫杉醇化合物上结合了所述氨基酸侧链，从而减弱了毒性,同时由于该衍生物能在肿瘤部位聚集和激活而释放紫杉醇,达到治疗肿瘤的效果，可以制成更低毒和有效的抗肿瘤药物。本发明提供的肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物是本发明人的创新，首次公开发表。

本发明的另一目的是提供了所述肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物的制备方法。

本发明方法为通过紫杉醇链接含有多种短肽或不同基团化合物,然后通过肿瘤组织或天冬氨酸酶激活紫杉醇效率筛选,最终得到毒性降低,释放效率高的肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇。

本发明的又一目的是提供了所述肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物用于制备抗肿瘤药物的用途，所述的用途为用于制备抗膀胱癌、脑癌、乳房/乳腺癌、宫颈癌、结肠/直肠癌、食管癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌或血癌药物的用途。

本发明提供的肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物，实验设计思路来源于通过大量的合成实验设计制备不同连接的方式的复杂化合物，然后通过连接复杂化合物到紫杉醇上的2位或7位(即分别将复杂化合物连接到紫杉醇分子式上的第7位或第2位的OH上)，再通过肿瘤组织或天冬氨酸酶存在时激活效率的大小进行紫杉醇效率筛选，并依次筛选所得化合物在R1、R2，以及n取不同值时对肿瘤的抑制作用，最终得到毒性降低、释放效率高的肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物。其中肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇的结构为我们首次合成和报道。该化合物不同部分的结构对肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇的靶向、激活、稳定、毒性和药效等功能产生巨大影响。肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物能够通过复杂的化学连接封闭紫杉醇的毒性，而使其在肿瘤组织中的肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞中才能够被天冬氨酸酶有效激活，从而靶向的释放毒性，达到治疗肿瘤的效果。取得肿瘤靶向性，封闭毒性和高效激活是与整个化合物整体的构效关系相关的。通过R1、R2，以及n的筛选研究发现R1、R2，以及n的选择也具有一定的构效关系，但从实验可以看出n优选的取值范围为1～150时获得的治疗效果几乎相同。肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇能够有效降低紫杉醇的毒性,却增加了治疗肿瘤的效果,形成了强烈的构效关系。

本发明通过试验发现(1)肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇在肿瘤部位具有聚集,滞留和激活效应,具有靶向肿瘤微环境的特性。(2)肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇能够被肿瘤组织特异性的激活或断裂,生成紫杉醇。(3)在体外体内代谢实验中肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇在血液中并不激活,具有长期的血液稳定性和对正常组织器官低毒的特性。(4)肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇的毒性相比紫杉醇大大降低。(5)化合物短肽的两边基团,以及紫杉醇的连接位置与药物的激活释放,以及药物的溶解性,稳定性和有效性都密切相关。如果药物无法激活,药物是一个无细胞毒性的药物,将不会具有疗效。(6)肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇在能在多种肿瘤激活,加上溶解性的改变,直接能够改变紫杉醇肿瘤适应症限制的情况,开发成为广谱性抗肿瘤药物,(7)肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇的长度也具有不同的影响,即n不同长度的药物对整体药物的激活有影响,随着n值增大，激活活性轻微下降，并且等摩尔计量的药物质量数增大，但是因为n值增大也可使药物代谢改变，因此整体药效并没有降低，这也是本发明保护范围由n选自1～300的原因。(8)肿瘤细胞转移时通常分泌大量的蛋白酶水解酶以降解细胞间质,所以蛋白酶水解酶激活的靶向药物对肿瘤转移治疗具有特殊的疗效。

肿瘤相关巨噬细胞(M2型)区别于单核细胞和炎症型巨噬细胞(M1型)确认标记就是天冬氨酸酶的表达。肿瘤分泌的细胞因子诱导单核细胞转化为肿瘤相关巨噬细胞,肿瘤相关巨噬细胞能够刺激产生强烈的免疫抑制和直接帮助肿瘤细胞浸润和转移。我们的研究中发现肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇具有杀伤肿瘤相关巨噬细胞,减弱微环境中免疫抑制的细胞因子和促进毒性CD8细胞的免疫增强现象。其中，更重要的是，肿瘤微环境释放性紫杉醇只在肿瘤局部激活,不同于传统化疗药物会损伤整体免疫系统,在我们的实验中肿瘤微环境释放性紫杉醇和PD-1(程序性死亡分子1，programmed death-1)抑制抗体(PDL1-抗体，市售，是目前认为具有免疫治疗效果的候选药物)具有强烈协同治疗作用,能够解决免疫治疗很难与化疗药物结合使用的弊端。

本发明所述肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述药物为由肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物与药用辅料组成的药物组合物。

本发明通过系列试验证明了本发明的肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇具有抗肿瘤靶向性。特异的激活活性和免疫促进的特性，相对于紫杉醇，抑制肿瘤生长和转移的药效具有很大的提高，且药物的毒性大大降低，具有非常好的应用前景。迄今为止，尚未有专利和文献报道，因此，本发明提供了一种新颖的肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇药物用于治疗人体肿瘤的有效方法，具有非常好的应用前景，有较大的社会效益。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步地说明。

实施例1：肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇的合成

1)(R)-2-(2-(R)-(苄氧羰基)氨基)丙酰氨基)丙酸甲酯(I)的合成

将N-苄氧羰基-L-丙氨酸(100g,0.45mol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(3L)中，搅拌下加入1-羟基苯并三氮唑(72.6g,0.54mol)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(103.3g,0.54mol)，0-5℃搅拌反应1小时后，冰浴下滴加L-丙氨酸甲酯(46.2g,0.45mol)和N,N-二异丙基乙基胺(173.8g,1.34mol)的N,N-二甲基甲酰胺(1L)溶液，滴加完毕后在室温(25℃)下搅拌10h，减压蒸除溶剂，粗产品溶于二氯甲烷(2L)，依次用饱和氯化铵溶液、水和饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸除溶剂后粗产物重结晶后得到白色固体I，(101g，收率：73.1％)。LC-MS:309[M+1]⁺。

2)(R)-2-(2-(R)-(苄氧羰基)氨基)丙酰氨基)丙酸(II)的合成

将(R)-2-(2-(R)-(苄氧羰基)氨基)丙酰氨基)丙酸甲酯(100g,0.34mol)溶于四氢呋喃(2L)和水(1L)的混合溶液中，冷却至0℃下滴加1M的氢氧化锂溶液(400mL)，室温(25℃)搅拌反应10小时，滴加浓盐酸中和至pH<6，旋转蒸发除去大部分四氢呋喃，剩余水相用二氯甲烷(1L×3)萃取，有机相经无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到白色固体II(88g，收率：92.2％)。LC-MS:295[M+1]⁺。

3)(R)-2-((9H-芴-9-基)甲氧羰基氨基)-4-(三苯甲基氨基)-1-羟甲基苯基丁二酸单酰胺(III)的合成

于500mL三口瓶中加入(R)-2-((9H-芴-9-基)甲氧羰基氨基)-4-(三苯甲基氨基)丁酸(20g,0.03mol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)(15g,0.04mol)、N,N-二甲基甲酰胺(200mL)，搅拌30min。然后0℃下分别加入对氨基苄醇(4.1g,0.03mol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(5mL)和N,N-二异丙基乙胺(8.7g,0.06mol)，室温(25℃)下搅拌3h，旋转蒸发除去大部分N,N-二甲基甲酰胺，残余物溶于乙酸乙酯(200mL)，依次用饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤后，蒸除溶剂，所得粗产品经正己烷/乙酸乙酯(5/1，300mL)打浆得白色固体III(21.3g,收率：90％)。LC-MS:702[M+1]⁺。

4)(R)-2-氨基-4-(三苯甲基氨基)-1-羟甲基苯基丁二酸单酰胺(IV)的合成

将(R)-2-((9H-芴-9-基)甲氧羰基氨基)-4-(三苯甲基氨基)-1-羟甲基苯基丁二酸单酰胺(13.0g,18mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(80mL)的混合溶液中，加入哌啶(30mL)，室温(25℃)下搅拌2h，减压蒸出溶剂，然后置于真空干燥箱高真空干燥(100℃)除去少量的哌啶，得淡黄色固体IV(8.43g，收率：95％),未经纯化直接用于下一步。

5)(R)-2-((R)-2-((R)-2-苄氧羰氨基)丙酰氨基)丙酰氨基-4-(三苯甲基氨基)-1-羟甲基苯基丁二酸单酰胺(V)的合成

于三口瓶中加入(R)-2-((R)-2-(苄氧羰基氨基)丙酰氨基)丙酸(6.0g,20.4mmol)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(11.6g,30.6mmol)和N,N-二甲基甲酰胺(50mL)，冰浴下搅拌30min。于0℃下分别加入化合物(R)-2-氨基-4-(三苯甲基氨基)-1-羟甲基苯基丁二酸单酰胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液(50mL)和N,N-二异丙基乙胺(7.89g,61.2mmol)，室温(25℃)下搅拌17小时，减压蒸除溶剂，残余物溶于乙酸乙酯(200mL)，依次用饱和氯化铵溶液(100mL)、饱和氯化钠溶液(100mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤后，蒸除溶剂，所得粗产品经重结晶得白色固体V(15g,收率：97％)。LC-MS:756[M+1]⁺。

6)(R)-2-((R)-2-((R)-氨基丙酰氨基)丙酰氨基-4-(三苯甲基氨基)-1-羟甲基苯基丁二酸单酰胺(VI)的合成

将(R)-2-((R)-2-((R)-2-苄氧羰氨基)丙酰氨基)丙酰氨基-4-(三苯甲基氨基)-1-羟甲基苯基丁二酸单酰胺(5.0g,6.61mmol)溶于THF(150mL)中，加入10％钯炭(1g)，通入氢气，常温(22℃)下搅拌反应5h，过滤除去钯炭，用甲醇(100mL)洗涤，合并滤液和洗液，旋转蒸发除去大部分溶剂得到粗品，经硅胶柱层析(200-300目，二氯甲烷/甲醇＝20/1-10/1，2.5L)得到白色固体VI(2.0g,收率：49％)。LC-MS:622[M+1]⁺。

7)(R)-2-((R)-2-((R)-2-(甲氧基乙氧基乙酰氨基)丙酰氨基)丙酰氨基-4-(三苯甲基氨基)-1-羟甲基苯基丁二酸单酰胺(VII)的合成

将2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸(432mg,3.22mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(20mL)中，加入苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(1.83g,4.83mmol)，搅拌30min，然后滴加(R)-2-((R)-2-((R)-氨基丙酰氨基)丙酰氨基-4-(三苯甲基氨基)-1-羟甲基苯基丁二酸单酰胺(2.0g,3.22mmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.24g,9.61mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(20mL)，完毕后缓慢升至室温(25℃)搅拌10h。减压蒸除大部分N,N-二甲基甲酰胺，所得残余物溶于乙酸乙酯(200mL),依次用饱和的氯化铵溶液(150mL)和饱和的氯化钠溶液(150mL)洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，旋转蒸发除去溶剂，所得粗产品经硅胶柱层析(200-300目，二氯甲烷/甲醇＝20/1-10/1，2L)得白色固体VII(1.2g,收率：50％)。LC-MS:738[M+1]⁺。

8)(R)-2-((R)-2-((R)-2-(甲氧基乙氧基乙酰氨基)丙酰氨基)丙酰氨基-1-羟甲基苯基丁二酸二酰胺(VIII)的合成

将(R)-2-((R)-2-((R)-2-(甲氧基乙氧基乙酰氨基)丙酰氨基)丙酰氨基-4-(三苯甲基氨基)-1-羟甲基苯基丁二酸单酰胺(VII)(1.0g,1.36mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，加入三氟乙酸(2mL)，室温(25℃)下搅拌5小时。反应液经水洗(20mL)后分液后，有机相无水硫酸钠干燥。减压蒸除溶剂，蒸除残余的三氟乙酸，粗品经硅胶柱层析(200-300目，二氯甲烷/甲醇＝15/1-8/1，1.5L)分离得X(600mg,收率：89％)。LC-MS:496[M+1]⁺。

9)4-((R)-2-((R)-2-((R)-2-(甲氧基乙氧基乙酰氨基)丙酰氨基)丙酰氨基-4-氨基丁二酰基))氨基苄基对硝基苯基碳酸酯(IX)的合成

于50mL三口瓶加入化合物(R)-2-((R)-2-((R)-2-(甲氧基乙氧基乙酰氨基)丙酰氨基)丙酰氨基-1-羟甲基苯基丁二酸二酰胺(500mg,1.01mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中，冰浴(0-5℃)下、氮气保护下分别滴加氯甲酸对硝基苯酯(406mg,2.02mmol)，吡啶(160mg，2.03mmol)。室温(25℃)下搅拌18小时。反应液经水(10mL)洗后分液后，有机相无水硫酸钠干燥。旋蒸除去溶剂，所得粗产品经硅胶柱层析(200-300目，二氯甲烷/甲醇＝30/1-20/1，1L)得IX(450mg,收率：67％)。LC-MS:661[M+1]⁺。

10)2-(2-甲氧基乙氧基)乙酰基-L-Ala-L-Ala-L-Asn-对氨基苄基紫杉醇(化合物S1)的合成

将4-((R)-2-((R)-2-((R)-2-(甲氧基乙氧基乙酰氨基)丙酰氨基)丙酰氨基-4-氨基丁二酰基))氨基苄基紫杉醇碳酸酯(250mg，0.293mmol)和紫杉醇(194mg,0.293mmol)用干燥的N,N-二甲基甲酰胺(10mL)溶解，冷却至0℃下加入4-二甲氨基吡啶(54mg,0.44mmol)，室温(25℃)下搅拌18小时。将反应液倒入乙酸乙酯(20mL)中，合并有机相，水(30mL)洗，无水硫酸钠干燥。旋转蒸发除去溶剂得到粗产物，经硅胶柱层析(200-300目，二氯甲烷/甲醇＝20/1-15/1，500mL)得目标产物化合物S1(150mg,收率：57％)。LC-MS:1375[M+1]⁺。LC-MS检测结果如下:8.59洗脱峰的对应质荷比为1375,与结构计算获得分子量1374.5相对应。

化合物S2,S3,S4的合成参照S1的合成,结果如下表，区别仅在于步骤7)的合成使用的烷氧基取代乙酸的分子量的不同。其中，S2的合成是以3,6,9,12,15,18-六氧杂十九酸替代2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸；S3的合成是以3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十七酸替代2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸；S4的合成是以直接购买的长链多氧杂脂肪酸(吉尔生化定制,n＝300聚合物)替代2-(2-甲氧基乙氧基)乙酸；质谱(MS)检测结果S2,S3的对应质荷比分别为1551,1816,与结构计算获得分子量1550.6和1815.9相一致。基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测S4分子量约为14524,与结构计算获得分子量14524.7相一致。

编号

n

性状

质谱检测

荧光

产量(毫克)

收率

S1

1

白色粉末

1375

无

150

57％

S2

5

白色粉末

1551

无

178

48％

S3

11

白色粉末

1816

无

159

56％

S4

150

白色粉末

14524

无

525

38％

实施例10～24合成方法与实施例S1相近,只是氨基酸连接时原料不同,如下表所示。

将对应的R₁氨基酸和R₂氨基酸溶于N,N-二甲基甲酰胺中,分别加入相同的缩合剂(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)反应，于0℃-25℃反应0.5-2h，再加入天门冬酰胺；，于0℃-25℃反应2-24h得到三肽。质谱(MS)检测结果确认S10-S24化合物(n＝1)分子量依次如下表,与结构计算预测的分子量相一致。

实施例2本发明实施例制得的肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物与对照化合物的性能比较

(1)样品处理

本发明实施例制得的肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物，化合物S1,S2,S3和S4(实施例10-11制得)和上述制备的对照化合物C1,C2,C3,C4,C5,C6.经过冷冻干燥(-70℃)，在无菌室进行分装。在动物实验前，S1,S2,S3和S4在无菌室中可按下面两种溶剂方案复溶:溶剂1(50％注射用水,42％～49％酒精,1％～8％吐温80)或溶剂2(50％注射用水,42％～49％丙二醇,1％～8％吐温80)。S1,S2,S3和S4在溶剂1和溶剂2中能够完全溶解，复溶浓度可达10毫克/毫升,再用注射用水稀释到所需浓度，而对比化合物(C1，C2，C3，C4，C5)不满足药物的制剂要求，如下表1。

表1：筛选药物溶解性试验:对照化合物中近似不同成分的缺失或紫杉醇7位或2位连接对药物制剂溶解性影响.(即，分别将基团连接到紫杉醇分子式上的第7位或第2位的OH上)对药物制剂溶解性影响。下表中的AAN、AANL、AANK分别代表化合物中小肽氨基酸的连接，A：Ala、N：Asn、L：Leu、K：Lys。溶剂1(50％注射用水,45％～49％酒精,1％～5％吐温80)或溶剂2(50％注射用水,45％～49％丙二醇,1％～5％吐温80,溶解浓度为10毫克/毫升)

化合物	溶剂1	溶剂2
			C1:AAN-基团2-紫杉醇(2位连接)	不溶	不溶
C2:基团1-AAN-紫杉醇(2位连接)	不溶	不溶
			C3:AAN-紫杉醇(2位连接)	不溶	不溶
C4:基团1-AAN-基团2-紫杉醇(7位连接)	不溶	不溶
			C5:基团1-AANL-基团2-紫杉醇(2位连接)	不溶	不溶
C6:基团1-AANK-基团2-紫杉醇(2位连接)	溶解	溶解

S1	溶解	溶解
			S2	溶解	溶解
S3	溶解	溶解
			S4	溶解	溶解

基团1:

基团2:

表1结果说明本发明的紫杉醇衍生物溶解性能发生巨大变化,在溶剂1(注射用水)或溶剂2(45％酒精，55％注射用水)中的溶解性增加,溶解特性的变化对药物的制剂有巨大影响。而对比化合物(C1,C2,C3,C4,C5)不溶性不能满足药物的制剂要求。因此与的不溶于水的紫杉醇药物相比,S1,S2,S3和S4可制备可溶性的药物制剂,能提高注射剂量和疗效,避免已有紫杉醇药物使用过敏性辅料蓖麻油等的缺陷,具有非常好的创新性和应用前景。

实施例3S1,S2,S3和S4(实施例10-11制得)含量测定的方法及含量范围。

S1,S2,S3和S4使用分析型HPLC(安捷伦1220(Agilent1220series)，C8柱5μm,4.6mm ID x250mm,流动相为0～95％乙腈(ACN)纯度在95％-99％)。

实施例4肿瘤组织对本发明肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物的激活效率试验

S1,S2,S3和S4样品化合物(实施例10-11制得),使用溶剂1(50％注射用水,45％～49％酒精,1％～5％吐温80)统一溶解,并用水稀释10倍到1毫克/毫升。在本发明的实验中,在37度温度下100微克酸化的肿瘤组织匀浆(pH6.0)中加入1毫克/毫升的样品化合物,肿瘤组织匀浆中的酶能够导致释放紫杉醇,通过HPLC能够检测化合物的减小和紫杉醇的增加而比较肿瘤组织对药物的激活效率,通过筛选发现本发明的化合物S1,S2,S3,S4连接在筛选的化合物中具有最高的激活效率。

表2：不同肿瘤组织匀浆中的S1,S2,S3,S4的化合物激活比例(％),

	产生肿瘤的细胞	S1,	S2	S3	S4
						人纤维肉瘤	HT-1080	74.7	75.4	67.9	74.6
人乳腺癌	MDA-MB435	92.3	91.4	90.4	92.8
						人卵巢癌	SK-OV-3	88.4	84.6	79.3	63.8
人结肠癌	HT-29	79.4	89.9	91.4	90.6
						人慢性白血病	K562	64.7	73.3	70.2	74.2
人胰腺癌	Panc-1	94.8	93.8	91.5	93.1
						人非小细胞肺癌	A549	86.4	89.4	81.4	83.6
人前列腺癌	PC-3	97.3	98.4	96.3	93.5
						人肝癌	Hep G2	95.3	84.6	83.5	74.2
人肾癌	OS-RC-2	86.4	91.5	86.4	90.5
						人心脏		无	无	无	无

表3：筛选对比化合物中近似不同成分的缺失对激活药物的的影响。S1,S2,S3和S4样品化合物(实施例10-11制得),使用溶剂1(50％注射用水,42％～49％酒精,1％～8％吐温80)统一溶解,并用水稀释10倍到1毫克/毫升。在本发明的实验中,在37度温度下100微克酸化的人乳腺癌(MDA-MB435)肿瘤组织匀浆(pH6.0)中加入1毫克/毫升的样品化合物,肿瘤组织匀浆中的酶能够导致释放紫杉醇,通过HPLC能够检测化合物的减小和紫杉醇的增加而比较肿瘤组织对药物的激活效率。

化合物	激活效率(％)
		C1:AAN-基团2-紫杉醇(2位连接)	67.4
C2:基团1-AAN-紫杉醇(2位连接)	54.8
		C3:AAN-紫杉醇(2位连接)	34.9
C4:基团1-AAN-基团2-紫杉醇(7位连接)	12.1

C5:基团1-AANL-基团2-紫杉醇(2位连接)	57.4
		C6:基团1-AANK-基团2-紫杉醇(2位连接)	47.7
S1:基团1-AANL-基团2-紫杉醇(2位连接)	94.3
		S2	93.1
S3	91.5
		S4	87.8

上述结果说明：本发明肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物不同基团的连接与紫杉醇对药物在肿瘤组织激活具有不同的影响。紫杉醇与相连接的化合物基团间的相互构效关系决定在组织部位的靶向和激活效果。S1,S2,S3,S4在不同肿瘤类型中(10种不同肿瘤)的激活说明了药物激活的广谱性(表2)。同时比较化合物筛选过程中产生的特定化合物,分析在同一人乳腺癌MDA-MB435肿瘤组织中的激活效率,实验证明S1,S2,S3,S4化合物的各基团选择是相对激活效率更高的搭配(表3).

本发明提供的肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物，实验设计思路来源于通过大量的合成实验设计制备不同连接的方式的复杂化合物，然后通过连接复杂化合物到紫杉醇上的2位或7位(即分别将复杂化合物连接到紫杉醇分子式上的第7位或第2位的OH上)，再通过肿瘤组织激活效率的大小进行筛选，并依次筛选所得化合物在R1、R2，以及n取不同值时对肿瘤的抑制作用。肿瘤组织特异性的激活位点是AAN与基团2之间的连接处，激活断裂后，基团2能够自释放，而进一步释放出紫杉醇。因为天冬氨酸酶的酶活中心位于球囊状内陷的底部,切割位点需要接近酶活中心,这时复杂化合物对切割位点是否有空间位阻变为非常重要。

通过筛选实验的结果,本发明推测基团2的连接，可以有效避免直接连接紫杉醇带来的空间位阻，而不影响天冬氨酸酶的接近。而基团1的构效关系能够增加切割位点的极性,使更水溶性的蛋白酶更容易接近酶切位点,而增加切割效率。连接到紫杉醇第2位也显然减少了紫杉醇对蛋白酶的空间位阻和暴露的更多的整体亲水极性基团,增加切割效率和水溶性。而如果分别多添加一个极型K和一个极型L氨基酸则降低了激活效率。

实施例5本发明肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物受试药静脉用药最大耐受剂量(MTD)的测定。

试验目的：通过测定小鼠静脉用药MTD(最大耐受量)实验，了解本发明紫杉醇衍生物的急性毒性。

试验药物：S1,S2,S3和S4注射液(S1,S2,S3和S4样品化合物(实施例10-11制得),使用溶剂1溶剂1(50％注射用水,42％～49％酒精,1％～8％吐温80)统一溶解,试验时用生理盐水稀释到相应剂量。

动物：一级巴比赛(BALB/C)小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，体重19-21g,全为雌性。

方法和结果：受试BALB/C小鼠36只，体重19-21g,全为雌性，按体重随机分为7组，每组6只。如表1所示，按0mg/kg,25mg/kg,50mg/kg，60mg/kg,70mg/kg,80mg/kg,960mg/kg,分别一次性静脉注射S1，S2，S3，S4。并进行生理盐水组、紫杉醇组注射液(市售,北京悦康)的对照试验，每个小鼠给药体积0.2ml。连续观察17天，每日观察动物是否出现立毛树立、糟乱无光泽、昏睡、弯腰驼背、过激反应等，记录体重和死亡情况。在第3、5、14天采血样进行全血球计数，在第14天解剖动物采取心脏、肝脏、肾脏、肺、脾脏、胰腺HE染色观察。

表4：受试小鼠分别接受不同剂量的S1,S2和S3注射液与生理盐水、紫杉醇注射液的死亡率结果对照

结果与讨论：本发明注射S1,S2,S3和S4溶液的小鼠组，在90mg/kg剂量时，动物没有出现立毛树立、糟乱无光泽、昏睡、弯腰驼背、过激反应和死亡情况，如表4所示S1和S2溶液液的MTD值(最大耐受剂量)为90mg/kg，远大于紫杉醇的MTD值6mg/kg，受试药静脉用药最大耐受剂量是药物毒性的重要参考指数，表明靶向激活释放的紫杉醇的毒性比紫杉醇显著降低。

实施例6本发明S1,S2,S3和S4溶液(同实施例5样品)在裸鼠(nude mice)中的药效研究

试验目的：通过小鼠的肿瘤治疗模型，了解S1,S2,S3和S4化合物的抗肿瘤药效。

试验药物：S1,S2,S3和S4溶液(同实施例5样品)；紫杉醇注射液(市售，同上)

试验时用生理盐水稀释到相应浓度。

对照组为生理盐水

方法和结果：

1.动物：裸鼠，6-8周龄，全为雌性。(上海斯莱克实验动物有限公司)

2.产生肿瘤模型

1)人前列腺癌PC-3cells(细胞)从美国模式培养物集存库(American typeculture collection，ATCC)购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(简称，DMEM培养液)在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。

2)肿瘤产生，将5x 10⁶Panc-1细胞皮下注射到裸鼠(nude mice)小鼠背部，待肿瘤长至少达100mm³左右时随机分组，开始治疗,以开始治疗当天为第一天。

3)治疗过程

根据S1,S2,S3和S4临床用药使用IV注射，S1,S2,S3和S4都使用小于1/6MTD的计量24毫克/公斤剂量，S1,S2,S3和S4治疗组使用1/3MTD的计量8毫克/公斤剂量,对照组使用生理盐水,每周一次给药，共4周。

4)分组与结果测量如下表5所示

表5：S1S2S3和S4药物、紫杉醇及对照组对裸鼠治疗肿瘤的效果

5)结果与讨论：如表5所示，与等摩尔浓度的紫杉醇药物治疗组对照组比较，在S1,S2,S3和S4治疗组的肿瘤生长抑制效果大大提高。

实施例7:本发明S1,S2,S3和S4化合物在D121肿瘤免疫模型的药效研究

试验目的：通过D121肺癌肿瘤免疫模型治疗模型，了解S1,S2,S3和S4化合物的抗肿瘤药效。

动物：C57小鼠,6-8周龄，全为雌性。(上海斯莱克实验动物有限公司)

试验药物：S1,S2,S3和S4溶液(同实施例5样品)；紫杉醇注射液(市售，同上)

试验时用生理盐水稀释到相应浓度。

对照组为生理盐水

产生肿瘤模型：

1)D121肺癌肿瘤从美国模式培养物保藏所ATCC购买，细胞使用含有10％胎牛血清DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。

2)肿瘤免疫,小鼠腹腔注射5x10⁵经过照射死亡的D121肺癌细胞(购自美国模式培养物保藏所),免疫注射3次,每次间隔2周。在免疫结束后注射瘤细胞,然后再给药,每周一次给药，共4周。下表免疫组就是用D121肺癌细胞免疫,而无D121死肿瘤细胞免疫组注射生理盐水为对照。

3)肿瘤产生：在免疫过程结束之后(4周后),将10⁶活的D121肺癌肿瘤细胞皮下注射到肿瘤免疫的C57小鼠背部，待肿瘤长至0.3～0.4cm左右时开始治疗,记录计小鼠肿瘤大小(mm³),并计算抑瘤率。

4)肿瘤CD8+T细胞(T淋巴细胞亚群)分析。肿瘤组织经过匀浆,过滤分离出肿瘤中单个细胞,用缓冲液洗两次,白细胞共同抗原CD45-PE和CD8-FITC标记的抗体在室温1小时结合,细胞用包含1％胎牛血清磷酸缓冲液PBS洗两次,然后用流式细胞仪分析白细胞共同抗原(CD45)阳性细胞中T淋巴细胞抗原(CD8)阳性细胞的比例。

5)分组与结果测量

表6：S1,S2,S3和S4化合物、紫杉醇治疗组及对照组肿瘤抑制和免疫激活的效果

6)结果与讨论：与免疫对照组和其他治疗对照组相比较,S1,S2,S3和S4化合物在C57小鼠的治疗效果大大提高，S1与PDL1-抗体具有良好的协同促经免疫和协同治疗效果作用,能够通过提高免疫抑制肿瘤的生长。见表6。

实施例8本发明S1,S2,S3和S4药物在BALB/C小鼠的肿瘤转移模型中的药效研究

试验目的：通过BALB/C小鼠的肿瘤转移治疗模型，了解S1,S2和S3药物的抗肿瘤药效。

试验药物：S1,S2,S3和S4溶液(同实施例5样品)；紫杉醇注射液(市售，同上)

试验时用生理盐水稀释到相应浓度。

对照组为生理盐水

1.动物：BALB/C小鼠,6-8周龄，全为雌性。一级巴比赛(BALB/C)小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)

2.产生肿瘤模型

1)4T1cells从ATCC购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清DMEM培养液在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。

2)、肿瘤转移的产生，将10⁶T1cells细胞皮下注射到BALB/C小鼠背部，待肿瘤长至1.5cm左右时随机分组，手术去除皮下肿瘤，并开始用药物治疗，在第27天时麻醉后处死小鼠，取出整个肺，放入布安溶液(Bouin’s solution)中染色，在解剖显微镜下统计转移到肺部的肿瘤数量。

3)治疗过程：使用IV注射，S1,S2,S3和S4都使用1/6MTD的计量,12毫克/公斤剂量，紫杉醇药物治疗组使用1/6MTD的计量4毫克/公斤剂量,对照组使用生理盐水,每三天一次给药(量/)，共4次。

4)分组与结果测量如表7所示

表6：S1,S2,S3和S4药物、紫杉醇治疗组及对照组对于裸鼠肿瘤转移抑制的效果

4)分组与结果测量如表7所示

表7：S1,S2,S3和S4药物、紫杉醇治疗组及对照组对于裸鼠肿瘤转移抑制的效果

组别	动物	转移肿瘤数量	抑制转移率
				S1组	10	2±3	99.2％
S2组	10	8±7	94.1％
				S3组	10	13±8	90.44％
S4组	10	15±16	89.0％
				紫杉醇治疗组	10	128±25	5.9％
模型对照组	10	136.0±46	—

5)结果与讨论：如表7所示，与紫杉醇治疗组对照组比较，在S1,S2,S3和S4组腹腔给药后，在BALB/C小鼠的肿瘤转移抑制效果被大大提高，说明此类药物具有良好的抗肿瘤转移药效。

实施例9S1化合物在多肿瘤模型的药效研究

试验目的：通过小鼠的多肿瘤模型，了解S1的抗肿瘤药物的广谱性。

治疗药物：S1溶液(同实施例5样品)，试验时用生理盐水稀释到相应浓度。

方法和结果：

1.动物：裸鼠，6-8周龄，全为雌性。(上海斯莱克实验动物有限公司)

2.产生肿瘤模型

1)对应的细胞从美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)购买，并根据ATCC提供的说明书进行细胞的鉴定，细胞使用含有10％胎牛血清达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(简称，DMEM培养液)在37℃，5％的二氧化碳条件下培养。每3天传代一次，细胞使用在15代以内。

2)肿瘤产生，将5x10⁶对应细胞皮下注射到裸鼠(nude mice)小鼠背部，待肿瘤长至少达100mm³左右时随机分组，开始治疗,以开始治疗当天为第一天。

3)治疗过程

根据S1溶液使用IV注射，S都使用1/6MTD的计量17.6微摩/公斤剂量对照组使用生理盐水,每周一次给药，共3周。

4)分组与结果测量如下表2所示

表9：S1在多肿瘤模型的治疗效果

组别

肿瘤细胞

抑瘤率

		26天
			人乳腺癌	MDA-MB435	90.7％
人卵巢癌	SK-OV-3	85.6％
			人结肠癌	HT-29	89.7％
人慢性白血病	K562	77.9％
			人直肠癌	HT1080	94.3％
人胰腺癌	Panc-1	88.59％
			人非小细胞肺癌	A549	94.6％
人肝癌	Hep G2	84.3％
			人肾癌	OS-RC-2	85.7％

5)结果与讨论：如表9所示，S1在多种肿瘤模型中具有良好的药效,说明药物可以成为一个广谱性的肿瘤治疗药物。

本发明的另一些实施例(实施例10～24，合成方法与实施例S1相近)中，对于不同氨基酸结构的肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇的激活特性、抑瘤率及抑制转移率分别进行了测试，测试方法与上述实施例4，6，8相同，测试结果如表9所示：

表9：实施例10～24的肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇的激活特性、抑瘤率及抑制转移率结果。

项目	R1	R2	激活特性(％)	抑瘤率(38天)	抑制转移率
						实施例9	Ala	Thr	65.4％.	65.6％	75％.3
实施例10	Ala	Val	42.6％	46.2％	44.5％
						实施例11	Ala	Asn	38.4％	49.5％	81.6％
实施例12	Thr	Ala	75.7％	61.3％	87.4％
						实施例13	Thr	Thr	37.5％	52.4％	29.4％
实施例14	Thr	Val	54.6％	45.8％	39.3％
						实施例15	Thr	Asn	33.2％	68.3％	56.8％
实施例16	Val	Ala	30.6％	58.3％	64.8％
						实施例17	Val	Thr	65.8％	69.8％	80.1％

实施例18	Val	Val	38.5％	55.2％	68.3％
						实施例19	Val	Asn	43.5％	47.8％	71.4％
实施例20	Ile	Ala	49.6％	43.4％	63.9％
						实施例21	Ile	Thr	69.9％	59.5％	70.5％
实施例22	Ile	Val	57.5％	65.2％	45.5％
						实施例23	Ile	Asn	49％	47.48％	54.2％

结果与讨论：如表9所示，实施例10～24的化合物具有一定激活活性和肿瘤生长和转移抑制效果，说明我们筛选个的过程具有优化激活和疗效的实际意义，通过上述优选化合物的实施例，应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的R₁和R₂位的氨基酸替换和改变都将是显而易见的。

在本发明的一些实施例中，还合成了其他的肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇化合物，其中，n＝1-300中的任意整数，R₁为Ala，Thr，Val或Ile中的任意一种氨基酸；R₂为Ala，Thr，Val或Asn中的任意一种氨基酸；并做了上述的激活测试(方法同实施例2)、对肿瘤的疗效研究(方法同实施例6、7)、转移疗效(方法同实施例8)及多肿瘤疗效(方法同实施例9)的实验，并取得了与S1-S4相似的实验结果。经实验证明，n＝1-300范围内，随着n增大，抑瘤率轻微下降。随着n值增大，激活活性轻微下降，并且等摩尔计量的药物质量数增大，但是因为n值增大也使药物代谢半衰期增大，因此整体药效只是轻微下降，在n选自1～300的范围内，均能到达本发明实施例S1-S4相近的技术效果。

综上所述，本发明合成了肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇的抗肿瘤药物，并通过毒性和药效试验证明化合物比紫杉醇具有更低的毒性的，更好的制剂方法，同时药物,免疫治疗和直接治疗都药效大大提高,并具有治疗适应症扩大和对肿瘤转移有特效的显著特征,具有良好的实际治疗应用价值。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (10)

1.肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物，其特征在于，所述紫杉醇衍生物以下列结构式表示：

其中,R₁选自Ala，Thr，Val或Ile；R₂选自Ala，Thr，Val或Asn；n＝1～300。

2.根据权利要求1所述的肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物，其特征在于，其中n＝1，R₁为Ala，R₂为Ala，所述紫杉醇衍生物为化合物S1，以下列结构式表示:

3.根据权利要求1所述的肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物，其特征在于，其中n＝5，R₁为Ala，R₂为Ala，所述紫杉醇衍生物为化合物S2，以下列结构式表示:

4.根据权利要求1所述的肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物，其特征在于，其中n＝11，R₁为Ala，R₂为Ala，所述紫杉醇衍生物为化合物S3，以下列结构式表示:

5.根据权利要求1所述的肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物，其特征在于，其中n＝300，R₁为Ala，R₂为Ala，所述紫杉醇衍生物为化合物S4，以下列结构式表示:

6.根据权利要求1所述的肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物，其特征在于，所述紫杉醇衍生物为S10～S24。

7.如权利要求1～6中任一项所述的肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物用于制备抗肿瘤药物的用途，其特征在于，所述的用途为用于制备抗膀胱癌、脑癌、乳房/乳腺癌、宫颈癌、结肠/直肠癌、食管癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌或血癌药物的用途。

8.根据权利要求7所述的肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物用于制备抗肿瘤药物的用途，其特征在于，所述的用途为用于制备放射性治疗中辅助使用的抗肿瘤药物的用途。

9.根据权利要求7所述的肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物用于制备抗肿瘤药物的用途，其特征在于，所述的用途为用于制备免疫治疗和免疫治疗中的协同治疗药物的用途。

10.根据权利要求7所述肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物用于制备抗肿瘤药物的用途，其特征在于，所述药物为由肿瘤微环境靶向激活的紫杉醇衍生物与药用辅料组成的药物组合物。