CN102585012B - 一种石斑鱼α干扰素衍生物的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种石斑鱼α干扰素衍生物的制备方法与应用。该方法包括以下步骤：1)用氨基保护剂封闭石斑鱼α干扰素中赖氨酸残基的ε氨基，得到ε氨基被封闭的石斑鱼α干扰素；2)使所述ε氨基被封闭的石斑鱼α干扰素的位于氨基端的α氨基和醛基化的单甲氧基聚乙二醇发生亲核取代反应；反应完毕后，去除所述氨基保护剂，得到所述石斑鱼α干扰素衍生物。所述石斑鱼α干扰素衍生物为石斑鱼α干扰素的α氨基与醛基化的单甲氧基聚乙二醇发生亲核取代反应形成酰胺键后生成的化合物，分子量为38KD。使用本发明的方法得到的石斑鱼α干扰素衍生物修饰率约为30％以上，分离纯化后纯度可达95％以上，半衰期为石斑鱼α干扰素的3倍，活性为石斑鱼α干扰素的70％。
Description
技术领域
本发明涉及一种石斑鱼α干扰素衍生物的制备方法与应用，属于蛋白质类药物修饰领域。
背景技术
我国海域中有1700多种鱼类，种质资源丰富，品种多样，但制约鱼类养殖的病毒性疾病已成为限制鱼类养殖的最大障碍，并且由于鱼类不同于陆地动物，其通过疫苗预防控制鱼类疾病的方法受到接种方式、扩散方式等的多方面制约。因此，通过鱼类干扰素来控制病毒病已逐步成为首选。
但由于蛋白质类药物自身的一些缺点制约了其进一步发展：①稳定性差，易被胃肠道内蛋白水解酶水解，难以口服给药；②较高的免疫原性，易引起发热、过敏等不良反应；③半衰期短，进入机体后易被循环系统清除，生物利用度低，频繁给药增加了工作量且造成极大地痛苦。为了提高疗效，延长半衰期，降低免疫原性等，国内外学者对干扰素等蛋白质类药物的修饰技术进行了深入的研究，包括脂质体、多糖缓释技术，以及基因突变，共价修饰等，其中，聚乙二醇(PEG)共价修饰技术能有效改善药物体内分布和药动学性质，是近十几年来应用较广的改进蛋白质类药物药动学性质的新技术，并在人类已广泛应用于临床。
聚乙二醇是由环氧乙烷与水或乙二醇不断加成聚合而成的高分子化合物。有学者将PEG注射小鼠做实验发现PEG为基本无毒的化学物质，且广泛应用于化妆品、食品和制药等行业。聚乙二醇易溶于水及乙醚、己烷等有机溶剂，在水溶液中，PEG为高度水合的聚合物，由于其具有高度灵活的骨架以及和水分子的高度结合性，PEG流体动力学体积为相近分子量水溶性蛋白分子的5到10倍，并且，当PEG与蛋白结合后，对这些蛋白的性质几乎没有太大的影响，但却可以在很大程度上提高这些蛋白的溶解度和分子量。由于普通聚乙二醇末端为活性很低的羟基，需要在复杂条件才能够发生与蛋白质类药物的共价结合，对蛋白质类药物的活性造成一定的损失，且不利于大批量生产纯化。
发明内容
本发明的目的是提供一种石斑鱼α干扰素衍生物的制备方法与应用。
该石斑鱼α干扰素衍生物的制备方法，包括以下步骤：
1)用氨基保护剂封闭石斑鱼α干扰素中赖氨酸残基的ε氨基，得到ε氨基被封闭的石斑鱼α干扰素；
2)使所述ε氨基被封闭的石斑鱼α干扰素的位于氨基端的α氨基和醛基化的单甲氧基聚乙二醇发生亲核取代反应；反应完毕后，去除所述氨基保护剂，得到所述石斑鱼α干扰素衍生物；所述石斑鱼α干扰素衍生物为石斑鱼α干扰素的α氨基与醛基化的单甲氧基聚乙二醇发生亲核取代反应形成酰胺键后生成的化合物，所述石斑鱼α干扰素衍生物分子量为38KD；
所述石斑鱼α干扰素的分子量为18.2KD，其氨基酸全序列见序列表序列2。
所述步骤2)中所述醛基化的单甲氧基聚乙二醇具体可为丙醛基修饰的单甲氧基封端的直链聚乙二醇，分子量为20KD。
所述步骤1)中所述氨基保护剂为二甲基马来酸酐，其用量为所述石斑鱼α干扰素氨基端的α氨基和赖氨酸残基的ε氨基的摩尔数之和的3-5倍，或具体可为0.2g所述石斑鱼α干扰素使用0.0664g二甲基马来酸酐或1g所述石斑鱼α干扰素使用0.332g二甲基马来酸酐；所述封闭是在0℃，pH值为8.5的磷酸盐缓冲溶液中进行；所述磷酸盐缓冲溶液的溶质为43mM的Na2HPO4和14mM的KH2PO4，溶剂为水。
所述步骤1)中所述石斑鱼α干扰素在所述磷酸盐缓冲溶液中的含量为2mg/ml-10mg/ml。
所述步骤2)中所述亲核取代反应是在如下条件下进行的：温度为37℃，使用NaBH3CN作为催化剂；所述NaBH3CN的用量与所述步骤1)中所述石斑鱼α干扰素摩尔数相同，或具体可为0.2g步骤1)中所述石斑鱼α干扰素使用0.032g NaBH3CN或1g步骤1)中所述石斑鱼α干扰素使用0.16g NaBH3CN。
所述步骤2)中所述醛基化的单甲氧基聚乙二醇的用量为步骤1)中所述石斑鱼α干扰素摩尔数的2-10倍，或具体可为0.2g步骤1)中所述石斑鱼α干扰素使用2.63g所述醛基化的单甲氧基聚乙二醇或具体可为1g步骤1)中所述石斑鱼α干扰素使用7.89g所述醛基化的单甲氧基聚乙二醇；去除所述氨基保护剂的方法是将反应体系的pH调至6.0。
由以上任一所述方法制备的石斑鱼α干扰素的衍生物也属于本发明保护的范围。
所述的衍生物可用于制备病毒抑制剂。
使用本发明的方法得到的石斑鱼α干扰素衍生物，其修饰率约为30％以上，分离纯化后纯度可达95％以上；半衰期为石斑鱼α干扰素的3倍，活性为石斑鱼α干扰素的70％。使用本发明的方法可有效地延长干扰素的半衰期，提高干扰素在体内的有效作用时间，最终可得到一种不会产生耐药性的杀灭病毒的蛋白质类新药，拓宽了蛋白质类药物在临床上的应用。
附图说明
图1为石斑鱼α干扰素的原核表达及包涵体的SDS-PAGE鉴定。其中，由左至右依次为：分子量标准(从上到下短横线所指示的片段大小依次为97.4、66.2、43.0、31.0、20.1、14.4kD)、Rosetta(DE3)/pET-GrIFNα-2b、石斑鱼α干扰素的包涵体、空菌株Rosetta(DE3)对照、Rosetta(DE3)/pET-21a(+)。
图2为石斑鱼α干扰素的凝胶过滤层析图谱及SDS-PAGE鉴定。
图3为石斑鱼α干扰素的离子交换层析图谱及SDS-PAGE鉴定。
图4为Superdex 75分离纯化实施例2和3制备的聚乙二醇-石斑鱼α干扰素后SDS-PAGE鉴定。其中，A为未修饰的游离石斑鱼α干扰素，B为聚乙二醇修饰的石斑鱼α干扰素。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例所用的醛基化的单甲氧基聚乙二醇是丙醛基修饰的单甲氧基封端的直链聚乙二醇，又称为单甲氧基聚乙二醇丙醛，分子量为20kD。
实施例1、石斑鱼α干扰素(GrIFNα-2b)的制备与纯化
1)将序列表中序列1所示的石斑鱼α干扰素成熟肽基因用NdeI和XhoI酶切后连接到质粒pET-21a(+)(默克化工，69740)的NdeI和XhoI位点得到重组表达载体pET-GrIFNα-2b。其中，序列表中序列1所示的石斑鱼α干扰素成熟肽基因编码序列表中序列2的多肽。
2)将pET-GrIFNα-2b转入菌株Rosetta(DE3)(购自全式金生物科技有限公司)的感受态细胞，得到含有重组表达载体pET-GrIFNα-2b的重组菌Rosetta(DE3)/pET-GrIFNα-2b。将pET-21a(+)转入菌株Rosetta(DE3)(购自全式金生物科技有限公司)的感受态细胞，得到含有空载体的对照重组菌Rosetta(DE3)/pET-21a(+)。
将重组菌Rosetta(DE3)/pET-GrIFNα-2b和Rosetta(DE3)/pET-21a(+)分别于LB液体培养基中37℃培养3小时，提取包涵体(用超声破碎细胞，12000rpm离心，将沉淀溶于8M盐酸胍水溶液中)，进行SDS-PAGE鉴定，结果如图1所示。
3)将步骤2)得到的包涵体3ml约60mg逐滴加入到500ml复性液(由100mM Tris·Cl、400mM L-精氨酸、2mM EDTA、5mM还原型谷胱甘肽和0.5mM氧化型谷胱甘肽组成的水溶液；该复性液的pH为8.0)中，4℃条件下复性6-12小时。
4)浓缩管离心浓缩步骤3)得到的复性包涵体，经凝胶过滤层析和离子交换柱层析分离纯化，得到高纯度的石斑鱼α干扰素GrIFNα-2b，大小为18.2KD，如图2、3所示。
其中，凝胶过滤层析和离子交换柱层析具体方法如下：
将步骤4)浓缩的复性包涵体经Superdex75(GE公司，17-5174-01)凝胶过滤层析，洗脱液为pH8.0的20mM Tris·Cl缓冲溶液，层析柱规格30cm(柱长)×10cm(内径)，上样体积为5mL，流速为1ml/min。收集得到的主峰(洗脱体积为60-65mL)进行活性检测，然后进行SDS-PAGE，结果如图2所示。
将上述活性峰溶液经过pH8.0的Tris缓冲溶液(溶质为50mM的Tris和20mM的Nacl，溶剂为水)平衡后，进行阴离子交换柱层析。该离子交换柱的体积为5ml。收集得到的主峰进行活性检测，然后进行SDS-PAGE，结果如图3所示。
对照Rosetta(DE3)/pET-21a(+)经包涵体提取后得到的产物在分离纯化中的洗脱峰经石斑鱼α干扰素的活性检测无活性，说明Rosetta(DE3)/pET-GrIFNα-2b的包涵体分离纯化过程中的洗脱峰活性为石斑鱼α干扰素成熟肽基因表达产生的蛋白活性。
实施例2、低浓度石斑鱼α干扰素条件下mPEG20000-GrIFNα-2b的制备
1)石斑鱼α干扰素溶液的制备：用0.1M磷酸盐缓冲液(溶质为43mM的Na2HPO4和14mM的KH2PO4，溶剂为水，pH8.5)溶解实施例1制备的GrIFNα-2b，得到浓度为2mg/mLGrIFNα-2b的100mL溶液。
2)封闭反应：将步骤1)得到的2mg/mL GrIFNα-2b的100mL溶液于0℃冰浴，在缓慢搅拌条件下加入0.0664g二甲基马来酸酐(DMMAn)，待DMMAn溶解后再持续搅拌30min。
3)亲核取代反应：将步骤2)的反应体系升温至37℃，在缓慢搅拌条件下加入2.63g单甲氧基封端、丙醛基修饰的直链聚乙二醇(mPEG20000-ALD)(分子量为20KD，北京键凯生物技术有限公司，M-ALD-20K)，待mPEG20000-ALD溶解后再加入0.032g氰化硼氢化钠(NaBH3CN)，溶解后保持反应30min。
4)终止反应：以0.1M的HCl调节步骤3)的反应溶液pH至6.0，37℃再持续搅拌30min，得到含有石斑鱼α干扰素衍生物mPEG20000-GrIFNα-2b的溶液。该mPEG20000-GrIFNα-2b为石斑鱼α干扰素的α氨基与醛基化的单甲氧基聚乙二醇发生亲核取代反应形成酰胺键后生成的化合物。
实施例3、高浓度石斑鱼α干扰素条件下mPEG20000-GrIFNα-2b的制备
1)石斑鱼α干扰素溶液的制备：用0.1M磷酸盐缓冲液(溶质为43mM的Na2HPO4和14mM的KH2PO4，溶剂为水，pH8.5)溶解实施例1制备的GrIFNα-2b，得到浓度为10mg/mL GrIFNα-2b的100mL溶液。
2)封闭反应：将步骤1)得到的10mg/mL GrIFNα-2b的100mL溶液于0℃冰浴，在缓慢搅拌条件下加入0.332g二甲基马来酸酐(DMMAn)，待DMMAn溶解后再持续搅拌30min。
3)亲核取代反应：将步骤2)的反应体系升温至37℃，在缓慢搅拌条件下加入7.89g单甲氧基封端、丙醛基修饰的直链聚乙二醇(mPEG20000-ALD)，待mPEG20000-ALD溶解后再加入0.16g氰化硼氢化钠(NaBH3CN)，溶解后保持反应30min。
4)终止反应：以0.1M的HCl调节步骤3)的反应溶液pH至6.0，37℃再持续搅拌30min，得到含有石斑鱼α干扰素衍生物mPEG20000-GrIFNα-2b的溶液。该mPEG20000-GrIFNα-2b为石斑鱼α干扰素的α氨基与醛基化的单甲氧基聚乙二醇发生亲核取代反应形成酰胺键后生成的化合物。
实施例4、mPEG20000-GrIFNα-2b的分离纯化
1)将实施例2和实施例3得到的含有石斑鱼α干扰素衍生物mPEG20000-GrIFNα-2b的溶液中的0.1M的磷酸盐缓冲溶液更换为10mM磷酸盐缓冲液(溶质为4.3mM的Na2HPO4和1.4mM的KH2PO4，溶剂为水，pH7.0)，进行Superdex 75凝胶过滤层析。
2)收集主峰处的蛋白，即得到mPEG20000-GrIFNα-2b原液。
3)经SDS-PAGE鉴定，实施例2和实施例3制备的mPEG20000-GrIFNα-2b的大小均为38KD，结果如图4所示。
Claims (8)
1.一种制备石斑鱼α干扰素衍生物的方法，包括以下步骤：
1）用氨基保护剂封闭石斑鱼α干扰素中赖氨酸残基的ε氨基，得到ε氨基被封闭的石斑鱼α干扰素；
2）使所述ε氨基被封闭的石斑鱼α干扰素的位于氨基端的α氨基和醛基化的单甲氧基聚乙二醇发生亲核取代反应；反应完毕后，去除所述氨基保护剂，得到所述石斑鱼α干扰素衍生物；所述石斑鱼α干扰素衍生物为石斑鱼α干扰素的α氨基与醛基化的单甲氧基聚乙二醇发生亲核取代反应形成酰胺键后生成的化合物，所述石斑鱼α干扰素衍生物分子量为38KD；
所述石斑鱼α干扰素的分子量为18.2KD，其氨基酸全序列见序列表序列2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2）中所述醛基化的单甲氧基聚乙二醇为丙醛基修饰的单甲氧基封端的直链聚乙二醇，分子量为20KD。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中所述氨基保护剂为二甲基马来酸酐，其用量为所述石斑鱼α干扰素氨基端的α氨基和赖氨酸残基的ε氨基的摩尔数之和的3-5倍；
所述封闭是在0℃，pH值为8.5的磷酸盐缓冲溶液中进行；
所述磷酸盐缓冲溶液的溶质为43mM的Na2HPO4和14mM的KH2PO4，溶剂为水。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中所述石斑鱼α干扰素在所述磷酸盐缓冲溶液中的含量为2mg/ml-10mg/ml。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2）中所述亲核取代反应是在如下条件下进行的：温度为37℃，使用NaBH3CN作为催化剂；
所述NaBH3CN的用量与所述步骤1）中所述石斑鱼α干扰素的摩尔数相同。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2）中所述醛基化的单甲氧基聚乙二醇的用量为步骤1）中所述石斑鱼α干扰素摩尔数的2-10倍；
去除所述氨基保护剂的方法是将反应体系的pH调至6.0。
7.由权利要求1-6中任一所述方法制备的石斑鱼α干扰素的衍生物。
8.权利要求7所述的衍生物在制备病毒抑制剂中的应用。
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