CN106692961A - 精氨酸酶组合物、精氨酸酶激活剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种精氨酸酶组合物、精氨酸酶激活剂及其应用。所述精氨酸酶组合物包含精氨酸酶和精氨酸酶激活剂，所述精氨酸酶激活剂包括选自通式1至通式5所表示的化合物及其异构体或衍生物，及其组合。本发明的精氨酸酶激活剂大大提高了精氨酸酶的活性，从而一定程度上弥补了其半衰期短的缺陷。

Description

精氨酸酶组合物、精氨酸酶激活剂及其应用

技术领域

本发明涉及酶学领域，特别涉及利用精氨酸酶活性的制剂或药物，具体涉及一种精氨酸酶激活剂，含有该激活剂的精氨酸酶组合物及其在疾病治疗中的应用。

背景技术

精氨酸酶I(EC 3.5.3.1；L-精氨酸水解酶)，是一种关键的哺乳动物肝脏酶，其催化尿素循环中尿素形成的最终步骤，将精氨酸转变为鸟氨酸和尿素。精氨酸对于正常的人体细胞来说是半必须氨基酸，正常的人体细胞可以合成自身所需的精氨酸，而精氨酸对于癌细胞来说是必须氨基酸，很多癌细胞系是精氨酸营养缺陷型的。很多证据表明，体外精氨酸耗损(利用精氨酸降解酶或使用缺乏精氨酸的介质)会导致癌细胞的迅速破坏(Scott et al.,2000,Single amino acid(arginine)deprivation:rapid and selective death of culturedtransformed and malignanat cells.Br.J.Cancer 83,800-810；Wheatley etal.,2000,Single amino acid(arginine)restriction:Growth and Death of culturedHela and Human Diploid Fibroblasts.Cellular Physiol.Biochem.10,37-55)。当肝癌病人发生意外肝损伤时，大量肝源的精氨酸酶I意外的进入外周血液循环，肝癌胚抗原的水平明显降低，而当外周血液中的精氨酸酶含量回复正常范围，肝癌胚抗原的水平明显也随之升高。目前的实验证实，耗竭精氨酸可以诱导癌细胞发生自噬，从而使肿瘤放缓或停止生长，延长癌症病人存活期,为后续治疗争取时间(Chun A.Changou,2014，Arginine starvation-associatedatypical cellular death involves mitochondrial dysfunction,nuclear DNA leakage,and chromatin autophagy.J.PNAS 39,14147-14152)。因此，使用精氨酸酶来治疗癌症，也是目前癌症治疗研究的一个重要方向。

通过精氨酸剥夺还可以对病毒进行抑制。病毒感染是死亡的主要原因之一，每年病毒直接导致数百万的死亡病例，包括肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒(HIV)。然而，现有的抗病毒疗法还存在一些问题或缺点。首先，有效的抗病毒药物比较较少。很多现有的抗病毒物质导致不利的副作用。大部分有效的疗法(例如接种疫苗)只对单个病毒株具有高特异性。病毒经常发生突变，使得其对药物或疫苗产生抗性。因此，需要克服上述问题的新的抗病毒疗法。实验证明，实现精氨酸耗竭导致很多不同的病毒家族的复制受到抑制，所述病毒家族包括腺病毒(Rouse等，1963，Virology,20：357-365)和疱疹病毒(Tankersley,1964,J Bacteriol,87:609_13)。

但是，由于精氨酸酶药理学半衰期短，在患者体内难以实现治疗有效的血液水平，是将其临床应用的一大障碍。有些研究者通过将该蛋白与聚合物(例如聚乙二醇(PEG))偶联来克服这一问题。作为具有惰性的、非毒性的生物降解性聚合物，PEG与生物分子的共价结合在生物技术和医药中具有重要的应用。据报道，具有生物学和药学活性的蛋白的聚乙二醇化改善了药代动力学，从而延长了持续时间、改善了安全性(例如更低的毒性、免疫原性和抗原性)、增加了功效、降低了给药频率、提高了药物溶解度和稳定性、降低了蛋白质水解性并促进了药物的可控释放(Roberts et al.,2002,AdvDrug Deliv Rev,54:459-76；Harris&Chess,2003,Nat Rev Drug Discov,2:214-221)。随着PEG化技术的发展，第二代PEG技术比第一代PEG技术相比在延长半衰期、修饰专一性等方面取得了长足的进步，特别是双臂及多臂PEG，具有更大的分子体积和特殊的分子形态，更有利于对药物分子等的修饰与改性，达到更优的综合效果。以PEG-IFNα-2b为例，当PEG化采用直链PEG(20k)时，半衰期约为40小时，药物全身分布，按体重给药，而采用大分子支链PEG(PEG-IFNα-2a(Y型40k))时，半衰期约为80小时，药物可浓聚于靶器官如肝脏，无需按体重给药，被FDA批准用于慢性丙型肝炎和慢性乙型肝炎的治疗。

在正常生理条件下，血浆精氨酸水平维持在正常范围之间(100—120μM)，肌肉是主要调节物。对于氨基酸缺乏，胞内蛋白质分解途径被激活(蛋白酶体和溶酶体)，将氨基酸释放至循环中。这种氨基酸稳态机制使多种氨基酸水平保持在恒定范围。因为机体的氨基酸稳态机制的存在，先前多种物理方法或精氨酸降解酶耗竭精氨酸的尝试均以失败告终。因此，想要靠降解酶耗竭精氨酸，降解酶必须要维持长时间足够高的活力来抵消机体的氨基酸稳态机制。

截止到2015年6月，美国FDA批准进行临床试验的通过耗竭人体血液中的精氨酸治疗癌症的酶制剂有两种，一是PEG修饰的支原体精氨酸脱亚氨酶(3期临床)，另一种是PEG修饰人的精氨酸酶I(1期临床)。二者的共同点是：都能耗竭人体血液中的精氨酸，都通过PEG修饰来延长半衰期；二者的差异如下：

PEG修饰的支原体精氨酸脱亚氨酶(ADI)的活性比PEG修饰人的精氨酸酶I(recombinant human arginase I,rhArg I)的活性高，但是在3期临床中发现支原体精氨酸脱亚氨酶虽然进行了PEG修饰，还是能引发免疫反应，此外ADI降解血液中的精氨酸产生L-瓜氨酸和NH₃，后者有可能使患者血氨含量升高产生氨中毒症状。仅有精氨基琥珀酸合成酶(argininosuccinatesynthetase,ASS)表达缺失的癌细胞对ADI敏感，而非ASS表达缺失的癌细胞对ADI有抗性(Shen LJ et al.Resistance to the anti-proliferative activity ofrecombinant arginine deiminase in cell culture correlates with the endogenousenzyme,argininosuccinate synthetase.Cancer Lett 2003；191:165-70)。

PEG修饰人源精氨酸酶I不会引起免疫反应，降解精氨酸产物是尿素和鸟氨酸，没有发生氨中毒的风险，并且对ASS缺陷型和非ASS缺陷型的癌细胞均有抑制性。(Paul Ning-Man Cheng et al,PEGylated RecombinantHuman Arginase(rhArg-PEG)Inhibits the In vitro and In vivo Proliferation ofHuman Hepatocellular Carcinoma through Arginine Depletion.Cancer Res 2007；67:(1)309-317)但是因为PEG修饰人源精氨酸酶I活性较低(大约是前者的1/100)，在安全给药量(1000-1600u/kg)范围内出现无效受试个体，而有效受试个体,也需要给药4周才能到达耗竭精氨酸的效果，虽然高剂量受试者(2500u/kg)给药2周时达到了耗竭精氨酸的效果，但是有受试者出现了肝功能的损伤(Thomas Yau et al.A phase 1dose-escalating study of PEGylatedrecombinant human arginase 1(PEG-rhArg 1)in patients with advancedhepatocellular carcinoma.Invest New Drugs.2013Feb；31(1):99–107.)。因此提高活力是PEG修饰人源精氨酸酶I目前最迫切需要解决的问题。

阿魏酸普遍存在于当归、川芎等中药材中，具有抗凝、解除血管平滑肌痉挛，抗氧化、抗炎、镇痛和护肝等药理作用，临床上阿魏酸的盐或酯(阿魏酸钠、阿魏酸哌嗪等)广泛被用于偏头痛、脑血管病、肾小球病和肺动脉病变等血管相关疾病(Mathew S et al.,Ferulic acid an antioxidant foundnaturally in plant cell walls and feruloyl esterases involved in its release and theirapplications.Crit Rev Biotechnol 2004；24(2-3):59-83)。此外，近些年发现阿魏酸具有抑制肿瘤生长的作用，其机制是抑制血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达，并干扰VEGF的作用通路，使得VEGF功能减弱或丧失。目前从未发现阿魏酸类化合物可以激活精氨酸酶或有相关的活性。

发明内容

为了进一步提高精氨酸酶的有效性，本发明提供了一种精氨酸酶组合物，其能够增强精氨酸酶的活性，从而更加有效发挥其作用。

本发明的发明人意外地发现了阿魏酸类的化合物具有激活精氨酸酶，增强其活性的作用，并进一步开发了相关的组合物，以用于科研或疾病的治疗。

在一个实施方式中，本发明提供了一种精氨酸酶组合物(或称为精氨酸酶与其激活剂的组合)，包含精氨酸酶和精氨酸酶激活剂，所述精氨酸酶激活剂包括选自以下通式1至通式5所表示的化合物及其异构体或衍生物，及其组合：

其中，X选自O、N和S，

R₁、R₂和R₃各自独立的选自氢、氘、卤素、羟基、羧基取代或未取代的C₁至C₂₀烷基和取代或未取代的C₁至C₂₀烷氧基，

m为1至4的整数，n为1至3的整数，

其中所述取代的C₁至C₂₀烷基和取代的C₁至C₂₀烷氧基的取代基选自羟基、羧基、卤素和C₁至C₁₀烷基。所述精氨酸酶和精氨酸酶激活剂可以单独分别存在于所述组合中，也可以混合物的形式存在于所述组合中。在应用时，精氨酸酶与上述激活剂可以在不同时间段分别依次施用。

通过上述精氨酸酶激活剂与精氨酸酶的组合，可以显著提高精氨酸酶的活性，从而能够在有限的时间内更大的发挥降解精氨酸的活性，增强利用精氨酸酶进行治疗的效果。

优选地，其中所述精氨酸酶与所述精氨酸酶激活剂的比例为1活性单位精氨酸酶：0.25nmol至80nmol精氨酸酶激活剂。

在一个优选的实施方式中，其中所述衍生物包括盐或酯，优选钠盐、钾盐、和阿魏酸烷基酯，所述烷基为C1至C10的烷基，例如阿魏酸甲酯、阿魏酸乙酯。

在进一步优选的实施方式中，其中所述精氨酸酶激活剂包括阿魏酸及其衍生物、丁烯基苯酞、丁苯酞、藁本内酯、苯丙素类化合物，所述阿魏酸衍生物包括阿魏酸盐例如阿魏酸钠、阿魏酸酯和阿魏酸哌嗪(结构如下)。

阿魏酸哌嗪

在一个优选的实施方式中，其中所述精氨酸酶为重组人源精氨酸酶，优选重组人源精氨酸酶I。重组人源精氨酸酶的使用最大程度地降低了潜在的免疫反应对疗效的影响，也不会引起像化疗药物那样引起的副作用所造成的不适。

在一个优选的实施方式中，其中所述精氨酸酶为PEG化的精氨酸酶。精氨酸酶I的体内半衰期很短，只有8至10分钟，使用PEG化，可以大大延长其半衰期。优选使用直链型或分枝型PEG，优选Y型mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)。

在一个优选的实施方式中，可以进一步包括另一种已知的精氨酸酶激活剂，如锰离子或甘氨酸，以进一步增强精氨酸酶的活性。

在另一个实施方式中，本发明还提供了具有通式1至通式5的化合物作为精氨酸酶激活剂的应用，

其中，X选自O、N和S，

R₁、R₂和R₃各自独立的选自氢、氘、卤素、羟基、羧基取代或未取代的C₁至C₂₀烷基和取代或未取代的C₁至C₂₀烷氧基，

m为1至4的整数，n为1至3的整数，

其中所述取代的C₁至C₂₀烷基和取代的C₁至C₂₀烷氧基的取代基选自羟基、羧基、卤素和C₁至C₁₀烷基。

其中所述衍生物包括盐或酯，优选钠盐、钾盐、和酯，例如阿魏酸烷基酯，所述烷基可以为C1至C10烷基，例如阿魏酸甲酯和阿魏酸乙酯。优选地，所述精氨酸酶激活剂包括阿魏酸及其衍生物、丁烯基苯酞、丁苯酞、藁本内酯、苯丙素类化合物，所述阿魏酸衍生物包括阿魏酸盐例如阿魏酸钠、阿魏酸酯和阿魏酸哌嗪。

在一个优选的实施方式中，所述精氨酸酶激活剂用于与精氨酸酶联合制备药物，所述药物用于治疗癌症、抗病毒、促进胶原生成、促进细胞分裂、加快伤口愈合、促进组织再生与修复，以及抵抗炎症反应。

本发明还提供了一种药物组合物，包含如上所述的精氨酸酶组合物和药学可接受的载体或赋形剂。

本发明还提供了一种精氨酸酶激活剂，包括选自以下通式1至通式5所表示的化合物及其衍生物，及其组合：

其中，X选自O、N和S，

R₁、R₂和R₃各自独立的选自氢、氘、卤素、羟基、羧基取代或未取代的C₁至C₂₀烷基和取代或未取代的C₁至C₂₀烷氧基，

m为1至4的整数，n为1至3的整数，

其中所述取代的C₁至C₂₀烷基和取代的C₁至C₂₀烷氧基的取代基选自羟基、羧基、卤素和C₁至C₁₀烷基。

附图说明

图1为人源精氨酸酶I的构象示意图，图中用箭头指出半胱氨酸(Cys)的位置，赖氨酸(Lys)用标签指出；

图2为根据本发明的一个实施方式制备的rh精氨酸酶I和mPEG2-NHS单修饰rh精氨酸酶I的纯化后电泳图，Marker从上到下依次是：97.2KD，66,4KD，44.3KD，29.0KD，20.1KD，14.3KD，泳道1是：mPEG2-NHS单修饰的rh精氨酸酶I,泳道2是：rh精氨酸酶I；

图3是mPEG2-NHS与蛋白质偶联反应示意图；

图4是体外检测中rhArg I与rhArg I-PEG的酶活力随阿魏酸钠浓度变化的曲线图；

图5是根据本发明一个实施方式的组合物在大鼠的精氨酸耗竭实验中，血液中精氨酸酶活力随时间的变化曲线图；

图6是本发明一个实施方式中血液中精氨酸的含量随时间的变化。

具体实施方式

下文将结合具体实施例来具体说明本发明的精神和原理，并验证本发明的技术效果。本领域技术人员应了解的是，本发明的范围并不限于下述实施例，其范围应由权利要求书限定。

实施例1：重组人源精氨酸酶I的制备

1.重组人源精氨酸酶I的表达

rhArg I的氨基酸序列如下所示，使含有rhArg I基因的Pgex-6p-1质粒的大肠杆菌BL21(DE3)于LB培养基中加入80ug/L氨苄青霉素，在37℃，220转每分钟培养，直到600nm光吸收值达到0.7-0.9，随后降温至16℃,220转每分钟培养。半小时后，加入乳糖诱导表达，乳糖浓度为0.5mM，表达时间14-18小时。随后在4℃，4000rpm离心40分钟收集菌体。测沉淀细胞质量。

2.纯化

用PBS(内含2mM/L的DTT)重悬(4L菌大概用100mL PBS)菌。超声破菌后，14000转/分钟离心50分钟。取上清，上清过GST亲和柱，用PBS(内含2mM/L的DTT)洗杂后，用蛋白磷酸酶(pp酶)酶切过夜。第二天用50mM pH8.0Tris-HCl缓冲液配置的10mM的还原型谷胱甘肽的洗脱缓冲液从GST柱上洗脱下来，用10kD(截留值)的浓缩管进行浓缩，并去除谷胱甘肽，随后用AKTA过superdex75(GE公司)的分子筛,收集蛋白峰。分子筛superdex75的缓冲体系是PH8.5的50mM Bicine。最后用10KD(截留值)的浓缩管浓缩，rhArg I最终浓缩至5mg/ml。

3.支链PEG修饰和纯化

图1中显示了精氨酸酶1的构象示意图，图2显示了mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)(40kDa)与蛋白质的NH₂发生偶联的过程。

由于mPEG2-NHS的分子量较大，受到空阻的限制，只和蛋白质表面的NH₂反应，与NH₂形成稳定的酰胺键。精氨酸酶的浓度最终稀释到1-2mg/mL。在4℃-25℃,PH6.0-9.0环境下，把精氨酸酶与mPEG2-NHS按照摩尔比1:1-30的比例混合，缓慢搅拌15-60分钟。随后用SDS-PAGE来监测MPEG的修饰过程。随后用阳离子交换柱分离反应混合物，收集单修饰的精氨酸酶1的洗脱峰，用10kD的浓缩管进行浓缩。

本专利中用40KD的Y型mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)修饰rhArg，与现有技术的区别与优势在于：

(1)rhArg I没做任何突变

先前的专利为了定点偶联PEG做了突变

(2)PEG的种类和修饰点不同

先前的专利用5KD的PEG-SPA(香港)和20KD的mPEG-MAL(香港)，前者是第一代PEG修饰剂，分子量偏小，容易产生多修饰，产物不单一，修饰产物的半衰期短(3天)；后者的修饰点是半胱氨酸的还原型巯基，虽然能做到定点修饰和控制修饰数量，但是相对于赖氨酸侧链的氨基，巯基与蛋白质主链的距离只间隔一个单键，在这里引入大分子的PEG会干扰附近的蛋白质主链的结构，从而可能干扰蛋白质的活性。香港理工大学的专利用20KD的mPEG-MAL修饰rhArg的cys45，由人源精氨酸酶1的结晶结构可知，这个半胱氨酸紧邻两个二级结构，并且侧链的巯基伸向蛋白质内侧，与mPEG-MAL偶联时空阻比较大，并且要把侧链巯基拉到蛋白质外侧，这样反应效率低，而且会影响rhArg I的空间结构。

本发明中用40KD的Y型mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)修饰N末端氨基和赖氨酸侧链的氨基，mPEG2-NHS具有许多优点，其产物的支化结构会产生较大的分子体积，多点修饰的几率较直链的PEG修饰剂较低，这样mPEG2-NHS就不大可能渗透到蛋白质空间位阻大的区域，主要与伸展到蛋白质外侧的赖氨酸侧链的氨基偶联，赖氨酸侧链与蛋白质主链有5个单键的距离，并且柔性较强，mPEG2-NHS偶联在这里对rhArg I的空间结构的影响最小，对rhArg I的活性干扰相对前者较小，修饰产物的半衰期更长。

4.体外酶学测试

精氨酸酶的活性可以通过检测反应释放尿素的量来确定，测定尿素使用邻苯二甲醛(OPA)法，尿素与OPA和NED(N-(1-萘基)乙烯-二胺盐酸盐)生成红色化合物，颜色的深浅与酶的活性成正比。在50μl反应系统中，含200mM的Tris-HCl(pH7.4)，20mM的L-精氨酸，100μM氯化锰，0.225μg/ml的精氨酸酶。37℃反应2小时，加入200μl冷终止显色液(1MH₂SO₄-50mM H₃BO₃-1.6mM OPA&NED)，室温下20分钟后显色，然后立即在520nm吸光度的测量。rhArg I的活力约为300U/mg，rhArg I-PEG的活力保留了约81％。反应体系中添加0-200μM的阿魏酸钠，在0-200μM浓度下，阿魏酸钠对rhArg I和rhArg I-PEG均有激活性，在50-60μM时达到最高激活率约为42％。未修饰的rhArg I与PEG修饰的rhArg I的活性随阿魏酸钠浓度变化曲线如图4所示。

由图4可见，随着阿魏酸钠的加入，精氨酸酶的活性急剧增加，并且在0-80μM的阿魏酸钠浓度范围内，精氨酸酶活性随着阿魏酸钠浓度升高逐渐升高，因此，说明阿魏酸钠对精氨酸酶激活作用在一定范围内能够呈现一定程度的线性关系。

在应用于动物或人体内时，由于精氨酸酶和阿魏酸钠各自有其安全剂量范围，为了兼顾安全与酶活性，通过发明人多次评估实验得出：精氨酸酶与阿魏酸钠的比例优选为1活性单位精氨酸酶：0.25nmol至80nmol阿魏酸钠，更优选1活性单位精氨酸酶：1至10nmol阿魏酸钠，最优选1活性单位精氨酸酶：4至8nmol阿魏酸钠。在此范围内，既可以保证安全用药，又能够最大限度地增强精氨酸酶的活性，通过其协同作用增强治疗效果。

5.细胞学测试

对于每种癌细胞系，将在100μL培养物培养基中的细胞(5×10³)接种到96孔板的板孔中并采用标准方法温育24小时。用含有不同浓度的rhArg I-PEG，阿魏酸钠(Sodium ferulic,SF)，rhArg I-PEG与阿魏酸钠复合物(rhArg I-PEG&SF)之一的培养基替换培养物培养基。单纯rhArg I-PEG的添加浓度是0-1U/ml，rhArg I-PEG&SF中的rhArg I-PEG的添加浓度是0-1U/ml，阿魏酸钠的添加浓度是300μM。将96孔板在37℃在95％空气/5％CO₂环境中温育3天。通过MTT测定法确定活细胞数量，计算50％的细胞生长抑制作用所需的上述3种药物的量(以U/mL或单位/ml或ug/mL表示)即为IC50。

下表1展示了细胞培养的结果，单纯rhArg I-PEG和rhArg I-PEG&SF对4种癌细胞系有明显的抑制性，并且，在相同癌细胞系中rhArg I-PEG&SF组的IC50明显低于单纯rhArg I-PEG组，单独阿魏酸钠本身对4种癌细胞系均没有抑制性。

因此，如果阿魏酸钠与精氨酸酶的组合物能够对癌细胞系有抑制作用的话，是通过阿魏酸钠与精氨酸酶协同作用，或者说是通过激活或增强精氨酸酶本身的活性来发挥作用，这属于本发明的发明人首次发现并提出的阿魏酸钠的作用。

表1

6.rhArg I-PEG和rhArg I-PEG&SF大鼠的精氨酸耗竭有效性测试

随机选取大鼠分成5组，从第0天开始1-4组分别单剂量腹膜内注射4000U/kg的rhArg I-PEG，第2-4组每12小时(2次/天)额外分别腹膜内注射1mg/kg、5mg/kg或10mg/kg的SF，第5组为对照组仅注射PBS。随后每2天抽血，测试血中rhArg I活力和精氨酸含量。结果如图5和6所示。

7.血液中精氨酸的含量随时间的变化结果说明

血液中rhArg I-PEG活力和精氨酸含量随时间的变化如图5和6所示。单独注射rhArg I-PEG的T1/2约为10天，单独注射rhArg I-PEG后的10天内能维持精氨酸的10μM以下的低浓度水平，而SF的注射量为5或10mg/kg时可以使维持精氨酸低浓度水平的时间延长约2天，并且10-20天的血中精氨酸浓度明显低于单独注射rhArg I-PEG时的精氨酸浓度，说明SF的联合使用可以提高rhArg I-PEG的活性，加速耗竭精氨酸。

具体而言，由图5可见，注射了阿魏酸钠SF的大鼠中rhArg I活力显著高于未注射阿魏酸钠的大鼠中的rhArg I活力，并且能够更长时间维持较高的rhArg I活力，从而为精氨酸酶发挥作用争取了时间。

由图6可见，与没有添加SF仅仅使用rhArg I-PEG相比，rhArg I-PEG与SF协同作用，能够在更长时间内保持精氨酸浓度在极低水平。如果用在癌症治疗中，更长时间的极低精氨酸水平能够更加有效地遏制癌细胞，诱导癌细胞的自噬，从而达到治疗癌症的效果。

上述实施例说明，本发明的精氨酸酶激活剂能够有效增强精氨酸酶的活性，从而能够有效增强其对癌细胞等靶点的作用。

上文中仅仅以阿魏酸钠为例，说明了本发明的精氨酸酶激活剂对精氨酸酶活性的促进作用，并仅仅示出了阿魏酸钠的实验结果。实际上，发明人发现，例如丁烯基苯酞、丁苯酞、藁本内酯、苯丙素类化合物的化合物也能够实现增强精氨酸酶活性的作用，其构效关系等数据并未在此提供。本领域技术人员可以了解的是，上述化合物的衍生物，例如能够在体内代谢后与阿魏酸钠等上述化合物生成相同的产物的衍生物，也能够具有上述效果，因此，也在本发明的保护范围内。

综上，精氨酸酶降解精氨酸为多胺、脯氨酸,促进细胞分裂和胶原的形成,加快伤口愈合和组织再生及修复，并且对炎症后期由病原微生物造成的组织损伤进行修复和重塑。此外，精氨酸酶降解精氨酸得到的鸟氨酸，进一步降解可以生成两种重要的多胺---精脒(spermidine)和精胺(sper-mine)，它们是微生物和培养中的哺乳动物细胞膜的强力生长促进剂，对核酸代谢有多种影响。在这种情况下，本发明的精氨酸酶组合物由于精氨酸酶激活剂的存在，提高了精氨酸酶的活性，从而能够具有如下技术效果，或者说可以在如下领域更好地发挥精氨酸酶的作用：

1.促进细胞分裂，加快伤口愈合和组织再生及修复，可以应用于加速外伤、手术伤口愈合，移植组织扩增，血管再生及建立侧支循环；

2.促进胶原的生成，与所有胶原蛋白相关的用途相关，抗衰老，美容，抗癌等等；

3.拮抗M1型巨噬细胞的促炎症作用，缓解及修复炎症造成的组织损伤，即抗炎作用。

并且，本发明使用的阿魏酸钠等为临床常用药，毒性低，未发现明显的副反应，安全系数大,可安全应用于人体。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims (14)

1.一种精氨酸酶组合物，包含精氨酸酶和精氨酸酶激活剂，所述精氨酸酶激活剂包括选自以下通式1至通式5所表示的化合物及其异构体或衍生物，及其组合：

其中，X选自O、N和S，

R₁、R₂和R₃各自独立的选自氢、氘、卤素、羟基、羧基取代或未取代的C₁至C₂₀烷基和取代或未取代的C₁至C₂₀烷氧基，

m为1至4的整数，n为1至3的整数，

其中所述取代的C₁至C₂₀烷基和取代的C₁至C₂₀烷氧基的取代基选自羟基、羧基、卤素和C₁至C₁₀烷基。

2.如权利要求1所述的精氨酸酶组合物，其中所述衍生物包括盐或酯，优选钠盐、钾盐，或阿魏酸烷基酯。

3.如权利要求1所述精氨酸酶组合物，其中所述精氨酸酶激活剂包括阿魏酸及其衍生物、丁烯基苯酞、丁苯酞、藁本内酯、苯丙素类化合物，所述阿魏酸衍生物包括阿魏酸盐例如阿魏酸钠、阿魏酸酯和阿魏酸哌嗪。

4.如权利要求1或2所述的精氨酸酶组合物，其中所述精氨酸酶为重组人源精氨酸酶。

5.如前述权利要求中任一项所述的精氨酸酶组合物，其中所述精氨酸酶为PEG化的精氨酸酶。

6.如权利要求5所述的精氨酸酶组合物，其中所述PEG为直链型或分枝型PEG，优选Y型mPEG2-N-羟基琥珀酰亚胺酯(mPEG2-NHS)。

7.如前述权利要求中任一项所述的精氨酸酶组合物，进一步包括另一种精氨酸酶激活剂，如锰离子，甘氨酸。

8.如前述权利要求中任一项所述的精氨酸酶组合物，其中所述精氨酸酶与所述精氨酸酶激活剂的比例为1活性单位精氨酸酶：0.25nmol至80nmol精氨酸酶激活剂。

9.具有通式1至通式5的化合物作为精氨酸酶激活剂的应用，

其中，X选自O、N和S，

R₁、R₂和R₃各自独立的选自氢、氘、卤素、羟基、羧基取代或未取代的C₁至C₂₀烷基和取代或未取代的C₁至C₂₀烷氧基，

m为1至4的整数，n为1至3的整数，

其中所述取代的C₁至C₂₀烷基和取代的C₁至C₂₀烷氧基的取代基选自羟基、羧基、卤素和C₁至C₁₀烷基。

10.如权利要求9所述的应用，其中所述衍生物包括盐或酯，优选钠盐、钾盐或阿魏酸烷基酯，所述烷基为C1至C10烷基，例如阿魏酸甲酯或阿魏酸乙酯。

11.如权利要求9所述的应用，其中所述精氨酸酶激活剂包括阿魏酸及其衍生物、丁烯基苯酞、丁苯酞、藁本内酯、苯丙素类化合物，所述阿魏酸衍生物包括阿魏酸盐例如阿魏酸钠、阿魏酸酯和阿魏酸哌嗪。

12.如权利要求9至11中任一项所述的应用，其中所述精氨酸酶激活剂用于与精氨酸酶联合制备药物，所述药物用于治疗癌症、抗病毒、促进胶原生成、促进细胞分裂、加快伤口愈合、促进组织再生与修复，以及抵抗炎症反应。

13.一种药物组合物，包含如权利要求1至8中任一项所述的精氨酸酶组合物和药学可接受的载体或赋形剂。

14.一种精氨酸酶激活剂，包括选自以下通式1至通式5所表示的化合物及其衍生物，及其组合：

其中，X选自O、N和S，

R₁、R₂和R₃各自独立的选自氢、氘、卤素、羟基、羧基取代或未取代的C₁至C₂₀烷基和取代或未取代的C₁至C₂₀烷氧基，

m为1至4的整数，n为1至3的整数，

其中所述取代的C₁至C₂₀烷基和取代的C₁至C₂₀烷氧基的取代基选自羟基、羧基、卤素和C₁至C₁₀烷基。