CN1524516A - 胰高血糖素样肽－1缓释微球制剂及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域，是胰高血糖素样肽－1(GLP－1)的一种缓释微球制剂及其作为降糖药或控制体重的减肥药的用途。GLP－1是由小肠和大肠的分泌细胞及脑的神经细胞分泌的内源性多肽，具有刺激胰岛素分泌和抑制胰高血糖素分泌的作用，还有抑制食欲和延缓胃排空的作用，但其在体内的半衰期不到两分钟，从而制约了它作为药品的开发和利用。本发明以PLGA为基质，将GLP－1制成缓释微球制剂，缓释效果达4周以上，故可用作治疗糖尿病或控制体重的药品。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，是胰高血糖素样肽-1(Glucagon-likepepide-1，GLP-1)的缓释微球制剂及其用途。
背景技术
胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like pepide-1，GLP-1)是由小肠和大肠的分泌细胞及脑的神经细胞分泌的多肽，由37个氨基酸构成，其氨基酸序列为：His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly。(Lopez LC，Fraz ier ML，Su C-J，et al.Mammalianpancreatic proglucangon contains three glucanguon-related peptides.Proc Nalt Acad Sci USA 1983，80：5485-5489)。GLP-1能刺激胰岛素的分泌，并能抑制胰高血糖素的分泌，降低空腹或餐后血糖，其作用已在健康人体和糖尿病病人的临床研究中得到证实{M.A.Nauck，D.Wollschlager，J.Werner，et al.Effects of subcutaneous glucagon-like peptide 1[GLP-1(7-36amide)]in patients with NIDDM.Diabetologia1996，39：1546-1553}。正因为GLP-1具有刺激胰岛素分泌和抑制胰高血糖素分泌的作用，故人们试图将其用作治疗糖尿病的药物。又因GLP-1可以抑制食欲，减缓胃排空，所以也有人拟将其作为控制体重的药物(Juris J.Meier，Baptist Gallwitz，Wolfgang E.Schmidt，et al.Glucagon-like peptide-1as a regulator of food intake and body weight：therapeutic perspectves.Eur J Pharm 2000，440：269-279)。GLP-1作为内源性多肽，安全性和药理作用是明确的，毒副作用很小，GLP-1的降血糖作用是依赖于血浆中葡萄糖的浓度，用于治疗糖尿病不会发生低血糖的副反应，对磺酰脲类降糖药治疗无效的糖尿病病人同样有良好的疗效。[Ritzel R，Orskov C，et al.Pharmacokietic，insulinotropic，and glucangonostatic properties ofGLP-1(7-36amide)after subcutaneous injection in healthy volunteers.dose-response-relationships.Diabetologia 1995 38：720-725]。然而，由于GLP-1在体内的半衰期很短(小于2分钟)(DeaconCF，Knudsen LB，MadsenK，et al.Dipeptidyl peptidase IV resistant analogues of glucagons-likepeptide-1 which have extended metabolic stability and improvedbiological activity.Diabetologia 1998 41：271-278)，这就制约了其作为药品的开发和利用，因此至今仍未应用于临床。
发明内容
本发明提供一种GLP-1的缓释微球制剂，可持续释药达4周以上，从而使GLP-1有望成为可供临床使用的药物，用于治疗糖尿病或控制体重。近年来生物可降解的高分子材料广泛应用于蛋白多肽类药物缓释微球的制备，其中聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactide-co-glycolide)，PLGA]，由于其良好的生物相容性及生物降解性已被美国FDA批准为药用高分子材料使用。以PLGA作为微球基质，体内外降解实验证明，在药物释放过程中，整个聚合物骨架呈均匀性降解，随着分子量的下降，骨架材料的亲水性增强，由于水分的不断渗入使蛋白多肽类药物持续释放出来(Wang YM，Sato H，Horikoshi.In vitro and in vivo evalution of taxol release from ploy(lactic-co-glycotic acid)microspheres containing isopropyl myristate anddegradation of the microspheres.J Control Rel，1997，49：157)。本发明就是使用PLGA作为基质制备GLP-1缓释微球制剂的。由于GLP-1第7至第36位氨基酸所组成的多肽片断[简称GLP-1(7-36)]与天然GLP-1具有同样的生物活性，并且较易制备，所以本发明以GLP-1(7-36)为主药，PLGA为基质，制备供皮下注射的GLP-1缓释微球制剂。
本发明缓释微球制剂制备方法有三种：
1.w/o/w溶剂挥发法：
(1)制备油相
将基质材料PLGA溶于有机溶剂二氯甲烷制成油相，浓度为50mg～300mg/ml；
(2)制备内水相
取适量GLP-1和保护剂溶于水形成内水相，GLP-1浓度为1mg～10mg/ml，保护剂选自碳酸锌、人血清白蛋白、海藻糖和甘露醇等，其含量为1～5％；
(3)制备微球
将内水相加入上述油相超声乳化形成初乳，将初乳迅速滴加在2～6％聚乙烯醇(PVA)水溶液中，该溶液还可含有0～2％NaCl，或/和0.5％表面活性剂F-68，机械搅拌充分匀化，搅拌速度为1000～1800rpm，室温下继续低速搅拌4小时，搅拌速度为300～600rpm，即成缓释微球，洗涤，收集，冷冻干燥即可。
2.s/o/o溶剂挥发法：
(1)制备油相
将基质材料PLGA溶于有机溶剂乙腈制成油相，浓度为50mg～300mg/ml；
(2)制备GLP-1微粉
将适量的聚乙二醇(PEG)和GLP-1及保护剂(其比例为8∶1∶2)分散于水中，冷冻干燥后，用二氯甲烷洗涤、离心，除去PEG，得到GLP-1微粉，保护剂选自碳酸锌、海藻糖和甘露醇等；
(3)制备微球
将GLP-1微粉加入油相，超声分散，然后逐滴加在棉子油中，机械搅拌充分匀化，搅拌速度为600～800rpm，室温下搅拌1小时，再加入适量的石油醚继续搅拌2小时，搅拌速度为300～600rpm，可得GLP-1微球，洗涤，收集，冷冻干燥即可。
3.喷雾干燥法
(1)制备GLP-1微粉
取适量GLP-1和保护剂溶于水，喷雾冷冻干燥，得到微粉，保护剂选自碳酸锌、人血清白蛋白、海藻糖等，其含量为1～5％；
(2)制备微球
将GLP-1微粉加入有机溶剂二氯甲烷，超声分散，喷雾干燥，即得微球，室温下真空干燥6小时后收集。
本发明所用的基质材料PLGA，分子量为3000～40000，聚乳酸(PLA)∶羟基乙酸(PGA)为25∶75～75∶25，浓度为50mg～300mg/ml。超声乳化，超声条件为：duty cycle％：40；output control：3档；timer：8次。喷雾干燥时进口温度为40℃、出口温度为30℃、喷雾压力5Pa。
本发明缓释微球经体外释放实验，缓释达4周以上，释放符合近似零级模式，可用于治疗糖尿病和控制体重的皮下注射制剂。
附图说明
图1为本发明GLP-1缓释微球制剂给药后第1天血糖浓度～时间曲线图。
图2为本发明GLP-1缓释微球制剂给药后第5天血糖浓度～时间曲线图。
图3为本发明GLP-1缓释微球制剂给药后第10天血糖浓度～时间曲线图。
图4为本发明GLP-1缓释微球制剂给药后第15天血糖浓度～时间曲线图。
图5为本发明GLP-1缓释微球制剂给药后第20天血糖浓度～时间曲线图。
图6为本发明GLP-1缓释微球制剂给药后第25天血糖浓度～时间曲线图。
图7为本发明GLP-1缓释微球制剂给药后第30天血糖浓度～时间曲线图。
具体实施方式
实施例1：w/o/w溶剂挥发法制备GLP-1缓释微球制剂
将PLGA(RG502H，PLA∶PGA＝50∶50，Mw＝34000)100mg溶于1.0ml二氯甲烷制成油相；将GLP-1(SIGMA公司，下同)3mg溶于0.1ml的重蒸溜水中(内含3％海藻糖、5％甘露醇)形成内水相，将其加入上述油相，超声乳化，形成w/o的初乳，将3％PVA溶液30ml(含NaCl 2％和F-68 0.5％)置于搅拌容器中，将初乳在1000rpm搅拌下快速加入外水相中充分匀化，三分钟后，将转速下调至400rpm同时外水相加入30ml蒸馏水，室温下搅拌4小时，微球硬化后离心分离并洗涤，冷冻干燥。分装密封后辐照消毒即可。GLP-1微球的包封率为92％，粒径小于100μm。
实施例2：s/o/o溶剂挥发法制备GLP-1缓释微球制剂
将PEG(PEG6000)24mg和GLP-1 3mg及保护剂碳酸锌5mg，分散于1ml重蒸溜水中，旋涡混合3分钟左右，冷冻干燥后，用二氯甲烷洗涤、离心，除去PEG，得到GLP-1微粉。将PLGA(RG502H，PLA∶PGA＝50∶50，Mw＝34000)200mg溶于乙腈1.0ml制成油相，将上述微粉加入油相，超声分散，将其逐滴加入棉子油中充分匀化，以600rpm搅拌1小时，再加入适量的石油醚以400rpm继续搅拌2小时，可得GLP-1微球，离心，用石油醚洗涤，收集，冷冻干燥，分装密封后辐照消毒即可。GLP-1微球的包封率为90％，粒径小于100μm。
实施例3：喷雾干燥法制备GLP-1缓释微球制剂
将GLP-1 8mg及保护剂人血清白蛋白30mg，溶于10ml的重蒸溜水中，喷入液氮中，将液氮在低温下挥发，得到GLP-1微粉。将PLGA(RG502H，PLA∶PGA＝50∶50，Mw＝34000)600mg溶于二氯甲烷10ml制成油相，将微粉加入油相中超声分散，喷雾干燥，进口温度为40℃、出口温度为30℃、喷雾压力5Pa，喷嘴直径0.5mm，流速1～2ml/分钟。将收集的微球在室温下真空干燥6小时，分装密封后辐照消毒即可。GLP-1微球的包封率为80％，粒径＜60μm。
动物试验：选取成年wister大鼠16只，体重200g左右，雌雄各半，随机分成给药组和空白组，给药组皮下注射适量微球(用实施例1制得的微球，每鼠注射160mg微球，含GLP-1约4.5mg)，空白组皮下注射同体积的生理盐水。分别于给药后的第1、5、10、15、20、25、30天的同一时间，给每只大鼠腹腔注射18mmol/kg葡萄糖，注射前每鼠先采血样，在注射后5、10、15、20、30和50分钟眼眶取血，测定注射前后的血糖。血糖测定参照葡萄糖测定试剂盒(葡萄糖氧化酶法，北京化工厂)的说明书进行。制作血糖浓度和时间曲线图(见图1至图7)，由图可见，空白对照组腹腔注射葡萄糖，5分钟后血糖明显升高，回落缓慢，50分钟时仍未达到基态血糖浓度。给药组在第1、5、10、15、20、25、30天都可以观察到明显的降血糖作用，30分钟内即回落到基态浓度。说明GLP-1微球在体内有明显的缓释和降血糖作用，所以本发明可作为GLP-1的缓释剂型用于治疗糖尿病或控制体重。
Claims (2)
1.一种胰高血糖素样肽-1缓释微球制剂，由基质和药物组成，其特征在于所说的基质为PLGA，所说的药物为胰高血糖素样肽-1及其保护剂，保护剂选自碳酸锌、人血清白蛋白、海藻糖和甘露醇。
2.权利要求1所说胰高血糖素样肽-1缓释微球制剂作为治疗糖尿病或控制体重药物的应用。
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