KR19990069475A

KR19990069475A - 과립구 콜로니 자극인자의 유도체 단백질을 생산하는 재조합미생물 및 그로부터 전기 재조합 단백질의 제조방법

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Publication number: KR19990069475A
Application number: KR1019980003751A
Authority: KR
Inventors: 손영덕; 강관엽; 이은경; 정경환; 박두홍; 정수일
Original assignee: 허영섭; 재단법인 목암생명공학연구소
Priority date: 1998-02-09
Filing date: 1998-02-09
Publication date: 1999-09-06
Also published as: KR100260350B1

Abstract

본 발명은 인간 과립구 콜로니 자극인자(granulocyte colony stimulating factor : G-CSF)의 유일한 당쇄화(glycosylation) 부위인 133번 트레오닌을 다른 아미노산 잔기로 치환한 유도체 단백질을 암호화하는 cDNA를 포함하는 L-아라비노즈(arabinose) 유도성 발현벡터, 전기 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물 및 그 형질전환체로부터 재조합 인간 G-CSF 유도체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 천연형 G-CSF의 133번 아미노산 트레오닌을 발린, 글라이신 또는 글루탐산으로 치환한 G-CSF 유도체들은 천연형과 유사한 정도의 활성을 나타내고, 그 중에서도 G-CSF 발린 유도체는 천연형 G-CSF의 활성을 유지하면서도 비활성형인 이중합체의 생성을 현저히 억제하며, 보다 열에 안정하였다. 따라서, G-CSF 발린 유도체를 의약품으로 개발할 경우, 천연형 G-CSF와 동등한 호중구 결핍증 치료효과를 나타내면서도 비활성형인 이중합체의 생성이 억제되어, 경제적인 호중구 결핍증 치료제로 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 정제 및 보관상의 안정성에 있어 우수할 것이다.

Description

과립구 콜로니 자극인자의 유도체 단백질을 생산하는 재조합 미생물 및 그로부터 전기 재조합 단백질의 제조방법

본 발명은 인간의 과립구 콜로니 자극인자(granulocyte colony stimulating factor : G-CSF)의 유도체 단백질을 발현하는 재조합 미생물 및 그로부터 전기 재조합 단백질의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 과립구 콜로니 자극인자의 유일한 당쇄화(glycosylation) 부위인 133번 트레오닌을 발린, 글라이신 또는 글루탐산 등의 다른 아미노산 잔기로 치환한 유도체 단백질을 암호화하는 cDNA를 포함하는 L-아라비노즈(arabinose) 유도성 발현벡터, 전기 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물 및 그 형질전환체로부터 재조합 인간 과립구 콜로니 자극인자 유도체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

콜로니 자극인자(colony stimulation factor)는 조혈 세포의 증식, 분화 및 활성화에 작용하는 당단백질군으로서 G-CSF, GM-CSF, M-CSF, multi-CSF 등이 있다. 이 중 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF)는 호중구 전구세포의 증식 및 분화를 촉진시켜 호중구의 방출을 증가시키며, 또한 성숙한 호중구를 활성화시켜 탐식작용, 항체의존 세포살해작용, 수퍼옥사이드(superoxide) 생성, 화학주성인자(chemotactic factor)에 대한 반응을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 아울러, G-CSF는 화학항암요법시 부작용으로 나타나는 호중구 결핍증을 개선하는 약물로 개발되어 전세계적인 각광을 받고 있다.

인간의 G-CSF cDNA는 수자 등(L.M. Souza et al., Science, 232:61-65, 1986)에 의하여 방광암 세포주(bladder carcinoma cell line) 5673으로 부터 처음 분리되었으며, 그 후 판상의 암세포주(squamouse carcinoma cell line)와 말초성 혈액 대식세포(peripheral blood macrophage)의 cDNA 라이브러리에서 유전자가 클로닝되었고(참조: S. Nagata et al., EMBO J., 5:575-581, 1986; Y. Komatsu et al., Jpn. J. Cancer Res., 78:1179-1181, 1987), 대장균 또는 동물세포에서 재조합 C-CSF를 대량발현하는 연구도 활발히 진행되었다. 본 발명자들도 이미 인간 유래 G-CSF의 cDNA를 대식세포로 분화된 U937 세포주로부터 클로닝하였고, 이를 재조합 대장균에서 L-아라비노즈 유도성 발현벡터 체계하에서 대량 발현을 성공시킨바 있다(참조: 대한민국 특허출원 제 97-15210호).

그러나, 대장균에서 생산한 천연형 재조합 G-CSF는 단백질이 용액내에서 쉽게 이중합체(dimer)나 다중중합체(oligomer)를 형성하여 활성을 잃고 침전되며, 2개의 이황화 결합과 1개의 자유 시스테인이 존재하여 정제시 재결합(refolding)이 어려운 문제점 등이 보고되어 있다. 상기 재조합 대장균 G-CSF 발현체계를 이용하여 대량 발현된 G-CSF의 단백질을 정제 또는 활성화하는 과정에서 발생하는 용액내 이중합체나 다중중합체의 형성으로 침전되는 비활성형 G-CSF의 발생을 해소할 수 있는 G-CSF가 당업계에서 절실히 요구되었다.

이에, 본 발명자들은 인간유래 G-CSF cDNA에 부위특이적 돌연변이(site directed mutagenesis)를 실시하여 133번 아미노산이 발린, 글라이신 또는 글루탐산 등의 다른 아미노산 잔기로 치환된 G-CSF 유도체의 cDNA를 제조하였다. 이들 유도체 cDNA를 재조합 대장균에서 대량 발현한 결과, 이 유도체들은 천연형 G-CSF와 동등하거나 또는 보다 우수한 활성을 가짐을 확인하였고, 그 중에서도 발린 유도체는 비활성형인 이중합체의 생성을 현저히 억제하며, 열안정성이 크게 향상됨을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 첫 번째 목적은 천연형 G-CSF의 133번 트레오닌을 발린, 글라이신 또는 글루탐산 등의 아미노산 잔기로 치환한 유도체 단백질을 암호화하는 cDNA를 포함하는 L-아라비노즈 유도성 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 두 번째 목적은 전기 발현벡터로 형질전환된 재조합 대장균을 제공하는 것이다.

본 발명의 세 번째 목적은 전기 재조합 대장균으로부터 재조합 G-CSF 유도체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 X-선 결정법에 의해 규명된 천연형 재조합 G-CSF(granulocyte colony stimulating factor)의 3차원 구조를 나타내는 그림이다.

도 2는 G-CSF cDNA 절편을 pBluescript SK(-)에 삽입하여 플라스미드 pBGW2.0를 제조하는 과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.

도 3은 G-CSF의 133번 아미노산 치환체를 제조하기 위한 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오티드 프라이머들의 염기서열 및 그 반응 결과로 제조한 133번 아미노산 치환체들의 염기서열을 나타낸 그림이다.

도 4는 G-CSF의 133번 아미노산 치환체를 제조하기 위한 부위특이적 돌연변이 반응 및 그로부터 완성된 G-CSF 유도체들의 벡터 제조과정을 도식적으로 나타낸 그림이다.

도 5는 도 4에서 완성한 G-CSF 유도체들을 L-아리비노즈 유도성 대장균 발현벡터에 삽입하여 G-CSF 유도체 발현벡터를 제조하는 과정을 도식화한 그림이다.

도 6은 재조합 대장균으로부터 발현된 G-CSF 유도체들의 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 사진이다.

도 7은 재조합 대장균으로부터 부분 정제된 G-CSF 유도체들의 생물학적 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 8은 순수 정제된 재조합 G-CSF 133번 발린 유도체의 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 사진이다.

도 9는 순수 정제된 재조합 G-CSF 133번 발린 유도체와 천연형 G-CSF의 골수세포 증식 촉진 활성을 비교분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 10은 순수 정제된 천연형 재조합 G-CSF와 133번 발린 유도체에서의 이중합체 존재 비율 및 활성화 과정시 생성되는 이중합체의 비율을, SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동한 후 은염색법으로 확인한 결과를 나타내는 사진이다.

도 11은 천연형 재조합 G-CSF와 133번 발린 유도체의 열안전성을 ED₅₀수치로 비교한 그래프이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

G-CSF 단백질의 3차원구조가 X-선 결정법(X-ray crystallography)에 의해 밝혀져 있는데(참조: 도 1), 그에 의하면 4개의 헬릭스(helix)가 서로의 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)에 의해 G-CSF의 구조를 안정화시키며, 헬릭스 A와 헬릭스 B를 연결하는 AB 루프(loop)와 헬릭스 C와 헬릭스 D를 연결하는 CD 루프는 그의 구조에 큰 영향을 주지 않는 것으로 알려져 있다. 또한, 헬릭스 A의 말단 부위가 G-CSF 수용체에 부착하는 부위인 것으로 알려져 있다.

이러한 구조를 근거로 하여 첫 번째로 제조한 G-CSF의 비구조적 유도체(non-structural variant)는 2번 프롤린(proline) 아미노산을 라이신으로 치환한 유도체이다. 이를 대장균에서 발현시킨 결과, 천연형 G-CSF 단백질 보다 높은 발현율을 나타내었다. 또한, 이 유도체는 G-CSF 단백질의 아미노 말단 10개의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환 또는 제거하여도 활성에는 영향을 미치지 않는다는 보고(참조: Okabe et al., Blood, 75:1788-1793, 1990)를 토대로, G-CSF 활성에는 큰 변화가 없을 것으로 예상하였으나, 이와는 달리 이 유도체는 골수세포 증식(bone marrow proliferation) 분석을 통하여 G-CSF 활성을 측정한 결과, ED₅₀값이 약 10배 정도 높은 것으로 나타났다.

또 다른 유도체로 G-CSF의 유일한 당쇄부위인 133번 트레오닌을 라이신, 알기닌, 글루탐산, 아스파르트산, 발린, 글라이신 등의 아미노산으로 각각 치환한 유도체들을 제조하였다. 인체내에서 생산되는 천연형 G-CSF는 133번 트레오닌에 의해 O-연결 당화형태(O-linked glycosylation)를 띠고 있는 반면에, 대장균에서 발현시킨 재조합 G-CSF 단백질은 비당화(non-glycosyated) 형태이나 천연형과 동등한 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다(참조: Morstyn. G & Dexter. M 편저, Filgrastim (r-metHuG-CSF) in Clinical Practice, Marcel Dekker Inc. 1994).

도 1에서 보듯이, 133번 트레오닌 위치는 3차원 구조상 CD 루프의 중앙에 위치하여 돌출되어 있으며, 이곳이 비당화될 경우 G-CSF는 친수성이 떨어져 용액내에서 쉽게 침전을 형성할 것으로 예측되어, 이 문제점을 해결하고자 133번 트레오닌을 전술한 바와 같이 전하를 띄거나 중성 또는 소수성 아미노산으로 치환한 유도체들로 만들었다. 이를 위해 재조합 천연형 G-CSF 대장균 발현벡터인 pGW2(참조: 대한민국 특허출원제 97-15210호)의 G-CSF cDNA를 pBluescript SK(-)에 삽입하여 제조한 플라스미드 pBGW2.0를 주형으로 하여 쿤켈 등(Kunkel, T. A. et al Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82:488-492, 1985)에 의한 부위특이적 돌연변이 유발방법으로 유도체 cDNA를 제조하고, 이를 대장균 L-아라비노즈 발현벡터 ΔpMA(참조: 대한민국 특허출원 제 94-11449호)에 삽입하였다.

전기 발현벡터로 대장균 MC1061을 형질전환시키고, 그를 배양하여 균체를 수득한 다음, 파쇄하여 단백질들의 봉입체(inclusion body)를 분리하여 부분 정제한 후, 재조합 천연형 G-CSF 단백질과 골수세포 증식활성을 비교해 본 결과, 알기닌이나 아스파르트산 치환체는 전혀 활성을 보이지 않은데 비하여, 발린, 글라이신 또는 글루탐산 치환체들은 천연형과 동등하거나 일부 우수한 활성을 나타내었다. 특히, 발현된 단백질의 정제과정에서 발린 치환체는 천연형과 달리 이중합체 등을 형성하지 않아 침전을 형성하지 않을 뿐만 아니라, 열에 대한 안정성이 천연형보다 우수한 것으로 나타났다. 결국, G-CSF 발린 유도체는 천연형의 재조합 G-CSF가 갖는 단점을 상당히 보완하는 것으로, 이중합체의 생성 억제를 통한 생물학적 활성 증대 및 면역반응 유발 감소 등의 우수성이 기대된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: G-CSF 비구조적 유도체 cDNA의 제조

G-CSF의 133번 트레오닌 아미노산 잔기를 변형시킨 비구조적 유도체를 제조하기 위하여, G-CSF 재조합 대장균 발현벡터인 pGW2(참조: 대한민국 특허출원제 97-15210호)로부터 G-CSF cDNA를 포함하는 BamHI-HindIII(0.6kbp) DNA 절편을 얻고, 그를 pBluescript SK(-)(2.95kbp, Statagene, USA)의 BamHI-HindIII 부위에 삽입하여 플라스미드 pBGW2.0을 제조하였다(참조 도 2).

이 pBGW2.0을 대장균 균주 CJ 236(F'cat/dut unglthi-1 relA1 spoT1 mcrA)에 도입하여 얻은 형질전환체의 단일 콜로니를, 유리딘(uridine, 0.25㎍／㎖)을 포함하는 LB 앰피실린 배지(효모추출물 5g, 박토 트립톤 10g, NaC1 5g/L, 앰피실린 50㎍/L)에 접종하고 37℃에서 진탕배양하였다. 그런 다음, 헬퍼파지(helper phage) M13KO7을 첨가하고 약 6시간 배양한 후 원심분리하여, 상층액에 유출된 단일가닥(single strand)의 pBGW2.0 DNA를 함유하는 파지 입자들을 PEG(polyethyleneglycol) 및 NaC1로 침전시켜 회수하였다.

이로부터 추출한 단일 가닥 DNA를 주형으로 하여 부위특이적 돌연변이를 실시하기 위하여, 돌연변이 유발성(mutagenic) 올리고 뉴클레오티드 프라이머(oligonucleotide primer)인 AXY : 5'-CCTGCAGCCC AXY CAGGGTGC T ATGCCGGCC-3'(X=A,T 또는 G; Y=A 또는 T) 또는 GXY : 5'-CCTGCAGCCC GXY CAGGGTGC T ATGCCGGCC-3'(X=A,T 또는 G; Y=A 또는 T)를 어닐링시킨 후, DNA 폴리머라제(polymerase)를 처리하여 이중 가닥 DNA를 형성시켰다. 이때 사용한 올리고 뉴클레오티드들은 133번 아미노산 치환을 위한 염기서열과 함께, 돌연변이체의 용이한 선별을 위하여 야생형에 존재하는 BanⅠ 부위를 소멸시키는 염기서열을 갖고 있다. 이 반응물을 대장균 균주 MC1061[araD139 Δ(ara-leu)7679 Δ(lac)174galU galK hsdR ( ^r K- ^m K+) mcrB1 rpsL(Str ^r )]에 형질전환한 다음, 이를 앰피실린 함유 LB 고체배지에 평판 도말하여 형질전환체의 콜로니를 형성시켰다. 이들 형질전환체들로 부터 플라스미드 DNA를 추출하고 제한효소 BanⅠ을 처리하여 절단되지 않은 클론들을 1차 선별한 다음, DNA 염기서열 분석(Sequenase 2.0, Amersham, USA)을 실시하여, G-CSF 133번 아미노산의 치환 유도체들을 최종 선별하였다(참조: 도 3). 이로부터 133번 트레오닌 아미노산이 각각 라이신(lysine)으로 치환된 pBG133K, 알기닌(arginine)으로 치환된 pBG133R, 발린(valine)으로 치환된 pBG133V, 글라이신(glycine)으로 치환된 pBG133G, 글루탐산(glutamic acid)으로 치환된 pBG133E, 아스파르트산(aspartic acid)으로 치환된 pBG133D 등 G-CSF 유도체 cDNA를 포함하는 벡터들을 완성하였다(참조: 도 4).

실시예 2: G-CSF 유도체 발현벡터의 제조

실시예 1에서 제조한, G-CSF 유도체들의 cDNA를 포함하는 벡터들인 pBG133E, pBG133D, pBG133R, pBG133K, pBG133V, pBG133G 등으로 부터 G-CSF 유도체 cDNA의 NdeⅠ-HindⅢ 절편들을 얻고, 그를 L-아라비노즈 유도성 벡터인 ΔpMA(참조: 대한민국 특허출원 제 94-11449호)의 NdeⅠ-HindⅢ 부위에 삽입하였다. 이로부터 G-CSF의 133번 아미노산 잔기가 글루탐산인 G-CSF 유도체를 발현하는 벡터 pG133E, 133번 아미노산 잔기가 아스파르트산인 G-CSF 유도체를 발현하는 벡터 pG133D, 133번 아미노산 잔기가 알기닌인 G-CSF 유도체를 발현하는 벡터 pG133R, 133번 아미노산 잔기가 라이신인 G-CSF 유도체를 발현하는 벡터 pG133K, 133번 아미노산 잔기가 발린인 G-CSF 유도체를 발현하는 벡터 pG133V, 133번 아미노산 잔기가 글라이신인 G-CSF 유도체를 발현하는 벡터 pG133G 등을 각각 완성하였다(참조: 도 5).

실시예 3: 재조합 G-CSF 유도체의 발현

실시예 2에서 제조한, 133번 트레오닌 아미노산 치환 유도체들의 발현벡터들인 pG133E, pG133D, pG133R, pG133K, pG133V, pG133G 등을 대장균 균주 MC1061에 각각 형질전환한 다음, 이를 앰피실린 함유 LB 고체배지에 평판 도말하여 형질전환체의 콜로니를 형성시켰다. 이들 각각의 형질전환체 콜로니들을 LB배지에 접종하여 37℃에서 진탕배양하고 흡광도 0.5(O.D._600nm)에서 L-아라비노즈를 1% 첨가한 후, 약 20시간 동안 G-CSF 단백질의 발현을 유도하였다.

이들 배양체들을 원심분리하여 수득하고 파쇄하여 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동한 다음, 쿠마시에 브릴리언트 블루 R250으로 염색하여, G-CSF 유도체 단백질들이 천연형 G-CSF와 마찬가지로 높은 발현율로 발현됨을 확인하였다(참조: 도 6). 도 6에서, 제 1레인은 단백질 분자량 표준마커(New England Bio Lab, USA)로서, 말토스결합단백-β-갈락토시다제 175kDa, 단백-β-파라마이오신 83kDa, 글루탐산 탈수소효소 62kDa, 알도라제 47.5kDa, 트리오스포스페이트 이성화효소 32.5kDa, β-락토글로부린 25kDa, 라이소자임 16.5kDa이고; 제 2레인은 pG133D 함유 균체의 파쇄 상층액; 제 3레인은 pG133D 함유 균체의 봉입체; 제 4레인은 pG133G 함유 균체의 파쇄 상층액; 제 5레인은 pG133G 함유 균체의 봉입체; 제 6레인은 pG133V 함유 균체의 파쇄 상층액; 제 7레인은 pG133V 함유 균체의 봉입체; 제 8레인은 pG133E 함유 균체의 파쇄 상층액; 제 9레인은 pG133E 함유 균체의 봉입체; 제 10레인은 pG133R 함유 균체의 파쇄 상층액; 제 11레인은 pG133R 함유 균체의 봉입체; 제 12레인은 pG133K 함유 균체의 파쇄 상층액; 제 13레인은 pG133K 함유 균체의 봉입체를 나타낸다. 도 6에서 보듯이, G-CSF 133번 유도체 단백질들이 봉입체로 발현됨을 확인하였다.

실시예 4: 재조합 G-CSF 유도체들의 부분 정제 및 활성 분석

실시예 3의 각 G-CSF 유도체들의 배양 균체들을 수거하여, 그 균체 중량의 2배에 해당하는 완충용액 A(0.1 mM EDTA 및 25% 수크로스를 함유한 50mM 트리스-HC1(pH 7.8))에 분산시켰다. 여기에 0.2㎎／m1의 농도로 라이소자임을 첨가하고 얼음상에서 90분 동안 반응시킨 다음, 최종농도 20mM MgC1₂와 50㎍/m1의 DNase I을 처리하여 90분 동안 반응시켰다. 그런 다음, 균체중량의 3배에 해당하는 용해용 완충용액(lysis buffer, 0.2M NaC1, 1% 디옥시콜린산(deoxycholic acid), 1.6% Nonidet P-40, 2mM EDTA 및 0.5mM DTT를 함유한 20mM Tris-HC1(pH7.8))을 첨가하고, 15분 동안 교반하면서 균체를 용해시킨 다음, 원심분리하여 봉입체를 수거하고, 0.5% Triton X-100, 1mM EDTA 및 1mM DTT로 구성된 혼합용액으로 3회 세척한 후 원심분리하여 봉입체를 수거하였다.

이 봉입체 침전물을 완충용액 B(8M 구아니딘(guanidine HC1) 및 20μM DTT를 함유한 20mM Tris-HC1(pH 7.8))로 용해시킨 후, 20mM Tris-HC1(pH 8.0) 완충용액에 40:1(부피비)로 희석시키면서 G-CSF를 재결합(refolding)시켰다. 이러한 방법으로 부분정제된 G-CSF 유도체들을 ELISA 키트(Amersham, USA)를 이용하여 정량하였다.

상기에서 정량한 G-CSF 133번 아미노산 치환 유도체들의 활성을 각각 확인하기 위하여, 마우스 골수세포를 이용한 세포증식 분석을 수행하였다. 즉, C57/BL6 마우스를 경부탈구(cervical dislocation)에 의하여 치사시키고 사지를 고정한 다음, 70% 알코올 용액을 대퇴부와 종아리 부위에 잘 뿌려주고, 수술가위로 표피를 제거하였다. 이로부터 대퇴골(femur)과 경골(tibia)을 분리하여 각각 양끝부위를 자른 다음, 1㎖주사기를 이용하여 골수세포를 수획하였다. 이 골수세포 5x10⁴개를 96웰 플레이트에 웰당 100㎕씩 주입하고, 배양액에 순차적으로 희석된 재조합 천연형 G-CSF 및 G-CSF 유도체 용액을 각각 종류별로 100㎕씩 처리하여 최종부피 200㎕로 만든 다음, 3일간 CO₂배양기에서 배양하였다. 이후 [³H-메틸]티미딘(thymidine)을 웰당 0.6μCi 처리하여 24시간 표지(labelling)시키고, β-카운터를 이용하여 cpm을 측정하였다(참조: 도 7).

도 7에서 보듯이, 재조합 천연형 G-CSF와 비교하여 부분정제된 G-CSF 유도체들중 133번 아미노산이 알기닌이나 아스파르트산으로 치환된 유도체들은 전혀 활성을 나타내지 않는데, 이는 G-CSF 단백질 3차원 구조상의 큰 영향을 미치지 않는 것으로 알려진 CD 루프 구조에서 한 아미노산이 치환되어도 활성에 직접적인 영향을 미침을 의미한다. 한편, 글루탐산이나 글라이신으로 치환된 유도체들은 천연형과 유사한 활성을 나타내었으며, 발린으로 치환된 유도체는 천연형 G-CSF에 비하여 동등하거나 다소 증가된 활성을 보였다. 상기 G-CSF 유도체들중 133번 아미노산이 발린으로 치환된 유도체 단백질은 정제 과정중에 재조합 천연형 G-CSF 단백질(133번 트레오닌)에 비하여 침전현상을 일으키지 않음을 확인하여(참조: 실시예 6), 이를 순수 정제하였다.

상기의 발현벡터 pG133V로 형질전환된 대장균 MC1061은 MC1061:pG133V로 명명되어, 국제기탁기관인 사단법인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터(KCCM)에 1997년 11월 7일자로 기탁번호 KFCC-11000로 기탁되었다.

실시예 5: G-CSF 133번 발린 치환 유도체의 순수 정제

상기 부분 정제된 G-CSF 유도체들의 활성분석을 통해 선별된 G-CSF 133번 발린 유도체와 천연형 재조합 G-CSF를 발현하는 대장균 균주를 각각 대량 배양하여, 실시예 4의 활성 분석시와 동일한 방법으로 봉입체를 회수하였다. 추출된 봉입체를, 8M 우레아, 10mM EDTA 및 50mM 2-머캅토에탄올을 포함한 20mM 인산염 용액(pH 7.5) 완충용액에 8시간 용해시켰다. 용해된 봉입체를 15배 부피의 20mM 인산염 용액(pH 7.8, 5mM EDTA 함유)에 희석시킨 후, 48시간 동안 4℃에서 교반시켜 활성화(refolding)하였다. 활성화된 G-CSF를 HC1로 pH를 산성으로 조절한 후, 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액을 SP-Sepharose FF 칼럼에 주입하고, pH를 조절하여 SP-Sepharose로부터 천연형과 발린 유도체의 G-CSF를 용출시켰다. 이렇게 정제된 천연형 G-CSF와 발린 유도체 G-CSF의 순수도를 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 비교하였는데, 도 8은 G-CSF 133번 발린 유도체의 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 결과를 나타내는 사진이다. 도 8에서, 제 1레인은 단백질 분자량 표준마커(Novex Wide range MarkerMarker12^TM, USA)로 마이오신 200kDa, 대장균 β-갈락토시다제 116.3kDa, 토끼 근육 포스포릴라제 b 97.4kDa, 소 혈청 알부민 66.3kDa, 소 간 글루탐산 탈수소효소 55.4kDa, 젖산 탈수소효소 36.5kDa, 카보닉 안하이드라제 31kDa, 트립신 억제제 21.5kDa, 달걀 라이소자임 14.4kDa, 아프로티닌 6kDa이며; 제 2레인은 순수 정제된 G-CSF 133번 발린 유도체 단백질이다. 도 8에서 보듯이, G-CSF 133번 발린 유도체 단백질은 단일밴드로 나타나, 순수 정제되었음을 알 수 있었다.

일반적으로, G-CSF는 소수성이 강한 단백질로서 이중합체(dimer)나 다중합체(polymer)로 결합되는 성질이 매우 강하다. 이러한 중합체의 생성은 생물학적 활성을 크게 감소시키는 것으로 이미 확인되었으며, 특히 133번 Thr이 당화되지 않은 재조합 G-CSF의 경우 더욱 현저한 현상이다(참조: J. Bio1. Chem., 265(20):11432-11435). 후술하는 도 10은 위와 동일한 방법으로 정제한 천연형 및 G-CSF 발린 유도체의 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 사진으로서, 제 1 및 3레인에서 보듯이, G-CSF 발린 유도체는 천연형의 재조합 G-CSF에 비해 이중합체의 생성 비율이 현저히 낮았다. G-CSF의 이러한 특성을 고려해 볼 때, G-CSF 발린 유도체는 천연형의 재조합 G-CSF가 갖는 단점을 상당히 보안하는 것으로, 이중합체의 생성 억제를 통한 생물학적 활성 증대 및 면역반응 유발 감소 등의 우수성이 기대된다.

도 9는 순수 정제된 재조합 G-CSF 133번 발린 유도체와 천연형 G-CSF 및 기존의 상품화되어 있는 G-CSF 제품(그라신, Amgen, USA)간의 활성을 비교분석하기 위해 골수세포를 이용한 세포증식 분석을 실시한 결과이다. 도 9에서, (□)는 암젠사의 제품 그라신, (○)는 천연형 G-CSF, (■)는 G-CSF 133번 발린 유도체를 각각 나타낸다. 도 9에서 보듯이, 이들 3가지 G-CSF 모두는 거의 동등한 세포증식 활성을 나타내었다.

실시예 6: 활성화시 이중합체 생성 비율의 비교

실시예 5의 방법으로 천연형과 G-CSF 발린 유도체를 각각 정제한 후, 8M 우레아, 10mM EDTA 및 50mM 2-머캅토에탄올을 포함한 20mM 인산염 용액(pH 7.5)에 2mg/ml의 농도로 가하고 3시간 교반시켰다. 용해된 용액을 7배 부피의 20mM 인산염 용액(pH 7.5, 5mM EDTA 함유)에 희석하고 18시간 동안 냉실에서 교반시켜 활성화하였다. 이렇게 활성화된 천연형 및 G-CSF 발린 유도체로부터 일정량을 채취하여 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동하고, 이중합체의 생성정도를 비교하였다(참조: 도 10). 도 10에서, 제 1레인은 정제된 천연형 재조합 G-CSF, 제 2레인은 활성화된 천연형 재조합 G-CSF, 제 3레인은 정제된 재조합 G-CSF 발린 유도체, 제 4레인은 활성화된 재조합 G-CSF 발린 유도체, 제 5레인은 표준 분자량 마커를 나타낸다. 도 10의 제 2 및 4레인에서 보듯이, 활성화된 천연형 및 발린 유도체 모두에서 이중합체의 생성이 확인되었으나, 발린 유도체에 있어서 그 비율이 훨씬 낮았다. 아울러, 실시예 5와 동일한 정제 공정에 의해 정제할 때, 발린 유도체에 있어서는 이중합체가 완전히 제거되었으나, 천연형 재조합 G-CSF에 있어서는 이중합체의 제거가 완전히 이루어지지 못함을 추가로 확인하였다. G-CSF 발린 유도체는 이황화결합이나 자유 설프하이드릴기(SH)를 갖는 재조합 단백질의 활성화과정에서 생성되는 이중합체의 생성을 현저하게 억제함으로써, 정제공정시 이중합체를 제거하기 위해 추가적으로 소요되는 시간 및 경비를 줄일 수 있게 하였다.

실시예 7: 천연형 재조합 G-CSF와 발린 유도체의 열안정성 비교

실시예 5의 방법으로 정제된 천연형과 발린 유도체의 G-CSF 1ml을, 20mM 인산염 용액(pH 7.4)으로 평형화된 Sephadex G-25(PD10, Pharmacia, Sweden) 컬럼에 통과시켜 완충용액을 교환한 후, 최종 20㎍/ml 되게 20mM 인산염 용액(pH 7.4)에 희석하였다. 희석한 두종류의 시료 100μl씩을 폴리프로필렌 튜브에 분주한 후, 56℃에서 10분, 20분간 가열하고 일정량을 취하여 NSF60 세포를 이용하여 열처리한 후 잔존하는 G-CSF의 생물학적 활성을 측정하였다. 생물학적 활성 측정에 사용한 NFS60 세포는 WEHI 3 세포를 RPMI 배지(10% FBS)에서 배양하여 만든 배지(conditioned media)가 10%(v/v) 첨가된 RPMI 배지(10% FBS)에서 계대배양 중인 것을 사용하였다. 활성 측정할 시료를 10% FBS가 첨가된 RPMI 배지에 3 μg/ml 부터 2배 연속 희석하여 96웰 플레이트에 100μl씩 분주하였다. 계대 배양중인 NFS60 세포를 RPMI 배지에 3회 세척하여 잔존해있는 WEHI3 세포를 완전히 제거한 후, 10% FBS가 첨가된 RPMI 배지 50μl 부피에 세포를 분산시켜, 활성 측정을 하기 위해 희석해 놓은 웰에 첨가하여 최종 0.5∼1 X 10⁶세포/ml 되게 하여 48시간 배양하였다. 열처리한 천연형과 발린 유도체의 G-CSF에 의한 NFS60 세포증식은 미국 Promega사의 96세포 타이터 키트(96Cell titer kit)를 이용하여 측정하였다. 즉, MTS 시약과 PMS 시약을 10:1로 혼합하여 각 웰당 20μl씩 첨가하여 2 내지 4시간 배양한 후, 630nm를 기준 파장(reference)으로 하여 490nm에서의 흡광도를 측정하였다. 잔존해있는 G-CSF의 활성이 높을수록 NFS 60 세포증식을 더 많이 촉진시켰으며 490nm 흡광도도 높았다. G-CSF 활성은 단백질 농도와 흡광도를 플롯(plot)한 후 최고 활성의 50%를 나타내는 단백질량인 ED₅₀을 구하여 나타내었다(참조: 도 11). 도 11에서 보듯이, 열처리 전 천연형과 발린 유도체 G-CSF의 ED₅₀은 거의 동일한 활성을 가지나, 56℃ 열처리 후 10분과 20분이 지난 후의 천연형 G-CSF의 ED₅₀값과 발린 유도체 G-CSF의 ED₅₀값의 차이가 각각 17.3pg에서 27.6pg으로 점차 커지는 현상을 관찰하였다. 이는 발린 유도체가 가열후 시간이 지남에 따라 천연형에 비해 더 안정하다는 것을 보여주는 것으로, 정제공정 또는 보관 중에 발생할 수 있는 활성 상실에 발린 유도체가 더 안정할 수 있다는 것을 입증한다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 천연형 G-CSF의 133번 아미노산 트레오닌을 발린, 글라이신 또는 글루탐산으로 치환한 G-CSF 유도체들은 천연형과 유사한 정도의 활성을 나타내고, 그 중에서도 G-CSF 발린 유도체는 천연형 G-CSF의 활성을 유지하면서도 비활성형인 이중합체의 생성을 억제하며, 보다 열에 안정하였다. 따라서, G-CSF 발린 유도체를 의약품으로 개발할 경우, 천연형 G-CSF와 동등한 호중구 결핍증 치료효과를 나타내면서도 비활성형 단백질의 생성이 억제되어 경제적인 호중구 결핍증 치료제의 생산에 이용할 수 있을 뿐만 아니라, 정제 및 보관상의 안정성에 있어 우수할 것이다.

Claims

인간 과립구 콜로니 자극인자(granulocyte colony stimulating factor)의 133번 트레오닌이 다른 아미노산으로 치환된 단백질을 암호화하는 cDNA를 포함하는 L-아라비노즈 유도성 발현벡터.
제 1항에 있어서,

다른 아미노산은 발린, 글라이신 및 글루탐산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는

발현벡터.
제 2항에 있어서,

아미노산의 치환은 하기의 같은 염기서열의 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의한 부위특이적 돌연변이에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는

발현벡터:

5'-CCTGCAGCCC GXY CAGGGTGC T ATGCCGGCC-3'

(이때, X=A,T 또는 G; Y=A 또는 T)
인간 과립구 콜로니 자극인자(granulocyte colony stimulating factor)의 133번 트레오닌이 발린으로 치환된 단백질을 암호화하는 cDNA를 포함하는 L-아라비노즈 유도성 발현벡터 pG133V.
제 4항의 발현벡터 pG133V를 대장균 MC1061에 도입시켜 제조한 형질전환 체 MC1061:pG133V(KFCC-11000).
제 1항의 발현벡터로 형질전환된 재조합 대장균 MC1061을 배양하고 L-아라비노즈로 단백질의 발현을 유도한 다음, 균체를 파쇄하여 봉입체를 수득하고, 그로부터 133번 아미노산이 치환된 과립구 콜로니 자극인자의 유도체를 정제하는 공정을 포함하는, 전기 재조합 유도체 단백질의 제조방법.
제 6항에 있어서,

재조합 대장균은 MC1061:pG133V(KFCC-11000)인 것을 특징으로 하는 유도체 단백질의 제조방법.