ES2198879T3 - Metodo para replegar angiostatina. - Google Patents
Metodo para replegar angiostatina.Info
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Abstract
Un método para producir angiostatina que comprende las etapas de: (a) cultivar células hospedadoras que expresan un gen de angiostatina; (b) recuperar el producto de dicha expresión génica; (c) replegar dicho producto génico a un pH elevado de 9 a 11, 5; y (d) aislar las formas plegadas apropiadamente de dicho producto génico.
Description
Método para replegar angiostatina.
Se describe un método eficaz para purificar y
replegar angiostatina en cuerpos de inclusión expresados en
bacterias. También se describen ácido nucleicos que codifican la
angiostatina de longitud completa y subfragmentos que codifican
dominios kringle K1-4, K2-3,
K2-4, K1-3 y K1.
La angiogénesis, el desarrollo de nuevos vasos
sanguíneos, juega un papel importante en el crecimiento del cáncer
y en la metástasis. Se ha demostrado que, en los seres humanos, el
grado de vasculatura de un tumor está correlacionado con el
pronóstico del paciente para una diversidad de cánceres (Folkman
, J. Seminars in Medicine of the Beth Israel Hospital, Boston
333(26); 1757-1763, 1995; Casparini. G.,
European Journal of Cancer 32A(14):
2485-2493. 1996; Pluda. J. M., Seminars in
Oncology 24(2): 203-218, 1997). En
adultos normales, la angiogénesis está limitada a situaciones bien
controladas, tales como la curación de heridas y el sistema
reproductor femenino (Battegay, E J., J Mol Med
73:-333-346, 1995; Dvorak, H.F., New Engl
J Med. 315: 1650-1659, 1986).
Ciertos estudios animales sugieren que pueden
existir tumores en un estado latente, en el que el crecimiento del
tumor se limita por un equilibrio entre altas velocidades de
proliferación y altas velocidades de apoptosis (Holmgren, L. et
al., Nat. Med. (N.Y.) 1(2): 149-153,
1995; Hanahan, D. et al., Cell 86(3):
353-364, 1996). El cambio a un fenotipo angiogénico
permite que las células tumorales salgan de la latencia y se
desarrollen rápidamente, presumiblemente como resultado de una
reducción de la velocidad apoptótica de las células tumorales
(Bouck, Cancer Cells. 2(6): 179-185,
1990; Dameron et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol.
59: 483-489, 1994). Se cree que el control de
la angiogénesis es un equilibrio entre factores que promueven la
formación de nuevos vasos y factores
anti-angiogénicos que reprimen la formación de una
neovasculatura (Bouck, N. et al., Advances in Cancer
Research 69: 135-173. 1996:
O'Reilly et al., Cell (Cambridge, Mass) 79(2):
315-328, 1994).
Se ha caracterizado una diversidad de factores
pro-angiogénicos, incluyendo los factores de
crecimiento de fibroblastos básicos y ácidos (bFGF y aFGF) y el
factor de permeabilidad vascular/factor de crecimiento del
endotelio vascular (VPF/VEGF) (Potgens, A. J. et al., Biol.
Chem. Hoppe-Seyler 376:
57-70, 1995; Ferrara, N., European Journal of
Cancer 32A(14): 2413:2442; 1996; Bikfalvi, A. et al.,
Endocrine Reviews 18: 26-45, 1997).
También se han caracterizado varios factores anti- angiogénicos
endógenos, incluyendo la angiostatina (O'Reilly et al., Cell
79(2): 315-328, 1994), endostatina
(O'Reilly et al., Cell 88(2):
277-285, 1997), interferón-alfa
(Ezekowitz et al., N. Engl. J. Med., 28 de mayo,
326(22) 1456-1463, 1992), trombospondina
(Good et al., Proc Natl Acad Sci, Estados Unidos
87(17): 6624-6628, 1990; Tolsma et al.,
J. Cell Biol 122(2): 497-511, 1993) y
factor 4 de plaquetas (PF4) (Maione et al., Science
247:(4938): 77-79, 1990).
La angiostatina es una proteína de 38 kD que
comprende los tres o cuatro primeros dominios kringle del
plasminógeno y se describió por primera vez en 1994 (O'Reilly, M.S.
et al., Cell 79(2): 315-328, 1994).
Los ratones que tenían tumores primarios (carcinoma de pulmón de
Lewis poco metastático) no respondieron a estímulos angiogénicos
tales como bFGF en un ensayo de microbolsa de córnea, y el
crecimiento de tumores metastáticos en estos ratones se suprimió
hasta que se escindió el tumor primario. El factor responsable de
la inhibición de la angiogénesis y del crecimiento de tumores se
denominó angiostatina de ratón. También se demostró que la
angiostatina inhibía el crecimiento de células endoteliales in
vitro.
La angiostatina humana puede prepararse por
digestión de plasminógeno por la elastasa porcina (O'Reilly et
al., Cell 79(2): 315-328, 1994) o con
metaloelastasa humana (Dong et al., Cell 88,
801-810, 1997). La angiostatina producida a través
de la digestión con elastasa porcina inhibió el crecimiento de
metástasis y tumores primarios en ratones. O'Reilly et al.,
(Cell 79(2): 315-328, 1994)
demostraron que la angiostatina humana inhibía la metástasis del
carcinoma de pulmón de Lewis en ratones SCID. El mismo grupo
(O'Reilly, M. S. et al., Nat. Med. (N.Y.) 2(6):
689-692, 1996) posteriormente demostró que la
angiostatina humana inhibía el crecimiento de los siguientes tumores
humanos: carcinoma de próstata PC3, carcinoma de colon del clon A
y carcinoma de mama MDA-MB en ratones SCID. La
angiostatina humana también inhibía el crecimiento de los
siguientes tumores de ratón: carcinoma de pulmón de Lewis,
fibrosarcoma T241 y carcinoma de células de retículo M5076 en
ratones C57B1. La composición precisa de las moléculas no se
conoce porque estas angiostatinas preparadas enzimáticamente no se
han caracterizado bien bioquímicamente.
Pueden prepararse angiostatinas de composición
conocida por medio de la tecnología de ADN recombinante y de la
expresión en sistemas celulares heterólogos. Se ha producido una
angiostatina humana recombinante que comprende los dominios
Kringle uno a cuatro (K1-4) en la levadura
Pichia pastoris (Sim et al., Cancer Res 57:
1329-1334, 1997). La proteína humana recombinante
inhibía el crecimiento de células endoteliales in vitro e
inhibía la metástasis del carcinoma de pulmón de Lewis en ratones
C57B1. Se ha producido una angiostatina murina recombinante
(K1-4) en células de insecto (Wu et al., Biochem
Biophys Res Comm 236: 651-654, 1997). La
proteína de ratón recombinante inhibía el crecimiento de células
endoteliales in vitro y el crecimiento del carcinoma de
pulmón de Lewis primario in vivo. Estos experimentos
demostraron que los cuatro primeros dominios kringle son suficientes
para conseguir la actividad de la angiostatina, pero no
determinaron los dominios kringle que se necesitan.
Cao et al., (J. Biol. Chem. 271:
29461-29467, 1996) produjeron fragmentos de
plasminógeno humano por proteólisis y por expresión de proteínas
recombinantes en E. coli. Estos autores demostraron que el
kringle uno y, en una menor medida, los kringles dos y tres del
plasminógeno eran responsables de la inhibición del crecimiento
de células endoteliales in vitro. Específicamente, los
kringles 1-4 y 1-3 se inhibían a
concentraciones similares, mientras que el K1 solo inhibía el
crecimiento de células endoteliales a concentraciones cuatro
veces superiores. Los kringles dos y tres inhibían en una menor
medida. La solubilización y el replegamiento de la proteína se
realizó a pH 8 en presencia de DTT y glutatión reducido/oxidado.
De acuerdo con la invención, se usa un pH superior para solubilizar
y replegar la proteína. Más recientemente, Cao et al., (J. Biol
Chem 272: 22924-22928, 1997) demostraron
que el kringle cinco recombinante humano o de ratón inhibía el
crecimiento de células endoteliales a menores concentraciones que
la angiostatina (K1-4). Estos experimentos
demostraron una actividad semejante a la de la angiostatina in
vitro, pero no trataron la acción in vivo contra tumores
y sus metástasis.
Las solicitudes de patente mundiales WO 95/29242
A1, WO 96/41194 A1, WO 96/35774 A2 y WO 98/54217 A1 describen la
expresión, purificación y caracterización de angiostatina. El
documento WO 95/29242 A1 951102 describe la purificación de una
proteína a partir de sangre y de orina por HPLC, que inhibe la
proliferación de células endoteliales. La proteína tiene un peso
molecular comprendido entre 38 kilodaltons y 45 kilodaltons y una
secuencia de aminoácidos substancialmente similar a la de un
fragmento de plasminógeno murino que comienza en el aminoácido
número 79 de una molécula de plasminógeno murino. El documento WO
96/41194 A1 961219 describe compuestos y métodos para el
diagnóstico y el control de enfermedades dependientes de
angiogénesis. El documento WO 96/35774 A2 961114 describe la
estructura de fragmentos proteicos, que generalmente corresponden a
estructuras kringle que existen dentro de la angiostatina. También
describe formas agregadas de angiostatina, que tienen actividad
inhibidora de células endoteliales, y proporciona un medio para
inhibir la angiogénesis de tumores y para tratar enfermedades
mediadas por angiogénesis. El documento WO 98/54217 A1 describe
fragmentos de angiostatina que tienen actividad inhibidora de las
células endoteliales.
La terapia anti-angiogénica puede
ofrecer varias ventajas con respecto a la quimioterapia
convencional para el tratamiento del cáncer. Los agentes
anti-angiogénicos tienen baja toxicidad en ensayos
preclínicos y no se ha observado desarrollo de resistencia a estos
fármacos (Folkman, J., Seminars in Medicine of the Beth Israel
Hospital, Boston 333(26): 1757- 1763, 1995). Como la
angiogénesis es un proceso complejo que consta de muchas etapas que
incluyen la invasión, proliferación y migración de células
endoteliales, puede preverse que las terapias de combinación serán
las más eficaces. De hecho, ciertas combinaciones de
quimioterapia con una terapia anti-angiogénica ya
han mostrado resultados prometedores en modelos preclínicos
(Teicher, B. A. et al., Breast Cancer Research and Treatment
36: 227-236, 1995; Teicher, B. A. et al.,
European Journal of Cancer 32A(14):
2461-2466, 1996).
Aunque se han desarrollado muchos tipos de
sistemas de expresión durante los últimos veinte años, los
sistemas bacterianos, particularmente los basados en E. coli,
se usan ampliamente para la producción de proteínas a escala
industrial. Los vectores que permiten un alto nivel de expresión y
la capacidad de realizar fermentaciones a altas densidades
celulares y a bajo coste han contribuido al extenso desarrollo y
uso de sistemas de expresión basados en E. coli. Sin
embargo, un problema significativo es la tendencia de E.
coli a formar cuerpos de inclusión que contienen la proteína
recombinante deseada. La formación de cuerpos de inclusión
necesita un procesamiento posterior adicional, tal como un
replegamiento in vitro, antes de poder recuperar las
proteínas biológicamente activas. La tendencia a formar agregados
insolubles no parece estar correlacionada con factores tales como
el tamaño, la hidrofobia, la estructura de las subunidades o el
uso de dominios de fusión (Kane J.F. y Harley, D.L.,
Tibtech, 6: 95, 1988). La formación de cuerpos de
inclusión también parece determinarse por las velocidades de
síntesis de proteínas, plegamiento, agregación y degradación
proteolítica, la solubilidad y termodinámica de los intermedios de
plegamiento y las proteínas nativas, y las interacciones de esas
especies con proteínas chaperonas (Rainer Rudolph, en Protein
Engineering; Principles and Practice, Editado por Jeffrey L.
Cleland y Charles S. Craik, páginas 283-298,
Wiley-Liss, Inc., Nueva York, Nueva York, 1996).
Los cuerpos de inclusión generalmente se forman
en el citoplasma de células que expresan una proteína recombinante
a altos niveles. Refractan la luz cuando se observan por
microscopía de contraste de fase y, de esta manera, algunas veces
se denominan cuerpos refractarios. Los cuerpos de inclusión se
caracterizan por una densidad específica relativamente alta y pueden
sedimentarse a partir de las células lisadas por centrifugación.
La formación de cuerpos de inclusión puede proteger las proteínas
recombinantes de la proteolisis, ya que no se desintegran
fácilmente en condiciones de disolventes fisiológicos. Para
solubilizar las proteínas presentes en los cuerpos de inclusión, se
han usado comúnmente altas concentraciones de desnaturalizantes,
tales como clorhidrato de guanidina 6 M o urea 6-8
M. Se han comparado varios protocolos de solubilización de cuerpos
de inclusión (Fisher, B., Summer, L. y Goodenough, P.
Biotechnol. Bioeng. 1: 3-13, 1992).
Aunque el producto génico extraño deseado es el
componente principal de los cuerpos de inclusión, tales
preparaciones también pueden estar enriquecidas en otras proteínas
de la célula hospedadora tales como proteínas de choque térmico
pequeñas, proteínas de la membrana externa, factor de elongación
EF-Tu y la ARN polimerasa (Allen, S.P., Polazzi,
J.O. Gierse, J.K., y Easton, A.M., J. Bacteriol. 174:
6938-6947, 1992); Hart, R.A., Rinas, U., y Bailey,
J.E., J. Biol. Chem 265: 12728-12733,
1990; (Hartley, D.L., y Kane, J.F., Biochem. Soc. Trans.
16:101, 1988).
Todos los estudios detallados del replegamiento
de dominios kringle derivados de plasminógeno aislados a partir de
cuerpos de inclusión bacterianos sugieren que el replegamiento
óptimo se produce a un pH de 8,0 (Trexler, M., y Patty, L.,
Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2457-2461,
1983; Menhart N., et al., Biochemistry 30:
1948-1957, 1991; Marti, D., et al., Eur. J.
Biochem., 219: 455-462, 1994; Cao Y., et
al., J. Biol. Chem. 271: 29461-29467,
1996). En estos estudios, los cuerpos de inclusión generalmente se
disuelven en altas concentraciones de un desnaturalizante (tal como
urea o clorhidrato de guanidina) en presencia de un agente
reductor (tal como ditiotreitol o
beta-mercaptoetanol). En cada una de estas
referencias, el desnaturalizante se diluye rápidamente o lentamente
para iniciar el replegamiento.
La solicitud de patente mundial WO 96/35.774 de
Folkman et al., presentada el 26 de abril de 1996, describe
proteínas derivadas de plasminógeno humano que son capaces de
inhibir la proliferación de células endoteliales. También se
describen métodos para la preparación de formas agregadas de estas
proteínas.
Un objeto de la invención es describir un método
para expresar altos niveles de angiostatina y otros kringles de
plasminógeno en bacterias.
Otro aspecto de la invención es describir un
método eficaz por medio del cual puedan solubilizarse cuerpos de
inclusión de angiostatina, y posteriormente replegarse y purificarse
para generar un material biológicamente activo.
Las etapas de solubilización y replegamiento de
cuerpos de inclusión de angiostatina se realizan a un pH elevado,
que varía de pH 9 a pH 11,5. Preferiblemente, el intervalo de pH es
de pH 10 a pH 11. Incluso más preferiblemente, el pH es 10,5.
Preferiblemente, la concentración de producto
génico de angiostatina está presente a una concentración de
aproximadamente 1 a 20 mg/ml durante la etapa de solubilización.
Incluso más preferiblemente, la concentración es de aproximadamente
6 mg/ml.
Preferiblemente, la concentración de producto
génico de angiostatina está presente a una concentración de
aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5 mg/ml durante la etapa de
replegamiento. Incluso más preferiblemente, la concentración es de
aproximadamente 1 mg/ml.
Preferiblemente, durante las etapas de
solubilización y replegamiento se usa un desnaturalizante
seleccionado entre urea y clorhidrato de guanidina. Incluso más
preferiblemente, el desnaturalizante es urea.
Preferiblemente, la concentración de urea es de
aproximadamente 4 M a aproximadamente 10 M durante la etapa de
solubilización. Incluso más preferiblemente, la concentración es de
aproximadamente 6 M.
Preferiblemente, la concentración de urea es de
aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 3 M durante la etapa de
replegamiento. Incluso más preferiblemente, la concentración es
aproximadamente 1 M.
Preferiblemente, la concentración de clorhidrato
de guanidina es de aproximadamente 3 M a
aproximadamente
\break8 M durante la etapa de solubilización. Incluso más preferiblemente, la concentración es de aproximadamente 5 M.
Preferiblemente, la concentración de clorhidrato
de guanidina es de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 2 M
durante la etapa de replegamiento. Incluso más preferiblemente, la
concentración es de aproximadamente 0,5 M.
Preferiblemente, las etapas de solubilización y
reducción se realizan en presencia de un agente reductor capaz de
reducir enlaces disulfuro a grupos sulfhidrilo. Preferiblemente, el
agente reductor se selecciona entre el grupo compuesto por DTT,
BME, cisteína y glutatión reducido. Incluso más preferiblemente,
el agente reductor es DTT.
Preferiblemente, el DTT está presente a una
concentración de aproximadamente 2 mM a aproximadamente 10 mM
durante la etapa de solubilización. Incluso más preferiblemente, la
concentración es de aproximadamente 6 mM.
Preferiblemente, el DTT está presente a una
concentración de aproximadamente 0,5 mM a
aproximadamente
\break2 mM durante la etapa de replegamiento. Incluso más preferiblemente, la concentración es de aproximadamente
\break1 mM.
Preferiblemente, el glutatión reducido está
presente a una concentración de aproximadamente 5 mM a
aproximadamente 20 mM durante la etapa de solubilización. Incluso
más preferiblemente, la concentración es de aproximadamente 10
mM.
Preferiblemente, el glutatión reducido está
presente a una concentración de aproximadamente 1 mM a
aproximadamente 4 mM durante la etapa de replegamiento. Incluso más
preferiblemente, la concentración es de aproximadamente 2 mM.
Preferiblemente, la cisteína está presente a una
concentración de aproximadamente 5 mM a
aproximadamente
\break20 mM durante la etapa de solubilización. Incluso más preferiblemente, la concentración es de aproximadamente
\break10 mM.
Preferiblemente, la cisteína está presente a una
concentración de aproximadamente 1 mM a
aproximadamente
\break4 mM durante la etapa de replegamiento. Incluso más preferiblemente, la concentración es de aproximadamente
\break2 mM.
Preferiblemente, durante la etapa de
replegamiento está presente un agente capaz de potenciar el
intercambio de enlaces disulfuro. Preferiblemente, el agente se
selecciona entre cistina y glutatión oxidado. Incluso más
preferiblemente, el agente es cistina.
Preferiblemente, la cistina está presente a una
concentración de aproximadamente 0,2 mM a
aproximadamente
\break5 mM durante la etapa de replegamiento. Incluso más preferiblemente, la concentración es de aproximadamente
\break1 mM.
Preferiblemente, la etapa de replegamiento se
realiza en presencia de un ligando capaz de unir dominios de unión
de angiostatina y plasminógeno. Preferiblemente, el ligando se
selecciona entre el grupo compuesto por ácido
6-amino hexanoico, ácido 7-amino
heptanoico, ácido 5-amino pentanoico y ácido
4-amino butírico. Incluso más preferiblemente, el
ligando es ácido 6-amino hexanoico.
Preferiblemente, se forman enlaces disulfuro por
medio de la oxidación con aire durante la etapa de replegamiento.
Preferiblemente, la etapa de oxidación con aire se realiza durante
un período de aproximadamente 12 a aproximadamente 96 horas.
Incluso más preferiblemente, la etapa de oxidación con aire se
realiza durante un período de aproximadamente 24 a aproximadamente
72 horas. Más preferiblemente, la etapa de oxidación con aire se
realiza durante aproximadamente 60 horas.
Preferiblemente, la angiostatina replegada se
purifica adicionalmente por un proceso seleccionado entre el grupo
compuesto por cromatografía de lisina-sepharose,
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción
hidrófoba y RP-HPLC.
Preferiblemente, el método de expresión,
solubilización, replegamiento y purificación usa dominios kringle
derivados de plasminógeno o genes de angiostatina que son humanos.
Incluso más preferiblemente, estos genes se seleccionan entre el
grupo compuesto por la SEC ID Nº: 10 a la SEC ID Nº: 29.
Preferiblemente, el método de expresión,
solubilización, replegamiento y purificación usa los productos de
dominios kringle derivados de plasminógeno o genes de angiostatina
que son humanos. Incluso más preferiblemente, los productos de
estos genes se codifican por una secuencia seleccionada entre el
grupo compuesto por la SEC ID Nº: 10 a la SEC ID Nº: 29.
Las proteínas obtenidas son una secuencia de
aminoácidos de angiostatina humana modificada, y dicha proteína
puede estar inmediatamente precedida por (metionina^{-3}),
(alanina^{-1}), (metionina^{-2}, alanina^{-1}),
(serina^{-1}), (metionina^{-2}, serina^{-1}),
(cisteína^{-1}) o (metionina^{-2}, cisteína^{-1}).
Preferiblemente, estas proteínas se seleccionan
entre el grupo compuesto por angiostatina K1, angiostatina K5,
angiostatina K1-K3, angiostatina
K1-K4 o angiostatina K1-K5.
Además, la presente invención se refiere a
vectores de expresión recombinantes que comprenden secuencias de
nucleótidos que codifican la angiostatina, variantes y muteínas de
angiostatina, sistemas de expresión eucariotas y microbianos
relacionados, y procesos para la fabricación (que comprenden las
etapas de expresión, solubilización, replegamiento y purificación)
de estas proteínas.
La clonación de secuencias de ADN que codifican
estas proteínas puede realizarse por medio del uso de vectores
intermedios. Como alternativa, un gen puede clonarse directamente
en un vector que contiene el otro gen. Pueden usarse engarces y
adaptadores para unir las secuencias de ADN, así como para
reemplazar las secuencias perdidas, en los que haya un sitio de
restricción interno en la región de interés. De esta manera, el
material genético (ADN) que codifica un polipéptido, el engarce
peptídico y el otro polipéptido se insertan en un vector de
expresión adecuado que se usa para transformar bacterias,
levaduras, células de insectos o células de mamíferos. El organismo
o línea celular transformada se cultiva y la proteína se aísla
por técnicas convencionales. Por lo tanto, el producto resultante es
una nueva proteína que tiene todo o una porción de una proteína
unida por medio de una región de engarce a todo o a una porción de
una segunda proteína.
Otro aspecto de la presente invención incluye
vectores de ADN plasmídico para uso en la expresión de estas
proteínas. Estos vectores contienen las nuevas secuencias de ADN
descritas anteriormente que codifican para los nuevos polipéptidos
de la invención. Los vectores apropiados que pueden transformar
microorganismos o líneas celulares capaces de expresar las proteínas
incluyen vectores de expresión que comprenden secuencias de
nucleótidos que codifican para las proteínas unidas a secuencias
reguladoras de la transcripción y de la traducción que se
seleccionan de acuerdo con las células hospedadoras usadas.
En la presente invención se incluyen vectores que
incorporan secuencias modificadas como se ha descrito
anteriormente y son útiles en la producción de las proteínas. El
vector empleado en el método también contiene secuencias
reguladoras seleccionadas en asociación operativa con las
secuencias de ADN codificantes de la invención y que son capaces
de dirigir su replicación y su expresión en células hospedadoras
seleccionadas.
Otro aspecto de la presente invención son métodos
para producir estas proteínas. El método de la presente invención
implica cultivar células o líneas celulares adecuadas, que se han
transformado con un vector que contiene una secuencia de ADN que
codifica para la expresión de una nueva proteína multifuncional.
Las células o líneas celulares adecuadas pueden ser células
bacterianas. Por ejemplo, en el campo de la biotecnología son bien
conocidas las diversas cepas de E. coli como células
hospedadoras. Los ejemplos de tales cepas incluyen las cepas de
E. coli JM101 (Yanisch-Perron et al.,
Gene 33: 103-119, 1985) y MON105
(Obukowicz et al., Applied Environmental Microbiology
58: 1511-1523, 1992). En la presente
invención también se incluye la expresión de las proteínas
multifuncionales utilizando un vector de expresión cromosómico
para E. coli basado en el bacteriófago Mu (Weinberg et al.,
Gene 126: 25-33, 1993). En este
método también pueden emplearse diversas cepas de B.
subtilis. También se dispone de muchas cepas de células de
levadura conocidas por los especialistas en la técnica como células
hospedadoras para la expresión de los polipéptidos de la presente
invención.
Cuando se expresa en el citoplasma de E.
coli, el gen que codifica las proteínas de la presente
invención también puede construirse de tal forma que se añadan en el
extremo 5' del gen codones que codifican
Met^{-2}-Ala^{-1},
\breakMet^{-2}-Ser^{-1}, Met^{-2}-Cys^{-1} o Met^{-1} en el extremo N de la proteína. Los extremos N de proteínas obtenidas en el citoplasma de E. coli se ven afectados por un procesamiento post-traduccional por la metionina aminopeptidasa (Ben Bassat et al., J. Bacteriol, 169: 751-757, 1987) y posiblemente por otras peptidasas, de forma que tras la expresión, la metionina se escinde del extremo N. Las proteínas de la presente invención pueden incluir polipéptidos que tienen Met^{-1}, Ala^{-1}, Ser^{-1}, Cys^{-1}, Met^{-2}-Ala^{-1}, Met^{-2}-Ser^{-1} o Met^{-2}-Cys^{-1} en el extremo N. Estas proteínas mutantes también pueden expresarse en E. coli por fusión de un péptido señal de secreción al extremo N. Este péptido señal se escinde del polipéptido como parte del proceso de secreción.
A continuación se proporciona una lista de
abreviaturas y los correspondientes significados que se usan
indistintamente en este documento:
BME = beta mercaptoetanol
DTT = ditiotreitol
g = gramo(s)
HPLC = cromatografía líquida de alta
resolución
mg = miligramo(s)
ml = mililitro(s)
RT = temperatura ambiente
\mug = microgramo(s)
\mul = microlitro(s)
A continuación se proporciona una lista de
definiciones de las diversas expresiones usadas en este
documento:
La expresión "anti-tumor"
significa que posee una actividad que ralentiza o anula el
crecimiento, o que destruye o perjudica de otra forma a los tumores
in vivo.
La expresión "secuencia nativa" se refiere a
una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico que es idéntica a
una forma de tipo silvestre o nativa de un gen o proteína.
Las expresiones "secuencia de aminoácidos
mutante", "proteína mutante", "proteína variante",
"muteína" o "polipéptido mutante" se refieren a un
polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que varía de
una secuencia nativa debido a adiciones, deleciones, substituciones
de aminoácidos, o cualquier combinación de las mismas, o se
codifica por una secuencia de nucleótidos de una variante obtenida
intencionadamente derivada de una secuencia nativa o sintetizada
químicamente.
La expresión "angiostatina" significa un
fragmento proteico de plasminógeno (codificado por la SEC ID Nº:9)
que tiene actividad anti-angiogénica. La actividad
de dichos fragmentos puede determinarse por el ensayo de
angiogénesis de microbolsa de córnea de ratón o por la inhibición
del crecimiento de células endoteliales in vitro.
La expresión "kringle" o "K" significa
un fragmento o subestructura de plasminógeno o angiostatina unido
por restos de cisteína unidos por enlaces disulfuro, y que retiene
una estructura similar a la que adoptará dentro del plasminógeno
entero. Un dominio kringle también puede incluir secuencias
interkringle que sirven para conectarlo con otros dominios kringle.
Los términos K1, K2, K3, K4 y K5 se refieren a dominios kringle
específicos, y los términos tales como K1-3 o
K2-4, por ejemplo, se refieren a segmentos
proteicos contiguos desde el primer kringle hasta el último kringle
en una serie, incluyendo las secuencias interkringle.
La figura
1
Se muestran los dominios kringle del plasminógeno
humano pMON24624 (K1-5), pMON24642
(K1-4E),
\breakpMON24643 (K1-4), pMON24644 (2-3), pMON24645 (K2-4), pMON24646 (K1-3) y pMON24649 (K1). Las marcas K1, K2, K3, K4 y K5 se refieren a dominios kringle específicos dentro del plasminógeno humano o la angiostatina. El plásmido pMON24624 contiene la secuencia del plasminógeno humano, K1-K5, incluyendo el péptido N-terminal (NTP) y el péptido señal (SP). El plásmido pMON24642 codifica kringles K1-K4 más secuencias de plasminógeno humano adicionales en sus extremos 5' y 3' mostradas en el diagrama por áreas sólidas. También se muestran representaciones esquemáticas de las secuencias relacionadas con la angiostatina en los plásmidos pMON24625
\break(K1-K4), pMON24626 (K1-K3), pMON24627 (K2-K4), pMON24628 (K2-K3) y pMON24650 (K1) que contienen dominios kringle específicos de plasminógeno humano. Estos plásmidos también contienen secuencias necesarias para la expresión de los polipéptidos codificados en E. coli.
La figura
2
Se indican las condiciones óptimas de
solubilización en presencia de urea y DTT y de replegamiento en
presencia de cistina y ácido 6-amino hexanoico.
La figura
3
Se ensayaron K1-3,
K1-4 y angiostatina derivada de elastasa,
purificados, en el ensayo de migración de células HMEC a 20
\mug/ml. Todas las angiostatinas mostraron inhibición de la
migración.
La figura
4
Se ensayaron K1-3,
K1-4 y angiostatina derivada de elastasa,
purificados, en el ensayo de migración de células BAEC a 20
\mug/ml. Todas las angiostatinas mostraron inhibición de la
migración.
La figura
5
Inhibición de la migración de células HMEC frente
a la concentración de angiostatina. Se muestran curvas de
dosis/respuesta de la concentración de angiostatina frente al
porcentaje de inhibición de la migración celular
para
\breakK1-3, K1-4 y angiostatina derivada de elastasa.
La figura
6
Se muestran perfiles de elución para
K1-3 a pH 10,5 y un solo kringle a pH 8,0 por
cromatografía de HPLC-lisina.
Los siguientes ejemplos ilustrarán la invención
con más detalle, aunque se entenderá que la invención no se limita
a estos ejemplos específicos.
Pueden encontrarse métodos generales para la
clonación, la expresión y la caracterización de proteínas en T.
Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, y referencias citadas en este
documento; y en J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory,
1989, y referencias citadas en este documento.
A menos que se indique otra cosa, todos los
agentes químicos de especialidad se obtuvieron en Sigma, Co. (St.
Louis, MO). Las endonucleasas de restricción y la ADN ligasa de T4
se obtuvieron en New England Biolabs (Bervely, MA) o Boehringer
Mannheim (Indianapolis, IN).
Las cepas bacterianas usadas en estos estudios se
indican en la tabla 1. Los plásmidos usados o construidos para
este estudio se indican en la tabla 2.
Para la transformación de las reacciones de unión
se usan cepas de E. coli (tabla 1) tales como DH10B™ (Life
Technologies, Gaithersburg, MD) y TG1 (Amersham Corp., Arlington
Heights, IL) y son los hospedadores usados para preparar el ADN
plasmídico para transfectar células de mamífero. Para expresar las
proteínas de la presente invención, en el citoplasma o espacio
periplásmico pueden usarse cepas de E. coli tales como
JM101 (Yanisch-Perron et al., Gene,
33:103-119, 1985) y MON105 (Obukowicz et al.,
Appl. and Envir. Micr., 58: 1511-1523,
1992).
Se adquieren células con eficacia de subclonación
DH10™ como células competentes y se preparan para la
transformación usando el protocolo del fabricante, mientras que la
dos cepas de E. coli JM101 y MON105 se vuelven competentes
para la captación de ADN usando un método de CaCl_{2}.
Típicamente, se cultivan de 20 a 50 ml de células en medio LB (1%
de Bacto-triptona, 0,5% de extracto de levadura de
Bacto, NaCl 150 mM) hasta una densidad de aproximadamente 1,0
unidades de absorbancia a 600 nanómetros (OD600) medida por un
espectrofotómetro Baush & Lomb Spectronic (Rochester, NY). Las
células se recogen por centrifugación y se resuspenden en un
volumen de cultivo de un quinto de solución de CaCl_{2}
[CaCl_{2} 50 mM, Tris-Cl 10 mM (clorhidrato de
2-amino-2-(hidroximetil)
1,3-propanodiol 10 mM, pH 7,4] y se mantiene a 4ºC
durante 30 minutos. Las células se recogen de nuevo por
centrifugación y se resuspenden en un volumen de cultivo de un
décimo de solución de CaCl_{2}. Se añade ADN unido a 0,2 ml de
estas células y las muestras se mantienen a 4ºC durante
30-60 minutos. Las muestras se cambian a 42ºC
durante 2 minutos y se añade 1,0 ml de LB antes de agitar las
muestras a 37ºC durante 1 hora. Las células de estas muestras se
extienden en placas (medio LB más 1,5% de
Bacto-agar) que contienen ampicilina (100
microgramos/ml, \mug/ml) cuando se seleccionan los transformantes
resistentes a ampicilina, o espectinomicina (75 \mug/ml) cuando
se seleccionan los transformantes resistentes a espectinomicina.
Las placas se incuban durante una noche a 37ºC.
Se seleccionan colonias y se inoculan en LB más
el antibiótico apropiado (100 \mug/ml de ampicilina o 75
\mug/ml de espectinomicina) y se cultivan a 37ºC mientras se
agitan.
El ADN plasmídico puede aislarse por varios
métodos diferentes y usando kits disponibles en el mercado
conocidos por los especialistas en la técnica. El ADN plasmídico se
aísla usando el kit Promega Wizard™ Miniprep (Madison, WI), los
kits de aislamiento de plásmidos Qiagen QIAwell (Chatsworth, CA)
o el kit Qiagen Plasmid Midi o Mini. Estos kits siguen el mismo
procedimiento general para el aislamiento del ADN plasmídico. En
resumen, se sedimentan células por centrifugación (5000 x g), el
ADN plasmídico se libera con un tratamiento secuencial con
NaOH/ácido y el desecho celular se retira por centrifugación
(10000 x g). El sobrenadante (que contiene el ADN plasmídico) se
introduce en una columna que contiene una resina de unión a ADN,
la columna se lava y el ADN plasmídico se eluye. Después de la
selección de las colonias con el plásmido de interés, las células
E. coli se inoculan en 50-100 ml de LB más
el antibiótico apropiado para crecer durante una noche a 37ºC en un
incubador de aire mientras se agita. El ADN plasmídico purificado
se usa para la secuenciación del ADN, la digestión adicional con
enzimas de restricción, la subclonación adicional de los fragmentos
de ADN y la transfección de células E. coli, de células de
mamífero o de otros tipos celulares.
Se resuspende ADN plasmídico purificado en
H_{2}O desionizada y su concentración se determina midiendo la
absorbancia a 260/280 nanómetros en un espectrómetro UV Bausch and
Lomb Spectronic 601. Las muestras de ADN se secuencian usando los
kits de química de secuenciación de terminadores ABI PRISM™
DyeDeoxy™ (Applied Biosystems Division of Perkin Elmer Corporation,
Lincoln City, CA) (Nº de pieza 401388 o 402078) de acuerdo con el
protocolo sugerido por el fabricante modificado habitualmente por
la adición de un 5% de DMSO a la mezcla de secuenciación. Las
reacciones de secuenciación se realizan en un aparato de ciclos
térmicos de ADN (Perkin Elmer Corporation, Norwalk, CT) siguiendo
las condiciones de amplificación recomendadas. Las muestras se
purifican para retirar el exceso de terminadores colorantes con
columnas de centrifugación Centri-Sep™ (Princeton
Separations, Adelphia, NJ) y se liofilizan. Las reacciones de
secuenciación marcadas con colorante fluorescente se resuspenden
en formamida desionizada y se secuencian en geles desnaturalizantes
de poliacrilamida al 4,75%-urea 8 M usando secuenciadores de ADN
automáticos ABI Modelo 373A y Modelo 377. Los fragmentos de
secuencia de ADN solapantes se analizan y se ensamblan en
fragmentos solapantes (contigs) de ADN principal usando el
software de análisis de ADN Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann
Arbor, MI).
La cepa de E. coli MON105 o JM101 que
lleva el plásmido de interés se cultiva a 37ºC en medio M9 más
casaminoácidos con agitación en un incubador de aire modelo G25 de
New Brunswick Scientific (Edison, NJ). El crecimiento se controla
a OD_{600} hasta que alcanza un valor de 1,0, momento en el que
se añade ácido nalidíxico (10 mg/ml) en NaOH 0,1 N hasta una
concentración final de 50 \mug/ml. Después, los cultivos se
agitan a 37ºC durante tres a cuatro horas más. Se mantiene un alto
grado de aireación a lo largo de todo el período de cultivo para
conseguir la producción máxima del producto génico deseado. Las
células se examinan con un microscopio óptico con respecto a la
presencia de cuerpos de inclusión (IB). Se retiran alícuotas de
un ml del cultivo para el análisis del contenido de proteínas
hirviendo las células sedimentadas, y tratándolas con tampón
reductor y electroforesis a través de SDS-PAGE
(véase Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory
Manual", 1982). El cultivo se centrifuga (5000 x g) para
sedimentar las células.
Todas las moléculas de angiostatina se aumentaron
a escala en un fermentador Biostat E™ de 10 L (B. Braun Biotech
Inc., Allentown PA). El medio de fermentación usado fue sales M9
suplementadas con un 2% de casaminoácidos (Difco Laboratories,
Detroit MI) y glucosa. Se transfirió aproximadamente un mililitro
de un cultivo descongelado a un matraz de agitación Fernbach de 3,8
l que contenía 1,0 l de medio y después se incubó a 37ºC a una
velocidad del agitador de 250 r.p.m. durante 12 horas. Después,
este cultivo en el matraz de agitación se usó para inocular un
fermentador de 10 l que contenía 9,0 l de medio. Las condiciones
de fermentación fueron las siguientes: agitación = 1000 r.p.m.,
velocidad de flujo de aire del rociador = 15 litros/min., control
de pH = 7,0 por la adición de NH_{4}OH, contrapresión = 10 psi
(68,95 kPa), control de oxígeno disuelto > 30%, y temperatura =
37ºC. Se prepararon lotes de glucosa inicialmente a 15 g/l y se
controlaron a 2-5 g/l por la adición de solución
madre de alimentación de glucosa al 50%. El cultivo de
fermentación se desarrolló hasta una OD inicial (550 nm) =
12-15 y se indujo con 50 mg/l de ácido
nalidíxico. La fermentación se recogió cuatro horas después de la
inducción por centrifugación de flujo continuo.
La pasta celular de una fermentación de 10 l se
resuspendió en aproximadamente 6,0 l de tampón Tris
50
\breakmM/EDTA 150 mM que contenía 40 gránulos de Cóctel de Inhibidor de Proteasa Completo (Boehringer Mannheim; Indianapolis, IN) y 600.000 KIU de Trasyol. La resuspensión se pasó una vez a través de un Microfluidizer (Newton, MA) a 10.000 psi (68,947 MPa) y la temperatura se mantuvo por debajo de 8ºC. Después, el homogeneizado recuperado se centrifugó a 15.000 x G durante 25 minutos y se mezcló hasta la consistencia con un mezclador Ultra-Turrax. Después, la resuspensión de pasta de células se homogeneizó pasando la suspensión celular dos veces a través de un Microfluidizer (Newton, MA) que funcionaba a una presión de 10.000 psi (68,947 MPa). La temperatura del homogeneizado se mantuvo por debajo de 6ºC por recolección en un recipiente de acero inoxidable puesto en un baño de hielo. Después, se aislaron cuerpos de inclusión por centrifugación del homogeneizado celular a 15.000 X g durante 30 minutos y por la eliminación del sobrenadante. Después, los cuerpos de inclusión se lavaron un total de dos veces resuspendiendo los cuerpos de inclusión en D.I. enfriado y por centrifugación a 15.000 X g durante 30 minutos. Después, los cuerpos de inclusión de angiostatina se congelaron a -70ºC.
El sedimento celular de un cultivo de E.
coli de 330 ml se resuspende en 15 ml de tampón de
sonicación
\breakTris-Cl, pH 8,0 + ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 1 mM. Estas células resuspendidas se sonican usando la sonda de micropunta de un Sonicator Cell Disruptor (Modelo W-375, Heat Systems-Ultrasonics, Inc., Farmingdale, Nueva York). Para romper las células y lavar los cuerpos de inclusión (IB) se emplean tres vueltas de sonicación en tampón de sonicación seguido de centrifugación. La primera vuelta de sonicación es un estallido de 3 minutos seguido de un estallido de 1 minuto, y las dos vueltas finales de sonicación son de 1 minuto cada una.
Todas las etapas se realizan a 4ºC. Se
disolvieron cuerpos de inclusión de angiostatina
K1-4 en urea 6 M,
\breakDTT 5 mM, Bis-Tris Propano 50 mM, pH 10,8 a 1,2 mg/ml. Esta solución se agitó durante 2 horas y después se añadió ácido 6-amino hexanoico (solución madre 1 M) para conseguir una concentración 6 mM, seguido de la adición de cistina (solución madre 0,2 M, pH 10,5) a 6 mM. Esto se mezcló durante 5 minutos y después la angiostatina K1-4 se diluyó a 0,2 mg/ml por la adición de Bis-Tris propano 75 mM, pH 10,5. Después se agitó durante 72 horas para completar el replegamiento de la proteína como se evalúa por HPLC de fase inversa o por unión a Lys-HPLC
\hbox{(Figura 6).}
\newpage
La purificación de angiostatina
K1-4 se consiguió usando una columna de afinidad
Sepharose-Lys seguido de cromatografía en
Q-Sepharose. Después, la muestra se dializó frente a
fosfato sódico 50 mM, pH 8,0, y después se filtró a través de un
filtro de 1 \muM para la clarificación. Esta muestra se
introdujo en una columna de Sepharose-Lys
equilibrada en fosfato sódico 50 mM, pH 8,0. La carga se realizó a
aproximadamente 1,5 g de K1-4 por ml de resina.
Después de cargar la columna, se lavó con un volumen de columna
de tampón de equilibrio y después se eluyó
\breakK1-4 usando un gradiente de 10 volúmenes de columna de ácido 6-amino-hexanoico 0,8 mM en fosfato sódico 50 mM,
\breakpH 8,0.
Las fracciones se analizaron por electroforesis
en gel de SDS y/o RP-HPLC y se reunieron. Este
conjunto se llevó a Tris-Cl 40 mM y se ajustó a pH
9,0. Después, se dializó extensivamente frente a
Tris-Cl 40 mM, pH 9,0 y se aplicó a una columna de
Pharmacia Q-Sepharose HP (\sim5 mg de proteína/ml
de resina) equilibrada en el mismo tampón. Después, se eluyó
K1-4 usando un gradiente de NaCl de
0-0,1 M en el tampón de equilibrio. Las fracciones
se analizaron por RP-HPLC y/o electroforesis en gel
de SDS y se reunieron.
En algunos casos, las proteínas plegadas pueden
purificarse por afinidad usando reactivos de afinidad tales como
anticuerpos monoclonales o subunidades de receptores unidas a una
matriz adecuada. La purificación también puede realizarse usando
cualquiera de una diversidad de métodos cromatográficos tales
como: cromatografía de intercambio iónico, de exclusión molecular o
de interacción hidrófoba o HPLC de fase inversa. En Methods in
Enzymology, Volumen 182 "Guide to Protein Purification"
editado por Murray Deutscher, Academic Press, San Diego,
California, 1990, se describen con detalle estos y otros métodos
de purificación de proteínas.
La proteína purificada se analiza por
RP-HPLC, espectrometría de masas de
electronebulización y SDS-PAGE. La cuantificación
de la proteína se realiza por composición de aminoácidos,
RP-HPLC y determinación de proteínas de Bradford.
En algunos casos, se realiza un mapeo de péptidos trípticos junto
con espectrometría de masas de electronebulización para confirmar la
identidad de la proteína.
Se siembran células Daudi de linfoma de Burkitt
humano (ATCC) a 2 x 10^{4} células/pocillo en placas de cultivo
de tejidos de 96 pocillos y las células se cultivan en presencia o
ausencia de dosis en serie de rhIFN.alpha.2b durante 3 días. Los
cultivos se someten a pulsos de ^{3}H-timidina
durante la última hora del período de cultivo, y la absorción de
^{3}H-timidina, en cuentas por minuto (cpm), se
mide en un lector de placas Beta. Todas las muestras se ensayan
por triplicado.
El ensayo de proliferación de células
endoteliales se realizó como se describe por Cao et al. (J.
Biol. Chem. 271: 29461-29467, 1996). En
resumen, se mantuvieron células endoteliales microvasculares
dérmicas humanas (HdMVEC, Clonetics) o células endoteliales
microvasculares bovinas (BacEnd, Incell) en MCD131 que contenía
un 5% de suero bovino fetal inactivado térmicamente (FBS, Hyclone),
antibióticos, 100 \mug/ml de heparina (Sigma) y 100 \mug/ml de
mitógeno endotelial (Biomedical Technologies). Se dispersaron
monocapas confluentes a 2-5 pasos en tripsina al
0,05% y se resuspendieron en medio completo. Se sembraron
quinientos \mul de medio completo que contenía 1,25 x 10^{4}
células en pocillos de una placa de cultivo de tejidos de 24
pocillos recubierta con un 0,1% de gelatina (Sigma). Las células se
incubaron durante una noche a 37ºC/5% de CO_{2}, después de lo
cual el medio se reemplazó con 250 \mul de medio que contenía
un 5% de FBS y diversas concentraciones de inhibidores. Después de
30 minutos de incubación, se añadieron 250 \mul de medio que
contenía 1 ng/ml de bFGF (R&D Systems) y las células se
incubaron durante 72 horas más, después de lo cual se tripsinizaron
y se contaron con un contador Coulter.
El ensayo de formación de tubos se realiza como
se ha descrito previamente (Gately et al., Cancer Res.
56:4887-4890, 1996). El efecto de inhibidores
de la angiogénesis puede ensayarse en un ensayo de angiogénesis
in vitro; la formación de tubos de células endoteliales en
una matriz. Se descongeló matrigel (Becton Dickinson) en hielo y
se diluyó a 1:1 con medio MCDB 131 suplementado con
L-glutamina 2 mM, que contenía control de tampón o
compuestos de ensayo. Se cultivaron alícuotas de 0,5 ml de
matrigel diluido a 1:1 en pocillos individuales de portaobjetos de
poliestireno Tissue-Tek de dos cámaras (Nunc) y se
dejaron polimerizar a 37ºC durante al menos 30 minutos. Se
cultivaron células endoteliales capilares bovinas primarias
procedentes de la corteza suprarrenal bovina (adquirida en Incell)
(como se describe para la proliferación de células endoteliales
bovinas). Después de la tripsinización, las células se lavaron
tres veces y después se resuspendieron a 3,5 x 10^{5} células/ml
en medio MCDB131 suplementado con L-glutamina y
suero bovino fetal al 1% que contenía el mismo control de tampón o
compuestos de ensayo. Las células endoteliales (0,5 ml a 3,5 x
10^{5} células/ml) se cultivaron en pocillos recubiertos con
matrigel que contenían los mismos aditivos. Después de la
incubación durante 16-24 horas a 37ºC en un
incubador con un 5% de CO_{2}, los cultivos se evaluaron con
respecto a la formación de tubos (brotación). Se fotografiaron
campos aleatorios de cada situación experimental usando una cámara
Nikon N6006 con un microscopio Nikon Diaphot. Después, las
fotografías se cuantificaron midiendo la longitud total de los
tubos. La formación de tubos también pueden cuantificarse usando
un software de análisis de imágenes. Se fijaron redes de tubos de
células endoteliales en metanol al 100% a -20ºC durante
7-10 min., se aclararon 4 veces con solución
salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron durante una noche
a 4ºC con antígeno policlonal de conejo
anti-humano relacionado con el Factor VIII (factor
de von Willibrand, vWF) (Dako). Al día siguiente, las células se
tiñeron con un anticuerpo secundario, F(ab')2 de IgG de cabra
anti-conejo conjugado con Cy3 específico (Jackson
ImmunoResearch Laboratories). La formación de los tubos se
visualizó usando una Nikon microphot-FXA con un
filtro de fluorescencia asociado a un ordenador que contenía un
software de análisis de imágenes. La formación de los tubos se
midió como se indica a continuación: área total incluida por
tubos de células endoteliales/área de superficie de células
endoteliales total.
El ensayo de migración de células endoteliales se
realiza esencialmente como se ha descrito previamente (Gately et
al., Cancer Res. 56:4887-4890, 1996).
Para determinar la capacidad de la angiostatina de inhibir la
migración de células endoteliales, se realizaron ensayos de
migración en una cámara transwell (Costar) que contenía membranas
de policarbonato con un tamaño de poros de 8 mm. Las células
utilizadas en el ensayo fueron células endoteliales microvasculares
humanas de Emory o células endoteliales bovinas (proporcionadas
amablemente por Gately Northwestern University, Evanston, IL). Las
células se sometieron a inanición durante una noche antes del uso
en MCDB131 + 0,1% de BSA (células humanas) o DMEM + 0,1% de BSA
(células bovinas), se recogieron y se resuspendieron en el mismo
medio a 10^{6} células/ml. El lado inferior de los transwell se
recubrió con gelatina al 0,1% durante 30 minutos a 37ºC antes de
la adición de 2 x 10^{5} células a la cámara superior. El
transwell se trasladó a un pocillo que contenía el
quimioatrayente (bFGF o VEGF) en la cámara inferior. Se dejó que se
produjera la migración durante una noche a 37ºC. Después, las
membranas se fijaron y se tiñeron, y se contó el número de células
que migraban al lado inferior de la membrana en 3 campos de alta
potencia.
Se sintetizó un ADNc que codificaba angiostatina
K1-4E (véase, por ejemplo,
pMON24642-a12.seq, SECID Nº10) por reacción en
cadena de la polimerasa usando los cebadores oligonucleotídicos
angec- s1 (angec-s1.seq, SECID Nº1) y
angec-n1 (angec-n1.seq, SECID Nº4) y
usando el ADNc de plasminógeno humano (pMON24624.seq SECID Nº9)
como plantilla. El ADN resultante se escindió con las
endonucleasas de restricción AflIII y HindIII y se
unió al vector de expresión de E. coli pMON5723 (Olins y
Rangwala, Methods Enzymol. 185 (Gene Expression
Technol.): 115-119, 1990) que se había digerido
con NcoI e HindIII. Se usó una porción de la reacción
de unión para transformar la cepa DH10B de E. coli con
resistencia a espectinomicina.
Se aisló ADN plasmídico a partir de las colonias
bacterianas de DH10B y se usó para transformar la cepa MON105 de
E. coli con resistencia a espectinomicina. Se inocularon
colonias resistentes a antibióticos individuales en 1 ml de Caldo
de Luria con 75 \mug/ml de espectinomicina y se cultivaron
durante una noche a 37 grados con agitación. Se inocularon cincuenta
microlitros del cultivo de una noche en un ml de medio M9 con
casaminoácidos y se cultivaron durante cuatro horas a 37 grados con
agitación. Se añadió ácido nalidíxico (50 \mul de una solución
acuosa a 1 mg/ml) y los cultivos se incubaron a 37 grados durante
3 horas más. Los cultivos se examinaron por microscopía de
contraste de fase con respecto a la presencia de cuerpos de
inclusión citoplásmicos y por electroforesis en gel de SDS-
poliacrilamida con respecto a la presencia de la proteína
expresada. Se seleccionaron tres cultivos con la mayor expresión
de angiostatina para una caracterización adicional. Se aisló ADN
plasmídico de los clones A12, B5 y B6 y se analizó por
secuenciación del ADN. Las secuencias de los ADNc en estos plásmidos
se muestran en 24642-A12.seq,
24642-B5.seq y 24642-B6.seq (SECID
Nº10, SECID Nº11 y SECID Nº12, respectivamente). Cada ADNc
codificaba la proteína esperada, pero contenía diversas mutaciones
silenciosas en las terceras posiciones de los codones dos a ocho.
Estas mutaciones se produjeron por las redundancias en el cebador
5' de PCR (angec-s1.seq, SECID Nº1) y las mutaciones
particulares en estos clones producen un alto nivel de expresión
de angiostatina. Cada ADNc difería de los otros y de la secuencia
de tipo silvestre en una o más de estas posiciones.
Se sintetizó un ADNc que codificaba angiostatina
K1-4 por reacción en cadena de la polimerasa
usando los cebadores oligonucleotídicos angec-s2
(angec-s2.seq, SECID Nº2) y
angec-n2 (angec- n2.seq, SECID Nº5) y usando el
ADNc de plasminógeno humano (pMON24624.seq, SECID Nº9) como
plantilla. El ADNc resultante se escindió con endonucleasas de
restricción AflIII y HindIII y se unió al vector de
expresión pMON5723 de E. coli que se había digerido con
NcoI y HindIII. Se usó una porción de la reacción
de unión para transformar la cepa DH10B de E. coli con
resistencia a espectinomicina.
Se aisló ADN plasmídico a partir de las colonias
bacterianas de DH10B y se usó para transformar la cepa MON105 de
E. coli con resistencia a espectinomicina. Se inocularon
colonias resistentes al antibiótico individuales en 1 ml de Caldo
de Luria con 75 \mug/ml de espectinomicina y se cultivaron
durante una noche a 37 grados con agitación. Se inocularon
cincuenta microlitros del cultivo de una noche en un ml de medio
M9 con casaminoácidos y se cultivaron durante cuatro horas a 37
grados con agitación. Se añadió ácido nalidíxico (50 \mul de
una solución acuosa de 1 mg/ml) y los cultivos se incubaron a 37
grados durante tres horas más. Los cultivos se examinaron por
microscopía de contraste de fase con respecto a la presencia de
cuerpos de inclusión citoplásmicos y por electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida con respecto a la presencia de
la proteína expresada. Se seleccionaron tres cultivos con la mayor
expresión de angiostatina para una caracterización adicional. Se
aisló ADN plasmídico de los clones C10, D5 y D7 y se analizó por
secuenciación del ADN. Las secuencias de los ADNc en estos plásmidos
se muestran en 24643-C10.seq,
24643-D5.seq y 24643-D7.seq (SECID
Nº13, SECID Nº14 y SECID Nº15, respectivamente). Cada ADNc
codificaba la proteína esperada, pero contenía diversas mutaciones
silenciosas en las terceras posiciones de los codones dos a ocho.
Estas mutaciones se debían a las redundancias en el cebador 5' de
PCR (angec-s2.seq, SECID Nº2) y las mutaciones
particulares de estos clones producen un alto nivel de expresión
de angiostatina. Cada ADNc difería de los otros y de la secuencia de
tipo silvestre en una o más de estas posiciones.
Se sintetizó un ADNc que codificaba angiostatina
K2-3 por reacción en cadena de la polimerasa
usando los cebadores oligonucleotídicos angec-s3
(angec-s3.seq, SECID Nº3) y
angec-n3 (angec- n3.seq, SECID Nº6) y usando el
ADNc de plasminógeno humano (pMON24624.seq, SECID Nº9) como
plantilla. El ADNc resultante se escindió con las endonucleasas de
restricción AflIII y HindIII y se unió al vector de
expresión pMON5723 de E. coli que se había digerido con
NcoI y HindIII. Se usó una porción de la reacción
de unión para transformar la cepa DH10B de E. coli con
resistencia a espectinomicina.
Se aisló ADN plasmídico a partir de las colonias
bacterianas de DH10B y se usó para transformar la cepa MON105 de
E. coli con resistencia a espectinomicina. Se inocularon
colonias resistentes al antibiótico individuales en 1 ml de Caldo
de Luria con 75 \mug/ml de espectinomicina y se cultivaron
durante una noche a 37 grados con agitación. Se inocularon
cincuenta microlitros del cultivo de una noche en un ml de medio
M9 con casaminoácidos y se cultivaron durante cuatro horas a 37
grados con agitación. Se añadió ácido nalidíxico (50 \mul de
una solución acuosa de
\break1 mg/ml) y los cultivos se incubaron a 37 grados durante tres horas más. Los cultivos se examinaron por microscopía de contraste de fase con respecto a la presencia de cuerpos de inclusión citoplásmicos y por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida con respecto a la presencia de la proteína expresada. Se seleccionaron tres cultivos con la mayor expresión de angiostatina para una caracterización adicional. Se aisló ADN plasmídico de los clones E7, E9 y F8 y se analizó por secuenciación del ADN. Las secuencias de los ADNc en estos plásmidos se muestran en 24644-E7.seq, 24644-E9.seq y 24644-F8.seq (SECID Nº16, SECID Nº17 y SECID Nº18, respectivamente). Cada ADNc codificaba la proteína esperada, pero también contenía mutaciones que alteraron uno o más aminoácidos. Cada ADNc también contenía diversas mutaciones silenciosas en las terceras posiciones de los codones dos a ocho. Estas mutaciones se debían a las redundancias en el cebador 5' de PCR (angec- s3.seq, SECID Nº3) y las mutaciones particulares de estos clones producen un alto nivel de expresión de angiostatina. Cada ADNc difería de los otros y de la secuencia de tipo silvestre en una o más de estas posiciones.
Se sintetizó un ADNc que codificaba angiostatina
K2-3 por reacción en cadena de la polimerasa
usando los cebadores oligonucleotídicos angec-s3
(angec-s3.seq, SECID Nº3) y
angec-n2 (angec-n2.seq, SECID Nº5)
y usando el ADNc de plasminógeno humano (pMON24624.seq, SECID Nº9)
como plantilla. El ADNc resultante se escindió con las
endonucleasas de restricción AflIII y HindIII y se
unió al vector de expresión pMON5723 de E. coli que se había
digerido con NcoI y HindIII. Se usó una porción de
la reacción de unión para transformar la cepa DH10B de E.
coli con resistencia a espectinomicina.
Se aisló ADN plasmídico a partir de las colonias
bacterianas de DH10B y se usó para transformar la cepa MON105 de
E. coli con resistencia a espectinomicina. Se inocularon
colonias resistentes a antibiótico individuales en 1 ml de Caldo
de Luria con 75 \mug/ml de espectinomicina y se cultivaron
durante una noche a 37 grados con agitación. Se inocularon
cincuenta microlitros del cultivo de una noche en un ml de medio
M9 con casaminoácidos y se cultivaron durante cuatro horas a 37
grados con agitación. Se añadió ácido nalidíxico (50 \mul de
una solución acuosa de 1 mg/ml) y los cultivos se incubaron a 37
grados durante tres horas más. Los cultivos se examinaron por
microscopía de contraste de fase con respecto a la presencia de
cuerpos de inclusión citoplásmicos y por electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida con respecto a la presencia de
la proteína expresada. Se seleccionaron tres cultivos que
expresaban la mayor parte de la angiostatina para una
caracterización adicional. Se aisló ADN plasmídico de los clones
G3, H5 y H6 y se analizó por secuenciación del ADN. Las secuencias
de los ADNc en estos plásmidos se muestran en
24645-G3.seq, 24645-H5.seq y
24645-H6.seq (SECID Nº19, SECID Nº20 y SECID Nº21,
respectivamente). Cada ADNc codificaba la proteína esperada, pero el
clon H5 contenía una mutación que alteró un aminoácido. Cada ADNc
también contenía diversas mutaciones silenciosas en las terceras
posiciones de los codones dos a ocho. Estas mutaciones se debían a
las redundancias en el cebador 5' de PCR
(angec-s3.seq, SECID Nº3), y las mutaciones
particulares en estos clones producen un alto nivel de expresión
de angiostatina. Cada ADNc difería de los otros y de la secuencia de
tipo silvestre en una o más de estas posiciones.
Se sintetizó un ADNc que codificaba angiostatina
K1-3 por reacción en cadena de la polimerasa
usando los cebadores oligonucleotídicos angec-s2
(angec-s2.seq, SECID Nº2) y
angec-n3 (angec- n3.seq, SECID Nº6) y usando el
ADNc de plasminógeno humano (pMON24624.seq, SECID Nº9) como
plantilla. El ADNc resultante se escindió con las endonucleasas de
restricción AflIII y HindIII y se unió al vector de
expresión pMON5723 de E. coli que se había digerido con
NcoI y HindIII. Se usó una porción de la reacción
de unión para transformar la cepa DH10B de E. coli con
resistencia a espectinomicina.
Se aisló ADN plasmídico a partir de las colonias
bacterianas de DH10B y se usó para transformar la cepa MON105 de
E. coli con resistencia a espectinomicina. Se inocularon
colonias resistentes al antibiótico individuales en 1 ml de Caldo
de Luria con 75 \mug/ml de espectinomicina y se cultivaron
durante una noche a 37 grados con agitación. Se inocularon
cincuenta microlitros del cultivo de una noche en un ml de medio
M9 con casaminoácidos y se cultivaron durante cuatro horas a 37
grados con agitación. Se añadió ácido nalidíxico (50 \mul de
una solución acuosa a 1 mg/ml) y los cultivos se incubaron a 37
grados durante tres horas más. Los cultivos se examinaron por
microscopía de contraste de fase con respecto a la presencia de
cuerpos de inclusión citoplásmicos y por electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida con respecto a la presencia de
la proteína expresada. Se seleccionaron seis cultivos con la mayor
expresión de angiostatina para una caracterización adicional. Se
aisló ADN plasmídico de los clones A7, A9, A10, A12, B1 y B10 y se
analizó por secuenciación del ADN. Las secuencias de los ADNc en
estos plásmidos se muestran en 24646-A7.seq,
24646-A9.seq y 24646-A10,
24646-A12, 24646-B1 y
24646-B10 (SECID Nº22, SECID Nº23, SECID Nº24,
SECID Nº25, SECID Nº26 y SECID Nº27, respectivamente). Cada ADNc
codificaba la proteína esperada. Cada ADNc también contenía diversas
mutaciones silenciosas en las terceras posiciones de los codones
dos a ocho. Estas mutaciones se debían a las redundancias en el
cebador 5' de PCR (angec-s2.seq, SECID Nº2) y las
mutaciones particulares en estos clones producen un alto nivel de
expresión de angiostatina. Cada ADNc difería de los otros y de la
secuencia de tipo silvestre en una o más de estas posiciones.
Se sintetizó un ADNc que codificaba angiostatina
K1 (24649.seq, SECID Nº28) por reacción en cadena de la polimerasa
usando los cebadores oligonucleotídicos angec-sk1
(angec-sk1.seq, SECID Nº7) y
angec-n4 (angec-n4.seq, SEQID Nº8) y
usando el ADNc en pMON24646-A7 (SECID Nº22) como
plantilla. El cebador 5' de PCR (angec-sk1) contenía
las mismas mutaciones silenciosas en los ocho primeros codones,
que dieron como resultado un alto nivel de expresión de
angiostatina K1-3 a partir de
pMON24646-A7. El ADNc resultante se escindió con las
endonucleasas de restricción NcoI y HindIII y se
unió al vector de expresión de E. coli pMON5723 que también
se había digerido con NcoI y HindIII. Se usó una
porción de la reacción de unión para transformar la cepa DH10B de
E. coli con resistencia a espectinomicina. Se aisló el ADN
plasmídico a partir de las colonias bacterianas y se analizó por
escisión con endonucleasas de restricción y secuenciación del
ADN.
Después, el ADN plasmídico se usó para
transformar la cepa MON105 de E. coli con resistencia a
espectinomicina. Se cultivaron colonias individuales durante una
noche en Caldo de Luria que contenía 75 \mug/ml de
espectinomicina. Se usó 1 ml de l cultivo de una noche para
inocular 20 ml de medio M9 que contenía casaminoácidos. Después de
aproximadamente tres horas de crecimiento a 37 grados, se añadió
ácido nalidíxico y los cultivos se incubaron durante tres horas más
a 37 grados. Los cultivos se seleccionaron por microscopía de
contraste de fase con respecto a la presencia de cuerpos de
inclusión citoplásmicos y por electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida para la expresión de la proteína.
A diferencia de otras formas de angiostatina, la proteína K1 no
se incorporó en los cuerpos de inclusión, sino que más bien se
mantuvo soluble en el citoplasma de las bacterias. Sin embargo, las
mutaciones en los primeros ocho codones en pMON246249 conferían
altos niveles de expresión de K1, al igual que lo hacían para la
expresión de K1-3 a partir de
pMON13646-A7.
Todas las etapas se realizan a 4ºC. Se
disolvieron cuerpos de inclusión de angiostatina
K1-4 en urea 6 M, DTT 5 mM,
Bis-Tris propano 50 mM, pH 10,8 a 1,2 mg/ml. Esta
solución se agitó durante 2 horas. Después, se añadió una solución
madre de ácido 6-amino hexanoico 1 M para conseguir
una concentración 6 mM, seguido de la adición de cistina (solución
madre 0,2 M, pH 10,5) a 6 mM. Esto se agitó durante 5 minutos.
Después, la angiostatina K1-4 se diluyó a 0,2 mg/ml
por la adición de Bis-Tris propano a 75 mM, pH
10,5. Después se agitó durante 72 horas hasta la finalización del
replegamiento de la proteína. La angiostatina replegada se
purificó por cromatografía en lisina-Sepharose y
cromatografía en Q- Sepharose-HP. Esta angiostatina
purificada se ensayó con respecto a la inhibición de la migración
de células como se muestra en las figuras 3-5.
| Designación | Descripción o Genotipo | Referencia/Fuente |
| DH10B | F^{-}mcrA \Delta(mrr-hsdRMS-mcrBC) | Life Technologies, Rockville, Maryland |
| \phidlacZ\DeltaM15 \DeltalacX74 deoR recA1 | ||
| endA1 araD139 \Delta(ara, leu)7697 | ||
| galU galK \lambda\cdotrpsL nupG | ||
| MON105 | F^{-}, lambda-, IN (rrnD, rrnE)1, | Obukowicz et al., Appl. and Envir. |
| (ATCC Nº 55204) | rpoD^{+}, rpoH358 | Micr., 58: 1511-1523, 1992 |
| JM101 | delta (pro lac), supE, thi, | Yanisch-Perron et al., Gene, 33: |
| (ATCC Nº 33876) | F^{-}(traD36, proA^{+}B^{+}, lacI^{q}, | 103-119, 1985 |
| lacZdeltaM15) |
| Plásmido | SEC ID Nº | Marcador | Descripción | Fuente |
| pMON5723 | Espec | Vector de expresión de E. coli | (Olins y Rangwala, | |
| resistente a espec. genérico, | Methods Enzymol | |||
| que contiene el promotor | 185 (Gene | |||
| recA1 de E. coli y el sitio de | Expression Technol.): | |||
| unión a ribosomas de G10L | 115-119, 1990) | |||
| pMON6875 | Espec | Vector de expresión de E. coli | (Olins y Rangwala, | |
| resistente a espec. genérico, | Methods Enzymol | |||
| que contiene el promotor | 185 (Gene | |||
| recA1 de E. coli y el sitio de | Expression Technol.): | |||
| unión a ribosomas de G10L | 115-119, 1990) | |||
| pMON24624 | Nº9 | Amp | Plasminógeno humano, | Este trabajo |
| incluyendo la secuencia señal | ||||
| del plasminógeno nativo, el | ||||
| péptido N-terminal y los | ||||
| kringles 1-5. Fragmento | ||||
| BamHI en pMON3360B. | ||||
| (Aminoácidos -19-537 | ||||
| del plasminógeno, | ||||
| nucleótidos 55-1752) | ||||
| pMON24642- | Nº10, | espec | Angiostatina (E) humana. | Este trabajo |
| A12, -B5, -B6 | Nº11, | Fragmento AflIII/HindIII en | ||
| Nº12 | pMON5723. El extremo 5' se | |||
| ha mutagenizado para aumentar | ||||
| la expresión. (Aminoácidos 74-470 | ||||
| de plasminógeno, | ||||
| nucleótidos 331-1464) |
| Plásmido | SEC ID Nº | Marcador | Descripción | Fuente |
| pMON24643- | Nº13, | espec | Angiostatina (S) humana | Este trabajo |
| C10, D5, -D7 | Nº14, | (K1-4). Fragmento AflIII/HindIII | ||
| Nº15 | en pMON5723. (Aminoácidos | |||
| 79-440 de plasminógeno, | ||||
| nucleótidos 346-1431) | ||||
| pMON24644- | Nº16, | espec | Fragmento K2-3 de angiostatina | Este trabajo |
| E7, -E9, -F8 | Nº17, | (S) humana. Fragmento AflIII/HindIII | ||
| Nº18 | en pMON5723. (Aminoácidos | |||
| 163-344 de plasminógeno, | ||||
| nucleótidos 598-1143) | ||||
| pMON24645- | Nº19, | espec | Fragmento K2-4 de angiostatina | Este trabajo |
| G3, -H5, -H6 | Nº20, | (S) humana. Fragmento AflIII/HindIII | ||
| Nº21 | en pMON5723. (Aminoácidos | |||
| 163-440 de plasminógeno, | ||||
| nucleótidos 598-1431) | ||||
| pMON24646- | Nº22, | espec | Fragmento K1-3 de angiostatina | Este trabajo |
| A7, -A9, -A10 | Nº23 | (S) humana. Fragmento AflIII/HindIII | ||
| A12, -B1, -B10 | Nº24 | en pMON5723. | ||
| Nº25 | (Aminoácidos 79-344 de | |||
| Nº26 | plasminógeno, nucleótidos | |||
| Nº27 | 346-1143) | |||
| pMON24649 | Nº28 | espec | Fragmento K1 de angiostatina | Este trabajo |
| (S) humana. Fragmento NcoI/HindIII | ||||
| en pMON5723. (Aminoácidos 79-184 | ||||
| de plasminógeno, nucleótidos | ||||
| 1-269 de pMON24646-A7.seq) | ||||
| pMON24650 | Nº29 | Amp | Fragmento K1 de angiostatina | Este trabajo |
| (S) humana. Fragmento NcoI/HindIII | ||||
| en pMON3633. (Aminoácidos | ||||
| 79-184 de plasminógeno) |
| SEQ ID Nº: | Secuencia | Descripción | Nombre |
| gatcacatgtchctbttygaraaraa | oligo K1E | angec-s1.seq | |
| 1 | rgtbtatctctcagagtgcaag | ||
| gatcacatgtchgtbtatctbtchga | oligo K1 | angecs2.seq | |
| 2 | rtgyaagactgggaatggaaag | ||
| gatcacatgtchgargargartgyat | oligo K2 | angecs3.seq | |
| 3 | gcaytgcagtggagaaaactat | ||
| gatcaagcttttattaaagcaggaca | oligo K4E | angec-nl.seq | |
| 4 | acaggcgg |
| SEQ ID Nº: | Secuencia | Descripción | Nombre |
| gatcaagcttttattacgcttctgtt | oligo K4 | angec-n2.seq | |
| 5 | cctgagca | ||
| gatcaagcttttattaagccaattgt | oligo K3 | angec-n3.seq | |
| 6 | tccgtgga | ||
| catgccatggcagtttatctttcaga | oligo Kl | angec-skl.seg | |
| 7 | gtgt | ||
| gatcaagcttttattattcctcttca | oligo K1 | angec-n4.seq | |
| 8 | cactcaag | ||
| 9 | plasminógeno humano, hPlgn | 24624.seg | |
| 10 | K1-4E/5723 | 24642-a12.seq | |
| 11 | K1-4E/5723 | 24642-b5.seq | |
| 12 | K1-4E/5723 | 24642-b6.seq | |
| 13 | K1-4/5723 | 24643-c10.seq | |
| 14 | K1-4/5723 | 24643-d5.seq | |
| 15 | K1-4/5723 | 24643-d7.seq | |
| 16 | K2-3/5723 | 24644-e7.seq | |
| 17 | K2-3/5723 | 24644-e9.seq | |
| 10 | K2-3/5723 | 24644-f8.seq | |
| 19 | K2-4/5723 | 24645-g3.seq | |
| 20 | K2-4/5723 | 24645-h5.seq | |
| 21 | K2-4/5723 | 24645-h6.seq | |
| 22 | K1-3/5723 | 24646-a7.seq | |
| 23 | K1-3/5723 | 24646-a9.seq | |
| 24 | K1-3/5723 | 24646-a10.seq | |
| 25 | K1-3/5723 | 24646-a12.seq | |
| 26 | K1-3/5723 | 24646-b1.seq | |
| 27 | K1-3/5723 | 24646-b10.seq | |
| 28 | K1/5723 (24646-A7 extremos 5') | 24649.seq | |
| 29 | K1/3633(el mismo ADNc que 24649) | 24650.seq |
\vskip0.333000\baselineskip
<110> Violand, B.N.
- Polazzi, J.O.
- Casperson, G.F.
\vskip0.333000\baselineskip
<120> Método de replegamiento de
angiostatina
\vskip0.333000\baselineskip
<130> C_3044-0
\vskip0.333000\baselineskip
<150> 60/071,247
\vskip0.333000\baselineskip
<151>
1998-01-12
\vskip0.333000\baselineskip
<160> 29
\vskip0.333000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> humano
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipgatcacatgt chctbttyga raaraargtb tatctctcag agtgcaag
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> humano
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipgatcacatgt chgtbtatct btchgarty aagactggga atggaaag
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> humano
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipgatcacatgt chgargarga rtgyatgcay tgcagtggag aaaactat
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> humano
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipgatcaagctt ttattaaagc aggacaacag gcgg
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> humano
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipgatcaagctt ttattacgct tctgttcctg agca
\hfill34
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> humano
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipgatcaagctt ttattaagcc aattgttccg tgga
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
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<213> humano
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipcatgccatgg cagtttatct ttcagagtgt
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> humano
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipgatcaagctt ttattattcc tcttcacact caag
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 1719
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> humano
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 10
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 1154
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> humano
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<400> 10
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\vskip0.333000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 1154
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 11
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\newpage
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<210> 12
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<211> 1154
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<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> humano
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<400> 12
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<211> 1106
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 13
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\vskip0.333000\baselineskip
<211> 1106
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 14
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<210> 15
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<211> 1106
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
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<213> humano
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
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<210> 16
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 564
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
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<213> humano
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<400> 16
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<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> humano
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 17
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 18
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<211> 566
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> humano
\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
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\vskip0.333000\baselineskip
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\newpage
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<210> 28
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 281
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
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<211> 345
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<212> ADN
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<213> humano
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<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (47)
1. Un método para producir angiostatina que
comprende las etapas de:
- (a)
- cultivar células hospedadoras que expresan un gen de angiostatina;
- (b)
- recuperar el producto de dicha expresión génica;
- (c)
- replegar dicho producto génico a un pH elevado de 9 a 11,5; y
- (d)
- aislar las formas plegadas apropiadamente de dicho producto génico.
2. Un método para producir angiostatina de
acuerdo con la reivindicación 1, que comprende las etapas de:
- (a)
- cultivar células hospedadoras que expresan un gen de angiostatina;
- (b)
- recuperar el producto de dicha expresión génica;
- (c)
- solubilizar dicho producto génico a un pH elevado de 9 a 11,5;
- (d)
- replegar dicho producto génico solubilizado a un pH elevado de 9 a 11,5 y
- (e)
- aislar las formas plegadas apropiadamente de dicho producto génico.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, donde
dicho pH elevado es de pH 10 a pH 11.
4. El método de la reivindicación 3, donde dicho
pH elevado es pH 10,5.
5. El método de la reivindicación 2, donde dicho
producto génico está presente a una concentración de
aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mg/ml durante dicha etapa de
solubilización.
6. El método de la reivindicación 5, donde dicho
producto génico está presente a una concentración de
aproximadamente 6 mg/ml durante dicha etapa de solubilización.
7. El método de la reivindicación 1 o de la
reivindicación 2, donde dicho producto génico está presente a una
concentración de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 5 mg/ml
durante dicha etapa de replegamiento.
8. El método de la reivindicación 7, donde dicho
producto génico está presente a una concentración de
aproximadamente 1 mg/ml durante dicha etapa de replegamiento.
9. El método de la reivindicación 1 o de la
reivindicación 2, donde dicho producto génico de angiostatina se
codifica por una secuencia que se selecciona entre el grupo
compuesto por SEC ID Nº10; SEC ID Nº11; SEC ID Nº12; SEC ID Nº13;
SEC ID Nº14; SEC ID Nº15; SEC ID Nº16; SEC ID Nº7:10; SEC ID Nº18;
SEC ID Nº19; SEC ID Nº20; SEC ID Nº21; SEC ID Nº22; SEC ID Nº23;
SEC ID Nº24; SEC ID Nº25; SEC ID Nº26; SEC ID Nº27; SEC ID Nº28; SEC
ID Nº29.
10. El método de la reivindicación 2, donde está
presente urea a una concentración de aproximadamente 4 M a
aproximadamente 10 M durante dicha etapa de solubilización.
11. El método de la reivindicación 10, donde está
presente urea a una concentración de aproximadamente 6 M durante
dicha etapa de solubilización.
12. El método de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, donde está presente urea a una concentración de
aproximadamente 0,5 M a aproximadamente 3 M durante dicha etapa de
replegamiento.
13. El método de la reivindicación 12, donde está
presente urea a una concentración de aproximadamente 1 M durante
dicha etapa de replegamiento.
14. El método de la reivindicación 2, donde está
presente clorhidrato de guanidina a una concentración de
aproximadamente 3 M a aproximadamente 8 M durante dicha etapa de
solubilización.
15. El método de la reivindicación 14, donde está
presente clorhidrato de guanidina a una concentración de
aproximadamente 5 M durante dicha etapa de solubilización.
16. El método de la reivindicación 1 o de la
reivindicación 2, donde está presente clorhidrato de guanidina a
una concentración de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 2 M
durante dicha etapa de replegamiento.
\newpage
17. El método de la reivindicación 16, donde está
presente clorhidrato de guanidina a una concentración de
aproximadamente 0,5 M durante dicha etapa de replegamiento.
18. Un método de la reivindicación 1 o 2
realizado en presencia de un agente reductor capaz de reducir
enlaces disulfuro a grupos sulfhidrilo.
19. Un método de la reivindicación 18, donde
dicho agente reductor se selecciona entre el grupo compuesto por
DTT, BME, cisteína y glutatión reducido.
20. El método de la reivindicación 19, donde está
presente DTT a una concentración de aproximadamente 2 mM a
aproximadamente 10 mM durante dicha etapa de solubilización.
21. El método de la reivindicación 20, donde está
presente DTT a una concentración de aproximadamente 6 mM durante
dicha etapa de solubilización.
22. El método de la reivindicación 21, donde está
presente DTT a una concentración de aproximadamente 0,5 mM a
aproximadamente 2 mM durante dicha etapa de replegamiento.
23. El método de la reivindicación 22, donde está
presente DTT a una concentración de aproximadamente 1 mM durante
dicha etapa de replegamiento.
24. El método de la reivindicación 19, donde está
presente glutatión reducido a una concentración de aproximadamente
5 mM a aproximadamente 20 mM durante dicha etapa de
solubilización.
25. El método de la reivindicación 24, donde está
presente glutatión reducido a una concentración de aproximadamente
10 mM durante dicha etapa de solubilización.
26. El método de la reivindicación 19, donde está
presente glutatión reducido a una concentración de aproximadamente
1 mM a aproximadamente 4 mM durante dicha etapa de
replegamiento.
27. El método de la reivindicación 26, donde está
presente glutatión reducido a una concentración de aproximadamente
2 mM durante dicha etapa de replegamiento.
28. El método de la reivindicación 19, donde está
presente cisteína a una concentración de
aproximadamente
\break5 mM a aproximadamente 20 mM durante dicha etapa de solubilización.
29. El método de la reivindicación 28, donde está
presente cisteína a una concentración de
aproximadamente
\break10 mM durante dicha etapa de solubilización.
30. El método de la reivindicación 19, donde está
presente cisteína a una concentración de
aproximadamente
\break1 mM a aproximadamente 4 mM durante dicha etapa de replegamiento.
31. El método de la reivindicación 30, donde está
presente cisteína a una concentración de
aproximadamente
\break2 mM durante dicha etapa de replegamiento.
32. El método de la reivindicación 1 o de la
reivindicación 2, donde está presente un agente capaz de potenciar
el intercambio de enlaces disulfuro durante dicha etapa de
replegamiento.
33. El método de la reivindicación 32, donde
dicho agente se selecciona entre cistina y glutatión oxidado.
34. El método de la reivindicación 33, donde la
cistina está presente a una concentración de
aproximadamente
\break0,2 mM a aproximadamente 5 mM durante dicha etapa de replegamiento.
35. El método de la reivindicación 34, donde la
cistina está presente a una concentración de
aproximadamente
\break1 mM durante dicha etapa de replegamiento.
36. El método de la reivindicación 1 o 2, donde
dicha etapa de replegamiento se realiza en presencia de un ligando
capaz de unir dominios kringle de dicho producto génico de
angiostatina.
37. El método de la reivindicación 36, donde
dicho ligando capaz de unir dominios kringle de dicho producto
génico de angiostatina se selecciona entre el grupo compuesto por
ácido 6-amino hexanoico, ácido
7-aminoheptanoico, ácido 5-amino
pentanoico y ácido 4-amino butírico.
38. El método de la reivindicación 37, donde está
presente ácido 6-amino hexanoico a una
concentración de aproximadamente 0,2 mM a aproximadamente 20 mM
durante dicha etapa de replegamiento.
\newpage
39. El método de la reivindicación 38, donde está
presente ácido 6-amino hexanoico a una
concentración de aproximadamente 1 mM durante dicha etapa de
replegamiento.
40. El método de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, donde se forman enlaces disulfuro por medio de
oxidación con aire durante dicha etapa de replegamiento.
41. El método de la reivindicación 40, donde
dicha etapa de oxidación con aire se realiza durante un período de
aproximadamente 12 horas a aproximadamente 96 horas.
42. El método de la reivindicación 41, donde
dicha etapa de oxidación con aire se realiza durante un período de
aproximadamente 24 horas a aproximadamente 72 horas.
43. El método de la reivindicación 42, donde
dicha etapa de oxidación con aire se realiza durante un período de
aproximadamente 60 horas.
44. El método de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, que incluye además la etapa de purificar la
angiostatina por un proceso seleccionado entre el grupo compuesto
por cromatografía de lisina-sepharose,
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción
hidrófoba y RP- HPLC.
45. El método de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, donde dicho gen de angiostatina comprende ADN
que codifica para una angiostatina animal.
46. El método de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, donde dicho gen de angiostatina comprende ADN
que codifica para la angiostatina humana.
47. El método de la reivindicación 1 o 2, que
incluyen además la etapa de purificar la angiostatina por un
proceso seleccionado entre el grupo compuesto por cromatografía de
intercambio iónico y cromatografía de interacción hidrófoba.
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