CN113845599A - 一种重组猪干扰素融合蛋白及其应用 - Google Patents

一种重组猪干扰素融合蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种重组猪干扰素融合蛋白，包含猪干扰素突变体和蓖麻毒素B链，所述猪干扰素突变体是将Seq ID NO：1所示猪IFNα的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸突变为极性氨基酸所得到的突变体蛋白。进一步的，所述猪干扰素突变体是将Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的第31位和/或第90位氨基酸突变为组氨酸或精氨酸，所述蓖麻毒素B链为蓖麻毒素B链截短肽。本发明将猪IFN‑α连接RTB Domain1(RTBD1)截短肽获得长效猪干扰素，可增强猪干扰素生物学活性，提高干扰素在机体血液中蛋白稳定性，进而提高干扰素于机体内药物半衰期。

Description

一种重组猪干扰素融合蛋白及其应用
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及由猪干扰素α重组蛋白及其制备方法。
背景技术
猪肉制品及其相关产品是我国作为农业大国具有出口优势的农产品之一。但近年来猪类病毒性传染疾病严重威胁着我国猪规模化养殖。为应对猪类病毒性疾病感染，干扰素作为具有广谱抗病毒活性的细胞因子药物逐步成为研究热点。干扰素(Interferon，IFN)是机体在感染病毒时，宿主细胞通过抗病毒应答反应从而产生的糖蛋白，干扰素在抗病毒复制活性上具有突出优势，可以增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活性，调节宿主免疫功能，发挥其抗病毒作用。根据产生干扰素的来源不同、理化性质不同、生物活性不同以及识别受体不同，IFN分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅰ型干扰素还可分为IFN-α、IFN-β和IFN-α，Ⅰ型干扰素抗病毒活性较强。
重组猪IFNα具有广谱抗病毒作用，对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、口蹄疫病毒和猪瘟病毒等多种病毒均有显著的抗病毒活性。但现有的猪用干扰素多属于单一的α型或β型，作用效果单一，治疗效果不理想。此外，干扰素在临床中存在半衰期短、体内易降解、慢性病毒感染等难题，限制了干扰素的临床应用。
发明内容
为了克服现有技术中的不足本发明提供了一种重组猪干扰素融合蛋白，包含猪干扰素突变体和蓖麻毒素B链，所述猪干扰素突变体是将Seq ID NO：1所示猪IFNα的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸突变为极性氨基酸所得到的突变体蛋白。分别对于野生型和突变蛋白做柔性分析,如果突变区域蛋白柔性提升，则将该区域的一个或几个氨基酸作为突变位点，突变为极性氨基酸。
所述极性氨基酸具有亲水性，提高蛋白等电点和稳定性，通过本发明所选择的位点进行突变，改变了天然蛋白的二硫键，制备得到的突变蛋白在保存过程中不易产生沉淀。本发明所选择的突变位点，突变蛋白与野生型蛋白相比，三维结构没有发生变化，从而维持了蛋白的生物学功能。
优选的是，突变方式包括将Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的第31位和/或第90位氨基酸突变为极性氨基酸。
上述任一项中优选的是，所述极性氨基酸包括精氨酸或组氨酸的至少一种。
上述任一项中优选的是，所述蓖麻毒素B链包括Seq ID NO：2所示的氨基酸序列中第4位甲硫氨酸至134位苏氨酸的氨基酸序列。
上述任一项中优选的是，所述蓖麻毒素B链为蓖麻毒素B链截短肽。
蓖麻毒素B链(Ricin toxin，RTB)没有毒性且具有增强机体免疫反应的功能。蓖麻毒素B链全长的氨基酸序列如Seq ID NO：2所示。本发明进一步优选的，将猪IFN-α连接RTBDomain 1(RTBD1)截短肽获得长效猪干扰素，可增强猪干扰素生物学活性，提高干扰素在机体血液中蛋白稳定性，进而提高干扰素于机体内药物半衰期。本发明所述RTB截短肽是将Seq ID NO：2所示的氨基酸序列的前端和/或后端敲除，前端敲除的方式为将Seq ID NO：2所示的氨基酸序列的第1位氨基酸敲除、第1、2位氨基酸敲除或第1至3位氨基酸敲除；后端敲除的方式为将Seq ID NO：2所示的氨基酸序列第135至263位氨基酸序列敲除、第136至263位氨基酸序列敲除、第137至263位氨基酸序列敲除、第138至263位氨基酸序列敲除、第139至263位氨基酸序列敲除、第140至263位氨基酸序列敲除、……、第260至263位氨基酸序列敲除、第261至263位氨基酸序列敲除、第262至263位氨基酸序列敲除、第263位氨基酸序列敲除。本发明所优选的蓖麻毒素B链截短肽与野生型全长RTB相比减小蛋白分子大小，增加在体内组织的渗透率。
上述任一项中优选的是，所述融合蛋白包括如Seq ID NO：3所示的氨基酸序列。
本发明还提供了一种编码所述融合蛋白的基因，所述基因序列包含如Seq ID NO：4所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种含有所述基因的重组载体。
本发明还提供了一种含有所述重组载体的基因工程菌，将所述的重组载体转化到大肠杆菌宿主细胞中，获得所述基因工程菌。
本发明还提供了所述融合蛋白在抗病毒药物中的应用。在制备猪抗病毒药物中的应用。
本发明提供一种猪干扰素重组融合蛋白及其制备方法，采用的技术方案如下：
本发明所述的一种猪干扰素重组融合蛋白，由猪干扰素α与蓖麻毒素B链蛋白经柔性linker连接而形成。优选的，所述猪干扰素α为猪干扰素α突变体蛋白，所述蓖麻毒素B链蛋白为截短的蓖麻毒素B链蛋白，本发明又称蓖麻毒素B链截短肽(RTBD1)。所获得的含有猪干扰素α突变体蛋白和RTBD1的重组融合蛋白命名为rmPoIFNα/RTBD1。
作为优选的实施方式，所述柔性linker为(Gly4Ser)3连接肽。
本发明的一种猪干扰素重组融合蛋白的制备方法，主要包括以下步骤：
步骤一、mPoIFNα/RTBD1突变载体构建；
步骤二、大肠杆菌重组表达载体构建；
步骤三、重组mPoIFNα/RTBD1融合蛋白表达；
步骤四、纯化与复性。
作为优选的实施方式，步骤一具体包括以下步骤：
(1)生物信息学分析PoIFNα潜在突变位点：通过在线公开数据库对猪干扰素α与猪I型干扰素受体进行同源建模，使用Z-DOCK获得分子对接结构模型，对I型干扰素全长序列进行丙氨酸扫描突变，分析突变前后干扰素与受体结合力变化，筛选获得潜在的突变位点(突变位点的选择原则为：预测评估突变前后IFN与IFN受体间结合力的变化，推算蛋白三维结构维持的关键位点，再将众多非关键位点作为突变位点的候选进行不同天然氨基酸的定点突变，选择最终突变结果中结合力较高的位点与氨基酸)；
(2)PoIFNα突变基因克隆载体构建：设计猪IFNα定点突变引物(引物名称及序列如下：F：Seq ID NO：5，R：Seq ID NO：6，PM1F:Seq ID NO：7，PM1R：Seq ID NO：8，PM2F：Seq IDNO：9，PM2R：Seq ID NO：10)，以实验室构建的pMD18T-PoIFNα为模板，将Seq ID NO：1所示的野生型猪IFNα序列中第31位氨基酸、90位氨基酸天冬氨酸突变为精氨酸，增加猪IFNα与1型干扰素受体的结合能力以增强其抗病毒活性，并将突变后的序列命名为mPoIFNα。将突变后的mPoIFNα连接至pMD18T载体，将测序正确的产物命名为：pMD18T-mPoIFNα质粒；
(3)RTB截短基因克隆载体构建：设计RTBD1截短引物(引物名称和序列如下：RTBD1F：Seq ID NO：11和RTBD1R：Seq ID NO：12)，以实验室构建的pMD18T-RTB为模板，将全长RTB序列中调取第10至402位核苷酸序列，对应RTB氨基酸序列中第4位甲硫氨酸至134位苏氨酸，调取基因命名为RTBD1。将调取基因连接至pMD18T克隆载体，测序正确的产物命名为pMD18T-RTBD1质粒；
(4)mPoIFNα/RTBD1融合基因克隆载体构建：设计含有(G4S)3linker基因的重叠PCR引物(引物名称和序列如下：F：Seq ID NO：13；Over-Lap PCR F：Seq ID NO：14；Over-Lap PCR R：Seq ID NO：15；R：Seq ID NO：16)，以构建正确的上述克隆质粒pMD18T-mPoIFNα与pMD18T-RTBD1为模板，扩增获得以5’-mPoIFNα-linker-RTBD1-3’为正确构成的融合基因，命名为mPoIFNα/RTBD1。将融合基因连接至pMD18T载体，测序正确的产物命名为pMD18T-mPoIFNα/RTBD1质粒，以便下游基因工程操作。
作为优选的实施方式，步骤二具体包括以下步骤：
分别对测序正确的pMD18T-mPoIFNα/RTBD1质粒和pET28a载体进行双酶切，反应体系及条件见下表1，将双酶切产物进行胶回收；利用T4连接酶将胶回收后的两个产物进行连接，连接体系及条件见下表2。
表1重组质粒双酶切体系
Figure BDA0003330950620000031
表2重组质粒连接体系
Figure BDA0003330950620000041
将上述连接产物转化至Trans10感受态细胞；转化后涂布至终浓度为100μg/mLKan+抗性的LB固体平板，培养过夜后，挑取长势良好的多个白色单菌落，扩大培养并进行PCR；将PCR鉴定正确的阳性质粒进行测序分析。
作为优选的实施方式，步骤三具体包括以下步骤：
将测序正确的阳性菌BL21(DE3)/PET28a-mPoIFNα/RTBD1按1:100v/v的比例接种于5mL含浓度为100μg/mL Kan的LB培养基中，37℃下、180rpm恒温振荡培养至OD600＝0.6时，再按1:100v/v的比例转接至500mL同样的LB培养基中，并补加Kan至终浓度为100μg/mL，37℃下、180rpm恒温振荡培养至OD600＝0.6；诱导组添加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃下、180rpm恒温振荡诱导16h；经诱导16h后，4℃下、8000rpm离心获得菌体沉淀。
作为优选的实施方式，步骤四具体包括以下步骤：
(1)离子交换层析；
(2)金属鳌合层析；
(3)rmPoIFNα/RTBD1蛋白复性。
作为优选的实施方式，步骤(1)具体包括以下步骤：
使用蛋白纯化A液平衡Q柱(强阴离子交换柱)，将rmPoIFNα/RTBD1包涵体溶解液上柱，收集流穿液，目的蛋白主要存在于流穿液中。将流穿液的盐离子浓度调整至0.5mol/L以进行下一步金属鳌合层析。
作为优选的实施方式，步骤(2)具体包括以下步骤：
使用蛋白纯化B液对装载Ni2+Chelating Sepharose进行平衡；将离子交换层析纯化的rmPoIFNα/RTBD1溶液上柱，通过蛋白纯化系统中梯度混合模块将蛋白纯化B液和蛋白纯化C液进行混合，分别使用终浓度为50mmol/L与250mmol/L的咪唑对ChelatingSepharose进行洗脱，分别收集蛋白流穿液、杂蛋白溶液与目的蛋白溶液；将每步收集到的蛋白溶液进行胶浓度为12％SDS-PAGE分析。(蛋白纯化系统中梯度混合模块，为Akta蛋白纯化系统中模块，仪器厂商为美国通用公司，型号为Akta explorer。)
作为优选的实施方式，步骤(3)具体包括以下步骤：
将经两步纯化的rmPoIFNα/RTBD1蛋白溶液使用蛋白复性A液进行稀释，稀释至rmPoIFNα/RTBD1浓度为0.1mg/mL，并装入至截留分子量为3000的蛋白超滤系统中进行透析复性，向蛋白超滤系统中加入蛋白复性B液；调节蛋白超滤系统中蠕动泵的转速和出液阀松紧程度，使蛋白浓缩速度与B液进液速度保持一致；蛋白复性过程于4℃进行，整个流程进行48-72h；蛋白复性B液流尽后，通入蛋白复性C液去除复性过程中残留的蔗糖及甘油成分，并将rmPoIFNα/RTBD1蛋白进行浓缩，浓缩至其浓度为1-1.5mg/mL，得到重组mPoIFNα/RTBD1融合蛋白。
本发明的一种猪干扰素重组融合蛋白能够应用在制备抗病毒药物中。
本发明的有益效果是：本发明的一种猪干扰素重组融合蛋白，由猪干扰素α突变体与蓖麻毒素B链蛋白经柔性linker连接而形成，其中，柔性linker选用(Gly4Ser)3连接肽。本发明的一种猪干扰素重组融合蛋白比普通猪干扰素α半衰期长、生物学活性高，延长了半衰期，提高了生物活性，降低了干扰素制剂的制备成本，具有开发成广谱抗病毒药物和兽医临床应用的巨大潜力和价值。
附图说明
图1本发明优选实施例2中猪IFNα突变蛋白与野生型猪IFNα蛋白三维结构比较结果
具体实施方式
本发明通过以下实施例进行更加清晰、完整的描述，但所描述的实例仅是本发明一部分实施例，并非全部。所述实施例为帮助理解本发明，不应依此来局限本发明的保护范围。
实施例1重组mPoIFNα/RTBD1融合蛋白的制备
1、mPoIFNα/RTBD1突变载体构建
(1)生物信息学分析PoIFNα潜在突变位点：通过在线公开数据库对猪干扰素α与猪I型干扰素受体进行同源建模，使用Z-DOCK获得分子对接结构模型，对I型干扰素全长序列进行丙氨酸扫描突变，分析突变前后干扰素与受体结合力变化，筛选获得潜在的突变位点；
(2)PoIFNα突变基因克隆载体构建：设计猪IFNα定点突变引物，以实验室构建的pMD18T-PoIFNα为模板(PoIFNα野生型蛋白的核苷酸序列如Seq ID NO：17所示，将Seq IDNO：17所示核苷酸序列构建于pMD18T为本领域的常规技术)，将Seq ID NO：1所示的猪IFNα序列中第31位氨基酸、90位氨基酸天冬氨酸突变为精氨酸，得到突变后的蛋白即猪IFNα突变体蛋白，其氨基酸序列如Seq ID NO：18所示。猪IFNα突变体蛋白增加猪IFNα与Ⅰ型干扰素受体的结合能力以增强其抗病毒活性，并将突变后的序列命名为mPoIFNα。将突变后的mPoIFNα连接至pMD18T载体，将测序正确的产物命名为：pMD18T-mPoIFNα质粒；
(3)RTB截短基因克隆载体构建：设计RTBD1截短引物，以实验室构建的pMD18T-RTB为模板(RTB的核苷酸序列如Seq ID NO：19，即全长RTB的核苷酸序列，将Seq ID NO：19所示的核苷酸序列构建于pMD18T是本领域的常规技术手段)，将全长RTB序列中调取第10至402位核苷酸序列，对应RTB氨基酸序列中第4位甲硫氨酸至134位苏氨酸，调取基因命名为RTBD1(RTBD1的氨基酸序列如Seq ID NO：20所示)。将调取基因连接至pMD18T克隆载体，测序正确的产物命名为pMD18T-RTBD1质粒；
(4)mPoIFNα/RTBD1融合基因克隆载体构建：设计含有(G4S)3linker基因的重叠PCR引物，以构建正确的上述克隆质粒pMD18T-mPoIFNα与pMD18T-RTBD1为模板，扩增获得以5’-mPoIFNα-linker-RTBD1-3’为正确构成的融合基因，命名为mPoIFNα/RTBD1。将融合基因连接至pMD18T载体，测序正确的产物命名为pMD18T-mPoIFNα/RTBD1质粒，以便下游基因工程操作。
2、大肠杆菌重组表达载体构建分别对上述测序正确的pMD18T-mPoIFNα/RTBD1质粒和pET28a载体进行双酶切，反应体系及条件如表1所示，将双酶切产物进行胶回收。利用T4连接酶将胶回收后的两个产物进行连接，连接体系及条件如表2所示。
将上述连接产物转化至Trans10感受态细胞。转化后涂布至终浓度为100μg/mLKan+抗性的LB固体平板，培养过夜后，挑取长势良好的多个白色单菌落，扩大培养并进行PCR。将PCR鉴定正确的阳性质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序分析。
3、重组mPoIFNα/RTBD1融合蛋白表达
将上述测序正确的阳性菌BL21(DE3)/PET28a-mPoIFNα/RTBD1按1:100v/v的比例接种于5mL含浓度为100μg/mL Kan的LB培养基中，37℃下、180r/min恒温振荡培养至OD600＝0.6时，再按1:100v/v的比例转接至500mL同样的LB培养基中，并补加Kan至终浓度为100μg/mL，37℃下、180r/min恒温振荡培养至OD600＝0.6；诱导组添加IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃下、180r/min恒温振荡诱导16h；经诱导16h后，4℃下、8000r/min离心获得菌体沉淀。
4、融合蛋白纯化与复性
使用两步纯化法将菌体沉淀rmPoIFNα/RTBD1进行纯化。其纯化方法以先进行离子交换层析、后进行金属鳌合层析的顺序进行，具体操作步骤如下：
(1)离子交换层析：使用蛋白纯化A液(50mmol/L PB，8mol/L Urea，pH 6.0)平衡Q柱，将rmPoIFNα/RTBD1包涵体以蛋白纯化A液变性溶解并将溶解液上柱，收集流穿液，目的蛋白主要存在于流穿液中。将流穿液的盐离子浓度调整至0.5mol/L以进行下一步金属鳌合层析。
(2)金属鳌合层析：使用蛋白纯化B液(50mmol/L PB，8mol/L Urea，0.5mol/L NaClpH 6.0)对装载Ni2+Chelating Sepharose进行平衡。将离子交换层析纯化的rmPoIFNα/RTBD1溶液上柱，通过蛋白纯化系统中梯度混合模块将蛋白纯化B液和蛋白纯化C液(50mmol/L Tris，8mol/L Urea，0.5mol/L NaCl，500mmol/L Imidazole pH 8.5)进行混合，分别使用终浓度为50mmol/L与250mmol/L的咪唑对Chelating Sepharose进行洗脱，分别收集蛋白流穿液、杂蛋白溶液与目的蛋白溶液。将每步收集到的蛋白溶液进行胶浓度为12％SDS-PAGE分析。
(3)rmPoIFNα/RTBD1蛋白复性：将经两步纯化的rmPoIFNα/RTBD1蛋白溶液使用蛋白复性A液(50mmol/L Tris，8mol/L Urea，10％m/v蔗糖，10％v/v丙三醇，5mmol/L DTT，pH8.5)进行稀释，稀释至rmPoIFNα/RTBD1浓度为0.1mg/mL，并装入至截留分子量为3000的蛋白超滤系统中进行透析复性，向蛋白超滤系统中加入蛋白复性B液(50mmol/L Tris，10％m/v蔗糖，10％v/v丙三醇，pH 8.5)。调节蛋白超滤系统中蠕动泵的转速和出液阀松紧程度，使蛋白浓缩速度与B液进液速度保持一致。蛋白复性过程于4℃进行，整个流程进行48-72h，以满足对尿素的彻底去除以及rmPoIFNα/RTBD1蛋白的缓慢而充分的折叠。蛋白复性B液流尽后，通入蛋白复性C液(50mmol/L Tris，pH 8.5)去除复性过程中残留的蔗糖及甘油等成分，并将rmPoIFNα/RTBD1蛋白进行浓缩，浓缩至其浓度为1-1.5mg/mL，得到重组mPoIFNα/RTBD1融合蛋白。
实施例2PoIFNα突变体蛋白三维结构验证
制备PoIFNα突变体蛋白(氨基酸序列如Seq ID NO：18所示)，制备方法与实施例1中重组融合蛋白的制备方法相似。PoIFNα突变体蛋白与野生型PoIFNα蛋白(氨基酸序列如Seq ID NO：1所示)相比，突变前后蛋白的三维结构保持不变。
实施例3重组mPoIFNα/RTBD1融合蛋白的抗病毒检测
1、体外抗猪水泡型口炎病毒活性检测
将rmPoIFNα/RTBD1蛋白进行10倍比稀释分别处理猪肾细胞(PK15)24h，然后以100TCID50浓度的猪水泡性口炎病毒(VSV)感染，以抑制50％细胞病变的干扰素的最高稀释度定为1个干扰素活性单位，检测结果表明，重组融合蛋白对VSV表现出极高的抑制活性，病毒效价达到5.86×107U/mL，重组融合蛋白抗病毒比活为4.19×107U/mg。
2、体外抗猪蓝耳病病毒活性检测
在24孔细胞板上常规培养Marc-145细胞，长成单层后，每孔加入100μL 2倍系列稀释的rmPoIFNα/RTBD1融合蛋白，37℃处理24h，然后用100×TCID50的PRRSV攻毒，90h后观察Marc-145细胞病变抑制结果，并作病毒空白对照，结果如下。
表3 rPoIFNα/RTB抑制PRRSV病毒致病变结果
Figure BDA0003330950620000071
实施例4重组mPoIFNα/RTBD1融合蛋白的药代动力学研究
对rmPoIFNα/RTBD1进行半衰期的测定，测定方法采用细胞病变抑制法测定rmPoIFNα/RTBD1的血药浓度与时间的关系；
取6只雌猪，分2组(3只/组)：长效干扰素组与普通干扰素组，分别肌肉注射2mg/mLrmPoIFNα/RTBD1与PoIFNα0.5mL，注射后1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h、72h静脉采血，血液静置4℃低温凝固后，3000r/min低温离心5min，获取上层血清；
本发明所述长效干扰素为本发明提供的rmPoIFNα/RTBD1重组融合蛋白，所述普通干扰素为天然干扰素、野生型干扰素，氨基酸序列如Seq ID NO：1所示。
采用细胞病变抑制法测定不同时间点血清中rmPoIFNα/RTBD1浓度，利用DAS药动学软件进行曲线拟合并计算相关参数；
经测定各组的半衰期如下表3所示，rmPoIFNα/RTBD1的半衰期远高于PoIFNα，能够显著延长半衰期。
表3药物半衰期测定结果
Figure BDA0003330950620000081
相比较于天然干扰素3.6h左右的半衰期，rmPoIFNα/RTBD1半衰期的均有大幅度的提升，半衰期提高至2.91倍。
本发明公开了一种猪干扰素重组融合蛋白及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
序列表
<110> 长春萤火虫生物科技有限公司
<120> 一种重组猪干扰素融合蛋白及其应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 166
<212> PRT
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 2
Cys Asp Leu Pro Gln Ile His Ser Leu Ala His Thr Arg Ala Leu Arg
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Asp His
20 25 30
Arg Arg Asp Phe Gly Ser Pro His Glu Ala Phe Gly Gly Asn Gln Val
35 40 45
Gln Lys Ala Gln Ala Met Ala Leu Val His Glu Met Leu Gln Gln Thr
50 55 60
Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser Ala Ala Ala Trp Asn Glu Ser
65 70 75 80
Leu Leu His Gln Phe Cys Thr Gly Leu Asp Gln Gln Leu Arg Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Ala Gly Leu Glu Gly Thr Pro Leu Leu
100 105 110
Glu Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe His Arg Leu Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Ser Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val
130 135 140
Arg Ala Glu Val Met Arg Ser Phe Ser Ser Ser Arg Asn Leu Gln Asp
145 150 155 160
Arg Leu Arg Lys Lys Glu
165
<210> 2
<211> 263
<212> PRT
<213> 蓖麻(Ricinus communis)
<400> 2
Ala Asp Val Cys Met Asp Pro Glu Pro Ile Val Arg Ile Val Gly Arg
1 5 10 15
Asn Gly Leu Cys Val Asp Val Arg Asp Gly Arg Phe His Asn Gly Asn
20 25 30
Ala Ile Gln Leu Trp Pro Cys Lys Ser Asn Thr Asp Ala Asn Gln Leu
35 40 45
Trp Thr Leu Lys Arg Asp Asn Thr Ile Arg Ser Asn Gly Lys Cys Leu
50 55 60
Thr Thr Tyr Gly Tyr Ser Pro Gly Val Tyr Val Met Ile Tyr Asp Cys
65 70 75 80
Asn Thr Ala Ala Thr Asp Ala Thr Arg Trp Gln Ile Trp Asp Asn Gly
85 90 95
Thr Ile Ile Asn Pro Arg Ser Ser Leu Val Leu Ala Ala Thr Ser Gly
100 105 110
Asn Ser Gly Thr Thr Leu Thr Val Gln Thr Asn Ile Tyr Ala Val Ser
115 120 125
Gln Gly Trp Leu Pro Thr Asn Asn Thr Gln Pro Phe Val Thr Thr Ile
130 135 140
Val Gly Leu Tyr Gly Met Cys Leu Gln Ala Asn Ser Gly Lys Val Trp
145 150 155 160
Leu Glu Asp Cys Thr Ser Glu Lys Ala Glu Gln Gln Trp Ala Leu Tyr
165 170 175
Ala Asp Gly Ser Ile Arg Pro Gln Gln Asn Arg Asp Asn Cys Leu Thr
180 185 190
Thr Asp Ala Asn Ile Lys Gly Thr Val Val Lys Ile Leu Ser Cys Gly
195 200 205
Pro Ala Ser Ser Gly Gln Arg Trp Met Phe Lys Asn Asp Gly Thr Ile
210 215 220
Leu Asn Leu Tyr Asn Gly Leu Val Leu Asp Val Arg Arg Ser Asp Pro
225 230 235 240
Ser Ser Leu Lys Gln Ile Ile Val His Pro Val His Gly Asn Leu Asn
245 250 255
Gln Ile Trp Leu Pro Leu Phe
260
<210> 3
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Cys Asp Leu Pro Gln Ile His Ser Leu Ala His Thr Arg Ala Leu Arg
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Arg His
20 25 30
Arg Arg Asp Phe Gly Ser Pro His Glu Ala Phe Gly Gly Asn Gln Val
35 40 45
Gln Lys Ala Gln Ala Met Ala Leu Val His Glu Met Leu Gln Gln Thr
50 55 60
Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser Ala Ala Ala Trp Asn Glu Ser
65 70 75 80
Leu Leu His Gln Phe Cys Thr Gly Leu Arg Gln Gln Leu Arg Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Ala Gly Leu Glu Gly Thr Pro Leu Leu
100 105 110
Glu Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe His Arg Leu Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Ser Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val
130 135 140
Arg Ala Glu Val Met Arg Ser Phe Ser Ser Ser Arg Asn Leu Gln Asp
145 150 155 160
Arg Leu Arg Lys Lys Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
165 170 175
Gly Gly Gly Gly Ser Met Asp Pro Glu Pro Ile Val Arg Ile Val Gly
180 185 190
Arg Asn Gly Leu Cys Val Asp Val Arg Asp Gly Arg Phe His Asn Gly
195 200 205
Asn Ala Ile Gln Leu Trp Pro Cys Lys Ser Asn Thr Asp Ala Asn Gln
210 215 220
Leu Trp Thr Leu Lys Arg Asp Asn Thr Ile Arg Ser Asn Gly Lys Cys
225 230 235 240
Leu Thr Thr Tyr Gly Tyr Ser Pro Gly Val Tyr Val Met Ile Tyr Asp
245 250 255
Cys Asn Thr Ala Ala Thr Asp Ala Thr Arg Trp Gln Ile Trp Asp Asn
260 265 270
Gly Thr Ile Ile Asn Pro Arg Ser Ser Leu Val Leu Ala Ala Thr Ser
275 280 285
Gly Asn Ser Gly Thr Thr Leu Thr Val Gln Thr Asn Ile Tyr Ala Val
290 295 300
Ser Gln Gly Trp Leu Pro Thr
305 310
<210> 5
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgtgacctgc ctcagatcca cagcctggct cacaccaggg ccctgaggct cctggcacaa 60
atgaggagaa tctctccctt ctcctgcctg cgccacagaa gggactttgg atcccctcat 120
gaggcttttg ggggcaacca ggtccagaag gctcaagcca tggctctggt gcatgagatg 180
ctccagcaga ccttccagct cttcagcaca gagggctcgg ctgctgcctg gaatgagagc 240
ctcctgcacc agttctgcac tggactgcgc cagcagctca gggacctgga agcctgtgtc 300
atgcaggagg cggggctgga agggaccccc ctgctggagg aggactccat cctggctgtg 360
aggaaatact tccacagact caccctctat ctgcaagaga agagctacag cccctgtgcc 420
tgggagatcg tcagggcaga agtcatgaga tccttctctt cctccagaaa cctgcaagac 480
agactcagga agaaggaggg tggcggcggt agtggcggcg gtggcagcgg tggtggtggt 540
tcaatggacc ctgaaccgat tgttcgcatt gttggtcgca atggcctgtg cgtggatgtg 600
cgcgatggtc gttttcataa tggtaatgcc attcagctgt ggccgtgtaa aagcaatacc 660
gatgcaaatc agctgtggac cctgaaacgt gataatacca ttcgtagcaa tggcaaatgc 720
ctgaccacct atggctatag tccgggtgtt tatgtgatga tctatgattg taataccgca 780
gccaccgatg ccacccgctg gcagatttgg gataatggta caattattaa cccgcgcagt 840
agtctggtgc tggcagcaac cagcggcaat agtggtacaa ccctgaccgt tcagaccaat 900
atctatgccg ttagccaggg ttggctgccg acc 933
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catatgtgtg acctgcctc 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctccttcttc ctgagtctg 19
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttctcctgcc tgcgcca 17
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tctgtggcgc aggcagga 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gactgcgcca gcagctca 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgagctgctg gcgcagtc 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggatccgg aaccgata 18
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaattctaag gtcggcagcc a 21
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
catatgtgtg acctgcctc 19
<210> 14
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggtggcggcg gtagtggcgg cggtggcagc ggtggtggtg gttcaatgga ccctgaaccg 60
a 61
<210> 15
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgaaccacca ccaccgctgc caccgccgcc actaccgccg ccaccctcct tcttcctga 59
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaattcaatg gtcggcagcc aaccctg 27
<210> 17
<211> 498
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 17
tgtgacctgc ctcagatcca cagcctggct cacaccaggg ccctgaggct cctggcacaa 60
atgaggagaa tctctccctt ctcctgcctg gaccacagaa gggactttgg atcccctcat 120
gaggcttttg ggggcaacca ggtccagaag gctcaagcca tggctctggt gcatgagatg 180
ctccagcaga ccttccagct cttcagcaca gagggctcgg ctgctgcctg gaatgagagc 240
ctcctgcacc agttctgcac tggactggat cagcagctca gggacctgga agcctgtgtc 300
atgcaggagg cggggctgga agggaccccc ctgctggagg aggactccat cctggctgtg 360
aggaaatact tccacagact caccctctat ctgcaagaga agagctacag cccctgtgcc 420
tgggagatcg tcagggcaga agtcatgaga tccttctctt cctccagaaa cctgcaagac 480
agactcagga agaaggag 498
<210> 18
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Cys Asp Leu Pro Gln Ile His Ser Leu Ala His Thr Arg Ala Leu Arg
1 5 10 15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Arg His
20 25 30
Arg Arg Asp Phe Gly Ser Pro His Glu Ala Phe Gly Gly Asn Gln Val
35 40 45
Gln Lys Ala Gln Ala Met Ala Leu Val His Glu Met Leu Gln Gln Thr
50 55 60
Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser Ala Ala Ala Trp Asn Glu Ser
65 70 75 80
Leu Leu His Gln Phe Cys Thr Gly Leu Arg Gln Gln Leu Arg Asp Leu
85 90 95
Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Ala Gly Leu Glu Gly Thr Pro Leu Leu
100 105 110
Glu Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe His Arg Leu Thr
115 120 125
Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Ser Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val
130 135 140
Arg Ala Glu Val Met Arg Ser Phe Ser Ser Ser Arg Asn Leu Gln Asp
145 150 155 160
Arg Leu Arg Lys Lys Glu
165
<210> 19
<211> 798
<212> DNA
<213> 蓖麻(Ricinus communis)
<400> 19
gcagatgttt gcatggaccc tgaaccgatt gttcgcattg ttggtcgcaa tggcctgtgc 60
gtggatgtgc gcgatggtcg ttttcataat ggtaatgcca ttcagctgtg gccgtgtaaa 120
agcaataccg atgcaaatca gctgtggacc ctgaaacgtg ataataccat tcgtagcaat 180
ggcaaatgcc tgaccaccta tggctatagt ccgggtgttt atgtgatgat ctatgattgt 240
aataccgcag ccaccgatgc cacccgctgg cagatttggg ataatggtac aattattaac 300
ccgcgcagta gtctggtgct ggcagcaacc agcggcaata gtggtacaac cctgaccgtt 360
cagaccaata tctatgccgt tagccagggt tggctgccga ccaataatac ccagccgttt 420
gttaccacca ttgttggtct gtatggcatg tgtctgcaag ccaatagtgg taaagtgtgg 480
ctggaagatt gtacaagcga aaaagccgaa cagcagtggg ccctgtatgc cgatggtagc 540
attcgcccgc agcagaatcg cgatagttgc ctgaccacag atgccaatat taaaggcacc 600
gttgttaaaa ttctgagctg cggcccggcc agtagcggcc aacgttagat gtttaaaaat 660
gatggcacca ttctgaatct gtatattggc ctggttctgg atgtgcgtcg cagcgatccg 720
agcagtctga aacagattat tgttcatccg gttcatggca atctgaatca gatttggtta 780
ccgctgtttt aagaattc 798
<210> 20
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Met Asp Pro Glu Pro Ile Val Arg Ile Val Gly Arg Asn Gly Leu Cys
1 5 10 15
Val Asp Val Arg Asp Gly Arg Phe His Asn Gly Asn Ala Ile Gln Leu
20 25 30
Trp Pro Cys Lys Ser Asn Thr Asp Ala Asn Gln Leu Trp Thr Leu Lys
35 40 45
Arg Asp Asn Thr Ile Arg Ser Asn Gly Lys Cys Leu Thr Thr Tyr Gly
50 55 60
Tyr Ser Pro Gly Val Tyr Val Met Ile Tyr Asp Cys Asn Thr Ala Ala
65 70 75 80
Thr Asp Ala Thr Arg Trp Gln Ile Trp Asp Asn Gly Thr Ile Ile Asn
85 90 95
Pro Arg Ser Ser Leu Val Leu Ala Ala Thr Ser Gly Asn Ser Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Gln Thr Asn Ile Tyr Ala Val Ser Gln Gly Trp Leu
115 120 125
Pro Thr
130

Claims (10)

1.一种重组猪干扰素融合蛋白，包含猪干扰素突变体和蓖麻毒素B链，其特征在于，所述猪干扰素突变体是将Seq ID NO：1所示猪IFNα的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸突变为极性氨基酸所得到的突变体蛋白。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，突变方式包括将Seq ID NO：1所示的氨基酸序列的第31位和/或第90位氨基酸突变为极性氨基酸。
3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述极性氨基酸包括精氨酸或组氨酸的至少一种。
4.如权利要求1至3任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述蓖麻毒素B链包括Seq IDNO：2所示的氨基酸序列中第4位甲硫氨酸至134位苏氨酸的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述蓖麻毒素B链为蓖麻毒素B链截短肽。
6.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括如Seq ID NO：3所示的氨基酸序列。
7.一种编码权利要求5所述融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因序列包含如Seq IDNO：4所示的核苷酸序列。
8.一种含有权利要求7所述基因的重组载体。
9.一种含有权利要求8所述重组载体的基因工程菌，其特征在于，将权利要求7所述的重组载体转化到大肠杆菌宿主细胞中，获得所述基因工程菌。
10.权利要求1至6任一项所述的融合蛋白在抗病毒药物中的应用。
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