JPS63133987A - 新規なプロモ−タ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規なプロモーターに間する。

本発明のプロモーターは、適当なベクターに挿入され宿
主中で外来性遺伝子の発現に使用される。

（従来の技術と問題点） 遺伝子組換え技術の進歩に伴ない、大腸菌等の原核生物
あるいは酵母、動物細胞等の真核生物宿主中で、有用な
種々のポリペプチドをコートする異種遺伝子を発現させ
て、これ等ポリペプチドを商業的に生産する試みがなさ
れている。

この場合、ベクター中に挿入された異種遺伝子の上流に
、強力な活性を有する転写開始制御領域（プロモーター
）を存在させることが、上記ポリペプチドを効率よく生
産するうえで好ましい。

く問題点を解決するための手段） 本発明は、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のαフ
ェロモン（性フェロモン）を生産する遺伝子である肛α
１の詳細な解析に基づいて種々検討の結果、達成された
ものである。

本発明を以下詳細に説明するに、サッカロマイセス・セ
レビシエのαフェロモンは、α細胞が生産する１３アミ
ノ酸からなるペプチドであり、αフェロモンがα細胞上
のαフェロモン受容体に結合することにより、α細胞は
細胞分裂を止め、接合過程に入る。このαフェロモンは
酵母では極めて稀な分泌性ペプチドであるため、その遺
伝子は異種蛋白質の分泌生産に広く利用されている。

αフェロモンの遺伝子は、染色体上にＭＦαｌ及びＭＦ
α２の２個が存在し、このうちＭＦα１の活性がとくに
強いことが知られている［Ｃｅ１ｌ、３９巻、９３３〜
９４３頁（＋９８２）コ。

αフェロモンの遺伝子ＭＦαｌは、サッカロマイセス・
セレビシエの染色体から１．７５　ｋｂのＥｃｏＲ１断
片として単離され、９６３　ｂｐのプロモーターと５′
の非翻訳領域を含み、その後に１６５アミノ酸をコード
する領域と３ｔｅ　ｂｐの３′非翻訳領域から成る。

本発明者等は、上記９６３　ｂｐのプロモーターと５゛
非翻訳領域を含む領域を解析した結果、該領域中に２個
の転写促進配列（ｌＪｐｓｔｒｅａｍ　Ａｃｔｉｖａｔ
ｉｎｇＳｅｑｅｎｃｅ、　Ｕ　Ａ　Ｓ　）の存在を確認
した。

即ち、αフェロモン前駆体の翻訳開始点から上流−４１
５から−３３６までの次の８０個のＤＮＡ配列：ＴＧＣ
ＡＡＴＡＴＣＣＡＡＣＡＡＣＴＡＴＴＴＧＴＧＣＡＡＴ
ＴＡＴＴＴＡＡＣＡＡＡＡＴＣＣＡＡＴＴＡＡＣＴＴＴ
ＣＣＴＡＡＴＴＡＧＴＣＣＴＴＣＡＡＴＡＣＡＡＣＡＴ
ＣＴ （ＵＡＳＩという） と、その下流−３１３から−２７３までの次の４１個の
ＤＮＡ配列： ＣＣＴＴＣＣＴＡＡＴＴＡＧＧＣＣＡＴＣＡＡＣＧＡＣ
ＡＧＴＡＡＡＴＴＴＴＧＣＣＧＡＡ（ＵＡＳ２という） の配列が本遺伝子の効率の良い転写に必要であるあるこ
とを認めた。

更に研究の結果、上記ＵＡＳ２の配列を、ＴＡＴＡ領域
（−１２８から−１２２）の上流に、更に少なくとも１
個を付加することによって、プロモーター活性を著しく
増強することができることを知り本発明を達成したもの
である。

以下にヒトのβ−エンドルフィンの遺伝子をマーカーと
して使用し、本発明のプロモーターの有用性について詳
細に説明する。

［ベクターの構築］ （１）酵母のα因子ＤＮＡを含むプラスミドｐＬｓＯ！
（４，４ｋｂ）の調製 酵母の染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し２　ｋｂ前後
のＤＮＡ断片をプラスミドｐＵｃ１３（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ社カタログ、Ｐ　−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ
、２７頁、２７−４９７３記載）のＥｃｏＲ１部位に挿
入して大腸菌を形質転換し、挿入ＤＮＡを含む白色のコ
ロニーを集め、上記酵母のα因子ＤＮＡＭＦα１及びＭ
Ｆα２と相同な下記の１６塩基のヌクレオチド ５　’　ＧＧＣＣＡＡＣＣＡＡＴＧＴＡＣＴ３　’（α
因子のＣ末端側の−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｎｅｔ−
Ｔｙｒに相当する） をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーションを
行ない、陽性のコロニーを選択する。次いでプラスミド
ＤＮＡを分離し、酵母のα因子ＤＮＡを含むプラスミド
ｐＬｓＯＩ（４，４ｋｂ）を選択採取する。

（２）プラスミドｐＲＥＩ０３２（５，８ｋｂ）の調製
プラスミドＹＲｐ７（５，７ｋｂ酵母のＴＲＰＩとＡＲ
５Ｉを含むＨＡ断片とｐＢＲ３２２を結合したプラスミ
ド）［Ｎ５ｔｕｒｅ。

２８２巻、３９〜４３頁（１９７９）記載コをＥｃｏＲ
Ｉで部分切断し粘着末端を充填した後、連結してＹＲｐ
７の一方のＥｃｏＲＩサイトが除去されたｐＲＥＩ０３
２（５，８ｋｂ）を調製する。

（３）プラスミドｐＵｃ８−βＥ（２，９ｋｂ）の調製
プラスミドｐＹＴ　３−２４（特開昭５８−９２６９６
号公報、２頁記載）をＨａｅＩＩＩで切断して、ヒトの
β−エンドルフィン遺伝子（９３ｂｐ、以下βＥ　ＤＮ
Ａという）を含む＋６０　ｂｐのＨａｅＩＩＩ　〜Ｈａ
ｅＩＩＩ断片を採取する。一方、ファージＭ１３ｍｐ７
（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　９
巻、３０９〜３２１頁記載）のＲＦ　Ｉ　ＤＮＡ（二本
鎖ＤＮＡ）をＨｉｎｃｌＩで切断し、エタノールに溶解
するＨｉｎｃＩＩ〜ＨｉｎｃＩＩ断片５’ＧＡＣＣＴＧ
ＣＡＧＧＴＣ３’を除いたＨ　ｉ　ｎｃ　１１部位に、
上記βＥ　ＤＮＡを含む＋６０　ｌａｐのＤＮＡ断片を
連結し大腸菌を形質転換した。形質転換株からＲＦＩＤ
ＮＡを調製し、これをＢａｍ）Ｉ　Ｉで切断して得られ
た１７２　ｂｐのＢａｍＨＩ　〜ＢａｍＨＩ断片をプラ
スミドｐＬｌｃ８［ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、発行のＢＲＬカ
タログ（Ａｕｇｕｓｔ　１．１９８３）、Ｃａｔ／　Ｎ
ｏ、５３５９ＳＡ記載コのＢａｗｌ　Ｉ切断部位に挿入
してｐＵｃ８−βＥ（２，９ｋｂ）を得る。

り４）プラスミドｐＲＥ１０４６（７，４ｋｂ）の調製
ｐＬｓＯＩ（４，４ｋｂ）のプロモーター配列及びリー
ダー配列を含むＥｃｏＲＩ　〜Ｈｉｎｄｍ断片（１，４
ｋｂ）とｐｕｃｓ−βＥ（２，９ｋｂ）の旧ｎｄｍ　〜
ＥｃｏＲＩ断片（０，２ｋｂ、βＥＤＮＡを含む）とを
ｐＲＥ１０３２（５，８ｋｂ）のｌ：ｃｏＲＩ切断部位
に連結してｐＲＥ１０４６（７，４ｋｂ）を得る（第１
図）。

Ｕ　〜ＥｃｏＲＩ断片（２，３ｋｂ）旧連結してｐＲＥ
１０５１（５，１ｋｂ）を作製した後ＥｃｏＲＩで部分
切断し、粘着末端を充填後連結して、ｐＲＥ＋０５１の
一方のＥｃｏＲＩ切断部位を欠いたｐＲＥ＋０５２（５
，２ｋｂ）を得る（第２図）。

（６）プラスミドｐＲＥＩ０５９（６，８ｋｂ）の調製
前記（４）で得たｐＲＥ＋０４６のプロモーター配列、
リーダー配列及びβＥ　ＤＮＡ配列を含むＥｃｏＲＩ　
−Ｓ＋ａａＩ断片（＋、６ｋｂ）と、ｐＬｓＯＩ（４，
４ｋｂ）のターミネータ−配列を含むＨｉｎｃＩＩ　〜
ＥｃｏＲＩ断片（０，３ｋｂ）とを採取する。

一方、ｐＲＥ１０５２（５，２ｋｂ）をＥｃｏＲＩで切
断し、次いてバクチリアルアルカリンフォスファターゼ
（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐ
ｈａｔａｓｅ、ＢＡＰ）を加えて末端のリン酸基を外し
た後、これを上記二つのＤＮＡ断片と連結することによ
り、αフェロモンのプロモーター、分泌シグナル、β−
エンドルフィンの遺伝子くβＥ　ＤＮＡ）及びターミネ
ータ−を含むプラスミドｐＲＥＩ０５９（６，８ｋｂ）
を得る（第３図）。

（７）プラスミドｐｌＮに００２（４，４ｋｂ）のＳｌ
！Ｉ′！ｊｉｐＲＥ１０５９の肛αｌとβＥ　ＤＮＡを
含むＥｃｏＲＩ断片をプラスミドｐｔＪｃ９に挿入した
プラスミドｐｌＮＫＯＯ２を調製する。

即ちｐＲＥ’＋０５９をＥｃｏＲＩで切断したＥｃｏＲ
Ｉ　〜ＥｃｏＲ１断片を、プラスミドｐＵｃ９（２，７
ｋｂ）［Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ−５ｅａｒｃｈ　Ｌａ
ｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、発行のＢＲＬカタロ
グ（Ａｕｇｕｓｔ　１，１９８３）、Ｃａｔ／　Ｎｏ、
５３６０ＳＡ記載コをＥｃｏＲＩで切断し、次いでＲＡ
Ｐ処理した断片と連結してｐｌＮに００２を得る（第４
図）。

（８）プラスミドｐｌＮＫ　Ａ４９（４，３ｋｂ）及び
ｐｌＮにＡ４０（４，３ｋｂ）の調製 ｐｌＮに００２に含まれる肝αｌ遺伝子のＵ　Ａ　Ｓ　
２　（以下便宜上ＵＡＳ２で示す）配列とＴＡＴＡ（以
下便宜上ＴＡＴＡで示す）配列の間に６５　ｂｐの欠失
を持つプラスミドｐｌＮに−Ａ４９とＮ５ｉｌ部位から
ＴＡＴＡ配列を含む１１１ｂｐの欠失を持つｐｌＮＫ−
Ａ４０（４，３ｋｂ）を調製する。

即ちｐｌＮＫＯＯ２をＮｓｉ　Ｉで切断し、ヌクレアー
ゼＢＡＬ３１て末端領域を消化した後、フレノウ酵素で
末端を充填し、次いＴ：　Ｘｈｏ　Ｉリンカ−（ｐＣＣ
ＴＣＧＡＧＧ）を継ぎＸｈｏ　ＩとＡａｔ　ｎで切断し
、旺α１のＴＡＴＡ領域、分泌シグナル、ターミネータ
−とβＥの前駆体領域及びｐＵｃ９の一部を含むＸｈｏ
　Ｉ　−Ａａｔｌｌ断片を得る。

一方、ｐｌＮに００２をＮ５ｉｌで切断し、ヌクレアー
ゼ゛・、’ｔ：　Ｘｈｏ　Ｉ　−ＡａｔＩＩ断片を得る
。両断片を連結して、Ｎ５ｉｌ切断部位から下流に６５
　ｂｐの欠失を有するｐｌＮにＡ４９（４，３ｋｂ）と
、Ｉｌｌ　ｂｐの欠失を有するｐｌＮにＡ４０（４，３
ｋｂ）を得る（第４図）。

（９）プラスミドｐＡにｌ　Ａ４９（６，７ｋｂ）の調
製旺α１遺伝子のＵＡＳ　１及びＵＡＳ２配列とＴＡＴ
Ａ配列の間の６５　ｂｐが欠失し、そこにＸｈｏ　Ｉ切
断部位を有する、βＥの発現ベクターｐＡＫＩ　Ａ４９
（６，７ｋｈ）を調製する。

即ち、前記（５）で得たｐＲＥ＋０５２をＥｃｏＲＩで
切断しＢＡＰ処理して得られたＥｃｏＲＩ　−ＥｃｏＲ
Ｉ断片と、ｐｌＮにＡ４９をＥｃｏＲＩで切断して得ら
れた、ＭＦαｌとβＥ遺伝子を含むＥｃｏＲＩ　−Ｅｃ
ｏＲＩ断片とを連結してプラスミドｐＡにＩ　Ａ４９（
６，７ｋｂ）を得る（第５図）。

（１０）プラスミドｐＡＫ１０３６−３０（６，９ｋｂ
）及Ｕ　ｐＡＫ１０３６−２０（６，８ｋｂ）の調製 前記に得たｐＩＮＫ　Ａ４０（４，３ｋｂ）とｐＡＫＩ
　Ａ４９（６，７ｋｂ）とから、旺αｌのＴＡＴＡ領域
の上流にＬＩＡＳ２配列が３個挿入された、即ち全体と
して４個のＵＡＳ２配列を含んだｐＡＫ１０３６−３０
（６，９ｋｂ）と、旺αｌのＴＡＴＡ領域の上流にＵＡ
Ｓ２配列カ月個挿入された、即ち全体として２個のｔＪ
Ａｓ２配列を含んだｐＡに１０３６−２０（６，８ｋｂ
）とを得る。

即ち、ｐｌＮＫ　Ａ４０をＸｍｎ　Ｉ次いでＸｈｏ　Ｉ
て切断し、ＩＪＡＳ２を含むＸｍｎ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ
断片のＸｆｆＩｎ　１部位にＸｈｏ　１リンカ−（ｐＣ
ＣＴＣＧＡＧＧ）を付加してＸｈｏ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ
断片とする。

一方、ｐＡＫＩ　Ａ４９を同様にＸｈｏ　Ｉで切断し、
次いでＢＡＰで処理することによりＸｈｏ　Ｉ　−Ｘｈ
ｏ　Ｉ断片を得、これと上記ｐｌＮＫ　Ａ４０からのＵ
ＡＳ２配列を含むＸｈｏ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ断片を連結
する。得られたプラスミドの中から、１ＪＡｓ２配列を
含むＸｈｏ　１−　Ｘｈｏ　Ｉ断片が３個並列に挿入さ
れたプラスミドｐＡＫ１０３６−３０（６，９ｋｂ）と
、１個挿入されたプラスミドｐＡＫ＋０３６−２０（６
，８ｋｂ）を得る（第６図）。

以上の方法によって得られたｐＡに＋０３６−３０（６
，９ｋｂ）は、ＭＦα１遺伝子に通常含まれるＩＪＡＳ
Ｉと１ＪＡｓ２の配列に加えて、１ＪＡｓ２の配列を更
に３個付加した発現ヘクターである。

また、ｐＡＫ１０３６−２０（６，８ｋｂ）は、ＭＦα
Ｉ遺伝子に通常含まれるＵＡＳＩとＬＩＡＳ２の配列に
加えて、ＬＩＡＳ２の配列を更に１個付加した発現ベク
ターである。

プラスミドｐＡＫ　＋　０３６−３０及びｐＡＫ＋０３
６−２０を、夫々適当な酵母宿主中に導入して発現させ
た場合、βエンドルフィンの培地中への分泌量は、後記
実施例に示すように、プロモーターとしてαフェロモン
の遺伝子ＭＦα１自体のプロモーターを用いた前記ｐＲ
Ｅ＋０５９の場合に比し、ｐＡＫ１０３６−３０の場合
的２．６倍に増大し、またｐＡＫ１０３６−２０の場合
は約１．６倍に増大する。

（実施例） 以下に実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説明する。

なお、以下の実施例における操作は、特に記載する場合
を除き、次の■〜■の方法によった。

■［制限酵素による　［）ＮＡの切断と回収］制限酵素
による切断用緩衝液は、下記４種類を用い（１）〜（３
）の使い分けは、Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅｒｉａ
ｌＧｅｎｅｔｉｃｓ（１９Ｂ＋）（Ｃｏｌｄ　ｓｐｒｉ
ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）に従った。ま
た切断条件は２単位／μｇＤＮＡの制限酵素を用い３７
℃または６５℃で３０分１処理する。

次いで、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ８，０
及び１ｍ門のＥＤＴＡからなる）で飽和したフェノール
で１回抽出し、エーテルでフェノールを除き、２倍容の
エタノールを加えて一２０℃で３０分間放置した後、遠
心分離してＤＮＡを回収する。

５０　ｍＭのＮａＣｌ、ｔｏ　ｍＭのトリス塩酸（ｐ）
Ｉ　７．４）、１０ｍＭの硫酸マグネシウム及びｌＩＩ
ＩＭのジチオスレイトールからなる。

（３）高塩濃度緩衝液 １００　ｍＨのＮａＣｌ、５０　ｍＭのト°リス塩２１
（ｐＨ７，４）及び１０　ｍＭの硫酸マグネシウムから
なる。

■［大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ　１）ＹＯ１６０匡■からのプ
ラスミドＤＮＡの調製］ （１）ミニ調製法（ｍｉｎｉ　ｐｒｅｐ法）　Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

７巻、１５１３〜１５２３頁（１９７９）］大腸菌ＹＯ
１６０劇」を宿主とし、０．５１のし一ブロス（１０ｇ
のペプトン、５ｇのイースト・エキス、１ｇのグルコー
ス、５ｇのＮａＣ１／　ｌからなる　ｐＨ７，２）を用
いて一夜間培養し、遠心分離して集菌した菌体を１００
μ＋の溶Ｋｌ　Ａ（５０ｍＭのグルコース、１０ｍＭの
ＥＤＴＡ、　２５　ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８，０）及
びリゾチーム２ｍｇ／ｍｌからなる）に懸濁し室温で３
０分間放置する。

次いで氷水中で２００μｍの溶液Ｂ［１χの５Ｏ５（ド
デシル硫酸ナトリウム）を含む０．２ＮのＮａ０）ｌコ
を加えて振盪して同時に［ｌＮＡの変性を行う。１５０
μｍの叶酢酸ソーダ溶液を加え水冷後、遠心分離し、上
清に冷エタノールを加え、−２０℃に冷却して遠心分離
し沈澱を集める。

沈澱を溶液Ｃ（５０ｍＭのトリス塩酸及び０．１　Ｍの
酢酸ソーダからなる）に溶解し、不溶物を除去後、冷エ
タノールを加え、沈澱する　ＤＮＡを洗浄し、減圧下乾
燥し一２０℃で保存する。

（２）大量調製法 ２００情１のし一ブロス（薬剤耐性プラスミドの場合は
薬剤を含む）に大腸菌’１０１６０　江聾を植菌し、−
夜間培養し、集画後１５　ｍｌの５ＴＥＳ緩衝液［：　
ＴＥＳ緩衝液＜１０慣門のトリス塩酸（ｐＨ７，４）、
Ｉ　ｍＭのＥＤＴＡ及び５０　ｍＭのＮａＣｌからなる
）に２５ｚのサッカロースを添加したもめ］に懸濁し、
ＥＤＴＡ、リゾチーム及びリボヌクレアーゼＡ（シグマ
社製）を夫々３０　ｍＭ、６００μ３／ｍｌ及び５０μ
ｇ／ｍｌ加え、更に氷水中でプロナーゼＥを５００μｇ
　／ｍｌ添加する。次いて、ＳＤＳをｌｚとなるように
加えて３７℃で＠盪後氷水中に戻し、ＮａＣｌを終濃度
ＩＭとなるように添加した後、遠心分離し、上清に２倍
容の冷エタノールを加え一２０℃に保持し遠心分離して
ＤＮＡを沈澱として回収し、減圧上乾燥し一２０℃で保
存する。

ＩＩＩ　［Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる連結コ連結する２
個のＤＮＡ断片は、ｌμｇ　／１０μｍになるように、
連結用緩衝液［６６ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，５）、
６．６　ｍＭの塩化マグネシウム、１０　ｎ＋Ｈのジチ
オスレイトールからなるコに溶解し６５℃で１０分間処
理した後、４℃で６６μ門のＡＴＰ（アデノシントリフ
オスフェート）を加え、更にＴ４リガーゼを粘着末端の
場合は０．１単位／μｇ　ＤＮＡ、また平滑末端の場合
は１単位／μｇ　ＤＮＡになるように加えて４℃で１８
時間反応させた後、６５℃で１０分間処理する。

■［大腸菌の形質転換（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔｅ
ｒｉ　ｌ　Ｇｅ　−ｎｅｔｉｃｓ（＋９８１）（Ｃｏｌ
ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｖｏｒ、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒ
ｋ）コ５ｍｌのＬ−ブロスに、大腸菌ＹＯ１６０匡昌を
植菌し、−夜間培養する。この０．２　ｍｌを２０ｍ１
のし一ブロスに植え、３７℃でクレットユニットが６０
に達するまで振盪培養する。菌体な集め水冷した５０　
ｍＭの塩化カルシウムとｌｏｍＭのトリス塩酸（ｐＨ８
，０）とからなる緩衝液１０　ｍｌに懸濁し３０分間水
冷する。

遠心分離した菌体をｌ　ｍｌの塩化カルシウム溶液に懸
濁し、この０．１　ｍｌを１０μｍのＤＮＡ溶液と混合
し、０℃で３０分間、４２℃で２分間インキユヘートし
た液［３０ｍＭの酢酸ソーダ（ｐＨ４，２５）、０．３
ＭのＮａＣｌ及び４ｍＭの硫酸亜鉛からなるコに溶解し
、Ｓｌヌクレアーゼを２０単位／μｇＤＮＡ加え、２２
℃で４０分間処理し、ＴＥ緩衝液で飽和したフェノール
で抽出処理した後、エーテルでフェノールを除き、冷エ
タノールを加え一２０°Ｃに冷却し、遠心分離により沈
澱したＤＮＡを回収する。

ＶＩ［ＸｈｏＩリンカ−のリン酸化コ Ｘｈｏ　Ｉリンカ−（Ｂ、Ｒ，Ｌ社製）５’ＣＣＴＣＧ
ＡＧＧ　３’ ３’ＧＧＡＧＣＴＣＣ５’ は、末端にリン酸基が付いていないので、Ｔ４キナ−七
でリン酸化を行なった。

３　ｎｍｏｌのＸｈｏ　Ｉリンカ−を、４１μｍのａｏ
ｍＭトリス塩酸（ｐ）ｌ　７．５）及び１２　ｍＭの塩
化マグネシウムに溶解し、６０℃で１０分間インキュベ
ートした後、３７℃で１０　ｍＭの２−メルカプトエタ
ノールと、２０　ｍＭのＡＴＰを加え更に１０単位のＴ
４キナーゼを添加して３７℃で３０分間処理した後、−
２０℃で保存する。

■［Ｘｈｏ　Ｉリンカ−の平滑末端への連結コ平滑末端
のＤＮＡ断片（１，２ｐ　ｍｏｌ末端）と上記■でリン
酸化したＸｈｏ　Ｉリンカ−（１００ｐｍｏｌ末端）を
連結用！１衝液［６６ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７，５）
、６．６　ｍ門の塩化マグネシウム、１０　ｍＭのジチ
オスレイトールからなるコに溶解し１単位のＴ４リガー
ゼを加え４℃で１８時間反応後、Ｘｈｏ　Ｉで処理して
余分のＸｈｏ　１リンカ−を除き、ＴＥ緩衝液で飽和し
たフェノールでＤＮＡを抽出し、エーテルでフェノール
を除去後エタノール沈殿でＤＮＡを回収する。

■［プラスミドＤＮＡのバクチリアルアルカリンフォス
ファターゼ（ＢＡＰ）処理コ プラスミドＤＮＡの自己連結を阻止するため、ブラスミ
）”ＤＮＡの制限酵素部位とＤＮＡ断片との連結に先だ
ってプラスミドＤＮＡを予め８ＡＰて処理する。

制限酵素で切断したプラスミドＤＮＡ（１０ｐＩＩｌｏ
ｌ　５’末端）を、２００μｍのＲＡＰ緩衝液［１０ｍ
Ｍのトリス塩酸（ｐＨ８，０）及び０−１ｍＭのＥＤＴ
Ａからなる］に溶解し１００単位のＢＡＰを加え６５℃
で１時間反応後、ＴＥ緩衝液で飽和したフェノールで抽
出処理し、エーテルでフェノールを除去し、エタノール
沈澱によりプラスミドＤＮＡを回収する。

ＩＸ　［ＢＡＬ３１処理コ ＤＮＡの両端から２本鎖とも消化するため、ＢＡＬ３１
処理を行う。

エタノール沈澱した１５μｇのＤＮＡを、２０μｍの５
ＸＢＡＬ緩衝漬［３Ｍの塩化ナトリウム、６０　ｍＭの
塩化カルシウム、６０　ｍＭの塩化マグネシウム及び５
ｍＭのＥＤＴＡＩに溶解し、水７９μｍとＢＡＬ酵素を
１μｍ（２単位）加え２０℃で３０分間保温する。反応
後フェノールで３回、エーテルで３回抽出した後エタノ
ール沈澱を行う。

実施例 （＋）プラスミドｐＬｓＯ！（４，４ｋｂ）の調製サツ
カロミセス・セレビシェ（ＩＦＯ１１３６）の染色体Ｄ
　Ｎ　Ａ　５００μｇを５００μｍの緩衝液［１００ｍ
Ｍのトリス塩Ｍ（ｐＨ７，５）、５０　ｍＭのＮａＣＩ
、１０　ｍＭの塩化マグネシウム及びＩ　ｍＭのジチオ
スレイトールからなる］中で１５単位のＥｃｏＲＩで３
７℃、１夜間処理して切断した後濃縮し、蔗糖密度勾配
遠心にかけ、２　ｋｂ前後のＤＮＡ断片を集めた。これ
をプラスミドｐｌＪｃ１３をＥｃｏＲＩを用いて切断し
た断片１μｇとＴ４リガーゼ２単位を用いて連結し、得
られたプラスミドで大Ｉｌｌ菌ＪＭ８３味を形質転換し
、アンピシリン（Ａρ）耐性株を選択した。

合成オリゴヌクレオチド ５’ＧＧＣＣＡＡＣＣＡＡＴＧＴＡＣＴ　３’−−−の
決定により、Ｃｅ１ｌ、３０巻、９３７頁（１９８２）
の記載と一致する塩基配列を有するα因子ＤＮＡを含む
プラスミドｐＬｓＯ１（４，４ｋｂ）を選択採取した。

（２）プラスミドｔ）ＲＥ１０３２　（５，８ｋｂ）の
調製プラスミドＹＲρ７（５，７ｋｂ）をＥｃｏＲＩで
部分切断し、粘着末端を充填した後Ｔ４リガーゼて連結
して’／Ｒｐ７の一方のＥｃｏＲＩサイトが除去された
ｐＲＥ１０３２（５，８ｋｂ）を調製した。

（３）プラスミドｐＬＩｃ８−βＥ（２，９ｋｂ）の調
製プラスミドｐＹＴ３−２４をＨａｅｍで切断してβＥ
　ＤＮＡ（９３ｂｐ）を含む＋６０　ｂｐのＨａｅＩＩ
Ｉ　−Ｈａｅｌｌｌ断片を採取した。

一方、ファージＭ１３ｍｐ７のＲＦ　Ｉ　ＤＮＡを　）
Ｉ　ｉ　ｎｃ　ＩＩで切断し、エタノールを添加してエ
タノールに溶解する断片５’ＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣ
３’（Ｈｉｎｃ■−Ｈ１ｎｃ■）を除去した後、Ｈｉｎ
ｃ［Ｉ部位に、上記βＥいＡを含む１６０ｂρのｔｌａ
ｅｍ　−）１ａｅｌｌｌ断片をＴ４リガーゼで連結し、
これを大腸菌に導入した。形質転換株からＤＮＡを調製
しこれをＢａｍＨＩで切断し、得られたＢａｍ１ｌ　Ｌ
　−［！ａｍＨＬ断片を、プラスミドｐｕｃａのＢａｍ
ＨＩ部位に°１人してｐＵｃ８−βＥ（２，９ｋｂ）を
得た。

（Ｉ４）プラスミドｐＲＥ１０４６（７，４ｋｂ）の調
製してプロモーター配列及びリーダー配列を含むＥｃｏ
ＲＴ　−ｔｌｉｎｄｌｌＩ断片（１，４ｋｂ）を得た。

（ロ）ｐＩＪＣ８−Ｅ（２，９ｋｂ）を）ｌｉｎｄｍ及
びＥｃｏＲＩで切断してＨｉｎｄｍ　〜ＥｃｏＲＩ断片
（０，２ｋｂ）を得た。

（ハ）ｐＲＥ＋０３２（５，８ｋｂ）をＥｃｏＲＩで切
断し、これを上記（イ）及び（ロ）で得たＤＮＡ断片と
Ｔ４リガーゼを用いて連結してｒ＋ＲＥ＋０４６（７，
４ｋｂ）を得た。

（５）プラスミドｐＲＥ１０５２（５，２ｋｂ）の調製
（イ）ｐＲＥ１０３２（５，８ｋｂ）をＥｃｏＲＩ及び
ＰｓｔＩで切断してＴＲＰ　ｌを含むＥｃｏＲＩ　−Ｐ
ｓｔ　Ｉ断片（（１，８ｋｂ）を得た。

（ロ）２μｍプラスミドをＥｃｏＲＩで切断し、その粘
着末端を充填して平滑末端とした後、Ｐｓｔ　Ｉて切断
して複製開始点を含むＰｓｔ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ断片（
２ｋｂ）を得た。

（ハ）上記（イ）及び（ロ）で得たＤＮＡ断片を、ｐ８
Ｒ３２２をＥｃｏＲＩ及びＰｖｕ　ＩＩで切断したＰｖ
ｕ　ＩＩ　−ＥｃｏＲＩ断片（２，３ｋｂ）と共に７４
ＤＮＡリガーゼによって連結してｐＲＥ１０５１（５，
１ｋｂ）を作製し、ＥｃｏＲＩで部分切断した後、粘着
末端を充填して平滑末端としてＴ４リガ（６）プラスミ
ドｐＲＥ＋０５９（６，８ｋｂ）の調製（イ）ｐＲＥ１
０４６（７，４ｋｂ）をＥｃｏＲＩ及びＳｍａ　Ｉて切
断し、得られたプロモーター配列、リーダー配列及びβ
Ｅ　ＤＮＡ配列を含むＥｃｏＲＩ　−Ｓｍａ　Ｉ断片（
１，６ｋｂ）を（采取した。

（ロ）ｌ）ＬＳＯＩ（４，４ｋｂ）を）Ｉ　ｉ　ｎｃ　
ＩＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、ターミネータ−配列を含
むＨｉｎｃＩＩ　−ＥｃｏＲＩ断片（０，３ｋｂ）を採
取した。

（ハ）ｐＲＥ１０５２（５，２ｋｂ）をＥｃｏＲＩで切
断し、ＢＡＰを加えて末端のリン酸基を外した後、上記
（イ）及び（ロ）で得たＤＮＡ断片とＴ４リガーゼを用
いて連結してプラスミドＩ］ＲＥ１０５９（６，８ｋｂ
）を得た。

（７）プラスミドｐｌＮＫＯＯ２（４，４ｋｂ）の調製
ｐＲＥ１０５９をＥｃｏＲＩて切断したＥｃｏＲＩ　−
ＥｃｏＲＩ断片を、プラスミドｐＵｃ９（２，７ｋｂ）
をＥｃｏＲ１で切断し次いでＢＡＰ処理して得た断片と
連結してｐｌＮに００２（４，４ｋｂ）を得た。

（８）プラスミドｐｌＮＫ−Ａ４９（４，３ｋｂ）及び
ｐｌＮＫ−Ａ４０（４，３ｋｂ）の調製 ｐ　ｌ　ＮＫＯＯ２をＮ５ｉｌで切断し、ヌクレアーゼ
ＢＡＬ３１て末端領域を消化した後、フレノウ酵素で末
端を充填し、次いでＸｈｏ　Ｉリンカ−（ｐＣＣＴＣＧ
ＡＧＧ）を継ぎ、Ｘｈｏ　ＩとＡａｔＩＩて切断し、Ｍ
ＦａｌのＴＡＴＡ領域、分泌シグナル、ターミネータ−
とβＥの前駆体領域及びｐ　ＩＪ　Ｃ９の一部を含むＸ
ｈｏ　Ｉ　−ＡａｔＩＩ断片を得た。

一方、ｐ’ｌ’ＮＫＯＯ２をＮ５ｉＩで切断し、ヌクレ
アーゼ５１で処理して平滑末端にした後、前記Ｘｈｏ　
Ｉリンカ−を結合し、Ｘｈｏ　ＩとＡａｔＩ［て切断し
て、ＭＦａｌのｔＪＡｓｌ及びＵＡＳ２配列とρＵＣ９
のの大部分の領域を含むＸｈｏ　Ｉ　−ＡａｔＩＩ断片
を得た。この両断片を連結して’ｌ５ｉｌ切断部位から
下流に６５　ｂｐの欠失を有するｐｌＮＫ　Ａ４９（４
，３ｋｂ）と、ＩＩＩ　ｂｐの欠失を有するｐｌＮＫＡ
４０（４，３ｋｂ）を得たく第４図）。

（９）プラスミドｐＡＫＩ　Ａ４９（６，７ｋｂ）の調
製前記（５）で得たｐＲＥ１０５２をＥｃｏＲＩで切断
しＢＡＰ処理して得られたＥｃｏＲＩ　−ＥｃｏＲＩ断
片と、ｐｌＮＫ　Ａ４９をＥｃｏＲＩて切断して得られ
た、ＭＦａｌとβＥ遺伝子を含むＥｃｏＲｒ　−Ｅｃｏ
ＲＩ断片とを連結してプラスミ１”　ｐＡＫＩ　Ａ４９
（６，７ｋｂ）を得た（第５図）。

（１０）プラスミドｐＡに＋０３６−３０（６，９ｋｂ
）及びｐＡＫ１０３６−２０（６，８ｋｂ）の調製 ｐｌＮＫ−Ａ４０をＸｎ＋ｎ　１次いでＸｈｏ　Ｉて切
断し、ＵＡＳ２を含むＸｍｎ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ断片の
Ｘｍｎ　１部位にＸｈｏ　Ｉリンカ−（ｐＣＣＴＣＧＡ
ＧＧ）を付加しテＸｈｏ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ断片とした
。

一方、ｐＡＫＩ　Ａ４９を同様にＸｈｏ　Ｉで切断し、
次いでＳＡＰで処理することによりＸｈｏ　ｒ　−Ｘｈ
ｏ　Ｉ断片を得、これと上記ｐｌＮにＡ４０からのＵＡ
Ｓ２配列を含むＸｈｏ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ断片を連結し
た。得られたプラスミドの中から、ＵＡＳ２配列を含む
Ｘｈｏ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ断片が３個並列に挿入された
プラスミドｐＡに１０３６−３０（６，９ｋｂ）と、１
個挿入されたプラスミドｐＡＫ１０３６−２０（６，８
ｋｂ）を得たく第６図）。

（ＩＩ）プラスミドｐＡＫ＋０３６−３０及びｐＡＫ　
１０３６−２０によるサッカロマイセス・セレビシエ２
０Ｂ−１２株の形質転喚 サツカロミセス・セレビシェ２０Ｂ−１２株を、ＹＰＤ
培地（１χの酵母エキス、２ｚのペプトン及び２χのグ
ルコースからなる）で−夜間培養した培養液０．５　ｍ
ｌを２０ｍ１のＹＰＤ培地に植え、３０℃でクレットユ
ニット６０まで振盪培養した。この１０　ｍｌを遠心分
離して得た菌体を１０　ｍｌのＴＥ緩衝液で洗浄し、ｌ
　ｍｌのＴＥ緩衝液に懸濁した。この０．５１に、０．
５ｍｌの０．２Ｍ酢酸リチウム、１０　ｍＭのトリス塩
酸（ｐＨ７，５）及びｌ　ｍＨのＥＤＴＡを加え、３０
℃で１時間保持した後、氷水中で冷却した。

間、次いて４２℃で５分間保持した後、集菌し、０．５
ｍｌの水で洗浄後０．３１の水に懸濁し、プレート１枚
に０．１　ｍｌ植えた。

（１２）β−エンドルフィンの分泌量 上記（ｌＯ）で得たプラスミドｐＡＫ＋０３６−３０及
びｐＡＫ＋０３６−２０を夫々含む酵母を２日間培養し
た後遠心分離し、上清について、β−エンドルフィン［
ＲＩＡ］キット、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅ
ａｒ社、カタログ番号’＋ＥＫ−００３を使用し、カタ
ログ記載の方法に従ってラジオイムノアッセイを行なっ
た結果、上清中のβ−エンドルフィンの分泌・量は、プ
ラスミド’ｐＡＫ１０３６−３０を含む酵母では１，４
１３　μｇ／ｍｌであり、また、ｐＡに１０３６−２０
を含む酵母では８８８　μｇ／ｍｌてあった。

なお前記のプラスミドｐＲＥ＋０５９により、同（ｆに
サッカロマイセス・セレビシエ２０Ｂ−１２ｔｉを形質
転換し、培養後、遠心分離した上清について、上記と同
一方法により測定したβ−エンドルフィンの分泌量は５
４４μｇ／ｍｌであった。

（発明の効果） 本発明のプロモーターを含有するプラスミドを導入した
サッカロマイセス・セレビシエは、従来のＭＦａｌ自体
のプロモーターを含有するプラスミドを導入した場合に
比して、前記実施例に示すように、高い効率で異種蛋白
質を培！ｉｉ液中に分泌させることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第６図は、夫々プラスミドｐＲＥ＋０４６、ｐ
ＲＥ１０５２、ｐＲＥ＋０５９、ｐｌＮＫ　Ａ４０及び
ｐｌＮＫ　Ａ４９、ｐＡＫＩＡ４９、ｐＡＫ　ｌ　０３
６−３０及びｐＡＫ　ｌ　０３６−２０の構成ルートを
示す模式図である。 出願人　工業技術院長　　飯　塚　幸　三乃　工　巴 謀６図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵母サッカロマイセス・セレビシエのαフエロモ
   ン遺伝子ＭＦα１の翻訳開始点の上流−３１３から−２
   ７３までのＤＮＡ配列 【遺伝子配列があります】 を、ＴＡＴＡ領域（−１２８から−１２２）の上流に少
   なくとも１個挿入してなるプロモーター。