JP2599892B2 - 新規コスミドベクターを用いる遺伝子バンクの製造法 - Google Patents
新規コスミドベクターを用いる遺伝子バンクの製造法Info
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- JP2599892B2 JP2599892B2 JP9511694A JP9511694A JP2599892B2 JP 2599892 B2 JP2599892 B2 JP 2599892B2 JP 9511694 A JP9511694 A JP 9511694A JP 9511694 A JP9511694 A JP 9511694A JP 2599892 B2 JP2599892 B2 JP 2599892B2
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は遺伝子操作技術に関し、
さらに詳しくは遺伝子操作技術を使つて作成した新規コ
スミドベクターを用いる遺伝子バンクの製造法に関す
る。
さらに詳しくは遺伝子操作技術を使つて作成した新規コ
スミドベクターを用いる遺伝子バンクの製造法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】ヒトをはじめとする哺乳動物の遺伝子の
大きさは２０キロ塩基対（以下キロ塩基対をＫｂｐと略
す）を越えるものが少なくない。現在、広く使われてい
るラムダベクターにクローン化できるＤＮＡの大きさは
２０Ｋｂｐなので、これより大きい遺伝子全体を機能の
ある形でクローン化することはできない。
大きさは２０キロ塩基対（以下キロ塩基対をＫｂｐと略
す）を越えるものが少なくない。現在、広く使われてい
るラムダベクターにクローン化できるＤＮＡの大きさは
２０Ｋｂｐなので、これより大きい遺伝子全体を機能の
ある形でクローン化することはできない。
【０００３】ラムダフアージのｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎ
ｄ ｓｉｔｅ（以下ｃｏｓと略す）を有するベクター、
すなわちコスミドベクターを使えば３５〜４５Ｋｂｐの
大きさのＤＮＡをクローン化できる。種々のベクターの
中で、コスミドベクターが最も大きい長さのＤＮＡをク
ローン化できるが、長いゲノムＤＮＡの調製がむずかし
いことや、インサートのないベクターだけのバツクグラ
ンドが高いこと、また効率が良くないことなどが障害に
なつて、コスミドベクターの利用はなかなか進まなかつ
た。ところが、Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚ ＆ Ｂｕｒ
ｋｅはホスフアターゼを利用してベクターに方向性を持
たせる工夫をし、ベクターだけのバツクグランドの値を
下げるとともにクローン化の効率を上げることに成功し
た〔Ｄ．Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚ ＆ Ｊ．Ｆ．Ｂｕ
ｒｋｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，
２８８９，（１９８１）〕。
ｄ ｓｉｔｅ（以下ｃｏｓと略す）を有するベクター、
すなわちコスミドベクターを使えば３５〜４５Ｋｂｐの
大きさのＤＮＡをクローン化できる。種々のベクターの
中で、コスミドベクターが最も大きい長さのＤＮＡをク
ローン化できるが、長いゲノムＤＮＡの調製がむずかし
いことや、インサートのないベクターだけのバツクグラ
ンドが高いこと、また効率が良くないことなどが障害に
なつて、コスミドベクターの利用はなかなか進まなかつ
た。ところが、Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚ ＆ Ｂｕｒ
ｋｅはホスフアターゼを利用してベクターに方向性を持
たせる工夫をし、ベクターだけのバツクグランドの値を
下げるとともにクローン化の効率を上げることに成功し
た〔Ｄ．Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚ ＆ Ｊ．Ｆ．Ｂｕ
ｒｋｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，
２８８９，（１９８１）〕。
【０００４】Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｃｚ ＆ Ｂｕｒｋ
ｅ法によるゲノムＤＮＡの遺伝子バンクの製造法は以下
のようである（たとえば、現在広く使われているコスミ
ドベクターの１つであるｐＪＢ−８を例にとる）。ｐＪ
Ｂ−８は５．４４Ｋｂｐの大きさで、制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ、ＨｉｎｄIII 、Ｓａ１Ｉでそれぞれ１カ所切断さ
れ、ラムダフアージのｃｏｓを１個有するコスミドベク
ターである。 （１）ｐＪＢ−８をＨｉｎｄIII で切断することによつ
て直線状ＤＮＡとし、次にホスフアターゼ処理によつて
ＨｉｎｄIII の切断片を不活化する。そして、ＢａｍＨ
Ｉで切断することによつて２個のＤＮＡ断片が得られ、
ｃｏｓを含む大きなＤＮＡ断片（５．４Ｋｂｐ）をアガ
ロースゲル電気泳動法によつて単離する。得られたｃｏ
ｓを含むＤＮＡ断片（５．４Ｋｂｐ）が、ラムダフアー
ジの左腕に相当する。
ｅ法によるゲノムＤＮＡの遺伝子バンクの製造法は以下
のようである（たとえば、現在広く使われているコスミ
ドベクターの１つであるｐＪＢ−８を例にとる）。ｐＪ
Ｂ−８は５．４４Ｋｂｐの大きさで、制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ、ＨｉｎｄIII 、Ｓａ１Ｉでそれぞれ１カ所切断さ
れ、ラムダフアージのｃｏｓを１個有するコスミドベク
ターである。 （１）ｐＪＢ−８をＨｉｎｄIII で切断することによつ
て直線状ＤＮＡとし、次にホスフアターゼ処理によつて
ＨｉｎｄIII の切断片を不活化する。そして、ＢａｍＨ
Ｉで切断することによつて２個のＤＮＡ断片が得られ、
ｃｏｓを含む大きなＤＮＡ断片（５．４Ｋｂｐ）をアガ
ロースゲル電気泳動法によつて単離する。得られたｃｏ
ｓを含むＤＮＡ断片（５．４Ｋｂｐ）が、ラムダフアー
ジの左腕に相当する。
【０００５】（２）ｐＪＢ−８をＳａｌＩで切断するこ
とによつて直線状ＤＮＡとし、次にホスフアターゼで処
理することによつてＳａｌＩの切断片を不活化する。そ
して、ＢａｍＨＩで切断することによつて２個のＤＮＡ
断片が得られ、ｃｏｓを含む小さなＤＮＡ断片（２．３
４Ｋｂｐ）をアガロースゲル電気泳動法によつて単離す
る。得られたｃｏｓを含むＤＮＡ断片（２．３４Ｋｂ
ｐ）が、ラムダフアージの右腕に相当する。 （３）たとえば、ヒトのゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ
３ＡもしくはＭｂｏＩで部分的に切断し、３５〜４５Ｋ
ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を分画する。この３５〜４５
Ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を、（１）と（２）で別々
に調製した左腕と右腕との間に、連結酵素（Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼ）で挿入させて、組換え体ＤＮＡを調製す
る。 （４）組換え体ＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏパツケージン
グで形質導入フアージ粒子に変え、次いで大腸菌に感染
させることによりヒトのゲノムＤＮＡの遺伝子バンクが
製造できる。
とによつて直線状ＤＮＡとし、次にホスフアターゼで処
理することによつてＳａｌＩの切断片を不活化する。そ
して、ＢａｍＨＩで切断することによつて２個のＤＮＡ
断片が得られ、ｃｏｓを含む小さなＤＮＡ断片（２．３
４Ｋｂｐ）をアガロースゲル電気泳動法によつて単離す
る。得られたｃｏｓを含むＤＮＡ断片（２．３４Ｋｂ
ｐ）が、ラムダフアージの右腕に相当する。 （３）たとえば、ヒトのゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ
３ＡもしくはＭｂｏＩで部分的に切断し、３５〜４５Ｋ
ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を分画する。この３５〜４５
Ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を、（１）と（２）で別々
に調製した左腕と右腕との間に、連結酵素（Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼ）で挿入させて、組換え体ＤＮＡを調製す
る。 （４）組換え体ＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏパツケージン
グで形質導入フアージ粒子に変え、次いで大腸菌に感染
させることによりヒトのゲノムＤＮＡの遺伝子バンクが
製造できる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】以上がＩｓｈ−Ｈｏｒ
ｏｗｉｃｚ ＆ Ｂｕｒｋｅ法によるゲノムＤＮＡの遺
伝子バンクの製造法であるが、次の３つの問題点があ
る。第１に、ｐＪＢ−８はｃｏｓが１つしかなく、左腕
と右腕とを別々に調製しなければならない。第２に、左
腕と右腕について、それぞれｃｏｓを含むＤＮＡ断片を
アガロースゲル電気泳動で分離しなければならない。第
３に、ｐＪＢ−８の左腕の長さは５．４Ｋｂｐ、右腕の
長さは２．３４Ｋｂｐであり、左腕と右腕との長さが異
なるので、３５〜４５ＫｂｐのゲノムＤＮＡに連結する
確率も異なり、左腕と右腕の混合する比率を検討しなけ
ればならない。
ｏｗｉｃｚ ＆ Ｂｕｒｋｅ法によるゲノムＤＮＡの遺
伝子バンクの製造法であるが、次の３つの問題点があ
る。第１に、ｐＪＢ−８はｃｏｓが１つしかなく、左腕
と右腕とを別々に調製しなければならない。第２に、左
腕と右腕について、それぞれｃｏｓを含むＤＮＡ断片を
アガロースゲル電気泳動で分離しなければならない。第
３に、ｐＪＢ−８の左腕の長さは５．４Ｋｂｐ、右腕の
長さは２．３４Ｋｂｐであり、左腕と右腕との長さが異
なるので、３５〜４５ＫｂｐのゲノムＤＮＡに連結する
確率も異なり、左腕と右腕の混合する比率を検討しなけ
ればならない。
【０００７】本発明者らは、これらの問題点を解決する
ために、同一の方向性を持つたラムダフアージのｃｏｓ
を２個有し、２種類の制限酵素で切ることによつて、そ
れぞれｃｏｓを１個づつ持つた長さのほぼ等しい右腕と
左腕が等モルできることを特徴とする新規コスミドベク
ターを作成した〔第３６回日本細胞生物学会大会、講演
要旨集、９３，９４ページ（１９８３）〕。そして、本
発明のコスミドベクターを用いる外来ＤＮＡの遺伝子バ
ンクの製造法を完成するにいたつた。
ために、同一の方向性を持つたラムダフアージのｃｏｓ
を２個有し、２種類の制限酵素で切ることによつて、そ
れぞれｃｏｓを１個づつ持つた長さのほぼ等しい右腕と
左腕が等モルできることを特徴とする新規コスミドベク
ターを作成した〔第３６回日本細胞生物学会大会、講演
要旨集、９３，９４ページ（１９８３）〕。そして、本
発明のコスミドベクターを用いる外来ＤＮＡの遺伝子バ
ンクの製造法を完成するにいたつた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明のコスミドベクタ
ーは、同一分子内に同一の方向性を持つたラムダフアー
ジまたはラムドイドフアージのｃｏｓを２個有し、２種
類の制限酵素で切ることによつて、それぞれｃｏｓを１
個づつ持つた長さがほぼ等しい右腕と左腕との間に、３
５〜４５Ｋｂｐの長さの種々の外来ＤＮＡ断片を挿入
し、ｉｎ ｖｉｔｒｏパツケージングで形質導入フアー
ジ粒子に変え、次いで大腸菌にクローン化することによ
つて、外来ＤＮＡの遺伝子バンクを製造するので、左腕
と右腕とを別々に調製する必要がなく、アガロースゲル
電気泳動で分離する必要もない。さらに、右腕と左腕の
長さがほぼ等しいので、３５〜４５ＫｂｐのゲノムＤＮ
ＡにＴ４−ＤＮＡリガーゼによつて連結される程度もほ
ぼ等しいと考えてよく、２種類の制限酵素で切断してで
きた右腕と左腕の等モル混合物を、そのまま３５〜４５
ＫｂｐのゲノムＤＮＡと連結すれば、組換え体ＤＮＡの
半分が形質導入フアージ粒子に変わり得ることが期待で
きる。このように、本発明のベクターを用いれば、３５
〜４５ＫｂｐのＤＮＡ断片として、ゲノムＤＮＡの遺伝
子バンクをより簡単、かつより効率よく製造できる。本
発明のコスミドベクターｐＤｃｏｓＡｐ r ／ｏｒｉはＰ
ｖｕII及びＢａｍＨＩで切断することにより、それぞれ
ｃｏｓを１個づつ持つた長さ２．３５ｋｂの２個のＤＮ
Ａ断片、すなわち右腕と左腕とが生じる。また、本発明
のコスミドベクターｐＤｃｏｓＴｃ r はＰｖｕII及びＢ
ｇlII で切断することにより、それぞれｃｏｓを１個づ
つ持つた長さ１．７ｋｂの２個のＤＮＡ断片、すなわち
右腕と左腕とが生じる。更に本発明のコスミドベクター
ｐＤｃｏｓＴｃ r ／ｏｒｉをＰｖｕIIとＢｇlII で切断
することにより、それぞれｃｏｓを１個づつ持つた長さ
３．０ｋｂの２個のＤＮＡ断片、すなわち右腕と左腕と
が生じる。更にまた、本発明のｐＤｃｏｓＡｐ r ／ｏｒ
ｉ／ｇｐｔ／ＴＫをＰｖｕIIとＢａｍＨＩで切断するこ
とにより、それぞれｃｏｓを１個づつ持つた長さ４．１
５ｋｂの２個のＤＮＡ断片、すなち右腕と左腕とが生じ
る。従って、本発明において、「長さがほぼ等しい」と
は、ＰｖｕII及びＢａｍＨＩ（またはＢｇlII)で切るこ
とによつて、それぞれｃｏｓを１個づつ持つた長さ がほ
ぼ等しい右腕と左腕とが生じる」ことである。
ーは、同一分子内に同一の方向性を持つたラムダフアー
ジまたはラムドイドフアージのｃｏｓを２個有し、２種
類の制限酵素で切ることによつて、それぞれｃｏｓを１
個づつ持つた長さがほぼ等しい右腕と左腕との間に、３
５〜４５Ｋｂｐの長さの種々の外来ＤＮＡ断片を挿入
し、ｉｎ ｖｉｔｒｏパツケージングで形質導入フアー
ジ粒子に変え、次いで大腸菌にクローン化することによ
つて、外来ＤＮＡの遺伝子バンクを製造するので、左腕
と右腕とを別々に調製する必要がなく、アガロースゲル
電気泳動で分離する必要もない。さらに、右腕と左腕の
長さがほぼ等しいので、３５〜４５ＫｂｐのゲノムＤＮ
ＡにＴ４−ＤＮＡリガーゼによつて連結される程度もほ
ぼ等しいと考えてよく、２種類の制限酵素で切断してで
きた右腕と左腕の等モル混合物を、そのまま３５〜４５
ＫｂｐのゲノムＤＮＡと連結すれば、組換え体ＤＮＡの
半分が形質導入フアージ粒子に変わり得ることが期待で
きる。このように、本発明のベクターを用いれば、３５
〜４５ＫｂｐのＤＮＡ断片として、ゲノムＤＮＡの遺伝
子バンクをより簡単、かつより効率よく製造できる。本
発明のコスミドベクターｐＤｃｏｓＡｐ r ／ｏｒｉはＰ
ｖｕII及びＢａｍＨＩで切断することにより、それぞれ
ｃｏｓを１個づつ持つた長さ２．３５ｋｂの２個のＤＮ
Ａ断片、すなわち右腕と左腕とが生じる。また、本発明
のコスミドベクターｐＤｃｏｓＴｃ r はＰｖｕII及びＢ
ｇlII で切断することにより、それぞれｃｏｓを１個づ
つ持つた長さ１．７ｋｂの２個のＤＮＡ断片、すなわち
右腕と左腕とが生じる。更に本発明のコスミドベクター
ｐＤｃｏｓＴｃ r ／ｏｒｉをＰｖｕIIとＢｇlII で切断
することにより、それぞれｃｏｓを１個づつ持つた長さ
３．０ｋｂの２個のＤＮＡ断片、すなわち右腕と左腕と
が生じる。更にまた、本発明のｐＤｃｏｓＡｐ r ／ｏｒ
ｉ／ｇｐｔ／ＴＫをＰｖｕIIとＢａｍＨＩで切断するこ
とにより、それぞれｃｏｓを１個づつ持つた長さ４．１
５ｋｂの２個のＤＮＡ断片、すなち右腕と左腕とが生じ
る。従って、本発明において、「長さがほぼ等しい」と
は、ＰｖｕII及びＢａｍＨＩ（またはＢｇlII)で切るこ
とによつて、それぞれｃｏｓを１個づつ持つた長さ がほ
ぼ等しい右腕と左腕とが生じる」ことである。
【０００９】本発明の新規コスミドベクターの１つであ
る、ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉを図１に示す〔第３６回
日本細胞生物学会大会、講演要旨集９３ページ（１９８
３）〕。ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉは、フアージベクタ
ーであるＣｈａｒｏｎ４Ａ由来の同一方向性のあるｃｏ
ｓ２個と、Ｔｎ９０３由来のネオマイシン耐性遺伝子
（ｎｅｏr ）〔Ｏｋａ，Ｓｕｇｉｓａｋｉ ＆ Ｔａｋ
ａｎａｍｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４７、２１７
（１９８１）〕、ｐＢＲ−３２７由来のアンピシリン耐
性遺伝子（Ａｐr ）及び複製開始点（ｏｒｉ）〔Ｓｏｂ
ｅｒｏｎ，Ｃａｖａｒｒｕｂｉａｓ ＆ Ｂｏｌｉｖａ
ｒ，Ｇｅｎｅ，９，２８７（１９８０）〕とからなる。
大きさは４．７Ｋｂｐであり、制限酵素ＰｖｕII、Ｂａ
ｍＨＩ、ＰｓｔＩによりそれぞれ１カ所、制限酵素Ｂｓ
ｔＥIIによつて２カ所、制限酵素ＥｃｏＲＩによつて３
カ所切断される。このベクターは次のような特徴を有す
る。
る、ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉを図１に示す〔第３６回
日本細胞生物学会大会、講演要旨集９３ページ（１９８
３）〕。ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉは、フアージベクタ
ーであるＣｈａｒｏｎ４Ａ由来の同一方向性のあるｃｏ
ｓ２個と、Ｔｎ９０３由来のネオマイシン耐性遺伝子
（ｎｅｏr ）〔Ｏｋａ，Ｓｕｇｉｓａｋｉ ＆ Ｔａｋ
ａｎａｍｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４７、２１７
（１９８１）〕、ｐＢＲ−３２７由来のアンピシリン耐
性遺伝子（Ａｐr ）及び複製開始点（ｏｒｉ）〔Ｓｏｂ
ｅｒｏｎ，Ｃａｖａｒｒｕｂｉａｓ ＆ Ｂｏｌｉｖａ
ｒ，Ｇｅｎｅ，９，２８７（１９８０）〕とからなる。
大きさは４．７Ｋｂｐであり、制限酵素ＰｖｕII、Ｂａ
ｍＨＩ、ＰｓｔＩによりそれぞれ１カ所、制限酵素Ｂｓ
ｔＥIIによつて２カ所、制限酵素ＥｃｏＲＩによつて３
カ所切断される。このベクターは次のような特徴を有す
る。
【００１０】（１）同一の方向性を持つた２つのｃｏｓ
がある。 （２）ＢａｍＨＩサイトにＳａｕ３ＡもしくはＭｂｏＩ
などで限定消化した３５〜４５ＫｂｐのゲノムＤＮＡを
クローン化できる。 （３）インサートはＢａｍＨＩサイトの両側にあるＥｃ
ｏＲＩサイトを切ることによつてベクターから切り出す
ことができる。 （４）ＰｖｕIIでベクターを切断し、ホスフアターゼ処
理することによつて、ベクターに方向性を持たせ、さら
にＢａｍＨＩサイトを切ることによつて、等モルの右腕
と左腕ができる。 （５）Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを使って、Ｓａｕ３Ａもし
くはＭｂｏＩなどで限定消化した３５〜４５Ｋｂｐのゲ
ノムＤＮＡの両側に、ベクターの右腕と左腕をＢａｍＨ
Ｉサイトで連結し、組換え体ＤＮＡを、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏパツケージングによつて形質導入フアージ粒子に変換
し、次いで大腸菌に感染させることができる。 （６）この形質導入体ＤＮＡは、ベクター由来のＡｐr
とｏｒｉを含むので、アンピシリンで選択することによ
つて、組換え体ＤＮＡをプラスミドとして持つ大腸菌の
みを選択的に生かすことができる。
がある。 （２）ＢａｍＨＩサイトにＳａｕ３ＡもしくはＭｂｏＩ
などで限定消化した３５〜４５ＫｂｐのゲノムＤＮＡを
クローン化できる。 （３）インサートはＢａｍＨＩサイトの両側にあるＥｃ
ｏＲＩサイトを切ることによつてベクターから切り出す
ことができる。 （４）ＰｖｕIIでベクターを切断し、ホスフアターゼ処
理することによつて、ベクターに方向性を持たせ、さら
にＢａｍＨＩサイトを切ることによつて、等モルの右腕
と左腕ができる。 （５）Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを使って、Ｓａｕ３Ａもし
くはＭｂｏＩなどで限定消化した３５〜４５Ｋｂｐのゲ
ノムＤＮＡの両側に、ベクターの右腕と左腕をＢａｍＨ
Ｉサイトで連結し、組換え体ＤＮＡを、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏパツケージングによつて形質導入フアージ粒子に変換
し、次いで大腸菌に感染させることができる。 （６）この形質導入体ＤＮＡは、ベクター由来のＡｐr
とｏｒｉを含むので、アンピシリンで選択することによ
つて、組換え体ＤＮＡをプラスミドとして持つ大腸菌の
みを選択的に生かすことができる。
【００１１】また、本ベクターを用いるゲノムＤＮＡ
（外来ＤＮＡ）の遺伝子バンクの製造法を示せば以下の
ようになる（図２）。 （１）ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉをＰｖｕIIで切断する
ことによつて直線状ＤＮＡとし、次にホスフアターゼ処
理によつてＰｖｕIIの切断片を不活化する。そしてＢａ
ｍＨＩで切断することによつて、それぞれｃｏｓを１個
づつ持つた長さがほぼ等しい右腕と左腕とを調製する。 （２）外来ＤＮＡをＳａｕ３ＡもしくはＭｂｏＩなどで
限定消化し、３５〜４５Ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を
調製する。 （３）３５〜４５ＫｂｐのゲノムＤＮＡ断片を（１）で
調製した左腕と右腕との間にＴ４−ＤＮＡリガーゼで挿
入させて、組換え体ＤＮＡを調製する。 （４）組換え体ＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏパツケージン
グで形質導入フアージ粒子に変え、大腸菌に感染させ
る。 （５）形質導入したアンピシリン耐性大腸菌をアンピシ
リンで選択することによつて、組換え体ＤＮＡをプラス
ミドとして持つ大腸菌のみを生かすことができる。この
ようにして、ゲノムＤＮＡの遺伝子バンクを製造するこ
とができる。
（外来ＤＮＡ）の遺伝子バンクの製造法を示せば以下の
ようになる（図２）。 （１）ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉをＰｖｕIIで切断する
ことによつて直線状ＤＮＡとし、次にホスフアターゼ処
理によつてＰｖｕIIの切断片を不活化する。そしてＢａ
ｍＨＩで切断することによつて、それぞれｃｏｓを１個
づつ持つた長さがほぼ等しい右腕と左腕とを調製する。 （２）外来ＤＮＡをＳａｕ３ＡもしくはＭｂｏＩなどで
限定消化し、３５〜４５Ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を
調製する。 （３）３５〜４５ＫｂｐのゲノムＤＮＡ断片を（１）で
調製した左腕と右腕との間にＴ４−ＤＮＡリガーゼで挿
入させて、組換え体ＤＮＡを調製する。 （４）組換え体ＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏパツケージン
グで形質導入フアージ粒子に変え、大腸菌に感染させ
る。 （５）形質導入したアンピシリン耐性大腸菌をアンピシ
リンで選択することによつて、組換え体ＤＮＡをプラス
ミドとして持つ大腸菌のみを生かすことができる。この
ようにして、ゲノムＤＮＡの遺伝子バンクを製造するこ
とができる。
【００１２】また、本発明者らはトランスホーマント細
胞から遺伝子回収を目的とするコスミドベクター、ｐＤ
ｃｏｓＴｃr （図３）、ｐＤｃｏｓＴｃr ／ｏｒｉ（図
４）の作成に成功した（第３６回日本細胞生物学会大
会、講演要旨集、９４ページ（１９８３）〕。哺乳動物
の培養細胞への遺伝子移入を利用して哺乳動物のマーカ
ー遺伝子を単離することができる。その際、培養細胞に
遺伝子移入したＤＮＡ配列をトランスホーマント細胞か
ら大腸菌に回収する作業があるが、本発明に包含される
新規コスミドベクターｐＤｃｏｓＴｃr 及びｐＤｃｏｓ
Ｔｃr ／ｏｒｉは、この遺伝子回収のために有用なベク
ターである。ｐＤｃｏｓＴｃr は、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ由
来の同一の方向性のあるｃｏｓ２個と、ｐＢＲ−３２７
由来のテトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃr ）及び複製
開始点（ｏｒｉ）とからなる。ｐＤｃｏｓＴｃr ／ｏｒ
ｉは、同様にｃｏｓ２個と、ｐＢＲ−３２７由来のＴｃ
r 及びｏｒｉと、スペーサーとしてのＳＶ−ジヒドロ葉
酸リダクターゼ遺伝子（ＳＶ−ｄｈｆｒ）〔Ｓｕｂｒａ
ｍａｎｉ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｍｏ１．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４（１９８１）〕とか
らなる。
胞から遺伝子回収を目的とするコスミドベクター、ｐＤ
ｃｏｓＴｃr （図３）、ｐＤｃｏｓＴｃr ／ｏｒｉ（図
４）の作成に成功した（第３６回日本細胞生物学会大
会、講演要旨集、９４ページ（１９８３）〕。哺乳動物
の培養細胞への遺伝子移入を利用して哺乳動物のマーカ
ー遺伝子を単離することができる。その際、培養細胞に
遺伝子移入したＤＮＡ配列をトランスホーマント細胞か
ら大腸菌に回収する作業があるが、本発明に包含される
新規コスミドベクターｐＤｃｏｓＴｃr 及びｐＤｃｏｓ
Ｔｃr ／ｏｒｉは、この遺伝子回収のために有用なベク
ターである。ｐＤｃｏｓＴｃr は、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ由
来の同一の方向性のあるｃｏｓ２個と、ｐＢＲ−３２７
由来のテトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃr ）及び複製
開始点（ｏｒｉ）とからなる。ｐＤｃｏｓＴｃr ／ｏｒ
ｉは、同様にｃｏｓ２個と、ｐＢＲ−３２７由来のＴｃ
r 及びｏｒｉと、スペーサーとしてのＳＶ−ジヒドロ葉
酸リダクターゼ遺伝子（ＳＶ−ｄｈｆｒ）〔Ｓｕｂｒａ
ｍａｎｉ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｍｏ１．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４（１９８１）〕とか
らなる。
【００１３】これらのベクターは、先に述べたｐＤｃｏ
ｓＡｐr ／ｏｒｉ（図１）と同様な特徴を有しており、
同様にこれらを用いてゲノムＤＮＡの遺伝子バンクを製
造することができるが、ＢａｍＨＩサイトの代わりにＢ
ｇ１IIサイトにＳａｕ３ＡもしくはＭｂｏＩなどで限定
消化した３５〜４５ＫｂｐのゲノムＤＮＡをクローン化
できる点が異なつている。ｐＤｃｏｓＴｃr で作成した
形質導入フアージ粒子はプラスミドのｏｒｉを持たない
ので、大腸菌に感染しても増殖できない。目的の遺伝子
の近傍にｏｒｉがある場合のみテトラサイクリン耐性
（Ｔｃr ）のクローンとして目的の遺伝子を大腸菌に回
収することができる。一方、ｐＤｃｏｓＴｃr ／ｏｒｉ
で作成した形質導入フアージ粒子は、ｏｒｉとＴｃr マ
ーカーを持つており、Ｔｃr クローンとしてゲノムＤＮ
Ａの遺伝子バンクを作成することができる。もし、目的
の遺伝子の近傍にＡｐr などの薬剤耐性マーカーがあれ
ば、アンピシリン耐性（Ａｐr ）などの薬剤耐性クロー
ンとして目的のものだけを選択的に大腸菌に回収でき
る。
ｓＡｐr ／ｏｒｉ（図１）と同様な特徴を有しており、
同様にこれらを用いてゲノムＤＮＡの遺伝子バンクを製
造することができるが、ＢａｍＨＩサイトの代わりにＢ
ｇ１IIサイトにＳａｕ３ＡもしくはＭｂｏＩなどで限定
消化した３５〜４５ＫｂｐのゲノムＤＮＡをクローン化
できる点が異なつている。ｐＤｃｏｓＴｃr で作成した
形質導入フアージ粒子はプラスミドのｏｒｉを持たない
ので、大腸菌に感染しても増殖できない。目的の遺伝子
の近傍にｏｒｉがある場合のみテトラサイクリン耐性
（Ｔｃr ）のクローンとして目的の遺伝子を大腸菌に回
収することができる。一方、ｐＤｃｏｓＴｃr ／ｏｒｉ
で作成した形質導入フアージ粒子は、ｏｒｉとＴｃr マ
ーカーを持つており、Ｔｃr クローンとしてゲノムＤＮ
Ａの遺伝子バンクを作成することができる。もし、目的
の遺伝子の近傍にＡｐr などの薬剤耐性マーカーがあれ
ば、アンピシリン耐性（Ａｐr ）などの薬剤耐性クロー
ンとして目的のものだけを選択的に大腸菌に回収でき
る。
【００１４】さらに、本発明者らは哺乳動物細胞に対す
る選択マーカーを持つていて、哺乳動物細胞への遺伝子
移入を目的とするコスミドベクター、ｐＤｃｏｓＡｐr
／ｏｒｉ／ｇｐｔ／ＴＫ（図５）を作成した。ｐＤｃｏ
ｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｇｐｔ／ＴＫは、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ
由来の同一の方向性のあるｃｏｓ２個と、ｐＢＲ−３２
７由来のＡｐr 及びｏｒｉ、スペーサーとしてのｐＳＶ
２−ｄｈｆｒ由来のＳＶ−ｄｈｆｒ遺伝子、ｐＳＶ２−
ｇｐｔ由来のｇｐｔ遺伝子〔Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｍｕｌｌ
ｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１，４４９（１９８１）〕、及びｐＴＫ−４由来
のＴＫ遺伝子〔Ｉｓｈｉｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，６０７（１９８
２）〕とからなる。
る選択マーカーを持つていて、哺乳動物細胞への遺伝子
移入を目的とするコスミドベクター、ｐＤｃｏｓＡｐr
／ｏｒｉ／ｇｐｔ／ＴＫ（図５）を作成した。ｐＤｃｏ
ｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｇｐｔ／ＴＫは、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ
由来の同一の方向性のあるｃｏｓ２個と、ｐＢＲ−３２
７由来のＡｐr 及びｏｒｉ、スペーサーとしてのｐＳＶ
２−ｄｈｆｒ由来のＳＶ−ｄｈｆｒ遺伝子、ｐＳＶ２−
ｇｐｔ由来のｇｐｔ遺伝子〔Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｍｕｌｌ
ｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１，４４９（１９８１）〕、及びｐＴＫ−４由来
のＴＫ遺伝子〔Ｉｓｈｉｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，６０７（１９８
２）〕とからなる。
【００１５】このコスミドベクターは、前記したｐＤｃ
ｏｓＡｐr ／ｏｒｉと同様に、ゲノムＤＮＡの遺伝子バ
ンクを製造できる。すなわち、同一の方向性を持つた２
個のｃｏｓがあり、ＰｖｕIIとＢａｍＨＩで切断するこ
とにより、ｃｏｓを１個づつ持つた長さがほぼ等しい右
腕と左腕とが等モルでき、ＢａｍＨＩサイトに３５〜４
５ＫｂｐのゲノムＤＮＡを挿入させた組換え体ＤＮＡを
作成できる。そして、この組換え体ＤＮＡは、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏパツケージングによつて形質導入フアージ粒子
に変換し、大腸菌に移すことができ、組換え体ＤＮＡは
ベクター由来のＡｐr とｏｒｉを含むので、組換え体Ｄ
ＮＡを含む大腸菌は、アンピシリン耐性で選択すること
によつて、アンピシリン耐性クローンとして得ることが
できる。
ｏｓＡｐr ／ｏｒｉと同様に、ゲノムＤＮＡの遺伝子バ
ンクを製造できる。すなわち、同一の方向性を持つた２
個のｃｏｓがあり、ＰｖｕIIとＢａｍＨＩで切断するこ
とにより、ｃｏｓを１個づつ持つた長さがほぼ等しい右
腕と左腕とが等モルでき、ＢａｍＨＩサイトに３５〜４
５ＫｂｐのゲノムＤＮＡを挿入させた組換え体ＤＮＡを
作成できる。そして、この組換え体ＤＮＡは、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏパツケージングによつて形質導入フアージ粒子
に変換し、大腸菌に移すことができ、組換え体ＤＮＡは
ベクター由来のＡｐr とｏｒｉを含むので、組換え体Ｄ
ＮＡを含む大腸菌は、アンピシリン耐性で選択すること
によつて、アンピシリン耐性クローンとして得ることが
できる。
【００１６】さらに、この組換え体プラスミドは、ｇｐ
ｔ遺伝子とＴＫ遺伝子を持つので、哺乳動物の培養細胞
へ遺伝子移入した際に、キサンチングアニンホスホリボ
シルトランスフエラーゼ（ｇｐｔ）活性もしくはチミジ
ンキナーゼ（ＴＫ）活性をマーカーとすることによつ
て、ベクター由来の組換え体ＤＮＡの挿入の判定が培養
細胞のレベルで可能であるという利点がある。本発明
は、かかる新規コスミドベクターを用いる新規な遺伝子
バンクの製造法に関するものであるが、本発明に用いら
れるｃｏｓとしては、ラムダフアージまたはラムドイド
フアージ由来のものが挙げられる。特に、ラムダフアー
ジ由来のｃｏｓが好ましいものとして挙げられる。
ｔ遺伝子とＴＫ遺伝子を持つので、哺乳動物の培養細胞
へ遺伝子移入した際に、キサンチングアニンホスホリボ
シルトランスフエラーゼ（ｇｐｔ）活性もしくはチミジ
ンキナーゼ（ＴＫ）活性をマーカーとすることによつ
て、ベクター由来の組換え体ＤＮＡの挿入の判定が培養
細胞のレベルで可能であるという利点がある。本発明
は、かかる新規コスミドベクターを用いる新規な遺伝子
バンクの製造法に関するものであるが、本発明に用いら
れるｃｏｓとしては、ラムダフアージまたはラムドイド
フアージ由来のものが挙げられる。特に、ラムダフアー
ジ由来のｃｏｓが好ましいものとして挙げられる。
【００１７】本発明のベクターは、２種類の制限酵素で
切ることによつて、それぞれｃｏｓを１個づつ持つた右
腕と左腕ができるのであるが、この２種類の制限酵素の
組合せとして、ＰｖｕIIとＢａｍＨＩ、ＰｖｕIIとＢｇ
１II、ＣｌａＩとＢａｍＨＩ、ＣｌａＩとＢｇｌIIなど
を挙げることができる。勿論、この他にも組合せること
ができるので、これらに限定されるものではない。本発
明のベクター中には、ベクター由来のＤＮＡ断片が挿入
されたことを、判定するためには一般的に薬剤耐性によ
る選択が行われる。従って、本発明のベクター中にも薬
剤耐性を発現するＤＮＡ断片が組込まれていることが好
ましい。薬剤耐性としては、アンピシリン耐性、テトラ
サイクリン耐性、ネオマイシン（カナマイシン）耐性、
もしくはクロラムフエニコール耐性など通常の抗生物質
耐性が挙げられる。ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉはアンピ
シリン耐性遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子を持ち、
ｐＤｃｏｓＴｃr とｐＤｃｏｓＴｃr ／ｏｒｉはテトラ
サイクリン耐性遺伝子を有している。ｐＤｃｏｓＡｐr
／ｏｒｉ／ｇｐｔ／ＴＫはアンピシリン耐性遺伝子を持
つている。
切ることによつて、それぞれｃｏｓを１個づつ持つた右
腕と左腕ができるのであるが、この２種類の制限酵素の
組合せとして、ＰｖｕIIとＢａｍＨＩ、ＰｖｕIIとＢｇ
１II、ＣｌａＩとＢａｍＨＩ、ＣｌａＩとＢｇｌIIなど
を挙げることができる。勿論、この他にも組合せること
ができるので、これらに限定されるものではない。本発
明のベクター中には、ベクター由来のＤＮＡ断片が挿入
されたことを、判定するためには一般的に薬剤耐性によ
る選択が行われる。従って、本発明のベクター中にも薬
剤耐性を発現するＤＮＡ断片が組込まれていることが好
ましい。薬剤耐性としては、アンピシリン耐性、テトラ
サイクリン耐性、ネオマイシン（カナマイシン）耐性、
もしくはクロラムフエニコール耐性など通常の抗生物質
耐性が挙げられる。ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉはアンピ
シリン耐性遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子を持ち、
ｐＤｃｏｓＴｃr とｐＤｃｏｓＴｃr ／ｏｒｉはテトラ
サイクリン耐性遺伝子を有している。ｐＤｃｏｓＡｐr
／ｏｒｉ／ｇｐｔ／ＴＫはアンピシリン耐性遺伝子を持
つている。
【００１８】本発明のベクターを用いてゲノムＤＮＡ
（外来ＤＮＡ）の遺伝子バンクを製造し、哺乳動物の培
養細胞へ遺伝子（遺伝子バンク）移入する際には、ベク
ター由来のＤＮＡ断片が挿入されたことを判定するため
に特定の生理機能を発現するＤＮＡ断片が本発明のベク
ター中に組込まれているのが好ましい。特定の生理機能
を発現せしめる遺伝子としては、アミノグリコシド３’
−ホスホトランスフエラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子〔Ｏｋ
ａ，Ｓｉｇｉｓａｋｉ ＆ Ｔａｋａｎａｍｉ，Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４７，２１７（１９８１）〕、チ
ミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子〔Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ｅ
ｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１４，７２５（１９７８）〕、
アデニンホスホリボシルトランスフエラーゼ（ＡＰＲ
Ｔ）遺伝子〔Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒ
ｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７
６，１３７３（１９７９）〕、ヒポキサンチングアニン
ホスホリボシルトランスフエラーゼ（ＨＧＰＲＴ）遺伝
子〔Ｇｒａｆ，Ｌ．Ｈ．Ｊｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｍ
ａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｇｅｎｅｔ．，５，１０３１（１９７
９）〕、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフ
エラーゼ（ＸＧＰＲＴ又はｇｐｔ）遺伝子〔Ｂｅｒｇ，
Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，
１，４４９（１９８１）〕などが挙げられる。本発明の
新規コスミドベクターｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｇｐ
ｔ／ＴＫはｇｐｔ遺伝子とＴＫ遺伝子を有している。
（外来ＤＮＡ）の遺伝子バンクを製造し、哺乳動物の培
養細胞へ遺伝子（遺伝子バンク）移入する際には、ベク
ター由来のＤＮＡ断片が挿入されたことを判定するため
に特定の生理機能を発現するＤＮＡ断片が本発明のベク
ター中に組込まれているのが好ましい。特定の生理機能
を発現せしめる遺伝子としては、アミノグリコシド３’
−ホスホトランスフエラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子〔Ｏｋ
ａ，Ｓｉｇｉｓａｋｉ ＆ Ｔａｋａｎａｍｉ，Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４７，２１７（１９８１）〕、チ
ミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子〔Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ｅ
ｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１４，７２５（１９７８）〕、
アデニンホスホリボシルトランスフエラーゼ（ＡＰＲ
Ｔ）遺伝子〔Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒ
ｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７
６，１３７３（１９７９）〕、ヒポキサンチングアニン
ホスホリボシルトランスフエラーゼ（ＨＧＰＲＴ）遺伝
子〔Ｇｒａｆ，Ｌ．Ｈ．Ｊｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｍ
ａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｇｅｎｅｔ．，５，１０３１（１９７
９）〕、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフ
エラーゼ（ＸＧＰＲＴ又はｇｐｔ）遺伝子〔Ｂｅｒｇ，
Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，
１，４４９（１９８１）〕などが挙げられる。本発明の
新規コスミドベクターｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｇｐ
ｔ／ＴＫはｇｐｔ遺伝子とＴＫ遺伝子を有している。
【００１９】さらに、本発明のベクター中には、Ｃｏｌ
ＥＩ由来の複製機能を有する遺伝子画分を有することが
好ましい。本発明において用いられる外来ＤＮＡの例と
しては、細菌、糸状菌、酵母などの微生物、高等動植物
もしくは各種フアージ等に由来するＤＮＡが挙げられ
る。また、本発明において用いられる制限酵素（ＤＮＡ
断片の特定の塩基配列部位を選択的に切断する機能を有
する酵素）や制限酵素により切断されて生じるＤＮＡ接
着末端と、これと相補的な関係のある他のＤＮＡ断片接
着末端を結合させるために用いる酵素（リガーゼ）、あ
るいは互いに相補的でないＤＮＡ末端同志を結合させる
ためにＤＮＡ末端同志を互いに相補的な接着末端にする
酵素、あるいはこれらを結合させるリガーゼについては
すでに良く知られ、数多くの酵素が市販され、それらを
用いる手法等についても広く開示されている〔Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８２）〕ので、それ
らを利用すればよい。
ＥＩ由来の複製機能を有する遺伝子画分を有することが
好ましい。本発明において用いられる外来ＤＮＡの例と
しては、細菌、糸状菌、酵母などの微生物、高等動植物
もしくは各種フアージ等に由来するＤＮＡが挙げられ
る。また、本発明において用いられる制限酵素（ＤＮＡ
断片の特定の塩基配列部位を選択的に切断する機能を有
する酵素）や制限酵素により切断されて生じるＤＮＡ接
着末端と、これと相補的な関係のある他のＤＮＡ断片接
着末端を結合させるために用いる酵素（リガーゼ）、あ
るいは互いに相補的でないＤＮＡ末端同志を結合させる
ためにＤＮＡ末端同志を互いに相補的な接着末端にする
酵素、あるいはこれらを結合させるリガーゼについては
すでに良く知られ、数多くの酵素が市販され、それらを
用いる手法等についても広く開示されている〔Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，（１９８２）〕ので、それ
らを利用すればよい。
【００２０】本発明のベクターを用いることによつて、
ヒトをはじめとする哺乳動物のガンや遺伝病などを分子
レベルで解析することがより容易となるであろう。例え
ば、ヒトの正常細胞由来のゲノムＤＮＡの遺伝子バンク
をｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉで作成し、この遺伝子バン
クで遺伝病細胞をトランスホーム（正常化）し、トラン
スホーマント細胞を得る。トランスホーマント細胞から
ゲノムＤＮＡを抽出し、ｐＤｃｏｓＴｃr もしくはｐＤ
ｃｏｓＴｃr ／ｏｒｉでゲノムＤＮＡの遺伝子バンクを
作成し、目的の遺伝子を回収する。目的の遺伝子を種々
の面から検討することによつて、ヒトの遺伝病を分子レ
ベルで解析することができる。
ヒトをはじめとする哺乳動物のガンや遺伝病などを分子
レベルで解析することがより容易となるであろう。例え
ば、ヒトの正常細胞由来のゲノムＤＮＡの遺伝子バンク
をｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉで作成し、この遺伝子バン
クで遺伝病細胞をトランスホーム（正常化）し、トラン
スホーマント細胞を得る。トランスホーマント細胞から
ゲノムＤＮＡを抽出し、ｐＤｃｏｓＴｃr もしくはｐＤ
ｃｏｓＴｃr ／ｏｒｉでゲノムＤＮＡの遺伝子バンクを
作成し、目的の遺伝子を回収する。目的の遺伝子を種々
の面から検討することによつて、ヒトの遺伝病を分子レ
ベルで解析することができる。
【００２１】また、本発明のベクターを用い、ゲノムＤ
ＮＡ（外来ＤＮＡ）の遺伝子バンクを作成することによ
つて、有用物質を発現せしめる特定の遺伝子を効率よく
見出すことが可能である。この特定の遺伝子とは、細
菌、糸状菌、酵母などの微生物、高等動植物あるいは各
種フアージ等に由来するＤＮＡがあり、具体的な有用物
質としては、例えば各種ホルモン、酵素、さらには抗生
物質やアミノ酸などの合成系酵素等が挙げられる。
ＮＡ（外来ＤＮＡ）の遺伝子バンクを作成することによ
つて、有用物質を発現せしめる特定の遺伝子を効率よく
見出すことが可能である。この特定の遺伝子とは、細
菌、糸状菌、酵母などの微生物、高等動植物あるいは各
種フアージ等に由来するＤＮＡがあり、具体的な有用物
質としては、例えば各種ホルモン、酵素、さらには抗生
物質やアミノ酸などの合成系酵素等が挙げられる。
【００２２】以下、実施例を示して本発明を具体的に説
明する。 実施例１ ｐＤｃｏｓＴｃr の作成及び調製（図６） （ａ）ｐＡＰｃｏｓの作成及び調製 １）作成 フアージベクターであるＣｈａｒｏｎ４Ａ由来のｃｏｓ
を１個有するコスミドベクターであるｐＨＣ７９〔Ｈｏ
ｈｎ ＆ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｇｅｎｅ，１１，２９１
（１９８０）〕２０μｇを、反応混液２００μl （１０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１２ｍＭＭｇＣ
ｌ2 、１０ｍＭＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ（ウシ
血清アルブミン）で、２９．９ユニツトの制限酵素Ｂａ
ｌＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）
と３７℃で２時間反応させて完全に消化したのち、さら
に反応混液５００μl （１５０ｍＭＮａＣｌ，６ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、６ｍＭＭｇＣｌ2 、６
ｍＭＤＴＴ、１００μｇ／μl ＢＳＡ〕で、４１．１ユ
ニツトの制限酵素ＢｓｔＥII（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ社製）と６０℃で２時間反応させて完
全に消化した。反応終了後、等量の水飽和フエノールで
抽出を行い、水層をセカンダリブタノールで濃縮後、
０．１倍容量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍容量のエタノ
ールを加えて、ＤＮＡを沈澱として得、９５％エタノー
ルで洗つたのち、水流ポンプで乾燥を行い、沈澱を１０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭＥＤ
ＴＡからなる水溶液（以下１０ｔ／０．１Ｅと略す）１
４μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。
明する。 実施例１ ｐＤｃｏｓＴｃr の作成及び調製（図６） （ａ）ｐＡＰｃｏｓの作成及び調製 １）作成 フアージベクターであるＣｈａｒｏｎ４Ａ由来のｃｏｓ
を１個有するコスミドベクターであるｐＨＣ７９〔Ｈｏ
ｈｎ ＆ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｇｅｎｅ，１１，２９１
（１９８０）〕２０μｇを、反応混液２００μl （１０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１２ｍＭＭｇＣ
ｌ2 、１０ｍＭＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ（ウシ
血清アルブミン）で、２９．９ユニツトの制限酵素Ｂａ
ｌＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）
と３７℃で２時間反応させて完全に消化したのち、さら
に反応混液５００μl （１５０ｍＭＮａＣｌ，６ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、６ｍＭＭｇＣｌ2 、６
ｍＭＤＴＴ、１００μｇ／μl ＢＳＡ〕で、４１．１ユ
ニツトの制限酵素ＢｓｔＥII（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ社製）と６０℃で２時間反応させて完
全に消化した。反応終了後、等量の水飽和フエノールで
抽出を行い、水層をセカンダリブタノールで濃縮後、
０．１倍容量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍容量のエタノ
ールを加えて、ＤＮＡを沈澱として得、９５％エタノー
ルで洗つたのち、水流ポンプで乾燥を行い、沈澱を１０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭＥＤ
ＴＡからなる水溶液（以下１０ｔ／０．１Ｅと略す）１
４μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。
【００２３】次に、このＢａｌＩ及びＢｓｔＥIIで消化
したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）を反応混液２５μl
〔５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１０ｍＭ
ＭｇＳＯ4 、０．１ｍＭＤＴＴ、５０μｇ／ｍｌＢＳ
Ａ、８０μＭｄＣＴＰ、８０μＭｄＧＴＰ、８０μＭｄ
ＡＴＰ、８０μＭｄＴＴＰ〕で、２ユニツトのＫｌｅｎ
ｏｗ酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社
製）と２２℃で３０分間反応させて、互いに相補鎖が存
在する２本鎖ＤＮＡ断片（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ）
を、両端がそろつた２本鎖ＤＮＡ断片（ｂｌｕｎｔ ｅ
ｎｄ）に変えた。反応終了後、反応液を６５℃で１０分
間熱処理してＫｌｅｎｏｗ酵素を失活させた。
したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）を反応混液２５μl
〔５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１０ｍＭ
ＭｇＳＯ4 、０．１ｍＭＤＴＴ、５０μｇ／ｍｌＢＳ
Ａ、８０μＭｄＣＴＰ、８０μＭｄＧＴＰ、８０μＭｄ
ＡＴＰ、８０μＭｄＴＴＰ〕で、２ユニツトのＫｌｅｎ
ｏｗ酵素（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社
製）と２２℃で３０分間反応させて、互いに相補鎖が存
在する２本鎖ＤＮＡ断片（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ）
を、両端がそろつた２本鎖ＤＮＡ断片（ｂｌｕｎｔ ｅ
ｎｄ）に変えた。反応終了後、反応液を６５℃で１０分
間熱処理してＫｌｅｎｏｗ酵素を失活させた。
【００２４】そして、この液１０μl （ＤＮＡ〜０．４
μｇ）を反応混液５０μl 〔５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．４）、１０ｍＭＭｇＣｌ2 、１０ｍＭＤＴ
Ｔ、１ｍＭスペルミジン、１ｍＭＡＴＰ、１００μｇ／
ｍｌＢＳＡ〕で１５ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼ
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）と１
２℃で１７．５時間反応させて、ｃｏｓ及びｏｒｉ、Ａ
ｐr 1 Ｔｃr を含むＤＮＡ断片（４．７５Ｋｂｐ）を閉
環化させた。反応終了後、フエノール抽出を行つたの
ち、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．１Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解さ
せた。
μｇ）を反応混液５０μl 〔５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．４）、１０ｍＭＭｇＣｌ2 、１０ｍＭＤＴ
Ｔ、１ｍＭスペルミジン、１ｍＭＡＴＰ、１００μｇ／
ｍｌＢＳＡ〕で１５ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼ
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）と１
２℃で１７．５時間反応させて、ｃｏｓ及びｏｒｉ、Ａ
ｐr 1 Ｔｃr を含むＤＮＡ断片（４．７５Ｋｂｐ）を閉
環化させた。反応終了後、フエノール抽出を行つたの
ち、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．１Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解さ
せた。
【００２５】２）トランスホーメーション このＤＮＡ溶液１０μl を大腸菌ＨＢ１０１のｃｏｍｐ
ｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ１００μl （対数増殖期の大腸菌
ＨＢ１０１を０〜４℃で０．１ＭＣａＣｌ2 溶液で１５
分間処理後、もとの培養液の１／１０容量の０．１ＭＣ
ａＣｌ2 ／１４％グリセロール溶液に再懸濁し、−７０
℃に保存）とよく混合し、０℃で１０分間、続いて３７
℃で５分間保温して、ＤＮＡを大腸菌内に取込ませた
後、これにＬ−ブロス（１％Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎ
ｅ、０．５％酵母エキス０．５％ＮａＣｌ、０．１％グ
ルコース）２ｍｌを加え、３７℃で１時間振とう培養し
た。この菌体懸濁液を２０μｇ／ｍｌのアンピシリン及
び２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬ−プレー
ト（Ｌ−ブロスに寒天を１％添加したプレート）上にま
き、３７℃で２４〜４８時間培養し、アンピシリン及び
テトラサイクリン耐性のクローンを得た。
ｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ１００μl （対数増殖期の大腸菌
ＨＢ１０１を０〜４℃で０．１ＭＣａＣｌ2 溶液で１５
分間処理後、もとの培養液の１／１０容量の０．１ＭＣ
ａＣｌ2 ／１４％グリセロール溶液に再懸濁し、−７０
℃に保存）とよく混合し、０℃で１０分間、続いて３７
℃で５分間保温して、ＤＮＡを大腸菌内に取込ませた
後、これにＬ−ブロス（１％Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｔｏｎ
ｅ、０．５％酵母エキス０．５％ＮａＣｌ、０．１％グ
ルコース）２ｍｌを加え、３７℃で１時間振とう培養し
た。この菌体懸濁液を２０μｇ／ｍｌのアンピシリン及
び２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬ−プレー
ト（Ｌ−ブロスに寒天を１％添加したプレート）上にま
き、３７℃で２４〜４８時間培養し、アンピシリン及び
テトラサイクリン耐性のクローンを得た。
【００２６】３）少量培養、及び少量ＤＮＡ調製 Ａｐr 1 Ｔｃr であるクローンをＬ−ブロス２ｍｌ中
（Ａｐ２０μｇ／ｍｌ含有）で３７℃、一晩振とうし
て、増殖させた。培養液１．５ｍｌをエツペンドルフチ
ユーブにとり、机上遠心分離機にかけて集菌後、この菌
体を抽出液〔８％シヨ糖、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１
００、５０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０〕、１０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））０．３５ｍｌに再懸濁さ
せた。次に、リゾチーム溶液２５μl 〔１０ｍｇ／ｍ
ｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕を加え
混合したのち、チユーブを沸騰水中に４０秒間おいた。
そして、直ちにチユーブを４℃にて遠心分離機（２１，
０００ｒｐｍ、１５分間）にかけて上澄液を得、これに
ＲＮａｓｅＡ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ、１０ｔ／０．１
Ｅ）０．５μl を加えて３７℃で一時間保温してＲＮＡ
を分解させた。その後、フエノール抽出で除蛋白後、Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１
Ｅ２０μl に溶解させて、プラスミドＤＮＡ溶液を得
た。
（Ａｐ２０μｇ／ｍｌ含有）で３７℃、一晩振とうし
て、増殖させた。培養液１．５ｍｌをエツペンドルフチ
ユーブにとり、机上遠心分離機にかけて集菌後、この菌
体を抽出液〔８％シヨ糖、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１
００、５０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０〕、１０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））０．３５ｍｌに再懸濁さ
せた。次に、リゾチーム溶液２５μl 〔１０ｍｇ／ｍ
ｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕を加え
混合したのち、チユーブを沸騰水中に４０秒間おいた。
そして、直ちにチユーブを４℃にて遠心分離機（２１，
０００ｒｐｍ、１５分間）にかけて上澄液を得、これに
ＲＮａｓｅＡ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ、１０ｔ／０．１
Ｅ）０．５μl を加えて３７℃で一時間保温してＲＮＡ
を分解させた。その後、フエノール抽出で除蛋白後、Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１
Ｅ２０μl に溶解させて、プラスミドＤＮＡ溶液を得
た。
【００２７】４）プラスミドＤＮＡの特性化 そして、このプラスミドＤＮＡ溶液１μl 又は２μl を
制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｓｔＥII、Ｂｇ１II、ＰｖｕII
などで消化したのち、０．４〜１．５％アガロースゲル
電気泳動〔４０ｍＭＴｒｉｓ、２０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、２ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．１５）；１０ｍＡ、１２
〜２４時間〕にかけた。分解されたＤＮＡ断片は臭化エ
チジウム染色と長波長紫外線照明によつて検出できる。
このようにして、プラスミドＤＮＡの制限地図を作成す
ることによつて、各クローンが持つているプラスミドＤ
ＮＡを特性化した。そして、ｐＨＣ７９のＢａｌＩサイ
トとＢｓｔＥIIサイトの間のＤＮＡ断片（１．６８Ｋｂ
ｐ）を欠いたプラスミド：ｐＡＰｃｏｓ（図６）を持つ
大腸菌を得た。
制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｓｔＥII、Ｂｇ１II、ＰｖｕII
などで消化したのち、０．４〜１．５％アガロースゲル
電気泳動〔４０ｍＭＴｒｉｓ、２０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、２ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．１５）；１０ｍＡ、１２
〜２４時間〕にかけた。分解されたＤＮＡ断片は臭化エ
チジウム染色と長波長紫外線照明によつて検出できる。
このようにして、プラスミドＤＮＡの制限地図を作成す
ることによつて、各クローンが持つているプラスミドＤ
ＮＡを特性化した。そして、ｐＨＣ７９のＢａｌＩサイ
トとＢｓｔＥIIサイトの間のＤＮＡ断片（１．６８Ｋｂ
ｐ）を欠いたプラスミド：ｐＡＰｃｏｓ（図６）を持つ
大腸菌を得た。
【００２８】５）大量培養、及びプラスミドＤＮＡの調
製 この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地（１％Ｂａｃｔｏｔｒｙ
ｐｔｏｎｅ、０．１％酵母エキス、０．２％グルコー
ス、０．１％ＮＨ4 Ｃｌ、０．３％ＮａＣｌ、０．０１
％Ｎａ2 ＳＯ4 、０．０８％ＭｇＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ、
１．５２％Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ、０．３％ＫＨ
2 ＰＯ4 ）１l 中で（Ａｐ２０μｇ／ｍｌ含有）、３７
℃で振とう培養し、６００ｎｍでの吸光度（Ａ600 ）が
１．０になつた時点で、クロラムフエニコールを１００
μｇ／ｍｌの濃度になるように添加し、さらに１５時間
３７℃で振とう培養した。培養終了後、遠心分離機
（６，０００ｒｐｍ，１０分間）にかけて集菌を行い、
次に菌体を２５％シヨ糖、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）からなる等張緩衝液１８ｍｌに再懸濁液
した。これに、リゾチーム溶液〔５ｍｇ／ｍｌ、０．２
５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕３．６ｍｌを加
え、おだやかに混合し、０℃で５分間おいたのち、０．
２５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液７．２ｍｌを加え、
おだやかに混合し、０℃で５分間おいた。
製 この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地（１％Ｂａｃｔｏｔｒｙ
ｐｔｏｎｅ、０．１％酵母エキス、０．２％グルコー
ス、０．１％ＮＨ4 Ｃｌ、０．３％ＮａＣｌ、０．０１
％Ｎａ2 ＳＯ4 、０．０８％ＭｇＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ、
１．５２％Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ、０．３％ＫＨ
2 ＰＯ4 ）１l 中で（Ａｐ２０μｇ／ｍｌ含有）、３７
℃で振とう培養し、６００ｎｍでの吸光度（Ａ600 ）が
１．０になつた時点で、クロラムフエニコールを１００
μｇ／ｍｌの濃度になるように添加し、さらに１５時間
３７℃で振とう培養した。培養終了後、遠心分離機
（６，０００ｒｐｍ，１０分間）にかけて集菌を行い、
次に菌体を２５％シヨ糖、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）からなる等張緩衝液１８ｍｌに再懸濁液
した。これに、リゾチーム溶液〔５ｍｇ／ｍｌ、０．２
５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕３．６ｍｌを加
え、おだやかに混合し、０℃で５分間おいたのち、０．
２５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液７．２ｍｌを加え、
おだやかに混合し、０℃で５分間おいた。
【００２９】その後、１０％ＳＤＳ溶液２．７ｍｌと５
ＭＮａＣｌ溶液８．１ｍｌとを加えおだやかに混合し、
０℃で一晩おいた後、遠心分離機（２０，０００ｒｐ
ｍ、４５分間）にかけて粗溶菌液（ｃｌｅａｒｅｄ ｌ
ｙｓａｔｅ）〜３９ｍｌを得た。この粗溶菌液に、ＲＮ
ａｓｅＡ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ、１０ｔ／０．１Ｅ）２
０μl を加えて、３７℃にて１時間保温してＲＮＡを分
解させたのち、フエノール抽出で除蛋白を行い、さらに
セフアロース２Ｂのゲル濾過にかけた。プラスミドＤＮ
Ａを含むボイドフラクシヨンから、ＤＮＡをエタノール
沈澱として得、次にＤＮＡを塩化セシウム−臭化エチジ
ウム溶液〔１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）０．３
７５ｍｌ、０．２５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）０．３０
ｍｌ、Ｈ2Ｏ６．４５ｍｌ、ＣｓＣｌ７．５ｇ、ＥｔＢ
ｒ溶液（４ｍｇ／ｍｌ）０．３７５ｍｌ〕で平衡密度勾
配遠心（６０，０００ｒｐｍ １２時間）にかけた。
ＭＮａＣｌ溶液８．１ｍｌとを加えおだやかに混合し、
０℃で一晩おいた後、遠心分離機（２０，０００ｒｐ
ｍ、４５分間）にかけて粗溶菌液（ｃｌｅａｒｅｄ ｌ
ｙｓａｔｅ）〜３９ｍｌを得た。この粗溶菌液に、ＲＮ
ａｓｅＡ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ、１０ｔ／０．１Ｅ）２
０μl を加えて、３７℃にて１時間保温してＲＮＡを分
解させたのち、フエノール抽出で除蛋白を行い、さらに
セフアロース２Ｂのゲル濾過にかけた。プラスミドＤＮ
Ａを含むボイドフラクシヨンから、ＤＮＡをエタノール
沈澱として得、次にＤＮＡを塩化セシウム−臭化エチジ
ウム溶液〔１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）０．３
７５ｍｌ、０．２５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）０．３０
ｍｌ、Ｈ2Ｏ６．４５ｍｌ、ＣｓＣｌ７．５ｇ、ＥｔＢ
ｒ溶液（４ｍｇ／ｍｌ）０．３７５ｍｌ〕で平衡密度勾
配遠心（６０，０００ｒｐｍ １２時間）にかけた。
【００３０】そうすると、共有結合で閉鎖された環状の
プラスミドＤＮＡ（ｃｃｃ−ＤＮＡ）は、遠沈管中で長
波長紫外線照射下において、線状のプラスミドＤＮＡ及
び染色体のけい光帯の下にバンド状に見えてくる。この
ｃｃｃ−ＤＮＡのバンドを分画し、ＣｓＣｌ水溶液で飽
和したイソプロパノールで抽出を行つて、臭化エチジウ
ムを取除いた後、１０ｔ／０．１Ｅ１l に対して透析を
行つた。そして、透析内液から、ｃｃｃ−ＤＮＡをエタ
ノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ２ｍｌに
溶解させてｐＡＰｃｏｓのプラスミドＤＮＡ溶液（０．
４１８ｍｇ／ｍｌ）を調製した。
プラスミドＤＮＡ（ｃｃｃ−ＤＮＡ）は、遠沈管中で長
波長紫外線照射下において、線状のプラスミドＤＮＡ及
び染色体のけい光帯の下にバンド状に見えてくる。この
ｃｃｃ−ＤＮＡのバンドを分画し、ＣｓＣｌ水溶液で飽
和したイソプロパノールで抽出を行つて、臭化エチジウ
ムを取除いた後、１０ｔ／０．１Ｅ１l に対して透析を
行つた。そして、透析内液から、ｃｃｃ−ＤＮＡをエタ
ノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ２ｍｌに
溶解させてｐＡＰｃｏｓのプラスミドＤＮＡ溶液（０．
４１８ｍｇ／ｍｌ）を調製した。
【００３１】（ｂ）ｐＡＰｃｏｓΔ（ＥｃｏＲＩ）の作
成及び調製 ｐＡＰｃｏｓ１０μｇを反応混液１００μl 〔１００ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭＮａＣ
ｌ、５ｍＭＭｇＣｌ2 、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ〕で、
６０．６ユニツトの制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）と３７℃で２時間反
応させて完全に消化した。そして、フエノール抽出で除
蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０
ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。
次に、このＥｃｏＲＩで消化したＤＮＡ溶液１μl （〜
１μｇ）を反応混液２５μl 〔５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．２）、１０ｍＭＭｇＳＯ4 、０．１ｍＭＤ
ＴＴ、５０μｇ／ｍｌＢＳＡ、８０μＭｄＡＴＰ、８０
μＭｄＣＴＰ、８０μＭｄＧＴＰ、８０μＭｄＴＴＰ）
で、２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２℃で３０分間
反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂｌｕｎｔ
ｅｎｄに変えた。そして、反応液を６５℃で１０分間熱
処理してＫｌｅｎｏｗ酵素を失活させた。
成及び調製 ｐＡＰｃｏｓ１０μｇを反応混液１００μl 〔１００ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭＮａＣ
ｌ、５ｍＭＭｇＣｌ2 、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ〕で、
６０．６ユニツトの制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）と３７℃で２時間反
応させて完全に消化した。そして、フエノール抽出で除
蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０
ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。
次に、このＥｃｏＲＩで消化したＤＮＡ溶液１μl （〜
１μｇ）を反応混液２５μl 〔５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．２）、１０ｍＭＭｇＳＯ4 、０．１ｍＭＤ
ＴＴ、５０μｇ／ｍｌＢＳＡ、８０μＭｄＡＴＰ、８０
μＭｄＣＴＰ、８０μＭｄＧＴＰ、８０μＭｄＴＴＰ）
で、２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２℃で３０分間
反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂｌｕｎｔ
ｅｎｄに変えた。そして、反応液を６５℃で１０分間熱
処理してＫｌｅｎｏｗ酵素を失活させた。
【００３２】次に、このＤＮＡ溶液１０μl （〜０．４
μｇ）を反応混液５０μl （５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．４）、１０ｍＭＭｇＣｌ2 、１０ｍＭＤＴ
Ｔ、１ｍＭスペルミジン、１ｍＭＡＴＰ、１００μｇ／
ｍｌＢＳＡ）で、１５ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼ
と１２℃で１７．５時間反応させて閉環化したのち、フ
エノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として
得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶
液２０μl に溶解させた。そして、このＤＮＡ溶液１０
μl で大腸菌（ＨＢ１０１）をトランスホーメシヨンし
たのち、Ａｐr かつＴｃr クローンを得た。次いで、こ
れらのクローンについて少量培養及び少量ＤＮＡ調製を
行ったのち、各クローンのもつプラスミドＤＮＡの特性
を調べて、ｐＡＰｃｏｓのＥｃｏＲＩサイトを欠いたプ
ラスミド：ｐＡＰｃｏｓΔ（ＥｃｏＲＩ）（図６）を持
つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中
で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製
してｐＡＰｃｏｓΔ（ＥｃｏＲＩ）のプラスミドＤＮＡ
を調製した。
μｇ）を反応混液５０μl （５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．４）、１０ｍＭＭｇＣｌ2 、１０ｍＭＤＴ
Ｔ、１ｍＭスペルミジン、１ｍＭＡＴＰ、１００μｇ／
ｍｌＢＳＡ）で、１５ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼ
と１２℃で１７．５時間反応させて閉環化したのち、フ
エノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として
得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶
液２０μl に溶解させた。そして、このＤＮＡ溶液１０
μl で大腸菌（ＨＢ１０１）をトランスホーメシヨンし
たのち、Ａｐr かつＴｃr クローンを得た。次いで、こ
れらのクローンについて少量培養及び少量ＤＮＡ調製を
行ったのち、各クローンのもつプラスミドＤＮＡの特性
を調べて、ｐＡＰｃｏｓのＥｃｏＲＩサイトを欠いたプ
ラスミド：ｐＡＰｃｏｓΔ（ＥｃｏＲＩ）（図６）を持
つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中
で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製
してｐＡＰｃｏｓΔ（ＥｃｏＲＩ）のプラスミドＤＮＡ
を調製した。
【００３３】（ｃ）ｐＨＰｃｏｓの作成及び調製 ｐＡＰｃｏｓΔ（ＥｃｏＲＩ）２０μｇを、反応混液２
００μl 〔６０ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、１０ｍＭＭｇＣｌ2 、６ｍＭＤＴＴ、
１００μｇ／ｍｌＢＳＡ〕で、７５．８ユニツトの制限
酵素ＡｖａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ社製）と３７℃で２時間反応させて完全に消化したの
ち、さらに反応混液５００μl 〔６０ｍＭＮａＣｌ、７
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、７ｍＭＭｇＣｌ
2 、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ〕で、１０１ユニツトの制
限酵素ＨｉｎｄIII （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂｓ社製）と３７℃で２時間反応させて完全に消化
した。そして、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエ
タノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ１４μ
l （〜１μｇ／ｍｌ）に溶解させた。
００μl 〔６０ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）、１０ｍＭＭｇＣｌ2 、６ｍＭＤＴＴ、
１００μｇ／ｍｌＢＳＡ〕で、７５．８ユニツトの制限
酵素ＡｖａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ社製）と３７℃で２時間反応させて完全に消化したの
ち、さらに反応混液５００μl 〔６０ｍＭＮａＣｌ、７
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、７ｍＭＭｇＣｌ
2 、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ〕で、１０１ユニツトの制
限酵素ＨｉｎｄIII （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂｓ社製）と３７℃で２時間反応させて完全に消化
した。そして、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエ
タノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ１４μ
l （〜１μｇ／ｍｌ）に溶解させた。
【００３４】次に、このＡｖａＩとＨｉｎｄIII で消化
したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）を、反応混液２５μ
l で、２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２℃で３０分
間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂｌｕｎｔ
ｅｎｄに変えた。そして、反応液を６５℃で１０分間
熱処理してＫｌｅｎｏｗ酵素を失活させた。次に、この
ＤＮＡ溶液１０μl （〜０．４μｇ）を反応混液５０μ
l で、１５ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で
１７．５時間反応させて、ｃｏｓ及びｏｒｉ、Ａｐr を
含むＤＮＡ断片（３．７５Ｋｂｐ）を閉環化させた（Ｈ
ｉｎｄIII サイトは再構成される）。その後、フエノー
ル抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱
を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μ
l に溶解させた。
したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）を、反応混液２５μ
l で、２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２℃で３０分
間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂｌｕｎｔ
ｅｎｄに変えた。そして、反応液を６５℃で１０分間
熱処理してＫｌｅｎｏｗ酵素を失活させた。次に、この
ＤＮＡ溶液１０μl （〜０．４μｇ）を反応混液５０μ
l で、１５ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で
１７．５時間反応させて、ｃｏｓ及びｏｒｉ、Ａｐr を
含むＤＮＡ断片（３．７５Ｋｂｐ）を閉環化させた（Ｈ
ｉｎｄIII サイトは再構成される）。その後、フエノー
ル抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱
を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μ
l に溶解させた。
【００３５】そして、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンした後、Ａｐ
r かつＴｃs （テトラサイクリン感受性）クローンを得
た。次いで、これらのクローンのもつプラスミドＤＮＡ
の特性を調べて、ｐＡＰｃｏｓΔ（ＥｃｏＲＩ）のＡｖ
ａＩサイトとＨｉｎｄIII サイトの間のＤＮＡ断片（１
Ｋｂｐ）を欠いたプラスミド：ｐＨＰｃｏｓ（図６）を
持つ大腸菌を得た。この大腸菌をＴＹＧ−Ｐ培地１l 中
で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製
してｐＨＰｃｏｓのプラスミドＤＮＡを調製した。
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンした後、Ａｐ
r かつＴｃs （テトラサイクリン感受性）クローンを得
た。次いで、これらのクローンのもつプラスミドＤＮＡ
の特性を調べて、ｐＡＰｃｏｓΔ（ＥｃｏＲＩ）のＡｖ
ａＩサイトとＨｉｎｄIII サイトの間のＤＮＡ断片（１
Ｋｂｐ）を欠いたプラスミド：ｐＨＰｃｏｓ（図６）を
持つ大腸菌を得た。この大腸菌をＴＹＧ−Ｐ培地１l 中
で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製
してｐＨＰｃｏｓのプラスミドＤＮＡを調製した。
【００３６】（ｄ）ｐＨＢｇlII ｃｏｓの作成及び調製 ｐＨＰｃｏｓ１０μｇを、反応混液１００μl 〔６０ｍ
ＭＮａＣｌ、６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、
６ｍＭＭｇＣｌ2 、６ｍＭＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌＢ
ＳＡ）〕で、５１．２ユニツトの制限酵素ＰｖｕII（Ｔ
ａｋａｒａ社製）と３７℃で２時間反応させて完全に消
化した（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）。そして、フエノール抽
出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱
を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μｇ／μl ）に溶解さ
せた。次に、このＰｖｕIIで消化したＤＮＡ溶液０．４
μl （〜０．４μｇ）とＢｇｌIIリンカー〔ｄ（ｐＣ−
Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ）〕２μｇとを、反応混液
２０μl 〔５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、
１０ｍＭＭｇＣｌ2 、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭスペルミ
ジン、１ｍＭＡＴＰ、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ〕で、６
ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応
させて連結した。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮ
Ａをエタノール沈澱として得た。
ＭＮａＣｌ、６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、
６ｍＭＭｇＣｌ2 、６ｍＭＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌＢ
ＳＡ）〕で、５１．２ユニツトの制限酵素ＰｖｕII（Ｔ
ａｋａｒａ社製）と３７℃で２時間反応させて完全に消
化した（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）。そして、フエノール抽
出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱
を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μｇ／μl ）に溶解さ
せた。次に、このＰｖｕIIで消化したＤＮＡ溶液０．４
μl （〜０．４μｇ）とＢｇｌIIリンカー〔ｄ（ｐＣ−
Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ）〕２μｇとを、反応混液
２０μl 〔５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、
１０ｍＭＭｇＣｌ2 、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭスペルミ
ジン、１ｍＭＡＴＰ、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ〕で、６
ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応
させて連結した。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮ
Ａをエタノール沈澱として得た。
【００３７】このＤＮＡ沈澱を、反応混液２５０μl
〔６０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）、１０ｍＭＭｇＣｌ2 、１０ｍＭＤＴＴ、１０
０μｇ／ｍｌＢＳＡ〕で、２００ユニツトの制限酵素Ｂ
ｇｌII（Ｔａｋａｒａ社製）と３７℃で４時間反応させ
て消化したのち、０．８％調製用アガロースゲルにかけ
て、１０ｍＡで１２時間電気泳動した。分解されたＤＮ
Ａ断片は臭化エチジウム染色と長波長紫外線照明によつ
て見えてくる。ｃｏｓ及びｏｒｉ、Ａｐr からなるＤＮ
Ａ断片（２．５５Ｋｂｐ）を含有するゲルを切出したの
ち、５倍容量の抽出液（０．５ＭＮＨ4 ＯＡｃ、１ｍＭ
ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）：水飽和フエノール＝１：１）
の存在下で、ゲルをすりつぶしてＤＮＡを溶出させた。
そして、溶出液をセカンダリーブタノールで濃縮後、
０．１倍容量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍容量のエタノ
ールを加えてＤＮＡを沈澱として得た。
〔６０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）、１０ｍＭＭｇＣｌ2 、１０ｍＭＤＴＴ、１０
０μｇ／ｍｌＢＳＡ〕で、２００ユニツトの制限酵素Ｂ
ｇｌII（Ｔａｋａｒａ社製）と３７℃で４時間反応させ
て消化したのち、０．８％調製用アガロースゲルにかけ
て、１０ｍＡで１２時間電気泳動した。分解されたＤＮ
Ａ断片は臭化エチジウム染色と長波長紫外線照明によつ
て見えてくる。ｃｏｓ及びｏｒｉ、Ａｐr からなるＤＮ
Ａ断片（２．５５Ｋｂｐ）を含有するゲルを切出したの
ち、５倍容量の抽出液（０．５ＭＮＨ4 ＯＡｃ、１ｍＭ
ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）：水飽和フエノール＝１：１）
の存在下で、ゲルをすりつぶしてＤＮＡを溶出させた。
そして、溶出液をセカンダリーブタノールで濃縮後、
０．１倍容量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍容量のエタノ
ールを加えてＤＮＡを沈澱として得た。
【００３８】このＤＮＡ沈澱を反応混液２０μl で、６
ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時
間反応させて、ｃｏｓ及びｏｒｉ、Ａｐr からなるＤＮ
Ａ断片（２．５５Ｋｂｐ）を閉環化させた。その後、フ
エノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として
得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶
液２０μl に溶解させた。そして、このＤＮＡ溶液１０
μl で大腸菌（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨン
したのち、Ａｐr クローンを得た。次いで、これらのク
ローンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べてｐＨＰｃ
ｏｓのＰｖｕIIサイトにＢｇｌIIリンカーを挿入させた
プラスミド：ｐＨＢｇｌIIｃｏｓ（図６）を持つ大腸菌
を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖さ
せたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製してｐＨ
ＢｇｌIIｃｏｓのプラスミドＤＮＡを調製した。
ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時
間反応させて、ｃｏｓ及びｏｒｉ、Ａｐr からなるＤＮ
Ａ断片（２．５５Ｋｂｐ）を閉環化させた。その後、フ
エノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として
得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶
液２０μl に溶解させた。そして、このＤＮＡ溶液１０
μl で大腸菌（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨン
したのち、Ａｐr クローンを得た。次いで、これらのク
ローンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べてｐＨＰｃ
ｏｓのＰｖｕIIサイトにＢｇｌIIリンカーを挿入させた
プラスミド：ｐＨＢｇｌIIｃｏｓ（図６）を持つ大腸菌
を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖さ
せたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製してｐＨ
ＢｇｌIIｃｏｓのプラスミドＤＮＡを調製した。
【００３９】（ｅ）ｐＡＰｃｏｓ（ＢｇｌII）の作成お
よび調製 ｐＡＰｃｏｓ１０μｇを、反応混液１００μｌで６０．
６ユニツトのＥｃｏＲＩと３７℃で２時間反応させて消
化した。そして、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡを
エタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μ
l （〜１μl ／μl ）に溶解させた。次に、このＥｃｏ
ＲＩで消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）を、反応
混液２５μl で、２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２
℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄを
ｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そして、反応液を６５℃
で１０分間熱処理してＫｌｅｎｏｗ酵素を失活させた。
よび調製 ｐＡＰｃｏｓ１０μｇを、反応混液１００μｌで６０．
６ユニツトのＥｃｏＲＩと３７℃で２時間反応させて消
化した。そして、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡを
エタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μ
l （〜１μl ／μl ）に溶解させた。次に、このＥｃｏ
ＲＩで消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）を、反応
混液２５μl で、２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２
℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄを
ｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そして、反応液を６５℃
で１０分間熱処理してＫｌｅｎｏｗ酵素を失活させた。
【００４０】次に、このＤＮＡ溶液１０μl （０．４μ
ｇ）とＢｇｌIIリンカー〔ｄ（ｐＣ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−
Ｃ−Ｔ−Ｇ）〕２μｇとを、反応混液２０μl で、６ユ
ニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応さ
せて連結した。そして、この反応液１０μl を、反応混
液５０μl で、１５ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと
１２℃で１７．５時間反応させて、ｃｏｓ及びｏｒｉ、
Ａｐr ．Ｔｃr からなるＤＮＡ断片（４．７５Ｋｂｐ）
を閉環化させた。その後、フエノール抽出を行いＤＮＡ
をエタノール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させた。この
ＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌（ＨＢ１０１）をトランス
ホーメーシヨンした後、Ａｐr かつＴｃr クローンを得
た。次いで、これらのクローンのもつプラスミドＤＮＡ
の特性を調べて、ｐＡＰｃｏｓのＥｃｏＲＩサイトにＢ
ｇｌIIリンカーを挿入させたプラスミド：ｐＡＰｃｏｓ
（ＢｇｌII）（図６）を持つ大腸菌を得た。この大腸菌
を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体より
ｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製しｐＡＰｃｏｓ（ＢｇｌII）
のプラスミドＤＮＡを調製した。
ｇ）とＢｇｌIIリンカー〔ｄ（ｐＣ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−
Ｃ−Ｔ−Ｇ）〕２μｇとを、反応混液２０μl で、６ユ
ニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応さ
せて連結した。そして、この反応液１０μl を、反応混
液５０μl で、１５ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと
１２℃で１７．５時間反応させて、ｃｏｓ及びｏｒｉ、
Ａｐr ．Ｔｃr からなるＤＮＡ断片（４．７５Ｋｂｐ）
を閉環化させた。その後、フエノール抽出を行いＤＮＡ
をエタノール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させた。この
ＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌（ＨＢ１０１）をトランス
ホーメーシヨンした後、Ａｐr かつＴｃr クローンを得
た。次いで、これらのクローンのもつプラスミドＤＮＡ
の特性を調べて、ｐＡＰｃｏｓのＥｃｏＲＩサイトにＢ
ｇｌIIリンカーを挿入させたプラスミド：ｐＡＰｃｏｓ
（ＢｇｌII）（図６）を持つ大腸菌を得た。この大腸菌
を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体より
ｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製しｐＡＰｃｏｓ（ＢｇｌII）
のプラスミドＤＮＡを調製した。
【００４１】（ｆ）ｐＤｃｏｓＡｐr ／Ｔｃr （２Ｂｇ
ｌ II ）の作成及び調製 ｐＡＰｃｏｓ（ＢｇｌII）２０μｇを、反応混液２００
μl で２０２ユニツトのＢｇｌIIと３７℃で２時間反応
させて消化した後、０．８％調製用アガロースゲル電気
泳動にかけて、ｃｏｓ及びＴＣr を含むＤＮＡ断片
（１．８６Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノー
ル沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ５．５μl
（〜１μｇ／μｌ）に溶解させた。一方、ｐＨＢｇｌII
ｃｏｓ１０μｇを、反応混液１００μl で９４ユニツト
のＢｇｌIIと３７℃で２時間反応させて消化した。そし
てフエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱
として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μｇ／
μl ）に溶解させた。そして、ｐＡＰｃｏｓ（ＢｇｌI
I）のｃｏｓ及びＴｃr を含むＢｇｌII断片のＤＮＡ溶
液１μl （〜１μｇ）と、ｐＨＢｇｌIIｃｏｓをＢｇｌ
IIで消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）とを、反応
混液２０μl で６ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１
２℃で１７．５時間反応させて連結した。その後、フエ
ノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、
沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２
０μl に溶解させた。
ｌ II ）の作成及び調製 ｐＡＰｃｏｓ（ＢｇｌII）２０μｇを、反応混液２００
μl で２０２ユニツトのＢｇｌIIと３７℃で２時間反応
させて消化した後、０．８％調製用アガロースゲル電気
泳動にかけて、ｃｏｓ及びＴＣr を含むＤＮＡ断片
（１．８６Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノー
ル沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ５．５μl
（〜１μｇ／μｌ）に溶解させた。一方、ｐＨＢｇｌII
ｃｏｓ１０μｇを、反応混液１００μl で９４ユニツト
のＢｇｌIIと３７℃で２時間反応させて消化した。そし
てフエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱
として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μｇ／
μl ）に溶解させた。そして、ｐＡＰｃｏｓ（ＢｇｌI
I）のｃｏｓ及びＴｃr を含むＢｇｌII断片のＤＮＡ溶
液１μl （〜１μｇ）と、ｐＨＢｇｌIIｃｏｓをＢｇｌ
IIで消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）とを、反応
混液２０μl で６ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１
２℃で１７．５時間反応させて連結した。その後、フエ
ノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、
沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２
０μl に溶解させた。
【００４２】次に、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンした後、Ａｐ
r かつＴｃr クローンを得た。次いでこれらのクローン
のもつプラスミドＤＮＡの特性を調べて、同一の方向性
を持つたｃｏｓを２個有するプラスミド：ｐＤｃｏｓＡ
ｐr ／Ｔｃr （２ＢｇlII ）（図６）を持つ大腸菌を得
た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させた
後、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製してｐＤｃｏｓ
Ａｐr ／Ｔｃr （２ＢｇｌII）のプラスミドＤＮＡを調
製した。
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンした後、Ａｐ
r かつＴｃr クローンを得た。次いでこれらのクローン
のもつプラスミドＤＮＡの特性を調べて、同一の方向性
を持つたｃｏｓを２個有するプラスミド：ｐＤｃｏｓＡ
ｐr ／Ｔｃr （２ＢｇlII ）（図６）を持つ大腸菌を得
た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させた
後、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製してｐＤｃｏｓ
Ａｐr ／Ｔｃr （２ＢｇｌII）のプラスミドＤＮＡを調
製した。
【００４３】（ｇ）ｐＤｃｏｓＡｐr ／Ｔｃr の作成及
び調製 ｐＤｃｏｓＡｐr ／Ｔｃr （２ＢｇlII ）１０μｇを反
応混液１００μl で、１１．０ユニツトのＢｇlII と３
７℃で３０分間反応させて限定消化した。次いで、フエ
ノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として
得た。このＤＮＡ沈澱を反応混液１００μl で２１．８
ユニツトのＰｖｕIIと３７℃で２時間反応させて完全に
消化したのち、０．８％調製用アガロースゲル電気泳動
にかけて、２個のｃｏｓ及びｏｒｉ、Ａｐr 、Ｔｃr を
含むＤＮＡ断片（４．２Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮ
Ａをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ
６．５μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。
び調製 ｐＤｃｏｓＡｐr ／Ｔｃr （２ＢｇlII ）１０μｇを反
応混液１００μl で、１１．０ユニツトのＢｇlII と３
７℃で３０分間反応させて限定消化した。次いで、フエ
ノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として
得た。このＤＮＡ沈澱を反応混液１００μl で２１．８
ユニツトのＰｖｕIIと３７℃で２時間反応させて完全に
消化したのち、０．８％調製用アガロースゲル電気泳動
にかけて、２個のｃｏｓ及びｏｒｉ、Ａｐr 、Ｔｃr を
含むＤＮＡ断片（４．２Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮ
Ａをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ
６．５μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。
【００４４】次に、このＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）
を、反応混液２５μl で、２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵
素と２２℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ
ｅｎｄをｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そして、反応液
を６５℃で１０分間熱処理してＫｌｅｎｏｗ酵素を失活
させた。次に、このＤＮＡ溶液１０μl （０．４μｇ）
とＰｖｕIIリンカー〔ｄ（ｐＣ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−
Ｇ−Ｇ）〕２μｇとを、反応混液２０μl で、６ユニツ
トのＴ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応させて
連結した。そして、この反応液１０μl を、反応混液５
０μl で、１５ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２
℃で１７．５時間反応させて、２個のｃｏｓ及びｏｒ
ｉ、Ａｐr 、Ｔｃr からなるＤＮＡ断片（４．２Ｋｂ
ｐ）を閉環化させた。その後、フエノール抽出を行い、
ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させ
た。
を、反応混液２５μl で、２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵
素と２２℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ
ｅｎｄをｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そして、反応液
を６５℃で１０分間熱処理してＫｌｅｎｏｗ酵素を失活
させた。次に、このＤＮＡ溶液１０μl （０．４μｇ）
とＰｖｕIIリンカー〔ｄ（ｐＣ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−
Ｇ−Ｇ）〕２μｇとを、反応混液２０μl で、６ユニツ
トのＴ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応させて
連結した。そして、この反応液１０μl を、反応混液５
０μl で、１５ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２
℃で１７．５時間反応させて、２個のｃｏｓ及びｏｒ
ｉ、Ａｐr 、Ｔｃr からなるＤＮＡ断片（４．２Ｋｂ
ｐ）を閉環化させた。その後、フエノール抽出を行い、
ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させ
た。
【００４５】次に、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａ
ｐr かつＴｃr クローンを得た。そして、これらのクロ
ーンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＤｃｏ
ｓＡｐr ／Ｔｃr （２ＢｇｌlI）のＰｖｕIIサイトとＢ
ｇｌIIサイトの間のＤＮＡ断片（０．２Ｋｂｐ）を欠い
たプラスミド：ｐＤｃｏｓＡｐr ／Ｔｃr （図６）を持
つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中
で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡ分離を精製
してｐＤｃｏｓＡｐr ／Ｔｃr のプラスミドＤＮＡを調
製した。
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａ
ｐr かつＴｃr クローンを得た。そして、これらのクロ
ーンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＤｃｏ
ｓＡｐr ／Ｔｃr （２ＢｇｌlI）のＰｖｕIIサイトとＢ
ｇｌIIサイトの間のＤＮＡ断片（０．２Ｋｂｐ）を欠い
たプラスミド：ｐＤｃｏｓＡｐr ／Ｔｃr （図６）を持
つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中
で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡ分離を精製
してｐＤｃｏｓＡｐr ／Ｔｃr のプラスミドＤＮＡを調
製した。
【００４６】（ｈ）ｐＤｃｏｓＡｐr ／Ｔｃr ・Ｘｈｏ
Ｉa の作成及び調製 ｐＤｃｏｓＡｐr ／Ｔｃr １０μｇを反応混液１００μ
l で、４２．９ユニツトのＡｖａＩと３７℃で２時間反
応させて消化した。そして、フエノール抽出で除蛋白
後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得た。この沈澱を１
０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させ
た。次に、このＡｖａＩで消化したＤＮＡ溶液１μl
（〜１μｇ）を、反応混液２５μl で、２ユニツトのＫ
ｌｅｎｏｗ酵素と２２℃で３０分間反応させて、ｃｏｈ
ｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そ
して、反応液を６５℃で１０分間熱処理してＫｌｅｎｏ
ｗ酵素を失活させた。
Ｉa の作成及び調製 ｐＤｃｏｓＡｐr ／Ｔｃr １０μｇを反応混液１００μ
l で、４２．９ユニツトのＡｖａＩと３７℃で２時間反
応させて消化した。そして、フエノール抽出で除蛋白
後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得た。この沈澱を１
０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させ
た。次に、このＡｖａＩで消化したＤＮＡ溶液１μl
（〜１μｇ）を、反応混液２５μl で、２ユニツトのＫ
ｌｅｎｏｗ酵素と２２℃で３０分間反応させて、ｃｏｈ
ｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そ
して、反応液を６５℃で１０分間熱処理してＫｌｅｎｏ
ｗ酵素を失活させた。
【００４７】このＤＮＡ溶液１μl （０．４μｇ）と、
ＸｈｏＩリンカー〔ｄ（ｐＣ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ
−Ｇ）〕２μｇとを、反応混液２０μl で６ユニツトの
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応させて連結
した。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノ
ール沈澱として得た。このＤＮＡ沈澱を、反応混液６０
０μl 〔１５０ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．９）、６ｍＭＭｇＣｌ2 、６ｍＭＤＴＴ、１
００μｇ／ｍｌＢＳＡ〕で、１０００ユニツトのＸｈｏ
Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）と
３７℃で４時間反応させて消化したのち、０．８％調製
用アガロースゲル電気泳動にかけて、２個のｃｏｓ及び
ｏｒｉ、Ａｐr 、Ｔｃr を含むＤＮＡ断片（４．２Ｋｂ
ｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得
た。
ＸｈｏＩリンカー〔ｄ（ｐＣ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ
−Ｇ）〕２μｇとを、反応混液２０μl で６ユニツトの
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応させて連結
した。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノ
ール沈澱として得た。このＤＮＡ沈澱を、反応混液６０
０μl 〔１５０ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．９）、６ｍＭＭｇＣｌ2 、６ｍＭＤＴＴ、１
００μｇ／ｍｌＢＳＡ〕で、１０００ユニツトのＸｈｏ
Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）と
３７℃で４時間反応させて消化したのち、０．８％調製
用アガロースゲル電気泳動にかけて、２個のｃｏｓ及び
ｏｒｉ、Ａｐr 、Ｔｃr を含むＤＮＡ断片（４．２Ｋｂ
ｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得
た。
【００４８】このＤＮＡ沈澱を反応混液２０μl で、６
ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時
間反応させて閉環化したのち、フエノール抽出を行い、
ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させ
た。そして、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌（ＨＢ１
０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａｐr かつ
Ｔｃr クローンを得た。次いで、これらのクローンのも
つプラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＤｃｏｓＡｐr
／Ｔｃr のＡｖａＩサイトにＸｈｏＩリンカーを挿入さ
せたプラスミド：ｐＤｃｏｓＡｐr ／Ｔｃr ・ＸｈｏＩ
a （図６）を持つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ
−Ｐ培地１l 中で増殖させた後、菌体よりｃｃｃ−ＤＮ
Ａを分離精製してｐＤｃｏｓＡｐr ／Ｔｃr ・ＸｈｏＩ
a のプラスミドＤＮＡを調製した。
ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時
間反応させて閉環化したのち、フエノール抽出を行い、
ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させ
た。そして、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌（ＨＢ１
０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａｐr かつ
Ｔｃr クローンを得た。次いで、これらのクローンのも
つプラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＤｃｏｓＡｐr
／Ｔｃr のＡｖａＩサイトにＸｈｏＩリンカーを挿入さ
せたプラスミド：ｐＤｃｏｓＡｐr ／Ｔｃr ・ＸｈｏＩ
a （図６）を持つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ
−Ｐ培地１l 中で増殖させた後、菌体よりｃｃｃ−ＤＮ
Ａを分離精製してｐＤｃｏｓＡｐr ／Ｔｃr ・ＸｈｏＩ
a のプラスミドＤＮＡを調製した。
【００４９】（ｉ）ｐＤｃｏｓＴｃr の作成及び調製 ｐＤｃｏｓＡｐr ／Ｔｃr ・ＸｈｏＩa １０μｇを反応
混液１００μl で６．２ユニツトのＢｓｔＥIIと６０℃
で３０分間反応させて限定消化した。そして、フエノー
ル抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、
沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μｇ／μl ）に溶
解させた。次に、このＢｓｔＥIIで限定消化したＤＮＡ
溶液１μl （〜１μｇ）を、反応混液２５μl で、２ユ
ニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２℃で３０分間反応させ
て、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂｌｕｎｔ ｅｎｄに
変えた。そして、反応液を６５℃で１０分間熱処理して
Ｋｌｅｎｏｗ酵素を失活させた。
混液１００μl で６．２ユニツトのＢｓｔＥIIと６０℃
で３０分間反応させて限定消化した。そして、フエノー
ル抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、
沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μｇ／μl ）に溶
解させた。次に、このＢｓｔＥIIで限定消化したＤＮＡ
溶液１μl （〜１μｇ）を、反応混液２５μl で、２ユ
ニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２℃で３０分間反応させ
て、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂｌｕｎｔ ｅｎｄに
変えた。そして、反応液を６５℃で１０分間熱処理して
Ｋｌｅｎｏｗ酵素を失活させた。
【００５０】このＤＮＡ溶液１０μl （０．４μｇ）
と、ＰｓｔＩリンカー〔ｄ（ｐＧ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ａ
−Ｇ−Ｃ）〕２μｇとを、反応混液２０μｌで６ユニツ
トのＴ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応させて
連結した。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエ
タノール沈澱として得た。このＤＮＡ沈澱を、反応混液
４００μl 〔５０ｍＭ（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、２０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ2 、
１００μｇ／ｍｌＢＳＡ）で、６００ユニツトのＰｓｔ
Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）と
３７℃で４時間反応させて消化した後、０．８％調製用
アガロースゲル電気泳動にかけて、２個のｃｏｓ及びｏ
ｒｉ、Ｔｃr を含むＤＮＡ断片（〜４Ｋｂｐ）を分離精
製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得た。
と、ＰｓｔＩリンカー〔ｄ（ｐＧ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ａ
−Ｇ−Ｃ）〕２μｇとを、反応混液２０μｌで６ユニツ
トのＴ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応させて
連結した。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエ
タノール沈澱として得た。このＤＮＡ沈澱を、反応混液
４００μl 〔５０ｍＭ（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、２０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ2 、
１００μｇ／ｍｌＢＳＡ）で、６００ユニツトのＰｓｔ
Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）と
３７℃で４時間反応させて消化した後、０．８％調製用
アガロースゲル電気泳動にかけて、２個のｃｏｓ及びｏ
ｒｉ、Ｔｃr を含むＤＮＡ断片（〜４Ｋｂｐ）を分離精
製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得た。
【００５１】次に、このＤＮＡ沈澱を反応混液２０μl
で、６ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１
７．５時間反応させて閉環化したのち、フエノール抽出
を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．
１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶
解させた。そして、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ｔ
ｃr クローンを得た。次いで、これらのクローンのもつ
プラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＤｃｏｓＡｐ r ／
Ｔｃr ・ＸｈｏＩa のＢｓｔIIサイトとＰｓｔＩサイト
の間のＤＮＡ断片（〜０．２Ｋｂｐ）を欠いたプラスミ
ド：ｐＤｃｏｓＴｃr （図３、図６）を持つ大腸菌を得
た。なお、本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究
所に「微工研菌第７５５１号（ＦＥＲＭ Ｐ−７５５
１）」として寄託されている。この大腸菌を、ＴＹＧ−
Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮ
Ａを分離精製してｐＤｃｏｓＴｃr のプラスミドＤＮＡ
を調製した。
で、６ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１
７．５時間反応させて閉環化したのち、フエノール抽出
を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．
１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶
解させた。そして、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ｔ
ｃr クローンを得た。次いで、これらのクローンのもつ
プラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＤｃｏｓＡｐ r ／
Ｔｃr ・ＸｈｏＩa のＢｓｔIIサイトとＰｓｔＩサイト
の間のＤＮＡ断片（〜０．２Ｋｂｐ）を欠いたプラスミ
ド：ｐＤｃｏｓＴｃr （図３、図６）を持つ大腸菌を得
た。なお、本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究
所に「微工研菌第７５５１号（ＦＥＲＭ Ｐ−７５５
１）」として寄託されている。この大腸菌を、ＴＹＧ−
Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮ
Ａを分離精製してｐＤｃｏｓＴｃr のプラスミドＤＮＡ
を調製した。
【００５２】実施例 ２ ｐＤｃｏｓＴｃr ／ｏｒｉの
作成及び調製（図７） （ａ）ｐＢＲ−３２７・ＸｈｏＩp の作成及び調製 ｐＢＲ−３２７ １０μｇを反応混液１００μl で、２
４．８ユニツトのＰｓｔＩと３７℃で２時間反応させて
消化した。そして、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡ
をエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７
μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。次に、このＰｓ
ｔＩで消化したＤＮＡ溶液１．５μl （〜１．５μｇ）
を、反応混液３０μl 〔３３ｍＭＴｒｉｓ−ａｃｅｔａ
ｔｅ（ｐＨ７．９）、６６ｍＭ酢酸カリ、１０ｍＭＭｇ
Ｃｌ2 、０．５ｍＭＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ、
０．１ｍＭｄＡＴＰ、０．１ｍＭｄＣＴＰ、０．１ｍＭ
ｄＧＴＰ、０．１ｍＭｄＴＴＰ〕で、５ユニツトのＴ４
−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ．Ｌ社製）と、３７℃で１５
分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂｌｕｎ
ｔ ｅｎｄに変えた。そして、反応液を６５℃で１０分
間熱処理してＴ４−ＤＮＡポリメラーゼを失活させた。
作成及び調製（図７） （ａ）ｐＢＲ−３２７・ＸｈｏＩp の作成及び調製 ｐＢＲ−３２７ １０μｇを反応混液１００μl で、２
４．８ユニツトのＰｓｔＩと３７℃で２時間反応させて
消化した。そして、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡ
をエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７
μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。次に、このＰｓ
ｔＩで消化したＤＮＡ溶液１．５μl （〜１．５μｇ）
を、反応混液３０μl 〔３３ｍＭＴｒｉｓ−ａｃｅｔａ
ｔｅ（ｐＨ７．９）、６６ｍＭ酢酸カリ、１０ｍＭＭｇ
Ｃｌ2 、０．５ｍＭＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ、
０．１ｍＭｄＡＴＰ、０．１ｍＭｄＣＴＰ、０．１ｍＭ
ｄＧＴＰ、０．１ｍＭｄＴＴＰ〕で、５ユニツトのＴ４
−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ．Ｌ社製）と、３７℃で１５
分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂｌｕｎ
ｔ ｅｎｄに変えた。そして、反応液を６５℃で１０分
間熱処理してＴ４−ＤＮＡポリメラーゼを失活させた。
【００５３】このＤＮＡ溶液８μl （０．４μｇ）と、
ＸｈｏＩリンカー〔ｄ（ｐＣ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ
−Ｇ）〕２μｇとを、反応混液２０μl で６ユニツトの
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応させて連結
した。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノ
ール沈澱として得た。このＤＮＡ沈澱を、反応混液６０
０μl で１０００ユニツトのＸｈｏＩと３７℃で４時間
反応させて消化したのち、０．８％調製用アガロースゲ
ル電気泳動にかけて、３．２７ＫｂｐのＤＮＡ断片を分
離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得た。この
ＤＮＡ沈澱を反応混液２０μl で６ユニツトのＴ４−Ｄ
ＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて閉環化
したのち、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール
沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）溶液２０μl に溶解させた。
ＸｈｏＩリンカー〔ｄ（ｐＣ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ
−Ｇ）〕２μｇとを、反応混液２０μl で６ユニツトの
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応させて連結
した。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノ
ール沈澱として得た。このＤＮＡ沈澱を、反応混液６０
０μl で１０００ユニツトのＸｈｏＩと３７℃で４時間
反応させて消化したのち、０．８％調製用アガロースゲ
ル電気泳動にかけて、３．２７ＫｂｐのＤＮＡ断片を分
離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得た。この
ＤＮＡ沈澱を反応混液２０μl で６ユニツトのＴ４−Ｄ
ＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて閉環化
したのち、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール
沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）溶液２０μl に溶解させた。
【００５４】そして、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ｔ
ｃr クローンを得た。次いで、これらのクローンのもつ
プラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＢＲ−３２７のＰ
ｓｔＩサイトにＸｈｏＩリンカーを挿入させたプラスミ
ド：ｐＢＲ−３２７・ＸｈｏＩP （図７）を持つ大腸菌
を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖さ
せたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製してｐＢ
Ｒ−３２７・ＸｈｏＩp のプラスミドＤＮＡを調製し
た。
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ｔ
ｃr クローンを得た。次いで、これらのクローンのもつ
プラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＢＲ−３２７のＰ
ｓｔＩサイトにＸｈｏＩリンカーを挿入させたプラスミ
ド：ｐＢＲ−３２７・ＸｈｏＩP （図７）を持つ大腸菌
を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖さ
せたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製してｐＢ
Ｒ−３２７・ＸｈｏＩp のプラスミドＤＮＡを調製し
た。
【００５５】（ｂ）ｐＤｃｏｓＴｃr （２ｏｒｉ）の作
成及び調製 ｐＤｃｏｓＴｃr ２０μｇを、反応混液５００μl 〔１
５０ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
９）、６ｍＭＭｇＣｌ2 、６ｍＭＤＴＴ、１００μｇ／
ｍｌＢＳＡ〕で、１６７ユニツトの制限酵素ＢａｍＨＩ
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）及び
５００ユニツトのＸｈｏＩと３７℃で２時間反応させて
完全に消化したのち、０．８％調製用アガロースゲル電
気泳動にかけて、２個のｃｏｓ及びｏｒｉを含むＤＮＡ
断片（２．４Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノ
ール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ９．５μl
（〜１μｇ／μl ）に溶解させた。
成及び調製 ｐＤｃｏｓＴｃr ２０μｇを、反応混液５００μl 〔１
５０ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
９）、６ｍＭＭｇＣｌ2 、６ｍＭＤＴＴ、１００μｇ／
ｍｌＢＳＡ〕で、１６７ユニツトの制限酵素ＢａｍＨＩ
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）及び
５００ユニツトのＸｈｏＩと３７℃で２時間反応させて
完全に消化したのち、０．８％調製用アガロースゲル電
気泳動にかけて、２個のｃｏｓ及びｏｒｉを含むＤＮＡ
断片（２．４Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノ
ール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ９．５μl
（〜１μｇ／μl ）に溶解させた。
【００５６】一方、ｐＢＲ−３２７ＸｈｏＩP ２０μｇ
を反応混液５００μl で、１６７ユニツトのＢａｍＨＩ
及び５００ユニツトのＸｈｏＩと３７℃で２時間反応さ
せて完全に消化した後、０．８％調製用アガロースゲル
電気泳動にかけて、ｏｒｉを含むＤＮＡ断片（２．１４
Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱とし
て得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ９．０μl （〜１μｇ／
μl ）に溶解させた。そして、ｐＤｃｏｓＴｃr のｃｏ
ｓ及びｏｒｉを含むＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ断片のＤＮＡ
溶液１μl （〜１μｇ）と、ｐＢＲ−３２７・ＸｈｏＩ
P のｏｒｉを含むＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ断片のＤＮＡ溶
液１μl （〜１μｇ）とを、反応混液２０μl で６ユニ
ツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反
応させて連結した。その後、フエノール抽出を行い、Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させた。
を反応混液５００μl で、１６７ユニツトのＢａｍＨＩ
及び５００ユニツトのＸｈｏＩと３７℃で２時間反応さ
せて完全に消化した後、０．８％調製用アガロースゲル
電気泳動にかけて、ｏｒｉを含むＤＮＡ断片（２．１４
Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱とし
て得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ９．０μl （〜１μｇ／
μl ）に溶解させた。そして、ｐＤｃｏｓＴｃr のｃｏ
ｓ及びｏｒｉを含むＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ断片のＤＮＡ
溶液１μl （〜１μｇ）と、ｐＢＲ−３２７・ＸｈｏＩ
P のｏｒｉを含むＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ断片のＤＮＡ溶
液１μl （〜１μｇ）とを、反応混液２０μl で６ユニ
ツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反
応させて連結した。その後、フエノール抽出を行い、Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させた。
【００５７】次に、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ｔ
Ｃr クローンを得た。次いで、これらのクローンのもつ
プラスミドＤＮＡの特性を調べて、２個のｃｏｓ及び２
個のｏｒｉ、Ｔｃr を有するプラスミド：ｐＤｃｏｓＴ
ｃr （２ｏｒｉ）（図７）を持つ大腸菌を得た。この大
腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体
よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製してｐＤｃｏｓＴｃ
r （２ｏｒｉ）のプラスミドＤＮＡを調製した。
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ｔ
Ｃr クローンを得た。次いで、これらのクローンのもつ
プラスミドＤＮＡの特性を調べて、２個のｃｏｓ及び２
個のｏｒｉ、Ｔｃr を有するプラスミド：ｐＤｃｏｓＴ
ｃr （２ｏｒｉ）（図７）を持つ大腸菌を得た。この大
腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体
よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製してｐＤｃｏｓＴｃ
r （２ｏｒｉ）のプラスミドＤＮＡを調製した。
【００５８】（ｃ）ｐＳＶ２−ｄｈｆｒΔ（ＢｇlII ）
の作成及び調製 ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ〔Ｓｕｂｒａｍａｎｉ、Ｍｕｌｌｉ
ｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１、８５４（１９８１）〕１０μｇを反応混液１
００μl で、４８．５ユニツトのＢｇｌIIと３７℃で２
時間反応させ消化した。そして、フエノール抽出で除蛋
白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、１０ｔ／０．
１Ｅ７μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。次に、こ
のＢｇｌIIで消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）
を、反応混液２５μl で、2 ユニツトのｋｌｅｎｏｗ酵
素と２２℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ
ｅｎｄをｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そして、反応液
を６５℃で１０分間熱処理してｋｌｅｎｏｗ酵素を失活
させた。
の作成及び調製 ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ〔Ｓｕｂｒａｍａｎｉ、Ｍｕｌｌｉ
ｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１、８５４（１９８１）〕１０μｇを反応混液１
００μl で、４８．５ユニツトのＢｇｌIIと３７℃で２
時間反応させ消化した。そして、フエノール抽出で除蛋
白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、１０ｔ／０．
１Ｅ７μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。次に、こ
のＢｇｌIIで消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）
を、反応混液２５μl で、2 ユニツトのｋｌｅｎｏｗ酵
素と２２℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ
ｅｎｄをｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そして、反応液
を６５℃で１０分間熱処理してｋｌｅｎｏｗ酵素を失活
させた。
【００５９】次に、このＤＮＡ溶液１０μl （〜０．４
μｇ）を反応混液５０μl で、１５ユニツトのＴ４−Ｄ
ＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて閉環化
したのち、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール
沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）溶液２０μl に溶解させた。そして、このＤＮ
Ａ溶液１０μl で大腸菌（ＨＢ１０１）をトランスホー
メーシヨンしたのち、Ａｐr クローンを得た。次いで、
これらのクローンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べ
て、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒのＢｇｌIIサイトを欠いたプラ
スミド：ｐＳＶ２−ｄｈｆｒΔ（ＢｇｌII）（図７）を
持つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l
中で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精
製してｐＳＶ２−ｄｈｆｒΔ（ＢｇｌII）のプラスミド
ＤＮＡを調製した。
μｇ）を反応混液５０μl で、１５ユニツトのＴ４−Ｄ
ＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて閉環化
したのち、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール
沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）溶液２０μl に溶解させた。そして、このＤＮ
Ａ溶液１０μl で大腸菌（ＨＢ１０１）をトランスホー
メーシヨンしたのち、Ａｐr クローンを得た。次いで、
これらのクローンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べ
て、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒのＢｇｌIIサイトを欠いたプラ
スミド：ｐＳＶ２−ｄｈｆｒΔ（ＢｇｌII）（図７）を
持つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l
中で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精
製してｐＳＶ２−ｄｈｆｒΔ（ＢｇｌII）のプラスミド
ＤＮＡを調製した。
【００６０】（ｄ）ｐＤｃｏｓＴｃr ／ｏｒｉの作成及
び調製 ｐＤｃｏｓＴｃr （２ｏｒｉ）２０μｇを反応混液５０
０μl 〔６０ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、６ｍＭＭｇＣｌ2 、６ｍＭＤＴＴ、１
００μｇ／ｍｌＢＳＡ〕で、４２．５ユニツトのＰｖｕ
II及び３５．８ユニツトのＰｓｔＩと３７℃で２時間反
応させて完全に消化したのち、０．８％調製用アガロー
スゲル電気泳動にかけて、２個のｃｏｓ及びｏｒｉ、Ｔ
ｃr を含むＤＮＡ断片（３．１Ｋｂｐ）を分離精製し
て、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／
０．１Ｅ９．５μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。
び調製 ｐＤｃｏｓＴｃr （２ｏｒｉ）２０μｇを反応混液５０
０μl 〔６０ｍＭＮａＣｌ、６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、６ｍＭＭｇＣｌ2 、６ｍＭＤＴＴ、１
００μｇ／ｍｌＢＳＡ〕で、４２．５ユニツトのＰｖｕ
II及び３５．８ユニツトのＰｓｔＩと３７℃で２時間反
応させて完全に消化したのち、０．８％調製用アガロー
スゲル電気泳動にかけて、２個のｃｏｓ及びｏｒｉ、Ｔ
ｃr を含むＤＮＡ断片（３．１Ｋｂｐ）を分離精製し
て、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／
０．１Ｅ９．５μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。
【００６１】一方、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒΔ（ＢｇlII ）
２０μｇを反応混液５００μl で、３８．８ユニツトの
ＰｖｕII及び３２．７ユニツトのＰｓｔＩと３７℃で２
時間反応させて完全に消化した後、０．８％調製用アガ
ロースゲル電気泳動にかけて、ＳＶ−ｄｈｆｒを含むＤ
ＮＡ断片（２．４５Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡを
エタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μ
l （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。そして、ｐＤｃｏ
ｓＴｃr （２ｏｒｉ）のｃｏｓ及びｏｒｉ、Ｔｃr を含
むＰｖｕII／ＰｓｔＩ断片のＤＮＡ溶液１μl （〜１μ
ｇ）と、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒΔ（ＢｇｌII）のＳＶ−ｄ
ｈｆｒを含むＰｖｕII／ＰｓｔＩ断片のＤＮＡ溶液１μ
l （〜１μl ）とを、反応混液２０μl で６ユニツトの
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させ
て連結した。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡを
エタノール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させた。
２０μｇを反応混液５００μl で、３８．８ユニツトの
ＰｖｕII及び３２．７ユニツトのＰｓｔＩと３７℃で２
時間反応させて完全に消化した後、０．８％調製用アガ
ロースゲル電気泳動にかけて、ＳＶ−ｄｈｆｒを含むＤ
ＮＡ断片（２．４５Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡを
エタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μ
l （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。そして、ｐＤｃｏ
ｓＴｃr （２ｏｒｉ）のｃｏｓ及びｏｒｉ、Ｔｃr を含
むＰｖｕII／ＰｓｔＩ断片のＤＮＡ溶液１μl （〜１μ
ｇ）と、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒΔ（ＢｇｌII）のＳＶ−ｄ
ｈｆｒを含むＰｖｕII／ＰｓｔＩ断片のＤＮＡ溶液１μ
l （〜１μl ）とを、反応混液２０μl で６ユニツトの
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させ
て連結した。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡを
エタノール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させた。
【００６２】次に、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ｔ
ｃr クローンを得た。次いで、これらのクローンのもつ
プラスミドＤＮＡの特性を調べて、２個のｃｏｓ及びｏ
ｒｉ、Ｔｃr 、ＳＶ−ｄｈｆｒを有するプラスミド：ｐ
ＤｃｏｓＴｃr ／ｏｒｉ（図４、図７）を持つ大腸菌を
得た。なお、本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研
究所に「微工研菌第７５５４号（ＦＥＲＭ Ｐ−７５５
４）」として寄託されている。この大腸菌を、ＴＹＧ−
Ｐ培地１l 中で増殖させた後、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡ
を分離精製して、ｐＤｃｏｓＴｃr ／ｏｒｉのプラスミ
ドＤＮＡを調製した。
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ｔ
ｃr クローンを得た。次いで、これらのクローンのもつ
プラスミドＤＮＡの特性を調べて、２個のｃｏｓ及びｏ
ｒｉ、Ｔｃr 、ＳＶ−ｄｈｆｒを有するプラスミド：ｐ
ＤｃｏｓＴｃr ／ｏｒｉ（図４、図７）を持つ大腸菌を
得た。なお、本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研
究所に「微工研菌第７５５４号（ＦＥＲＭ Ｐ−７５５
４）」として寄託されている。この大腸菌を、ＴＹＧ−
Ｐ培地１l 中で増殖させた後、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡ
を分離精製して、ｐＤｃｏｓＴｃr ／ｏｒｉのプラスミ
ドＤＮＡを調製した。
【００６３】実施例 ３ ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉの
作成及び調製（図８） （ａ）ｐＢＲ−３２７ＸｈｏＩa の作成及び調製 ｐＢＲ−３２７ １０μｇを反応混液１００μl で、１
１０ユニツトのＡｖａＩと３７℃で２時間反応させて消
化した。そして、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡを
エタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μ
l （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。次に、このＡｖａ
Ｉで消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）を、反応混
液２５μl で、２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２℃
で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂ
ｌｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そして、反応液を６５℃で
１０分間熱処理してＫｌｅｎｏｗ酵素を失活させた。
作成及び調製（図８） （ａ）ｐＢＲ−３２７ＸｈｏＩa の作成及び調製 ｐＢＲ−３２７ １０μｇを反応混液１００μl で、１
１０ユニツトのＡｖａＩと３７℃で２時間反応させて消
化した。そして、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡを
エタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μ
l （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。次に、このＡｖａ
Ｉで消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）を、反応混
液２５μl で、２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２℃
で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂ
ｌｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そして、反応液を６５℃で
１０分間熱処理してＫｌｅｎｏｗ酵素を失活させた。
【００６４】このＤＮＡ溶液１０μl （０．４μｇ）
と、ＸｈｏＩリンカー〔ｄ（ｐＣ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ
−Ｇ−Ｇ）〕２μｇとを、反応混液２０μl で６ユニツ
トのＴ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応させて
連結した。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエ
タノール沈澱として得た。このＤＮＡ沈澱を、反応混液
６００μl で、１０００ユニツトのＸｈｏＩと３７℃で
４時間反応させて消化した後、０．８％調製用アガロー
スゲル電気泳動にかけて、３．２７ＫｂｐのＤＮＡ断片
を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得た。
と、ＸｈｏＩリンカー〔ｄ（ｐＣ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ
−Ｇ−Ｇ）〕２μｇとを、反応混液２０μl で６ユニツ
トのＴ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応させて
連結した。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエ
タノール沈澱として得た。このＤＮＡ沈澱を、反応混液
６００μl で、１０００ユニツトのＸｈｏＩと３７℃で
４時間反応させて消化した後、０．８％調製用アガロー
スゲル電気泳動にかけて、３．２７ＫｂｐのＤＮＡ断片
を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得た。
【００６５】このＤＮＡ沈澱を反応混液２０μl で６ユ
ニツトのＴ４−リガーゼと１２℃で１７．５時間反応さ
せて閉環化しのち、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエ
タノール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させた。そして、
このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌（ＨＢ１０１）をトラ
ンスホーメーシヨンしたのち、Ａｐr かつＴｃr クロー
ンを得た。次いで、これらのクローンのもつプラスミド
ＤＮＡの特性を調べて、ｐＢＲ−３２７のＡｖａＩサイ
トにＸｈｏＩリンカーを挿入させたプラスミド：ｐＢＲ
−３２７・ＸｈｏＩa （図８）を持つ大腸菌を得た。こ
の大腸菌をＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌
体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＢＲ−３２７
・ＸｈｏＩa のプラスミドＤＮＡを調製した。
ニツトのＴ４−リガーゼと１２℃で１７．５時間反応さ
せて閉環化しのち、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエ
タノール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させた。そして、
このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌（ＨＢ１０１）をトラ
ンスホーメーシヨンしたのち、Ａｐr かつＴｃr クロー
ンを得た。次いで、これらのクローンのもつプラスミド
ＤＮＡの特性を調べて、ｐＢＲ−３２７のＡｖａＩサイ
トにＸｈｏＩリンカーを挿入させたプラスミド：ｐＢＲ
−３２７・ＸｈｏＩa （図８）を持つ大腸菌を得た。こ
の大腸菌をＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌
体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＢＲ−３２７
・ＸｈｏＩa のプラスミドＤＮＡを調製した。
【００６６】（ｂ）ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｄｈｆ
ｒΔ（ＢｇｌII）の作成及び調製 ｐＤｃｏｓＴｃr ／ｏｒｉ２０μｇを反応液２００μl
で１０６ユニツトのＥｃｏＲＩと３７℃で２時間反応さ
せて消化したのち、さらに反応混液５００μlで５３０
ユニツトのＸｈｏＩと３７℃で２時間反応させて消化し
た。その後、０．８％調製用アガロースゲル電気泳動に
かけて２個のｃｏｓ及びＳＶ−ｄｈｆｒを含むＤＮＡ断
片（〜２．９Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノ
ール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜
１μｇ／μl ）に溶解させた。
ｒΔ（ＢｇｌII）の作成及び調製 ｐＤｃｏｓＴｃr ／ｏｒｉ２０μｇを反応液２００μl
で１０６ユニツトのＥｃｏＲＩと３７℃で２時間反応さ
せて消化したのち、さらに反応混液５００μlで５３０
ユニツトのＸｈｏＩと３７℃で２時間反応させて消化し
た。その後、０．８％調製用アガロースゲル電気泳動に
かけて２個のｃｏｓ及びＳＶ−ｄｈｆｒを含むＤＮＡ断
片（〜２．９Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノ
ール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜
１μｇ／μl ）に溶解させた。
【００６７】一方、ｐＢＲ−３２７・ＸｈｏＩa ２０μ
ｇを反応混液２００μl で１７６ユニツトのＥｃｏＲＩ
と３７℃で２時間反応させて消化した後、さらに反応混
液５００μl で８８０ユニツトのＸｈｏＩと３７℃で２
時間消化した。その後、０．８％調製用アガロースゲル
電気泳動にかけて、ｏｒｉ及びＡｐr を含むＤＮＡ断片
（１．８４Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノー
ル沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ８μl （〜１
μｇ／μl ）に溶解させた。
ｇを反応混液２００μl で１７６ユニツトのＥｃｏＲＩ
と３７℃で２時間反応させて消化した後、さらに反応混
液５００μl で８８０ユニツトのＸｈｏＩと３７℃で２
時間消化した。その後、０．８％調製用アガロースゲル
電気泳動にかけて、ｏｒｉ及びＡｐr を含むＤＮＡ断片
（１．８４Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノー
ル沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ８μl （〜１
μｇ／μl ）に溶解させた。
【００６８】そして、ｐＤｃｏｓＴｃr ／ｏｒｉのｃｏ
ｓ及びＳＶ−ｄｈｆｒを含むＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片
のＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）と、ｐＢＲ−３２７・
ＸｈｏＩa のｏｒｉ及びＡｐr を含むＥｃｏＲＩ／Ｘｈ
ｏＩ断片のＤＮＡ溶液１μl（〜１μｇ）とを、反応混
液２０μl で６ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２
℃で１７．５時間反応させて連結した。その後、フエノ
ール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈
澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０
μl に溶解させた。
ｓ及びＳＶ−ｄｈｆｒを含むＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片
のＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）と、ｐＢＲ−３２７・
ＸｈｏＩa のｏｒｉ及びＡｐr を含むＥｃｏＲＩ／Ｘｈ
ｏＩ断片のＤＮＡ溶液１μl（〜１μｇ）とを、反応混
液２０μl で６ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２
℃で１７．５時間反応させて連結した。その後、フエノ
ール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈
澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０
μl に溶解させた。
【００６９】次に、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａ
ｐr クローンを得た。次いで、これらのクローンのもつ
プラスミドＤＮＡの特性を調べて、２個のｃｏｓ及びｏ
ｒｉ、Ａｐr 、ＳＶ−ｄｈｆｒΔ（ＢｇｌII）を有する
プラスミド：ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｄｈｆｒΔ
（ＢｇlII ）（図８）を持つ大腸菌を得た。この大腸菌
を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体より
ｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＤｃｏｓＡｐr／ｏ
ｒｉ／ｄｈｆｒΔ（ＢｇｌII）のプラスミドＤＮＡを調
製した。
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａ
ｐr クローンを得た。次いで、これらのクローンのもつ
プラスミドＤＮＡの特性を調べて、２個のｃｏｓ及びｏ
ｒｉ、Ａｐr 、ＳＶ−ｄｈｆｒΔ（ＢｇｌII）を有する
プラスミド：ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｄｈｆｒΔ
（ＢｇlII ）（図８）を持つ大腸菌を得た。この大腸菌
を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体より
ｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＤｃｏｓＡｐr／ｏ
ｒｉ／ｄｈｆｒΔ（ＢｇｌII）のプラスミドＤＮＡを調
製した。
【００７０】（ｃ）ｐＳＶ２−ｄｈｆｒΔ（ＢａｍＨＩ
／ＢｇｌII）の作成及び調製 ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ１０μｇを反応混液１００μl で４
８．５ユニツトのＢｇｌIIと３７℃で２時間反応させて
消化したのち、さらに反応混液２５０μl で５８．２ユ
ニツトのＢａｍＨＩと２時間反応させて消化した。そし
て、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈
澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μｇ
／μl ）に溶解させた。次に、このＢｇｌIIとＢａｍＨ
Ｉで消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）を、反応混
液２５μl で、２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２℃
で３０分間反応させてｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂｌ
ｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そして、反応液を６５℃で１
０分間熱処理して、Ｋｌｅｎｏｗ酵素を失活させた。
／ＢｇｌII）の作成及び調製 ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ１０μｇを反応混液１００μl で４
８．５ユニツトのＢｇｌIIと３７℃で２時間反応させて
消化したのち、さらに反応混液２５０μl で５８．２ユ
ニツトのＢａｍＨＩと２時間反応させて消化した。そし
て、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈
澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μｇ
／μl ）に溶解させた。次に、このＢｇｌIIとＢａｍＨ
Ｉで消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）を、反応混
液２５μl で、２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２℃
で３０分間反応させてｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂｌ
ｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そして、反応液を６５℃で１
０分間熱処理して、Ｋｌｅｎｏｗ酵素を失活させた。
【００７１】次に、このＤＮＡ溶液１０μl （〜０．４
μｇ）を反応混液５０μl で、１５ユニツトのＴ４−Ｄ
ＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて閉環化
したのち、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール
沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）溶液２０μl に溶解させた。そして、このＤＮ
Ａ溶液１０μl で大腸菌（ＨＢ１０１）をトランスホー
メーシヨンしたのち、Ａｐr クローンを得た。次いで、
これらのクローンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べ
て、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒのＢｇｌIIサイトとＢａｍＨＩ
サイトとの間のＤＮＡ断片（０．８５Ｋｂｐ）を欠いた
プラスミド：ｐＳＶ２−ｄｈｆｒΔ（ＢａｍＨＩ／Ｂｇ
ｌII）（図８）を持つ大腸菌を得た。この大腸菌をＴＹ
Ｇ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−
ＤＮＡを分離精製して、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒΔ（Ｂａｍ
ＨＩ／ＢｇｌII）のプラスミドＤＮＡを調製した。
μｇ）を反応混液５０μl で、１５ユニツトのＴ４−Ｄ
ＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて閉環化
したのち、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール
沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）溶液２０μl に溶解させた。そして、このＤＮ
Ａ溶液１０μl で大腸菌（ＨＢ１０１）をトランスホー
メーシヨンしたのち、Ａｐr クローンを得た。次いで、
これらのクローンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べ
て、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒのＢｇｌIIサイトとＢａｍＨＩ
サイトとの間のＤＮＡ断片（０．８５Ｋｂｐ）を欠いた
プラスミド：ｐＳＶ２−ｄｈｆｒΔ（ＢａｍＨＩ／Ｂｇ
ｌII）（図８）を持つ大腸菌を得た。この大腸菌をＴＹ
Ｇ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−
ＤＮＡを分離精製して、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒΔ（Ｂａｍ
ＨＩ／ＢｇｌII）のプラスミドＤＮＡを調製した。
【００７２】（ｄ）ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｄｈｆ
ｒΔ（ＢａｍＨＩ／ＢｇｌII）の作成及び調製 ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｄｈｆｒΔ（ＢｇｌII）２
０μｇを反応混液２００μl で、２．９ユニツトのＰｓ
ｔＩと３７℃で３０分間反応させて限定消化した。次い
で、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈
澱として得た。このＤＮＡ沈澱を反応混液２００μl で
３４．０ユニツトのＰｖｕIIと３７℃で２時間反応させ
て消化した。その後、０．８％調製用アガロースゲル電
気泳動にかけて、２個のｃｏｓ及びｏｒｉ、Ａｐr を含
むＤＮＡ断片（２．３Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡ
をエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７
μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。
ｒΔ（ＢａｍＨＩ／ＢｇｌII）の作成及び調製 ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｄｈｆｒΔ（ＢｇｌII）２
０μｇを反応混液２００μl で、２．９ユニツトのＰｓ
ｔＩと３７℃で３０分間反応させて限定消化した。次い
で、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈
澱として得た。このＤＮＡ沈澱を反応混液２００μl で
３４．０ユニツトのＰｖｕIIと３７℃で２時間反応させ
て消化した。その後、０．８％調製用アガロースゲル電
気泳動にかけて、２個のｃｏｓ及びｏｒｉ、Ａｐr を含
むＤＮＡ断片（２．３Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡ
をエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７
μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。
【００７３】一方、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒΔ（ＢａｍＨＩ
／ＢｇｌII）２０μｇを反応混液５００μl で、４６．
８ユニツトのＰｖｕII及び３９．５ユニツトのＰｓｔＩ
と３７℃で２時間反応させて完全に消化したのち、０．
８％調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、ＳＶ−ｄ
ｈｆｒを含むＤＮＡ断片（１．６１Ｋｂｐ）を分離精製
して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ
／０．１Ｅ５．５μl（〜１μｇ／μl ）に溶解させ
た。そして、ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｄｈｆｒΔ
（ＢｇｌII）のｃｏｓ及びｏｒｉ、Ａｐr を含むＰｖｕ
II／ＰｓｔＩ断片のＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）と、
ｐＳＶ２−ｄｈｆｒΔ（ＢａｍＨＩ／ＢｇｌII）のＳＶ
−ｄｈｆｒを含むＰｖｕII／ＰｓｔＩ断片のＤＮＡ溶液
１μl （〜１μｇ）とを反応混液２０μl で６ユニツト
のＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応さ
せて連結した。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡ
をエタノール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させた。
／ＢｇｌII）２０μｇを反応混液５００μl で、４６．
８ユニツトのＰｖｕII及び３９．５ユニツトのＰｓｔＩ
と３７℃で２時間反応させて完全に消化したのち、０．
８％調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、ＳＶ−ｄ
ｈｆｒを含むＤＮＡ断片（１．６１Ｋｂｐ）を分離精製
して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ
／０．１Ｅ５．５μl（〜１μｇ／μl ）に溶解させ
た。そして、ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｄｈｆｒΔ
（ＢｇｌII）のｃｏｓ及びｏｒｉ、Ａｐr を含むＰｖｕ
II／ＰｓｔＩ断片のＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）と、
ｐＳＶ２−ｄｈｆｒΔ（ＢａｍＨＩ／ＢｇｌII）のＳＶ
−ｄｈｆｒを含むＰｖｕII／ＰｓｔＩ断片のＤＮＡ溶液
１μl （〜１μｇ）とを反応混液２０μl で６ユニツト
のＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応さ
せて連結した。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡ
をエタノール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させた。
【００７４】次に、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａ
ｐr クローンを得た。次いで、これらのクローンのもつ
プラスミドＤＮＡの特性を調べて、２個のｃｏｓ及びｏ
ｒｉ、Ａｐr 、ＳＶ−ｄｈｆｒΔ（ＢａｍＨＩ／Ｂｇｌ
II）を有するプラスミド：ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／
ｄｈｆｒΔ（ＢａｍＨＩ／ＢｇｌII）（図８）を持つ大
腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増
殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製し
て、ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｄｈｆｒΔ（ＢａｍＨ
Ｉ／ＢｇｌII）のプラスミドＤＮＡを調製した。
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａ
ｐr クローンを得た。次いで、これらのクローンのもつ
プラスミドＤＮＡの特性を調べて、２個のｃｏｓ及びｏ
ｒｉ、Ａｐr 、ＳＶ−ｄｈｆｒΔ（ＢａｍＨＩ／Ｂｇｌ
II）を有するプラスミド：ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／
ｄｈｆｒΔ（ＢａｍＨＩ／ＢｇｌII）（図８）を持つ大
腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増
殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製し
て、ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｄｈｆｒΔ（ＢａｍＨ
Ｉ／ＢｇｌII）のプラスミドＤＮＡを調製した。
【００７５】（ｅ）ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｄｈｆ
ｒ（ＢａｍＨＩ）の作成及び調製 ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｄｈｆｒΔ（ＢａｍＨＩ／
ＢｇｌII）１０μｇを、反応混液１００μl で、７３．
７ユニツトのＥｃｏＲＩと３７℃で２時間反応させて消
化した。そして、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡを
エタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μ
l （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。次に、このＥｃｏ
ＲＩで消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μl ）を、反応
混液２５μl で、２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２
℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄを
ｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そして、反応液を６５℃
で１０分間熱処理してＫｌｅｎｏｗ酵素を失活させた。
ｒ（ＢａｍＨＩ）の作成及び調製 ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｄｈｆｒΔ（ＢａｍＨＩ／
ＢｇｌII）１０μｇを、反応混液１００μl で、７３．
７ユニツトのＥｃｏＲＩと３７℃で２時間反応させて消
化した。そして、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡを
エタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μ
l （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。次に、このＥｃｏ
ＲＩで消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μl ）を、反応
混液２５μl で、２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２
℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄを
ｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そして、反応液を６５℃
で１０分間熱処理してＫｌｅｎｏｗ酵素を失活させた。
【００７６】このＤＮＡ溶液１０μl （０．４μｇ）
と、ＢａｍＨＩリンカー〔ｄ（ｐＣ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−
Ｃ−Ｃ−Ｇ）〕２μｇとを反応混液２０μl で６ユニツ
トのＴ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応させて
連結した。その後、フエノール抽出を行いＤＮＡをエタ
ノール沈澱として得た。このＤＮＡ沈澱を、反応混液６
００μl で１０００ユニツトのＢａｍＨＩと３７℃で４
時間反応させて消化したのち、０．８％調製用アガロー
スゲル電気泳動にかけて、３．９１ＫｂｐのＤＮＡ断片
を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得た。
と、ＢａｍＨＩリンカー〔ｄ（ｐＣ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−
Ｃ−Ｃ−Ｇ）〕２μｇとを反応混液２０μl で６ユニツ
トのＴ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応させて
連結した。その後、フエノール抽出を行いＤＮＡをエタ
ノール沈澱として得た。このＤＮＡ沈澱を、反応混液６
００μl で１０００ユニツトのＢａｍＨＩと３７℃で４
時間反応させて消化したのち、０．８％調製用アガロー
スゲル電気泳動にかけて、３．９１ＫｂｐのＤＮＡ断片
を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得た。
【００７７】このＤＮＡ沈澱を反応混液２０μl で６ユ
ニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間
反応させて閉環化したのち、フエノール抽出を行い、Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させた。
そして、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌（ＨＢ１０
１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａｐr クロー
ンを得た。次いで、これらのクローンの持つプラスミド
ＤＮＡの特性を調べて、ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｄ
ｈｆｒΔ（ＢａｍＨＩ／ＢｇｌII）のＥｃｏＲＩサイト
にＢａｍＨＩリンカーを挿入させたプラスミド（この場
合、ＢａｍＨＩサイトの両側にＥｃｏＲＩサイトが再構
成される）：ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｄｈｆｒ（Ｂ
ａｍＨＩ）（図８）を持つ大腸菌を得た。この大腸菌
を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で、増殖させたのち、菌体よ
りｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＤｃｏｓＡｐr ／
ｏｒｉ／ｄｈｆｒ（ＢａｍＨＩ）のプラスミドＤＮＡを
調製した。
ニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間
反応させて閉環化したのち、フエノール抽出を行い、Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させた。
そして、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌（ＨＢ１０
１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａｐr クロー
ンを得た。次いで、これらのクローンの持つプラスミド
ＤＮＡの特性を調べて、ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｄ
ｈｆｒΔ（ＢａｍＨＩ／ＢｇｌII）のＥｃｏＲＩサイト
にＢａｍＨＩリンカーを挿入させたプラスミド（この場
合、ＢａｍＨＩサイトの両側にＥｃｏＲＩサイトが再構
成される）：ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｄｈｆｒ（Ｂ
ａｍＨＩ）（図８）を持つ大腸菌を得た。この大腸菌
を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で、増殖させたのち、菌体よ
りｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＤｃｏｓＡｐr ／
ｏｒｉ／ｄｈｆｒ（ＢａｍＨＩ）のプラスミドＤＮＡを
調製した。
【００７８】（ｆ）ｐＳＶ０１０／ｎｅｏr の作成及び
調製 ｐＡＯ４３（ＯＫａ，Ｓｕｇｉｓａｋｉ ＆ Ｔａｋａ
ｎａｍｉ，Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ，１４７，２１４（１
９８１））２０μｇを反応混液２００μl （６０ｍＭＮ
ａＣｌ、６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０
ｍＭＭｇＣｌ2、６ｍＭＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌＢＳ
Ａ）で、１５０ユニツトの制限酵素ＡｖａII（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）と３７℃で２時
間反応させて消化したのち、０．８％調製用アガロース
ゲル電気泳動にかけて、ｎｅｏrを含むＤＮＡ断片
（１．２４Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノー
ル沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ５μl （〜１
μｇ／μl ）に溶解させた。このＤＮＡ溶液２μl （〜
２μｇ）を、反応混液５０μl で、４ユニツトのＫｌｅ
ｎｏｗ酵素と２２℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓ
ｉｖｅ ｅｎｄをｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そして
フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱と
して得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ１．５μl （〜１μｇ
／μl ）に溶解させた。
調製 ｐＡＯ４３（ＯＫａ，Ｓｕｇｉｓａｋｉ ＆ Ｔａｋａ
ｎａｍｉ，Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ，１４７，２１４（１
９８１））２０μｇを反応混液２００μl （６０ｍＭＮ
ａＣｌ、６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０
ｍＭＭｇＣｌ2、６ｍＭＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌＢＳ
Ａ）で、１５０ユニツトの制限酵素ＡｖａII（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）と３７℃で２時
間反応させて消化したのち、０．８％調製用アガロース
ゲル電気泳動にかけて、ｎｅｏrを含むＤＮＡ断片
（１．２４Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノー
ル沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ５μl （〜１
μｇ／μl ）に溶解させた。このＤＮＡ溶液２μl （〜
２μｇ）を、反応混液５０μl で、４ユニツトのＫｌｅ
ｎｏｗ酵素と２２℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓ
ｉｖｅ ｅｎｄをｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そして
フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱と
して得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ１．５μl （〜１μｇ
／μl ）に溶解させた。
【００７９】一方、ｐＳＶ０１０｛πＶＸ〔Ｂｒａｉｎ
ｓｅｅｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，
１１，２４２７（１９８３）〕由来のポリリンカーを持
つたｐＳＶ０１〔Ｔｊａｎ，Ｒ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏ
ｃ，Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７
７，６４９１（１９８０）〕の類縁プラスミド｝１０μ
ｇを、反応混液１００μl で１２９ユニツトのＢａｍＨ
Ｉと３７℃で２時間反応させて消化したのち、フエノー
ル抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱
を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μｇ／μl ）に溶解さ
せた。このＤＮＡ溶液２μl （〜２μｇ）を、反応混液
５０μl で、４ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２℃で
３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂｌ
ｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そして、フエノール抽出で除
蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０
ｔ／０．１Ｅ１．５μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させ
た。
ｓｅｅｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，
１１，２４２７（１９８３）〕由来のポリリンカーを持
つたｐＳＶ０１〔Ｔｊａｎ，Ｒ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏ
ｃ，Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７
７，６４９１（１９８０）〕の類縁プラスミド｝１０μ
ｇを、反応混液１００μl で１２９ユニツトのＢａｍＨ
Ｉと３７℃で２時間反応させて消化したのち、フエノー
ル抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱
を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μｇ／μl ）に溶解さ
せた。このＤＮＡ溶液２μl （〜２μｇ）を、反応混液
５０μl で、４ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２℃で
３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂｌ
ｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そして、フエノール抽出で除
蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０
ｔ／０．１Ｅ１．５μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させ
た。
【００８０】次に、ｐＡＯ４３のｎｅｏr を含むＤＮＡ
断片をＫｌｅｎｏｗ酵素で処理したＤＮＡ溶液１μl
（〜１μｇ）と、ｐＳＶ０１０をＢａｍＨＩで消化し、
Ｋｌｅｎｏｗ酵素で処理したＤＮＡ溶液１μl （〜１μ
ｇ）とを、反応液２０μl で６ユニツトのＴ４−ＤＮＡ
リガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて連結した。
その後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈
澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）溶液２０μl に溶解させた。そして、このＤＮ
Ａ溶液１０μl で大腸菌（ＨＢ１０１）をトランスホー
メーシヨンしたのち、Ａｐr かつＫｍr （ｎｅｏr ）ク
ローンを得た。次いで、これらのクローンのもつプラス
ミドＤＮＡの特性を調べてｐＳＶ０１０のＢａｍＨＩサ
イトにｎｅｏ r を挿入させたプラスミド：ｐＳＶ０１０
／ｎｅｏr （図８）を持つ大腸菌を得た。この大腸菌
を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で、増殖させたのち、菌体よ
りｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＳＶ０１０／ｎｅ
ｏr のプラスミドＤＮＡを調整した。
断片をＫｌｅｎｏｗ酵素で処理したＤＮＡ溶液１μl
（〜１μｇ）と、ｐＳＶ０１０をＢａｍＨＩで消化し、
Ｋｌｅｎｏｗ酵素で処理したＤＮＡ溶液１μl （〜１μ
ｇ）とを、反応液２０μl で６ユニツトのＴ４−ＤＮＡ
リガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて連結した。
その後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈
澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）溶液２０μl に溶解させた。そして、このＤＮ
Ａ溶液１０μl で大腸菌（ＨＢ１０１）をトランスホー
メーシヨンしたのち、Ａｐr かつＫｍr （ｎｅｏr ）ク
ローンを得た。次いで、これらのクローンのもつプラス
ミドＤＮＡの特性を調べてｐＳＶ０１０のＢａｍＨＩサ
イトにｎｅｏ r を挿入させたプラスミド：ｐＳＶ０１０
／ｎｅｏr （図８）を持つ大腸菌を得た。この大腸菌
を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で、増殖させたのち、菌体よ
りｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＳＶ０１０／ｎｅ
ｏr のプラスミドＤＮＡを調整した。
【００８１】（ｇ）ｐＢＲ−３２２／ｎｅｏr の作成及
び調製 ｐＳＶ０１０／ｎｅｏr ２０μｇを反応混液２００μl
で４６．６ユニツトのＰｓｔＩと３７℃で２時間反応さ
せて消化したのち、さらに反応混液５００μlで１６６
ユニツトのＥｃｏＲＩと３７℃で２時間反応させて消化
した。その後、０．８％調製用アガロース電気泳動にか
けて、ｎｅｏr を含むＤＮＡ断片（１．２４Ｋｂｐ）を
分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱
を１０ｔ／０．１Ｅ５μl （〜１μl ／μl ）に溶解さ
せた。
び調製 ｐＳＶ０１０／ｎｅｏr ２０μｇを反応混液２００μl
で４６．６ユニツトのＰｓｔＩと３７℃で２時間反応さ
せて消化したのち、さらに反応混液５００μlで１６６
ユニツトのＥｃｏＲＩと３７℃で２時間反応させて消化
した。その後、０．８％調製用アガロース電気泳動にか
けて、ｎｅｏr を含むＤＮＡ断片（１．２４Ｋｂｐ）を
分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱
を１０ｔ／０．１Ｅ５μl （〜１μl ／μl ）に溶解さ
せた。
【００８２】一方、ｐＢＲ−３２２ ２０μｇを反応混
液２００μl で３７．２ユニツトのＰｓｔＩと３７℃で
２時間反応させて消化したのち、さらに反応混液５００
μlで１３２ユニツトのＥｃｏＲＩと２時間反応させて
消化した。その後、０．８％調製用アガロースゲル電気
泳動にかけて、ｏｒｉ及びＴｃr を含むＤＮＡ断片
（３．６Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノール
沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ１１μl （〜１
μｇ／μl ）に溶解させた。そして、ｐＳＶ０１０／ｎ
ｅｏr を含むＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ断片のＤＮＡ溶液１
μl （〜１μｇ）と、ｐＢＲ−３２２のｏｒｉ及びＴｃ
r を含むＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ断片のＤＮＡ溶液１μl
（〜１μｇ）とを、反応混液２０μl で６ユニツトのＴ
４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて
連結した。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエ
タノール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させた。
液２００μl で３７．２ユニツトのＰｓｔＩと３７℃で
２時間反応させて消化したのち、さらに反応混液５００
μlで１３２ユニツトのＥｃｏＲＩと２時間反応させて
消化した。その後、０．８％調製用アガロースゲル電気
泳動にかけて、ｏｒｉ及びＴｃr を含むＤＮＡ断片
（３．６Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノール
沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ１１μl （〜１
μｇ／μl ）に溶解させた。そして、ｐＳＶ０１０／ｎ
ｅｏr を含むＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ断片のＤＮＡ溶液１
μl （〜１μｇ）と、ｐＢＲ−３２２のｏｒｉ及びＴｃ
r を含むＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ断片のＤＮＡ溶液１μl
（〜１μｇ）とを、反応混液２０μl で６ユニツトのＴ
４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて
連結した。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエ
タノール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させた。
【００８３】次に、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ｋ
ｍr （ｎｅｏr ）かつＴｃr 、ＡｐS クローンを得た。
次いで、これらのクローンのもつプラスミドＤＮＡの特
性を調べて、ｐＢＲ−３２２にｎｅｏr 断片を挿入させ
たプラスミド：ｐＢＲ−３２２／ｎｅｏr （図８）を持
つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中
で、増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精
製してｐＢＲ−３２２／ｎｅｏr のプラスミドＤＮＡを
調製した。
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ｋ
ｍr （ｎｅｏr ）かつＴｃr 、ＡｐS クローンを得た。
次いで、これらのクローンのもつプラスミドＤＮＡの特
性を調べて、ｐＢＲ−３２２にｎｅｏr 断片を挿入させ
たプラスミド：ｐＢＲ−３２２／ｎｅｏr （図８）を持
つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中
で、増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精
製してｐＢＲ−３２２／ｎｅｏr のプラスミドＤＮＡを
調製した。
【００８４】（ｈ）ｐＢＲ−３２２／ｎｅｏr Δ（Ｅｃ
ｏＲＩ／ＢａｌI ）の作成及び調製 ｐＢＲ−３２２／ｎｅｏr １０μｇを反応混液１００μ
l で４０ユニツトのＢａｌI と３７℃で２時間反応させ
て消化したのち、さらに反応混液２５０μl で１２０ユ
ニツトのＥｃｏＲＩと３７℃で２時間反応させて消化し
た。そして、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタ
ノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl
（〜１μｇ／μl ）に溶解させた。次に、このＢａｌI
とＥｃｏＲＩで消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）
を、反応混液２５μl で、２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵
素と２２℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ
ｅｎｄをｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そして、反応液
を６５℃で１０分間熱処理してＫｌｅｎｏｗ酵素を失活
させた。
ｏＲＩ／ＢａｌI ）の作成及び調製 ｐＢＲ−３２２／ｎｅｏr １０μｇを反応混液１００μ
l で４０ユニツトのＢａｌI と３７℃で２時間反応させ
て消化したのち、さらに反応混液２５０μl で１２０ユ
ニツトのＥｃｏＲＩと３７℃で２時間反応させて消化し
た。そして、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタ
ノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl
（〜１μｇ／μl ）に溶解させた。次に、このＢａｌI
とＥｃｏＲＩで消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）
を、反応混液２５μl で、２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵
素と２２℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ
ｅｎｄをｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そして、反応液
を６５℃で１０分間熱処理してＫｌｅｎｏｗ酵素を失活
させた。
【００８５】次に、このＤＮＡ溶液１０μl （〜０．４
μｇ）を反応混液５０μl で、１５ユニツトのＴ４−Ｄ
ＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて閉環化
したのち（この場合、ＥｃｏＲＩサイトが再構成され
る）、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱
として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）溶液２０μl に溶解させた。そして、このＤＮＡ溶
液１０μl で大腸菌（ＨＢ１０１）をトランスホーメー
シヨンしたのち、ｎｅｏr （Ｋｍr ）かつＴｃs、Ａｐ
s クローンを得た。次いで、これらのクローンのもつプ
ラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＢＲ−３２２／ｎｅ
ｏr のＥｃｏＲＩサイトとＢａlIサイトとの間のＤＮＡ
断片（１．４２Ｋｂｐ）を欠いたプラスミド：ｐＢＲ−
３２２／ｎｅｏr Δ（ＥｃｏＲＩ／ＢａｌI ）（図８）
を持つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１
l 中で、増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分
離精製して、ｐＢＲ−３２２／ｎｅｏr Δ（ＥｃｏＲＩ
／ＢａｌI ）のプラスミドＤＮＡを調製した。
μｇ）を反応混液５０μl で、１５ユニツトのＴ４−Ｄ
ＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて閉環化
したのち（この場合、ＥｃｏＲＩサイトが再構成され
る）、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱
として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）溶液２０μl に溶解させた。そして、このＤＮＡ溶
液１０μl で大腸菌（ＨＢ１０１）をトランスホーメー
シヨンしたのち、ｎｅｏr （Ｋｍr ）かつＴｃs、Ａｐ
s クローンを得た。次いで、これらのクローンのもつプ
ラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＢＲ−３２２／ｎｅ
ｏr のＥｃｏＲＩサイトとＢａlIサイトとの間のＤＮＡ
断片（１．４２Ｋｂｐ）を欠いたプラスミド：ｐＢＲ−
３２２／ｎｅｏr Δ（ＥｃｏＲＩ／ＢａｌI ）（図８）
を持つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１
l 中で、増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分
離精製して、ｐＢＲ−３２２／ｎｅｏr Δ（ＥｃｏＲＩ
／ＢａｌI ）のプラスミドＤＮＡを調製した。
【００８６】（ｉ）ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉの作成及
び調製 ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｄｈｆｒ（ＢａｍＨＩ）２
０μｇを反応混液２００μl で、４．１ユニツトのＰｓ
ｔＩと３７℃で３０分間反応させて限定消化した。次い
で、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈
澱として得た。このＤＮＡ沈澱を、反応混液２００μl
で４９ユニツトのＰｖｕIIと３７℃で２時間反応させて
消化した。その後、０．８％調製用アガロースゲル電気
泳動にかけて、２個のｃｏｓ及びｏｒｉ、Ａｐr を含む
ＤＮＡ断片（２．３Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡを
エタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ８μ
l（〜１μｇ／μl ）に溶解させた。
び調製 ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｄｈｆｒ（ＢａｍＨＩ）２
０μｇを反応混液２００μl で、４．１ユニツトのＰｓ
ｔＩと３７℃で３０分間反応させて限定消化した。次い
で、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈
澱として得た。このＤＮＡ沈澱を、反応混液２００μl
で４９ユニツトのＰｖｕIIと３７℃で２時間反応させて
消化した。その後、０．８％調製用アガロースゲル電気
泳動にかけて、２個のｃｏｓ及びｏｒｉ、Ａｐr を含む
ＤＮＡ断片（２．３Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡを
エタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ８μ
l（〜１μｇ／μl ）に溶解させた。
【００８７】一方、ｐＢＲ−３２２／ｎｅｏr Δ（Ｅｃ
ｏＲＩ／ＢａｌI ）２０μｇを反応混液５００μl で、
５６ユニツトのＰｖｕII及び４７ユニツトのＰｓｔＩと
３７℃で２時間反応させて完全に消化したのち、０．８
％調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、ｎｅｏr を
含むＤＮＡ断片（１．９Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮ
Ａをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ
８μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。そして、ｐＤ
ｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｄｈｆｒ（ＢａｍＨＩ）のｃｏ
ｓ及びｏｒｉ、Ａｐr を含むＰｖｕII／ＰｓｔＩ断片の
ＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）と、ｐＢＲ−３２２／ｎ
ｅｏr Δ（ＥｃｏＲＩ／ＢａｌI ）のｎｅｏr を含むＰ
ｖｕII／ＰｓｔＩ断片のＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）
とを、反応混液２０μl で６ユニツトＴ４−ＤＮＡリガ
ーゼと１２℃で１７．５時間反応させて連結した。その
後、フエノール抽出を行つてＤＮＡをエタノール沈澱と
して得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）溶液２０μl に溶解させた。
ｏＲＩ／ＢａｌI ）２０μｇを反応混液５００μl で、
５６ユニツトのＰｖｕII及び４７ユニツトのＰｓｔＩと
３７℃で２時間反応させて完全に消化したのち、０．８
％調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、ｎｅｏr を
含むＤＮＡ断片（１．９Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮ
Ａをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ
８μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。そして、ｐＤ
ｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｄｈｆｒ（ＢａｍＨＩ）のｃｏ
ｓ及びｏｒｉ、Ａｐr を含むＰｖｕII／ＰｓｔＩ断片の
ＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）と、ｐＢＲ−３２２／ｎ
ｅｏr Δ（ＥｃｏＲＩ／ＢａｌI ）のｎｅｏr を含むＰ
ｖｕII／ＰｓｔＩ断片のＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）
とを、反応混液２０μl で６ユニツトＴ４−ＤＮＡリガ
ーゼと１２℃で１７．５時間反応させて連結した。その
後、フエノール抽出を行つてＤＮＡをエタノール沈澱と
して得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）溶液２０μl に溶解させた。
【００８８】次に、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａ
ｐr かつｎｅｏr （Ｋｍr ）クローンを得た。次いで、
これらのクローンの持つプラスミドＤＮＡの特性を調べ
て、２個のｃｏｓ及びｏｒｉ、Ａｐr 、ｎｅｏr を有す
るプラスミド：ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ（図１、図
８）を持つ大腸菌を得た。なお、本菌株は、工業技術院
生命工学工業技術研究所に「微工研菌第７５５３号（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−７５５３）」として寄託されている。この
大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌
体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製してｐＤｃｏｓＡｐr
／ｏｒｉのプラスミドＤＮＡを調製した。
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａ
ｐr かつｎｅｏr （Ｋｍr ）クローンを得た。次いで、
これらのクローンの持つプラスミドＤＮＡの特性を調べ
て、２個のｃｏｓ及びｏｒｉ、Ａｐr 、ｎｅｏr を有す
るプラスミド：ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ（図１、図
８）を持つ大腸菌を得た。なお、本菌株は、工業技術院
生命工学工業技術研究所に「微工研菌第７５５３号（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−７５５３）」として寄託されている。この
大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌
体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製してｐＤｃｏｓＡｐr
／ｏｒｉのプラスミドＤＮＡを調製した。
【００８９】実施例 ４ ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／
ｇｐｔ／ＴＫの作成及び調製（図９） （ａ）ｐＳＶ２−ｇｐｔΔ（ＨｉｎｄIII ／ＢｇｌII）
の作成及び調製 ｐＳＶ２−ｇｐｔ〔Ｒｉｃｈａｒｄ、Ｍｕｌｌｉｇａｎ
＆ Ｂｅｒｇ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，
４４９（１９８１）〕１０μｇを、反応混液１００μl
で、４６ユニツトのＨｉｎｄIII 及び４６ユニツトのＢ
ｇlII と３７℃で２時間反応させて消化した。そして、
フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱と
して得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μｇ／μ
l ）に溶解させた。次に、このＨｉｎｄIII 及びＢｇｌ
IIで消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μl ）を、反応混
液２５μl で２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２℃で
３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂｌ
ｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そして、反応液を６５℃で１
０分間熱処理してＫｌｅｎｏｗ酵素を失活させた。
ｇｐｔ／ＴＫの作成及び調製（図９） （ａ）ｐＳＶ２−ｇｐｔΔ（ＨｉｎｄIII ／ＢｇｌII）
の作成及び調製 ｐＳＶ２−ｇｐｔ〔Ｒｉｃｈａｒｄ、Ｍｕｌｌｉｇａｎ
＆ Ｂｅｒｇ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，
４４９（１９８１）〕１０μｇを、反応混液１００μl
で、４６ユニツトのＨｉｎｄIII 及び４６ユニツトのＢ
ｇlII と３７℃で２時間反応させて消化した。そして、
フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱と
して得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μｇ／μ
l ）に溶解させた。次に、このＨｉｎｄIII 及びＢｇｌ
IIで消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μl ）を、反応混
液２５μl で２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２℃で
３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂｌ
ｕｎｔ ｅｎｄに変えた。そして、反応液を６５℃で１
０分間熱処理してＫｌｅｎｏｗ酵素を失活させた。
【００９０】次に、このＤＮＡ溶液１０μl （〜０．４
μｇ）を反応混液５０μl で、１５ユニツトのＴ４−Ｄ
ＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて閉環化
したのち、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール
沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）溶液２０μl に溶解させた。そして、このＤＮ
Ａ溶液１０μl で大腸菌（ＨＢ１０１）をトランスホー
メーシヨンしたのち、Ａｐr クローンを得た。次いで、
これらのクローンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べ
て、ｐＳＶ２−ｇｐｔのＨｉｎｄIII サイトとＢｇｌII
サイトとの間のＤＮＡ断片（０．１２Ｋｂｐ）を欠いた
プラスミド：ｐＳＶ２−ｇｐｔΔ（ＨｉｎｄIII ／Ｂｇ
ｌII）（図９）を持つ大腸菌を得た。この大腸菌を、Ｔ
ＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ
−ＤＮＡを分離精製してｐＳＶ２−ｇｐｔΔ（Ｈｉｎｄ
III ／ＢｇｌII）のプラスミドＤＮＡを調製した。
μｇ）を反応混液５０μl で、１５ユニツトのＴ４−Ｄ
ＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて閉環化
したのち、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール
沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）溶液２０μl に溶解させた。そして、このＤＮ
Ａ溶液１０μl で大腸菌（ＨＢ１０１）をトランスホー
メーシヨンしたのち、Ａｐr クローンを得た。次いで、
これらのクローンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べ
て、ｐＳＶ２−ｇｐｔのＨｉｎｄIII サイトとＢｇｌII
サイトとの間のＤＮＡ断片（０．１２Ｋｂｐ）を欠いた
プラスミド：ｐＳＶ２−ｇｐｔΔ（ＨｉｎｄIII ／Ｂｇ
ｌII）（図９）を持つ大腸菌を得た。この大腸菌を、Ｔ
ＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ
−ＤＮＡを分離精製してｐＳＶ２−ｇｐｔΔ（Ｈｉｎｄ
III ／ＢｇｌII）のプラスミドＤＮＡを調製した。
【００９１】（ｂ）ｐＳＶ２−ｇｐｔΔ（ＨｉｎｄIII
／ＢｇｌII）／ＢａｍＨＩの作成及び調製 ｐＳＶ２−ｇｐｔΔ（ＨｉｎｄIII ／ＢｇｌII）１０μ
ｇを反応混液１００μl で１８．８ユニツトのＰｖｕII
と３７℃で２時間反応させて消化した。そして、フエノ
ール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として
得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μｇ／μl ）
に溶解させた。次に、このＤＮＡ溶液０．４μl （〜
０．４μｇ）と、ＢａｍＨＩリンカー〔ｄ（ｐＣ−Ｇ−
Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ）〕２μｇとを、反応混液２０
μl で６ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６
時間反応させて連結した。その後、フエノール抽出を行
い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得た。
／ＢｇｌII）／ＢａｍＨＩの作成及び調製 ｐＳＶ２−ｇｐｔΔ（ＨｉｎｄIII ／ＢｇｌII）１０μ
ｇを反応混液１００μl で１８．８ユニツトのＰｖｕII
と３７℃で２時間反応させて消化した。そして、フエノ
ール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として
得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μｇ／μl ）
に溶解させた。次に、このＤＮＡ溶液０．４μl （〜
０．４μｇ）と、ＢａｍＨＩリンカー〔ｄ（ｐＣ−Ｇ−
Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ）〕２μｇとを、反応混液２０
μl で６ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと２２℃で６
時間反応させて連結した。その後、フエノール抽出を行
い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得た。
【００９２】このＤＮＡ沈澱を、反応混液６００μl で
１０００ユニツトのＢａｍＨＩと３７℃で４時間反応さ
せて消化したのち、０．８％調製用アガロースゲル電気
泳動にかけて、５．１Ｋｂｐの長さのＤＮＡ断片を分離
精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得た。このＤ
ＮＡ沈澱を反応混液２０μl で６ユニツトのＴ４−ＤＮ
Ａリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて閉環化し
たのち、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈
澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）溶液２０μl に溶解させた。
１０００ユニツトのＢａｍＨＩと３７℃で４時間反応さ
せて消化したのち、０．８％調製用アガロースゲル電気
泳動にかけて、５．１Ｋｂｐの長さのＤＮＡ断片を分離
精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得た。このＤ
ＮＡ沈澱を反応混液２０μl で６ユニツトのＴ４−ＤＮ
Ａリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて閉環化し
たのち、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈
澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）溶液２０μl に溶解させた。
【００９３】そして、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａ
ｐr クローンを得た。次いで、これらのクローンのもつ
プラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＳＶ２−ｇｐｔΔ
（ＨｉｎｄIII ／ＢｇｌII）のＰｖｕIIサイトにＢａｍ
ＨＩリンカーを挿入させたプラスミド：ｐＳＶ２−ｇｐ
ｔΔ（ＨｉｎｄIII ／ＢｇｌII）／ＢａｍＨＩ（図９）
を持つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１
l 中で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離
精製してｐＳＶ２−ｇｐｔΔ（ＨｉｎｄIII ／ＢｇｌI
I）／ＢａｍＨＩのプラスミドＤＮＡを調製した。
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａ
ｐr クローンを得た。次いで、これらのクローンのもつ
プラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＳＶ２−ｇｐｔΔ
（ＨｉｎｄIII ／ＢｇｌII）のＰｖｕIIサイトにＢａｍ
ＨＩリンカーを挿入させたプラスミド：ｐＳＶ２−ｇｐ
ｔΔ（ＨｉｎｄIII ／ＢｇｌII）／ＢａｍＨＩ（図９）
を持つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１
l 中で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離
精製してｐＳＶ２−ｇｐｔΔ（ＨｉｎｄIII ／ＢｇｌI
I）／ＢａｍＨＩのプラスミドＤＮＡを調製した。
【００９４】（ｃ）ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｇｐｔ
（２ＢａｍＨＩ）の作成及び調製 ｐＳＶ２−ｇｐｔΔ（ＨｉｎｄIII ／ＢｇｌII）／Ｂａ
ｍＨＩ ２０μｇを反応混液２００μl で、２２６ユニ
ツトのＢａｍＨＩと３７℃で２時間反応させて消化した
のち、０．８％調製用アガロースゲル電気泳動にかけ
て、ｇｐｔを含むＤＮＡ断片（２．２Ｋｂｐ）を分離精
製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０
ｔ／０．１Ｅ８．５μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させ
た。
（２ＢａｍＨＩ）の作成及び調製 ｐＳＶ２−ｇｐｔΔ（ＨｉｎｄIII ／ＢｇｌII）／Ｂａ
ｍＨＩ ２０μｇを反応混液２００μl で、２２６ユニ
ツトのＢａｍＨＩと３７℃で２時間反応させて消化した
のち、０．８％調製用アガロースゲル電気泳動にかけ
て、ｇｐｔを含むＤＮＡ断片（２．２Ｋｂｐ）を分離精
製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０
ｔ／０．１Ｅ８．５μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させ
た。
【００９５】一方、ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｄｈｆ
ｒ（ＢａｍＨＩ）１０μｇを反応混液１００μl で７４
ユニツトのＢａｍＨＩと３７℃で２時間反応させて消化
した。そして、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエ
タノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl
（〜１μｇ／μl ）に溶解させた。そして、ｐＳＶ２−
ｇｐｔΔ（ＨｉｎｄIII ／ＢｇｌII）／ＢａｍＨＩのｇ
ｐｔを含むＢａｍＨＩ断片のＤＮＡ溶液１μl （〜１μ
ｇ）と、ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｄｈｆｒ（Ｂａｍ
ＨＩ）をＢａｍＨＩで消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１
μｇ）とを、反応混液２０μl で６ユニツトのＴ４−Ｄ
ＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて連結し
た。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノー
ル沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）溶液２０μl に溶解させた。
ｒ（ＢａｍＨＩ）１０μｇを反応混液１００μl で７４
ユニツトのＢａｍＨＩと３７℃で２時間反応させて消化
した。そして、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエ
タノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl
（〜１μｇ／μl ）に溶解させた。そして、ｐＳＶ２−
ｇｐｔΔ（ＨｉｎｄIII ／ＢｇｌII）／ＢａｍＨＩのｇ
ｐｔを含むＢａｍＨＩ断片のＤＮＡ溶液１μl （〜１μ
ｇ）と、ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｄｈｆｒ（Ｂａｍ
ＨＩ）をＢａｍＨＩで消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１
μｇ）とを、反応混液２０μl で６ユニツトのＴ４−Ｄ
ＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて連結し
た。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノー
ル沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）溶液２０μl に溶解させた。
【００９６】次に、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａ
ｐr クローンを得た。次いで、これらのクローンのもつ
プラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＤｃｏｓＡｐr ／
ｏｒｉ／ｄｈｆｒのＢａｍＨＩサイトにｇｐｔを挿入さ
せたプラスミド：ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｇｐｔ
（２ＢａｍＨＩ）（図９）を持つ大腸菌を得た。この大
腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体
よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製してｐＤｃｏｓＡｐ r ／
ｏｒｉ／ｇｐｔ（２ＢａｍＨＩ）のプラスミドＤＮＡを
調製した。
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａ
ｐr クローンを得た。次いで、これらのクローンのもつ
プラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＤｃｏｓＡｐr ／
ｏｒｉ／ｄｈｆｒのＢａｍＨＩサイトにｇｐｔを挿入さ
せたプラスミド：ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｇｐｔ
（２ＢａｍＨＩ）（図９）を持つ大腸菌を得た。この大
腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体
よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製してｐＤｃｏｓＡｐ r ／
ｏｒｉ／ｇｐｔ（２ＢａｍＨＩ）のプラスミドＤＮＡを
調製した。
【００９７】（ｄ）ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｇｐｔ
の作成及び調製 ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｇｐｔ（２ＢａｍＨＩ）１
０μｇを、反応混液１００μl で９．１ユニツトのＢａ
ｍＨＩと３７℃で３０分間反応させて限定消化した。そ
して、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール
沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μ
ｇ／μl ）に溶解させた。次に、このＢａｍＨＩで限定
消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）を、反応混液２
５μl で２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２℃で３０
分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂｌｕｎ
ｔ ｅｎｄに変えたのち、０．８％調製用アガロースゲ
ル電気泳動にかけて、６．３Ｋｂｐの長さのＤＮＡ断片
を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得た。
の作成及び調製 ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｇｐｔ（２ＢａｍＨＩ）１
０μｇを、反応混液１００μl で９．１ユニツトのＢａ
ｍＨＩと３７℃で３０分間反応させて限定消化した。そ
して、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール
沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１μ
ｇ／μl ）に溶解させた。次に、このＢａｍＨＩで限定
消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）を、反応混液２
５μl で２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２℃で３０
分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂｌｕｎ
ｔ ｅｎｄに変えたのち、０．８％調製用アガロースゲ
ル電気泳動にかけて、６．３Ｋｂｐの長さのＤＮＡ断片
を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得た。
【００９８】このＤＮＡ沈澱を反応混液２０μl で６ユ
ニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間
反応させて閉環化したのち、フエノール抽出を行い、Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させた。
そして、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌（ＨＢ１０
１）をトランスホーメーシヨンした後、Ａｐr クローン
を得た。次いで、これらのクローンのもつプラスミドＤ
ＮＡの特性を調べて、ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｇｐ
ｔ（２ＢａｍＨＩ）のｃｏｓとｇｐｔとの間のＢａｍＨ
Ｉサイトを欠いたプラスミド：ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒ
ｉ／ｇｐｔ（図９）を持つ大腸菌を得た。この大腸菌
を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体より
ｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏ
ｒｉ／ｇｐｔのプラスミドＤＮＡを調製した。
ニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１７．５時間
反応させて閉環化したのち、フエノール抽出を行い、Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶解させた。
そして、このＤＮＡ溶液１０μl で大腸菌（ＨＢ１０
１）をトランスホーメーシヨンした後、Ａｐr クローン
を得た。次いで、これらのクローンのもつプラスミドＤ
ＮＡの特性を調べて、ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｇｐ
ｔ（２ＢａｍＨＩ）のｃｏｓとｇｐｔとの間のＢａｍＨ
Ｉサイトを欠いたプラスミド：ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒ
ｉ／ｇｐｔ（図９）を持つ大腸菌を得た。この大腸菌
を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体より
ｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏ
ｒｉ／ｇｐｔのプラスミドＤＮＡを調製した。
【００９９】（ｅ）ｐＴＫ−４／ＢａｍＨＩの作成及び
調製 ｐＴＫ−４〔Ｉｓｈｉｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２，６０７（１９８２）〕
１０μｇを反応混液１００μl で、３．０ユニツトのＰ
ｖｕIIと３７℃で３０分間反応させて限定消化したの
ち、０．８％調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、
６．４３Ｋｂｐの長さのＤＮＡ断片を分離精製して、Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１
Ｅ３μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。次に、この
ＤＮＡ溶液０．４μl （〜０．４μｇ）と、ＢａｍＨＩ
リンカー〔ｄ（ｐＣ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ）〕
２μｇとを、反応混液２０μl で６ユニツトのＴ４−Ｄ
ＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応させて連結した。
調製 ｐＴＫ−４〔Ｉｓｈｉｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏ
ｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２，６０７（１９８２）〕
１０μｇを反応混液１００μl で、３．０ユニツトのＰ
ｖｕIIと３７℃で３０分間反応させて限定消化したの
ち、０．８％調製用アガロースゲル電気泳動にかけて、
６．４３Ｋｂｐの長さのＤＮＡ断片を分離精製して、Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１
Ｅ３μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。次に、この
ＤＮＡ溶液０．４μl （〜０．４μｇ）と、ＢａｍＨＩ
リンカー〔ｄ（ｐＣ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ）〕
２μｇとを、反応混液２０μl で６ユニツトのＴ４−Ｄ
ＮＡリガーゼと２２℃で６時間反応させて連結した。
【０１００】そして、この反応液１０μl を、反応混液
５０μl で１５ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２
℃で１７．５時間反応させて閉環化した。その後フエノ
ール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈
澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０
μl に溶解させた。次に、このＤＮＡ溶液１０μl で大
腸菌（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンした後、
Ａｐr かつＴｃr クローンを得た。そして、これらのク
ローンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＴＫ
−４のｏｒｉとＴＫとの間のＰｖｕIIサイトにＢａｍＨ
Ｉリンカーを挿入させたプラスミド：ｐＴＫ−４／Ｂａ
ｍＨＩ（図９）を持つ大腸菌を得た。この大腸菌を、Ｔ
ＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ
−ＤＮＡを分離精製して、ｐＴＫ−４／ＢａｍＨＩのプ
ラスミドＤＮＡを調製した。
５０μl で１５ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２
℃で１７．５時間反応させて閉環化した。その後フエノ
ール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈
澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０
μl に溶解させた。次に、このＤＮＡ溶液１０μl で大
腸菌（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンした後、
Ａｐr かつＴｃr クローンを得た。そして、これらのク
ローンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＴＫ
−４のｏｒｉとＴＫとの間のＰｖｕIIサイトにＢａｍＨ
Ｉリンカーを挿入させたプラスミド：ｐＴＫ−４／Ｂａ
ｍＨＩ（図９）を持つ大腸菌を得た。この大腸菌を、Ｔ
ＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ
−ＤＮＡを分離精製して、ｐＴＫ−４／ＢａｍＨＩのプ
ラスミドＤＮＡを調製した。
【０１０１】（ｆ）ｐＴＫ−４／ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨ
Ｉの作成及び調製 ｐＴＫ−４／ＢａｍＨＩ １０μｇを反応混液１００μ
l で９ユニツトのＢａｍＨＩと３７℃で３０分間反応さ
せて限定消化したのち、フエノール抽出を行い、ＤＮＡ
をエタノール沈澱として得た。このエタノール沈澱を反
応混液１００μl で１５ユニツトのＰｖｕIIと３７℃で
２時間反応させて完全に消化したのち、フエノール抽出
を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０
ｔ／０．１Ｅ３μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。
Ｉの作成及び調製 ｐＴＫ−４／ＢａｍＨＩ １０μｇを反応混液１００μ
l で９ユニツトのＢａｍＨＩと３７℃で３０分間反応さ
せて限定消化したのち、フエノール抽出を行い、ＤＮＡ
をエタノール沈澱として得た。このエタノール沈澱を反
応混液１００μl で１５ユニツトのＰｖｕIIと３７℃で
２時間反応させて完全に消化したのち、フエノール抽出
を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０
ｔ／０．１Ｅ３μl （〜１μｇ／μl ）に溶解させた。
【０１０２】次に、このＢａｍＨＩで限定消化し、さら
にＰｖｕIIで消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）
を、反応混液２５μl で２ユニットのＫｌｅｎｏｗ酵素
と２２℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅ
ｎｄをｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変えたのち、０．８％調製
用アガロースゲル電気泳動にかけて、ｏｒｉ及びＡ
ｐr、ＴＫを含むＤＮＡ断片（４．６７Ｋｂｐ）を分離
精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得た。このＤ
ＮＡ沈澱を反応混液２０μl で６ユニツトのＴ４−ＤＮ
Ａリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて閉環化し
たのち（この場合、ＢａｍＨＩサイトが再構成され
る）、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱
として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）溶液２０μl に溶解させた。
にＰｖｕIIで消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）
を、反応混液２５μl で２ユニットのＫｌｅｎｏｗ酵素
と２２℃で３０分間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅ
ｎｄをｂｌｕｎｔ ｅｎｄに変えたのち、０．８％調製
用アガロースゲル電気泳動にかけて、ｏｒｉ及びＡ
ｐr、ＴＫを含むＤＮＡ断片（４．６７Ｋｂｐ）を分離
精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として得た。このＤ
ＮＡ沈澱を反応混液２０μl で６ユニツトのＴ４−ＤＮ
Ａリガーゼと１２℃で１７．５時間反応させて閉環化し
たのち（この場合、ＢａｍＨＩサイトが再構成され
る）、フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱
として得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）溶液２０μl に溶解させた。
【０１０３】そして、このＤＮＡ溶液１０μl で、大腸
菌（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、
Ａｐr かつＴｃr クローンを得た。次いで、これらのク
ローンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＴＫ
−４／ＢａｍＨＩのＰｖｕIIサイトとＢａｍＨＩサイト
（Ｔｃr 上）の間のＤＮＡ断片（１．７６Ｋｂｐ）を欠
いたプラスミド：ｐＴＫ−４／ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ
（図９）を持つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−
Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮ
Ａを分離精製して、ｐＴＫ−４／ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨ
ＩのプラスミドＤＮＡを調製した。
菌（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、
Ａｐr かつＴｃr クローンを得た。次いで、これらのク
ローンのもつプラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＴＫ
−４／ＢａｍＨＩのＰｖｕIIサイトとＢａｍＨＩサイト
（Ｔｃr 上）の間のＤＮＡ断片（１．７６Ｋｂｐ）を欠
いたプラスミド：ｐＴＫ−４／ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ
（図９）を持つ大腸菌を得た。この大腸菌を、ＴＹＧ−
Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−ＤＮ
Ａを分離精製して、ｐＴＫ−４／ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨ
ＩのプラスミドＤＮＡを調製した。
【０１０４】（ｇ）ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｇｐｔ
／ＴＫ（２ＢａｍＨＩ）の作成及び調製 ｐＴＫ−４／ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ ２０μｇを反応
混液２００μl で２４７ユニツトのＢａｍＨＩと３７℃
で２時間反応させて消化したのち、１．０％調製用アガ
ロースゲル電気泳動にかけて、ＴＫを含むＤＮＡ断片
（２Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱
として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ６μl（〜１μｇ／
μl ）に溶解させた。一方、ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ
／ｇｐｔ１０μｇを反応混液１００μl で、９１ユニツ
トのＢａｍＨＩと３７℃で２時間反応させて消化した。
そして、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノー
ル沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１
μｇ／μl ）に溶解させた。
／ＴＫ（２ＢａｍＨＩ）の作成及び調製 ｐＴＫ−４／ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ ２０μｇを反応
混液２００μl で２４７ユニツトのＢａｍＨＩと３７℃
で２時間反応させて消化したのち、１．０％調製用アガ
ロースゲル電気泳動にかけて、ＴＫを含むＤＮＡ断片
（２Ｋｂｐ）を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱
として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ６μl（〜１μｇ／
μl ）に溶解させた。一方、ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ
／ｇｐｔ１０μｇを反応混液１００μl で、９１ユニツ
トのＢａｍＨＩと３７℃で２時間反応させて消化した。
そして、フエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノー
ル沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜１
μｇ／μl ）に溶解させた。
【０１０５】そして、ｐＴＫ−４／ＢａｍＨＩ／Ｂａｍ
ＨＩのＴＫを含むＢａｍＨＩ断片のＤＮＡ溶液１μl
（〜１μｇ）と、ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｇｐｔを
ＢａｍＨＩで消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μl ）と
を、反応混液２０μl で６ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガ
ーゼと１２℃で１７．５時間反応させて連結した。その
後フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱とし
て得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
溶液２０μl に溶解させた。
ＨＩのＴＫを含むＢａｍＨＩ断片のＤＮＡ溶液１μl
（〜１μｇ）と、ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｇｐｔを
ＢａｍＨＩで消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μl ）と
を、反応混液２０μl で６ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガ
ーゼと１２℃で１７．５時間反応させて連結した。その
後フエノール抽出を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱とし
て得、沈澱を０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
溶液２０μl に溶解させた。
【０１０６】次に、このＤＮＡ溶液１０μl で、大腸菌
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａ
ｐr クローンを得た。次いで、これらのクローンのもつ
プラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＤｃｏｓＡｐr ／
ｏｒｉ／ｇｐｔのＢａｍＨＩサイトにＴＫを挿入させた
プラスミド：ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｇｐｔ／ＴＫ
（２ＢａｍＨＩ）（図９）を持つ大腸菌を得た。この大
腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体
よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＤｃｏｓＡｐr
／ｏｒｉ／ｇｐｔ／ＴＫ（２ＢａｍＨＩ）のプラスミド
ＤＮＡを調製した。
（ＨＢ１０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａ
ｐr クローンを得た。次いで、これらのクローンのもつ
プラスミドＤＮＡの特性を調べて、ｐＤｃｏｓＡｐr ／
ｏｒｉ／ｇｐｔのＢａｍＨＩサイトにＴＫを挿入させた
プラスミド：ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｇｐｔ／ＴＫ
（２ＢａｍＨＩ）（図９）を持つ大腸菌を得た。この大
腸菌を、ＴＹＧ−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体
よりｃｃｃ−ＤＮＡを分離精製して、ｐＤｃｏｓＡｐr
／ｏｒｉ／ｇｐｔ／ＴＫ（２ＢａｍＨＩ）のプラスミド
ＤＮＡを調製した。
【０１０７】（ｈ）ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｇｐｔ
／ＴＫの作成及び調製 ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｇｐｔ／ＴＫ（２ＢａｍＨ
Ｉ）１０μl を反応混液１００μl で、６．９ユニツト
のＢａｍＨＩと３７℃で３０分間反応させて限定消化し
た。そしてフエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノ
ール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜
１μｇ／μl ）に溶解させた。次に、このＢａｍＨＩで
限定消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）を、反応混
液２５μl で２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２℃で
３０分時間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂ
ｌｕｎｔ ｅｎｄに変えたのち、０．８％調製用アガロ
ースゲル電気泳動にかけて、８．３Ｋｂｐの長さのＤＮ
Ａ断片を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として
得た。
／ＴＫの作成及び調製 ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｇｐｔ／ＴＫ（２ＢａｍＨ
Ｉ）１０μl を反応混液１００μl で、６．９ユニツト
のＢａｍＨＩと３７℃で３０分間反応させて限定消化し
た。そしてフエノール抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノ
ール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ７μl （〜
１μｇ／μl ）に溶解させた。次に、このＢａｍＨＩで
限定消化したＤＮＡ溶液１μl （〜１μｇ）を、反応混
液２５μl で２ユニツトのＫｌｅｎｏｗ酵素と２２℃で
３０分時間反応させて、ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄをｂ
ｌｕｎｔ ｅｎｄに変えたのち、０．８％調製用アガロ
ースゲル電気泳動にかけて、８．３Ｋｂｐの長さのＤＮ
Ａ断片を分離精製して、ＤＮＡをエタノール沈澱として
得た。
【０１０８】そして、このＤＮＡ沈澱を反応混液２０μ
l で６ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１
７．５時間反応させて閉環化したのち、フエノール抽出
を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．
１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶
解させた。このＤＮＡ溶液１０μl で、大腸菌（ＨＢ１
０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａｐr クロ
ーンを得た。次いで、これらのクローンのもつプラスミ
ドＤＮＡの特性を調べて、ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／
ｇｐｔ／ＴＫ（２ＢａｍＨＩ）のＴＫとＡｐr との間の
ＢａｍＨＩサイトを欠いたプラスミド：ｐＤｃｏｓＡｐ
r ／ｏｒｉ／ｇｐｔ／ＴＫ（図５、図９）を持つ大腸菌
を得た。なお、本菌株は、工業技術院生命工学工業技術
研究所に「微工研菌第７５５２号（ＦＥＲＭ Ｐ−７５
５２）」として寄託されている。この大腸菌を、ＴＹＧ
−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−Ｄ
ＮＡを分離精製して、ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｇｐ
ｔ／ＴＫのプラスミドＤＮＡを調製した。
l で６ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼと１２℃で１
７．５時間反応させて閉環化したのち、フエノール抽出
を行い、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を０．
１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液２０μl に溶
解させた。このＤＮＡ溶液１０μl で、大腸菌（ＨＢ１
０１）をトランスホーメーシヨンしたのち、Ａｐr クロ
ーンを得た。次いで、これらのクローンのもつプラスミ
ドＤＮＡの特性を調べて、ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／
ｇｐｔ／ＴＫ（２ＢａｍＨＩ）のＴＫとＡｐr との間の
ＢａｍＨＩサイトを欠いたプラスミド：ｐＤｃｏｓＡｐ
r ／ｏｒｉ／ｇｐｔ／ＴＫ（図５、図９）を持つ大腸菌
を得た。なお、本菌株は、工業技術院生命工学工業技術
研究所に「微工研菌第７５５２号（ＦＥＲＭ Ｐ−７５
５２）」として寄託されている。この大腸菌を、ＴＹＧ
−Ｐ培地１l 中で増殖させたのち、菌体よりｃｃｃ−Ｄ
ＮＡを分離精製して、ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｇｐ
ｔ／ＴＫのプラスミドＤＮＡを調製した。
【０１０９】実施例 ５ ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉに
よるゲノムＤＮＡ（外来ＤＮＡ）の遺伝子バンクの製造
（図２） （ａ）高分子量のゲノムＤＮＡの調製 ｐＢＲ−３２２の塩基配列を持つ、ヘルペスシンプレツ
クウイルス１型（ＨＳＶ−１）のチミジンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）遺伝子の組換え体を移入したマウスＬ細胞（Ｌｔｋ
- 〔ＨＳＶ−１ＴＫ+ 〕）は、１０％仔牛血清を添加し
たイーグルＭＥＭで培養し、ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ｍｏ
ｎｏｌａｙｅｒｓ（１００ｍｍ−プレート９枚、〜１０
7 ｃｅｌｌｓ／プレート）とし、ＰＢＳ（１３７ｍＭＮ
ａＣｌ、３ｍＭＫＣｌ、８ｍＭＮａ2 ＨＰＯ4 、１ｍＭ
ＫＨ2 ＰＯ4 ）で２度洗つたのち、可溶化剤（１００μ
ｇ／ｍｌＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ、０．５％ＳＤＳ、１
５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））をプレート当たり１．０ｍ
ｌ加え、６５℃で１５〜３０分間保温して可溶化した。
この可溶化物は５０ｍｌ容量の遠沈管に移し、さらに３
７℃で一晩保温し、途中、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫをさ
らに１００μｇ／ｍｌ添加した。
よるゲノムＤＮＡ（外来ＤＮＡ）の遺伝子バンクの製造
（図２） （ａ）高分子量のゲノムＤＮＡの調製 ｐＢＲ−３２２の塩基配列を持つ、ヘルペスシンプレツ
クウイルス１型（ＨＳＶ−１）のチミジンキナーゼ（Ｔ
Ｋ）遺伝子の組換え体を移入したマウスＬ細胞（Ｌｔｋ
- 〔ＨＳＶ−１ＴＫ+ 〕）は、１０％仔牛血清を添加し
たイーグルＭＥＭで培養し、ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ｍｏ
ｎｏｌａｙｅｒｓ（１００ｍｍ−プレート９枚、〜１０
7 ｃｅｌｌｓ／プレート）とし、ＰＢＳ（１３７ｍＭＮ
ａＣｌ、３ｍＭＫＣｌ、８ｍＭＮａ2 ＨＰＯ4 、１ｍＭ
ＫＨ2 ＰＯ4 ）で２度洗つたのち、可溶化剤（１００μ
ｇ／ｍｌＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ、０．５％ＳＤＳ、１
５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））をプレート当たり１．０ｍ
ｌ加え、６５℃で１５〜３０分間保温して可溶化した。
この可溶化物は５０ｍｌ容量の遠沈管に移し、さらに３
７℃で一晩保温し、途中、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫをさ
らに１００μｇ／ｍｌ添加した。
【０１１０】反応後、等量のトリス緩衝液で飽和したフ
エノールでおだやかに２度抽出し、水層を５０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭＥＤＴＡ、１０
ｍＭＮａＣｌからなる透析緩衝液３l に対して４回透析
を行つた。透析内液は、５０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ−
ｆｒｅｅ ＲＮａｓｅＡを加えて３７℃で３時間保温し
てＲＮＡを分解した。反応後、等量のフエノール：クロ
ロホルム混液で２度おだやかに抽出し、水層を１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡから
なる水溶液（ＴＥ）３l に対して９回透析して、精製Ｄ
ＮＡ溶液５０ｍｌを得た。ＤＮＡ溶液の２６０ｎｍと２
８０ｎｍでの吸光度（ＯＤ）は、１０倍希釈でそれぞれ
０．６６７、０．３６３（ＯＤ280 ／ＯＤ260 ＝０．５
４４）であり、ＤＮＡの濃度は０．６６７×０．０５０
（μｇ／１０Ｄ）×１０＝０．３３４μｇ／μl であつ
た。
エノールでおだやかに２度抽出し、水層を５０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭＥＤＴＡ、１０
ｍＭＮａＣｌからなる透析緩衝液３l に対して４回透析
を行つた。透析内液は、５０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ−
ｆｒｅｅ ＲＮａｓｅＡを加えて３７℃で３時間保温し
てＲＮＡを分解した。反応後、等量のフエノール：クロ
ロホルム混液で２度おだやかに抽出し、水層を１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡから
なる水溶液（ＴＥ）３l に対して９回透析して、精製Ｄ
ＮＡ溶液５０ｍｌを得た。ＤＮＡ溶液の２６０ｎｍと２
８０ｎｍでの吸光度（ＯＤ）は、１０倍希釈でそれぞれ
０．６６７、０．３６３（ＯＤ280 ／ＯＤ260 ＝０．５
４４）であり、ＤＮＡの濃度は０．６６７×０．０５０
（μｇ／１０Ｄ）×１０＝０．３３４μｇ／μl であつ
た。
【０１１１】（ｂ）３５〜４５ＫｂｐのゲノムＤＮＡの
調製 精製したゲノムＤＮＡ溶液５．９８ｍｌ（２ｍｇ）を、
反応混液２９．９６ｍｌ（５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣ
ｌ2 、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ）で１５．６ユニットの
Ｓａｕ３Ａ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社
製）と３７℃で１時間反応させて限定消化したのち、
０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液を１．３ｍｌ加
え、等量のトリス緩衝液飽和フエノールで２度おだやか
に抽出した。そして水層をセカンダリーブタノールで１
０ｍl まで濃縮したのち、３．０Ｍ酢酸ナトリウム１．
１ｍｌとエタノール２０ｍｌを加え、エタノール沈澱と
してゲノムＤＮＡを得、７０％エタノールで洗つたのち
水流ポンプにて乾燥を行い、エタノール沈澱をＴＥ２ｍ
ｌに溶解させた。
調製 精製したゲノムＤＮＡ溶液５．９８ｍｌ（２ｍｇ）を、
反応混液２９．９６ｍｌ（５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣ
ｌ2 、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ）で１５．６ユニットの
Ｓａｕ３Ａ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社
製）と３７℃で１時間反応させて限定消化したのち、
０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液を１．３ｍｌ加
え、等量のトリス緩衝液飽和フエノールで２度おだやか
に抽出した。そして水層をセカンダリーブタノールで１
０ｍl まで濃縮したのち、３．０Ｍ酢酸ナトリウム１．
１ｍｌとエタノール２０ｍｌを加え、エタノール沈澱と
してゲノムＤＮＡを得、７０％エタノールで洗つたのち
水流ポンプにて乾燥を行い、エタノール沈澱をＴＥ２ｍ
ｌに溶解させた。
【０１１２】次に、このＤＮＡ溶液３００μl を５〜２
５％シヨ糖密度勾配遠心〔２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．６）、５ｍＭＥＤＴＡ、ベツクマンＳＷ２
８、２０，０００ｒｐｍ、９時間、２０℃〕にかけて３
０滴ごとに分画した。各分画２０μl を０．４％アガロ
ースゲル電気泳動にかけ長さを測定し、３５〜４５Ｋｂ
ｐの大きさのＤＮＡ分画を集めたのち、ＴＥ３l に対し
て３回透析を行つた。そして、透析内液をフエノール抽
出後、水層をセカンダリ−ブタノールで濃縮し、ＤＮＡ
をエタノール沈澱として得、沈澱をＴＥ１ｍｌに溶解さ
せて、３５〜４５ＫｂｐのゲノムＤＮＡ溶液を得た。Ｄ
ＮＡ溶液のＯＤ260 及びＯＤ280 は５０倍希釈でそれぞ
れ０．２１６、０．１１２（ＯＤ280 ／ＯＤ260 ＝０．
５１９）であり、ＤＮＡの濃度は０．２１６×０．０５
０（μｇ／１０Ｄ）×５０＝０．５４μｇ／μｌであつ
た。
５％シヨ糖密度勾配遠心〔２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．６）、５ｍＭＥＤＴＡ、ベツクマンＳＷ２
８、２０，０００ｒｐｍ、９時間、２０℃〕にかけて３
０滴ごとに分画した。各分画２０μl を０．４％アガロ
ースゲル電気泳動にかけ長さを測定し、３５〜４５Ｋｂ
ｐの大きさのＤＮＡ分画を集めたのち、ＴＥ３l に対し
て３回透析を行つた。そして、透析内液をフエノール抽
出後、水層をセカンダリ−ブタノールで濃縮し、ＤＮＡ
をエタノール沈澱として得、沈澱をＴＥ１ｍｌに溶解さ
せて、３５〜４５ＫｂｐのゲノムＤＮＡ溶液を得た。Ｄ
ＮＡ溶液のＯＤ260 及びＯＤ280 は５０倍希釈でそれぞ
れ０．２１６、０．１１２（ＯＤ280 ／ＯＤ260 ＝０．
５１９）であり、ＤＮＡの濃度は０．２１６×０．０５
０（μｇ／１０Ｄ）×５０＝０．５４μｇ／μｌであつ
た。
【０１１３】（ｃ）コスミドベクターＤＮＡの調製 ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ４０μｇを、反応混液８００
μl で１５２ユニツトのＰｖｕIIと３７℃で２時間反応
させて消化した。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮ
Ａをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ
１００μl に溶解させた。このＰｖｕIIで消化したＤＮ
Ａ溶液９５μl を、反応混液５００μl（５０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１ｍＭＭｇＣｌ2 、０．
１ｍＭＺｎＣｌ2 、１ｍＭスペルジミン）で、６ユニツ
トのホスフアターゼ（Ｃａｌｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ
ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）と、３７℃で１
５分間、５６℃で１５分間反応後、さらに６ユニツトの
ホスフアターゼを加え、３７℃で１５分間、続いて５６
℃で１５分間反応させて、ＰｖｕIIの切断片を不活化し
た。
μl で１５２ユニツトのＰｖｕIIと３７℃で２時間反応
させて消化した。その後、フエノール抽出を行い、ＤＮ
Ａをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１Ｅ
１００μl に溶解させた。このＰｖｕIIで消化したＤＮ
Ａ溶液９５μl を、反応混液５００μl（５０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１ｍＭＭｇＣｌ2 、０．
１ｍＭＺｎＣｌ2 、１ｍＭスペルジミン）で、６ユニツ
トのホスフアターゼ（Ｃａｌｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ
ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）と、３７℃で１
５分間、５６℃で１５分間反応後、さらに６ユニツトの
ホスフアターゼを加え、３７℃で１５分間、続いて５６
℃で１５分間反応させて、ＰｖｕIIの切断片を不活化し
た。
【０１１４】その後、Ｈ2 Ｏ４００μl 、ＳＴＥ（１０
０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ＭＮａＣ
ｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ）１００μl 、１０％ＳＤＳ５０
μl を加え、６８℃で１５分間保温してホスフアターゼ
を失活させた。そして、フエノール抽出で除蛋白後、Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１
Ｅ３０μl に溶解した。次に、このＰｖｕIIで消化し、
ホスフアターゼで不活化したＤＮＡ溶液３０μl を、反
応混液５００μl で、１５２ユニツトのＢａｍＨＩと３
７℃で２時間反応させて消化した。そして、フエノール
抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈
澱を１０ｔ／０．１Ｅ３０μl に溶解させて、コスミド
ベクターＤＮＡ溶液を得た。ＤＮＡ溶液のＯＤ260 及び
ＯＤ280 は３００倍希釈でそれぞれ０．０４６、０．０
２６（ＯＤ280 ／ＯＤ260 ＝０．５６５）であり、ＤＮ
Ａの濃度は０．０４６×０．０５０（μｇ／１０Ｄ）×
３００＝０．６９０μｇ／μｌであつた。
０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ＭＮａＣ
ｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ）１００μl 、１０％ＳＤＳ５０
μl を加え、６８℃で１５分間保温してホスフアターゼ
を失活させた。そして、フエノール抽出で除蛋白後、Ｄ
ＮＡをエタノール沈澱として得、沈澱を１０ｔ／０．１
Ｅ３０μl に溶解した。次に、このＰｖｕIIで消化し、
ホスフアターゼで不活化したＤＮＡ溶液３０μl を、反
応混液５００μl で、１５２ユニツトのＢａｍＨＩと３
７℃で２時間反応させて消化した。そして、フエノール
抽出で除蛋白後、ＤＮＡをエタノール沈澱として得、沈
澱を１０ｔ／０．１Ｅ３０μl に溶解させて、コスミド
ベクターＤＮＡ溶液を得た。ＤＮＡ溶液のＯＤ260 及び
ＯＤ280 は３００倍希釈でそれぞれ０．０４６、０．０
２６（ＯＤ280 ／ＯＤ260 ＝０．５６５）であり、ＤＮ
Ａの濃度は０．０４６×０．０５０（μｇ／１０Ｄ）×
３００＝０．６９０μｇ／μｌであつた。
【０１１５】（ｄ）３５〜４５ＫｂｐのゲノムＤＮＡと
コスミドベクターＤＮＡとの連結 （ｂ）で調製した３５〜４５Ｋｂｐのゲノム溶液２．６
１μl （１．４μｇ）と、（ｃ）で調製したコスミドベ
クターＤＮＡ溶液０．８６μl （０．５９μｇ）とを、
反応混液１０μl で５．９ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガ
ーゼと１２℃で１７．５時間反応させて連結した。反応
終了後、反応液を４℃で保存した。
コスミドベクターＤＮＡとの連結 （ｂ）で調製した３５〜４５Ｋｂｐのゲノム溶液２．６
１μl （１．４μｇ）と、（ｃ）で調製したコスミドベ
クターＤＮＡ溶液０．８６μl （０．５９μｇ）とを、
反応混液１０μl で５．９ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガ
ーゼと１２℃で１７．５時間反応させて連結した。反応
終了後、反応液を４℃で保存した。
【０１１６】（ｅ）パツケージング抽出液の調製 １）ＢＨＢ２６９０から超音波処理して得られる菌体抽
出液の調製 大腸菌ＢＨＢ２６９０をＮＺＹ培地（１％ＮＺａｍｉｎ
ｅ、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、０．２％
ＭｇＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ、ｐＨ７．５）１００ｍｌで一晩
培養した液のＯＤ600 を測定後、あらかじめ３２℃に保
温しておいたＮＺＹ培地５００ｍｌ（２l フラスコ中）
に最初のＯＤ600 が０．０２５になるように菌を接種
し、３２℃で振とう培養を開始した。そして、ＯＤ600
が０．３になつた時点で（培養開始から２時間４０分
後）、４５℃で１５分間おきプロフアージの誘導を行つ
た。その後、培養温度３８〜３９℃に変え、さらに３時
間激しく振とう培養した（培養液の少量にクロロホルム
を一滴、滴下することによつて誘導の検査をした）。
出液の調製 大腸菌ＢＨＢ２６９０をＮＺＹ培地（１％ＮＺａｍｉｎ
ｅ、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、０．２％
ＭｇＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ、ｐＨ７．５）１００ｍｌで一晩
培養した液のＯＤ600 を測定後、あらかじめ３２℃に保
温しておいたＮＺＹ培地５００ｍｌ（２l フラスコ中）
に最初のＯＤ600 が０．０２５になるように菌を接種
し、３２℃で振とう培養を開始した。そして、ＯＤ600
が０．３になつた時点で（培養開始から２時間４０分
後）、４５℃で１５分間おきプロフアージの誘導を行つ
た。その後、培養温度３８〜３９℃に変え、さらに３時
間激しく振とう培養した（培養液の少量にクロロホルム
を一滴、滴下することによつて誘導の検査をした）。
【０１１７】培養終了後、６，０００ｒｐｍで１０分間
遠心分離機にかけて集菌を行い、菌体を２０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭβ
−メルカプトエタノールからなる緩衝液３．６ｍｌに懸
濁させた。そして、４℃以下で超音波処理（最大出力で
５秒間×２０回）を行つた後、２０，０００ｒｐｍで１
０分間遠心分離機にかけて（４℃）、上澄液〜３ｍｌを
得た。次に、上澄液３ｍｌに等量の上記緩衝液とパツケ
ージング緩衝液〔６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、５０ｍＭスペルジミン、５０ｍＭプトレシン、２
０ｍＭＭｇＣｌ2、３０ｍＭＡＴＰ、３０ｍＭβ−メル
カプトエタノール〕０．５ｍｌを加えたのち、１５μl
づつ１．５ｍｌのエツペンドルフチユーブに分注し、直
ちに液体窒素中で冷凍し、−７０℃で保存した。
遠心分離機にかけて集菌を行い、菌体を２０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭβ
−メルカプトエタノールからなる緩衝液３．６ｍｌに懸
濁させた。そして、４℃以下で超音波処理（最大出力で
５秒間×２０回）を行つた後、２０，０００ｒｐｍで１
０分間遠心分離機にかけて（４℃）、上澄液〜３ｍｌを
得た。次に、上澄液３ｍｌに等量の上記緩衝液とパツケ
ージング緩衝液〔６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）、５０ｍＭスペルジミン、５０ｍＭプトレシン、２
０ｍＭＭｇＣｌ2、３０ｍＭＡＴＰ、３０ｍＭβ−メル
カプトエタノール〕０．５ｍｌを加えたのち、１５μl
づつ１．５ｍｌのエツペンドルフチユーブに分注し、直
ちに液体窒素中で冷凍し、−７０℃で保存した。
【０１１８】２）ＢＨＢ２６８８から凍結・融解によつ
て得られる菌体抽出液の調製 大腸菌２６８８を、ＮＺＹ培地１００ｍｌで一晩培養し
た液のＯＤ600 を測定したのち、あらかじめ３２℃に保
温しておいたＮＺＹ培地５００ｍｌ（２l フラスコ中）
に最初のＯＤ600 が０．０２５になるように菌を接種
し、３２℃で振とう培養を開始した。そして、ＯＤ600
が０．３になつた時点で（培養開始から２時間４０分
後）、４５℃で１５分間おきプロフアージの誘導を行つ
た。その後、培養温度を３８〜３９℃に変え、さらに３
時間激しく振とう培養した（培養液の少量にクロロホル
ムを一滴、滴下することによつて誘導の検査をした）。
て得られる菌体抽出液の調製 大腸菌２６８８を、ＮＺＹ培地１００ｍｌで一晩培養し
た液のＯＤ600 を測定したのち、あらかじめ３２℃に保
温しておいたＮＺＹ培地５００ｍｌ（２l フラスコ中）
に最初のＯＤ600 が０．０２５になるように菌を接種
し、３２℃で振とう培養を開始した。そして、ＯＤ600
が０．３になつた時点で（培養開始から２時間４０分
後）、４５℃で１５分間おきプロフアージの誘導を行つ
た。その後、培養温度を３８〜３９℃に変え、さらに３
時間激しく振とう培養した（培養液の少量にクロロホル
ムを一滴、滴下することによつて誘導の検査をした）。
【０１１９】培養終了後、６，０００ｒｐｍで１０分間
遠心分離機にかけて集菌を行い、菌体をシヨ糖溶液（１
０％シヨ糖、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
３ｍｌに懸濁させたのち、０．５ｍｌづつエツペンドル
フチユーブ６本にとり、この各々のチユーブにリゾチー
ム溶液（２ｍｇ／ｍｌ、０．２５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０））２５μl を加え（４℃）、おだやかに
混合し、すばやく液体窒素中にて凍結させた。次に、チ
ユーブを氷上において抽出物を融解させたのち、各チユ
ーブにパツケージング緩衝液２５μl を加えて混合し
た。そして、各抽出物を一緒にして、２１，０００ｒｐ
ｍで１時間（４℃）遠心分離機にかけて上澄液を得、こ
れの１０μl づつを１．５ｍｌのエツペンドルフチユー
ブに分注し、直ちに液体窒素中で冷凍し、−７０℃で保
存した。
遠心分離機にかけて集菌を行い、菌体をシヨ糖溶液（１
０％シヨ糖、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
３ｍｌに懸濁させたのち、０．５ｍｌづつエツペンドル
フチユーブ６本にとり、この各々のチユーブにリゾチー
ム溶液（２ｍｇ／ｍｌ、０．２５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．０））２５μl を加え（４℃）、おだやかに
混合し、すばやく液体窒素中にて凍結させた。次に、チ
ユーブを氷上において抽出物を融解させたのち、各チユ
ーブにパツケージング緩衝液２５μl を加えて混合し
た。そして、各抽出物を一緒にして、２１，０００ｒｐ
ｍで１時間（４℃）遠心分離機にかけて上澄液を得、こ
れの１０μl づつを１．５ｍｌのエツペンドルフチユー
ブに分注し、直ちに液体窒素中で冷凍し、−７０℃で保
存した。
【０１２０】（ｆ）ｉｎ ｖｉｔｒｏパツケージング −７０℃に保存しておいたＢＨＢ２６９０とＢＨＢ２６
８８の菌体抽出液を氷上におき、まず先に融解するＢＨ
Ｂ２６８８の抽出液をＢＨＢ２６９０の抽出液に加えて
おだやかに混合した。ほぼ全部融解したところで、
（ｄ）で調製した組換え体ＤＮＡ溶液２．５μl （０．
５μｇ）を加えてよく混合したのち、室温で１時間反応
させてｉｎ ｖｉｔｒｏパツケージングを行つた。反応
終了後、ＳＭ溶液（０．５８％ＮａＣｌ、０．２％Ｍｇ
ＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、０．０１％ゲラチン）１ｍｌとクロロホルム
一滴を加えて混合した。そして、エツペンドルフチユー
ブを机上遠心機に３０秒間かけて、上澄み液を形質導入
フアージ粒子溶液として得た。
８８の菌体抽出液を氷上におき、まず先に融解するＢＨ
Ｂ２６８８の抽出液をＢＨＢ２６９０の抽出液に加えて
おだやかに混合した。ほぼ全部融解したところで、
（ｄ）で調製した組換え体ＤＮＡ溶液２．５μl （０．
５μｇ）を加えてよく混合したのち、室温で１時間反応
させてｉｎ ｖｉｔｒｏパツケージングを行つた。反応
終了後、ＳＭ溶液（０．５８％ＮａＣｌ、０．２％Ｍｇ
ＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、０．０１％ゲラチン）１ｍｌとクロロホルム
一滴を加えて混合した。そして、エツペンドルフチユー
ブを机上遠心機に３０秒間かけて、上澄み液を形質導入
フアージ粒子溶液として得た。
【０１２１】（ｇ）形質導入及びプレーテイング 大腸菌ＨＢ１０１のＬ−ブロス（マルトース０．４％添
加）で一晩培養した液２００μl を机上遠心機にかけて
集菌を行い、その菌体を１０ｍＭＭｇＣｌ2 溶液１００
μl に再懸濁した。次に、この菌体懸濁液１００μl に
ＳＭ溶液で１０倍希釈した形質導入フアージ粒子溶液１
００μl を加え、３７℃で１５分間保温して形質導入を
行つたのち、さらにＬ−ブロス１．１ｍｌを加え、３７
℃で４５分間振とう培養した。そして、この菌体懸濁液
を１００μl づつアンピシリン２０μｇ／ｍｌ含有する
１００ｍｍのＬ−プレートに塗布し、プレートを３７℃
で一晩おいたのち、生ずるコロニーを竹ぐしでついてＬ
−ブロス（アンピシリン２０μｇ／ｍｌ含有）で増殖さ
せた。また、プレート当たりのコロニー数は２０〜１０
０個であつた。
加）で一晩培養した液２００μl を机上遠心機にかけて
集菌を行い、その菌体を１０ｍＭＭｇＣｌ2 溶液１００
μl に再懸濁した。次に、この菌体懸濁液１００μl に
ＳＭ溶液で１０倍希釈した形質導入フアージ粒子溶液１
００μl を加え、３７℃で１５分間保温して形質導入を
行つたのち、さらにＬ−ブロス１．１ｍｌを加え、３７
℃で４５分間振とう培養した。そして、この菌体懸濁液
を１００μl づつアンピシリン２０μｇ／ｍｌ含有する
１００ｍｍのＬ−プレートに塗布し、プレートを３７℃
で一晩おいたのち、生ずるコロニーを竹ぐしでついてＬ
−ブロス（アンピシリン２０μｇ／ｍｌ含有）で増殖さ
せた。また、プレート当たりのコロニー数は２０〜１０
０個であつた。
【０１２２】（ｈ）トランスホーマントの培養及び、そ
れの持つプラスミドＤＮＡの調製と特性化 アンピシリン耐性コロニー（トランスホーマント）２０
個を、Ｌ−ブロス（アンピシリン２０μｇ／ｍｌ含有）
２ｍｌで一晩培養した後、各培養液１．５ｍｌを１．５
ｍｌのエツペンドルフチユーブにとり、机上遠心機にか
けて集菌した。これらの菌体を溶液Ｉ（５０ｍＭグルコ
ース、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０
ｍＭＥＤＴＡ、４ｍｇ／ｍｌリゾチーム）１００μl に
再懸濁したのち、室温で５分間おいた。次に、溶液II
（０．２ＮＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）２００μl を加えて
おだやかに混合し、氷上に５分間おいたのち、溶液III
〔５Ｍ酢酸カリ（ｐＨ４．８）〕１５０μl を加えてお
だやかに混合し、氷上に５分間おいた。
れの持つプラスミドＤＮＡの調製と特性化 アンピシリン耐性コロニー（トランスホーマント）２０
個を、Ｌ−ブロス（アンピシリン２０μｇ／ｍｌ含有）
２ｍｌで一晩培養した後、各培養液１．５ｍｌを１．５
ｍｌのエツペンドルフチユーブにとり、机上遠心機にか
けて集菌した。これらの菌体を溶液Ｉ（５０ｍＭグルコ
ース、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０
ｍＭＥＤＴＡ、４ｍｇ／ｍｌリゾチーム）１００μl に
再懸濁したのち、室温で５分間おいた。次に、溶液II
（０．２ＮＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）２００μl を加えて
おだやかに混合し、氷上に５分間おいたのち、溶液III
〔５Ｍ酢酸カリ（ｐＨ４．８）〕１５０μl を加えてお
だやかに混合し、氷上に５分間おいた。
【０１２３】そして、エツペンドルフチユーブを机上遠
心機にかけて上澄液を得、これに２倍容量のエタノール
を加えて、プラスミドＤＮＡをエタノール沈澱として得
た。各トランスホーマントのもつプラスミドＤＮＡを少
量の１０ｔ／０．１Ｅに溶解させたのち、サイズマーカ
ーＤＮＡ（ラムダＤＮＡ：４８Ｋｂｐ、ラムダＤＮＡを
ＨｉｎｄIII で消化したもの：２２．３Ｋｂｐ、９．５
Ｋｂｐ）と一緒に、０．４％アガロースゲル電気泳動に
かけたところ、アンピシリン耐性コロニー２０個のう
ち、すべてが２２．３Ｋｂｐ〜４８Ｋｂｐの大きさのと
ころにプラスミドＤＮＡの存在が認められた。
心機にかけて上澄液を得、これに２倍容量のエタノール
を加えて、プラスミドＤＮＡをエタノール沈澱として得
た。各トランスホーマントのもつプラスミドＤＮＡを少
量の１０ｔ／０．１Ｅに溶解させたのち、サイズマーカ
ーＤＮＡ（ラムダＤＮＡ：４８Ｋｂｐ、ラムダＤＮＡを
ＨｉｎｄIII で消化したもの：２２．３Ｋｂｐ、９．５
Ｋｂｐ）と一緒に、０．４％アガロースゲル電気泳動に
かけたところ、アンピシリン耐性コロニー２０個のう
ち、すべてが２２．３Ｋｂｐ〜４８Ｋｂｐの大きさのと
ころにプラスミドＤＮＡの存在が認められた。
【図１】新規コスミドベクターｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒ
ｉを示すものである。
ｉを示すものである。
【図２】図１の新規コスミドベクターを用いるゲノムＤ
ＮＡの遺伝子バンクの製造法を示すものである。
ＮＡの遺伝子バンクの製造法を示すものである。
【図３】新規コスミドベクターｐＤｃｏｓＴｃr を示す
ものである。
ものである。
【図４】新規コスミドベクターｐＤｃｏｓＴｃr ／ｏｒ
ｉを示すものである。
ｉを示すものである。
【図５】新規コスミドベクターｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒ
ｉ／ｇｐｔ／ＴＫを示すものである。
ｉ／ｇｐｔ／ＴＫを示すものである。
【図６】ｐＤｃｏｓＴｃr の作成方法を示すものであ
る。
る。
【図７】ｐＤｃｏｓＴｃr ／ｏｒｉの作成方法を示すも
のである。
のである。
【図８】ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉの作成方法を示すも
のである。
のである。
【図９】ｐＤｃｏｓＡｐr ／ｏｒｉ／ｇｐｔ／ＴＫの作
成方法を示すものである。
成方法を示すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岡田 善雄 大阪府箕面市半町２−22−28
Claims (2)
- 【請求項１】 同一の方向性を持つたラムダフアージま
たはラムドイドフアージのｃｏｓを２個有し、２種類の
制限酵素で切ることによつて、それぞれｃｏｓを１個づ
つ持つた長さがほぼ等しい右腕と左腕との間に、３５〜
４５Ｋｂｐの長さの種々の外来ＤＮＡ断片を挿入し、ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏパツケージングで形質導入フアージ粒子
に変え、次いで大腸菌にクローン化することによつて、
外来ＤＮＡの遺伝子バンクを製造することを特徴とす
る、 下記の制限酵素地図に示すｐＤｃｏｓＡｐ r ／ｏｒｉ 【図１】 ｃｏｓ ：ラムダファージのｃｏｓ ｏｒｉ ：複製開始点 Ａｐ r ：アンピシリン耐性を発現する領域 ｎｅｏ r ：ネオマイシン耐性を発現する領域 、下記の制限酵素地図に示すｐＤｃｏｓＴｃ r 【図３】 ｃｏｓ：ラムダファージのｃｏｓ ｏｒｉ：複製開始点 Ｔｃ r ：テトラサイクリン耐性を発現する領域 、下記の制限酵素地図に示すｐＤｃｏｓＴｃ r ／ｏｒｉ 【図４】 ｃｏｓ：ラムダファージのｃｏｓ ｏｒｉ：複製開始点 Ｔｃ r ：テトラサイクリン耐性を発現する領域 ＳＶ−ｄｈｆｒ：ＳＶ−４０ジヒドロ葉酸リダクターゼ
活性を発現する 領域、及び 、下記の制限酵素地図に示すｐＤｃｏｓＡｐ r ／ｏｒｉ／
ｇｐｔ／ＴＫ 【図５】 ｃｏｓ：ラムダファージのｃｏｓ ｏｒｉ：複製開始点 Ａｐ r ：アンピシリン耐性を発現する領域 ＳＶ−ｄｈｆｒ：ＳＶ−４０ジヒドロ葉酸リダクターゼ
活性を発現する 領域 ＴＫ ：チミジンキナーゼ活性を発現する領域 ｇｐｔ：キサンチングアニンホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ活性を 発現する領域 、 を用いる遺伝子バンクの製造法。 - 【請求項２】 外来ＤＮＡが、細菌、糸状菌、酵母など
の微生物、高等動植物もしくは各種フアージ等に由来す
るＤＮＡである請求項１記載の遺伝子バンクの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9511694A JP2599892B2 (ja) | 1994-05-09 | 1994-05-09 | 新規コスミドベクターを用いる遺伝子バンクの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9511694A JP2599892B2 (ja) | 1994-05-09 | 1994-05-09 | 新規コスミドベクターを用いる遺伝子バンクの製造法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59112206A Division JPH0824580B2 (ja) | 1984-06-02 | 1984-06-02 | 新規コスミドベクタ− |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0889248A JPH0889248A (ja) | 1996-04-09 |
| JP2599892B2 true JP2599892B2 (ja) | 1997-04-16 |
Family
ID=14128877
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9511694A Expired - Lifetime JP2599892B2 (ja) | 1994-05-09 | 1994-05-09 | 新規コスミドベクターを用いる遺伝子バンクの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2599892B2 (ja) |
-
1994
- 1994-05-09 JP JP9511694A patent/JP2599892B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0889248A (ja) | 1996-04-09 |
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