KR100761790B1 - ＧｓＭＴｘ4 유전자를 포함하는 효모 발현용 재조합플라스미드 및 이를 이용한 칠레산 타란툴라 거미독펩타이드 ＧｓＭＴｘ4의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 GsMTx4 유전자를 포함하는 효모 발현용 재조합 플라스미드 및 이를 이용한 칠레산 타란툴라 거미독 펩타이드 GsMTx4의 생산 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 GsMTx4 유전자를 메탄올에 의해 발현이 유도되는 AOX(alcohol oxidase) 프로모터 및 알파-인자(α-factor) 분비 신호 서열에 연결하여 효모 발현용 재조합 플라스미드를 제조하고, 이를 이용하여 메탄올 자화 효모를 형질전환시켜 GsMTx4 펩타이드를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 효모 발현 시스템을 이용하면 천연의 GsMTx4 펩타이드에 비해 GsMTx4 펩타이드를 대량으로 생산하는 것이 가능하므로, 메카노센시티브 이온 채널을 차단하는 특이 억제제로서 심장마비 등 관련된 다양한 질병의 치료에 사용될 수 있다.

GsMTx4 펩타이드, 피키아 패스토리스, 메탄올

Description

ＧｓＭＴｘ4 유전자를 포함하는 효모 발현용 재조합 플라스미드 및 이를 이용한 칠레산 타란툴라 거미독 펩타이드 ＧｓＭＴｘ4의 생산 방법{recombinant yeast expression plasmid having GsMTx4 gene and method for mass-producing GsMTx4, Grammostola spatulata toxin peptide using the same}

도 1a는 pPICZαB 벡터의 개열 지도이고,

도 1b는 GsMTx4 유전자가 pPICZαB 벡터에 도입된 본 발명에 따른 재조합 플라스미드 pGSMTX4의 개열 지도이고,

도 2는 완성된 재조합 플라스미드 pGSMTX4의 구조 및 전체 서열이고,

도 3은 분리정제된 GsMTx4 펩타이드의 우레아 폴리아크릴아마이드 전기영동사진이고,

도 4는 분리정제된 GsMTx4 펩타이드의 순도를 측정한 결과를 나타낸 HPLC 그래프이고,

도 5는 GsMTx4 펩타이드의 분자량을 측정한 결과를 나타낸 MALDI-TOF 그래프이고,

도 6a 및 도 6b는 본 발명의 전 구성을 나타낸 개략도이다.

본 발명은 GsMTx4 유전자를 포함하는 효모 발현용 재조합 플라스미드 및 이를 이용한 칠레산 타란툴라 거미독 펩타이드 GsMTx4의 생산 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 GsMTx4 유전자를 메탄올에 의해 발현이 유도되는 AOX(alcohol oxidase) 프로모터 및 알파-인자(α-factor) 분비 신호 서열에 연결하여 효모 발현용 재조합 플라스미드를 제조하고, 이를 이용하여 메탄올 자화 효모를 형질전환시켜 GsMTx4 펩타이드를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

기계 자극에 의해 개폐되는 이온채널의 통칭인 메카노센시티브 이온 채널(mechanosensitive ion channel, MSCs)은 세포막에 존재하고, 막을 늘였을 때 개폐되기 때문에 신축-활성 채널(stretch-activated channel, SACs)이라고도 불리운다[Frederick Sachs et al. J. Gen. Physiol. 115, 583-598 (2000)]. 상기 신축-활성 채널은 그 채널을 특이적으로 억제하는 물질이 존재하지 않는 부류의 이온 채널로서 특이(specific) 억제 물질이 밝혀진 바 없어 이 채널의 기능에 대해서도 알려진 바가 드물었다.

칠레산 타란툴라 거미독 펩타이드인 GsMTx4는 신축-활성 채널을 특이적으로 억제하는 물질(작은 단백질)로서는 처음 밝혀진 것으로[Frederick Sachs et al. J. Gen. Physiol. 115, 583-598 (2000)], 이는 34개 아미노산으로 구성되고 6개의 시 스테인이 3개의 이중 황 결합을 이루며 분자량이 약 4,094Da인 펩타이드이다. GsMTx4 펩타이드는 타란툴라 거미의 학명인 Grammostola spatulata의 "Gs", 기계(mechano)의 "M", 독소(toxin)의 "Tx", 그리고 활성 시퀀스의 4번째 피크의 "4"를 조합하여 명명되었으며, 그 아미노산 서열은 하기와 같다:

Gly Cys Leu Glu Phe Trp Trp Lys Cys Asn Pro Asn Asp Asp Lys Cys Cys Arg Pro Lys Leu Lys Cys Ser Lys Leu Phe Lys Leu Cys Asn Phe Ser Phe (서열번호 1)

상기와 같이 GsMTx4 펩타이드가 신축-활성 채널을 특이적으로 억제하는 물질임이 밝혀짐에 따라, 타란툴라 거미독을 세포의 역학(mechanics)과 관련된 분야에 임상적으로 이용할 수 있다. 예를 들어 울혈성 심부전(congestive heart failure)이 생기면 각 조직, 특히 폐, 간, 장, 다리 등에 울혈과 부종이 나타나는데 거미독은 상기 과정을 억제할 수 있다[Frederick Sachs et al. J. Gen. Physiol. 115, 583-598 (2000)]. 또한 비정상적인 심장 박동을 치료하는데 칠레산 타란툴라로부터 추출한 독액이 좋은 효능을 나타낸다는 연구 결과가 있으며 신축-활성 채널 억제를 통해 심장마비의 원인이 되는 섬유성 연축(artial fibrillation)도 막을 수 있다[Frederick Sachs et al. Nature 409, 35-36 (2001), O.P. Hamill et al. Physiol. Rev. 81, 685 (2001)]. 또한 뇌조직에 종양이 침입하면 주위의 정상적인 세포들이 변형되어 신축-활성 채널을 통해 종양 성장을 촉진하는 성장 인자가 분비되는데, 이 경우에도 거미독이 상기 채널을 막아 뇌종양 치료에 높은 효과를 나타낼 수 있다[Frederick Sachs et al. J. Gen. Physiol. 115, 583-598 (2000)].

그러나 칠레산 타란툴라 거미독에서 추출할 수 있는 천연의 GsMTx4 펩타이드 는 극미소량에 불과하고 따라서 이를 신축-활성 채널 특이 억제제로서 임상적으로 이용하기 위해서는 화학적 합성이나 유전공학적 기법을 이용한 GsMTx4 펩타이드의 생산이 필연적으로 요구될 수 밖에 없다.

GsMTx4 펩타이드는 상기한 바와 같이 6개의 시스테인이 서로 시스테인 고리구조(cysteine knot)를 형성하고 있고 이들 시스테인 결합은 구조적으로 특정한 순서(ICK motif)를 가지고 있다[Robert E. Oswald et al. J. Biol. Chem. 277(37), 34443-34450 (2002)]. 이러한 구조적 특이성으로 인해 GsMTx4 펩타이드의 화학적 합성에는 제한이 따르게 된다. 또한 대장균을 이용한 단백질 합성의 경우에는 당쇄 부가(glycosylation) 반응이나 세포 외 분비가 일어나지 않음으로 인해 세포 내에서 생산된 펩타이드를 세포 외에서 얻기 위해서 별도의 조작이 필요하게 되고 이 경우 단백질 고유의 3차 구조를 유지하기가 어렵다. 따라서 GsMTx4 고유의 3차 구조를 유지하고 있는 펩타이드를 얻기 위해서는 세포 외 분비를 통해 얻어내는 것이 유리하다.

대장균과 달리 세포 외 분비가 일어나는 효모(yeast)는 옛날부터 술의 양조나 빵의 제조 등에 많이 이용되고 있는 것으로 진핵 생물이면서 단세포이고 발달된 막계를 가짐으로써 동물 세포와 원핵 생물의 특징을 모두 가지고 있는 생물로, 고등 진핵 생물 유전자의 발현 및 세포 내외의 물질 수송에서 대장균에서는 없는 여러 가지 장점을 나타낸다. 또한 고등 동물 세포와 유사한 유전자 발현의 제어 기구, 세포 증식의 제어 기구 및 분비 단백질의 수식 기구를 가지고 있다. 또한 배양시 내독소(endotoxin)를 생성하는 대장균에 비해 훨씬 안전하다[Marten & Seo, Chap. 7, Expression systems and processes for rDNA products, ed. by Hatch et al., ACS Symp. ser. 477, 1991].

이에 본 발명자들은 GsMTx4 펩타이드의 제조방법을 개발하고자 연구노력한 결과, GsMTx4 유전자를 효모, 바람직하게는 메탄올 자화 효모에 도입하여 GsMTx4 펩타이드를 대량 생산할 수 있는 발현 시스템을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 울혈성 심부전, 심장마비 및 뇌종양 치료에 사용될 수 있는 칠레산 타란툴라 거미독 펩타이드 GsMTx4를 대량으로 생산할 수 있는 GsMTx4 유전자 포함 효모 발현용 재조합 플라스미드 및 이를 이용한 대량 생산방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 GsMTx4 유전자를 포함하는 메탄올 자화 효모 발현용 재조합 플라스미드를 제공한다.

또한 본 발명은 재조합 메탄올 자화 효모를 이용하여 칠레산 타란툴라 거미독 펩타이드 GsMTx4를 대량 생산하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 GsMTx4 유전자를 포함하는 메탄올 자화 효모 발현용 재조합 플라스미드를 제공한다.

본 발명의 재조합 플라스미드는 메탄올 자화 효모 발현용 프로모터, 분비 신호 서열 및 GsMTx4 유전자를 포함하고 바람직하게는 AOX(alcohol oxidase) 프로모터, 알파-인자(α-factor) 분비 신호 서열(서열번호 7) 및 구조유전자로서 GsMTx4 펩타이드의 아미노산 서열을 코딩하는 GsMTx4 유전자를 포함한다. 상기 GsMTx4 유전자는 AOX 프로모터 및 알파-인자 분비 신호 서열의 조절을 받도록 연결되어 있다.

상기 구조유전자로서 GsMTx4 유전자는 공지의 GsMTx4 펩타이드의 아미노산 서열(서열번호 1)을 기초로 하고 효모에서 통상적으로 많이 사용되는 코돈 및 전체 염기서열의 안정성(즉, GsMTx4 펩타이드의 첫 번째 아미노산인 Glycine을 코딩하는 코돈은 GGT, GGC, GGA, GGG 모두 가능한 가운데 우리는 효모에서 통상적으로 많이 사용되는 코돈 및 전체 염기서열의 안정성을 고려하여 GGT를 선택하였다)을 고려하여 다음과 같은 서열로 이루어져 있다(Protein Expr Purif. 26, 96-105, 2002):

5′-GGT TGT TTG GAG TTC TGG TGG AAG TGC AAC CCA AAC GAC GAC AAG TGT TGC AGA CCA AAG TTG AAG TGT TCC AAG TTG TTC AAG TTG TGC AAC TTC TCT TTT- 3′(서열번호 2)

또한 상기 재조합 플라스미드는 종결인자 및 선별 표지 유전자를 가지며 바람직하게는 AOX 터미네이터 및 지오신(zeocin) 저항성 유전자를 갖고, 메탄올 자화 효모 균주에 도입되어 GsMTx4 유전자를 대량 발현할 수 있다.

상기 AOX 프로모터는 비-탄소원이 존재할 때는 유전자 발현을 억제하고, 메탄올 첨가에 의해서만 발현이 유도되므로 하류에 연결된 유전자의 발현을 정교하게 조절할 수 있고, AOX 터미네이터는 mRNA의 폴리아데닐화와 같은 mRNA 프로세싱을 통해 안정성을 높이는 역할을 한다. 그러나 이들 프로모터 및 터미네이터는 AOX 프로모터 및 AOX 터미네이터에 국한되지 않고 본 발명의 목적에 따라 다른 프로모터 및/또는 터미네이터로 대체될 수 있다.

상기 알파-인자(α-factor) 분비 신호 서열은 대부분의 이종 단백질을 균주로부터 효율적으로 분비할 수 있으며, 특히 분자량이 적은 단백질의 분비에 적합하다. 그러나 이 분비 신호 서열은 본 발명의 목적에 따라 적합한 다른 분비 신호 서열로 대체될 수 있다.

본 발명의 효모 발현용 재조합 플라스미드에 있어, 효모로는 메탄올 자화 효모로서 피키아 속 균주, 보다 바람직하게는 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)인 것이 바람직하다. 이와 같이 피키아 속 균주를 이용하면 진핵세포 발현계를 사용하므로 번역후 수식(posttranslational modification) 과정이 올바르게 일어나 기능과 작용 면에서 효율적인 GsMTx4 펩타이드를 생산할 수 있다. 또한 상기 효모에 존재하는 AOX 유전자 부위로 목적하는 외래 유전자의 삽입(integration)이 효율적으로 일어나게 되며, 메탄올에 의해 외래 유전자의 발현을 정교하게 조절할 수 있게 된다. 특히, 발효 공학적 측면에서도 10,000 배 이상으로 배양 규모를 확대(scale up)하는 것이 용이하고, 외래 유전자의 발현율이 기존에 많이 사용되고 있는 효모(Saccharomyces cerevisiae)에 비해 월등히 높다는 장점을 지닌다. 또한, 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)의 경우 외래 단백질을 다량으로 발현할 뿐 아니라 α-1,3-만노실트랜스퍼라제(α-1,3-mannosyltransferase)의 활성이 없어 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae)에 비하여 인체에서 독성으로 작용하는 α-1,3-만노즈 잔기가 존재하지 않는다는 잇점이 있다.

상기와 같은 특성으로 인해 피키아 속 균주는 지금까지 여러가지 외래 단백질을 생산하는데 있어 적용되어 왔으나[Sreekrishna et al. Biochemistry 28, 4117-4125 (1989), Clare et al. Bio/Technology 9, 455-461 (1991), Ikegaya et al. Anal. Chem. 69, 1986-1991 (1997)] 아직까지 이를 이용하여 칠레산 타란툴라 거미독 GsMTx4 펩타이드를 생산한 보고는 없었다.

본 발명의 실시예에서는 GsMTx4 유전자의 발현을 위한 재조합 플라스미드의 바람직한 예로서, GsMTx4 유전자가 pPICZαB에 도입된 pGSMTX4를 제작하였다.

본 발명에서 GsMTx4 유전자를 메탄올 자화 효모에서 발현시키기 위한 재조합 플라스미드 제작에 바람직한 예로서 사용된 pPICZαB 벡터는 AOX(alcohol oxidase) 프로모터, α-인자 분비 신호 서열(α-factor secretion signal sequence), AOX의 전사 종결 부위 및 선별 표지 유전자로서 지오신(zeocin) 저항성 유전자를 포함한다. 상기 AOX 프로모터는 비-탄소원이 존재할 때는 유전자 발현을 억제하고, 메탄올 첨가에 의해서만 발현이 유도되므로 하류에 연결된 유전자의 발현을 정교하게 조절할 수 있고, 피키아(Pichia)속 효모에서 목적하는 외래 유전자를 높은 수준으로 발현시키는 장점을 갖는다. 또한 AOX의 전사 종결 부위는 mRNA의 폴리아데닐화와 같은 mRNA 프로세싱을 통해 안정성을 높이는 역할하며 α-인자 분비 신호 서열 은 균주로부터 대부분의 단백질을 분비형으로 수득 가능하게 한다. 상기 α-인자 분비 신호 서열은 ATG 개시코돈으로 시작되는 총 85개의 아미노산으로 구성되며 끝 부분 83, 84, 85번의 배열인 Glu-Lys-Arg 배열 다음에 Glu-Ala-Glu-Ala 배열이 존재하며 바로 다음에 GsMTx-4의 N-말단 Gly 코돈(GGT)부터 시작되는 전체 GsMTx-4 유전자가 연결되어 있다. Glu-Lys-Arg 배열을 인식하는 단백분해효소 Kex2가 효모의 트랜스 골지체에 존재하기 때문에, 합성된 ppL::GsMTx-4의 폴리펩타이드는 트랜스 골지체에서 프로세싱되어 분비 시그날 부분이 절단되게 된다. 한편 Glu-Ala-Glu-Ala 배열은 이 부위를 인식하는 단백분해효소 Ste13에 의해 세포외 분비시 절단되게 된다. 따라서 최종적으로 배지로 분비되는 GsMTx-4 펩타이드는 N-말단이 Gly으로부터 시작되는 완전한 형태의 GsMTx-4가 되는 것이다.

또한, 본 발명은 재조합 메탄올 자화 효모를 이용하여 칠레산 타란툴라 거미독 펩타이드 GsMTx4를 대량 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 메탄올 자화 효모를 이용한 GsMTx4 펩타이드의 생산 방법은,

1) 본 발명의 재조합 플라스미드로 메탄올 자화 효모를 형질전환시키는 단계,

2) 단계 1)의 메탄올 자화 효모의 배양액에 메탄올을 첨가하여 GsMTx4 유전자 발현을 유도하는 단계; 및

3) 단계 2)의 배양액으로부터 GsMTx4 펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 거미독 펩타이드 GsMTx4의 생산 방법을 포함한다.

상기 단계 3)의 발현 유도는 메탄올을 5% 미만, 바람직하게는 0.5%의 농도로 첨가한 후 10일 이내, 바람직하게는 5일 간 배양함으로써 AOX 프로모터를 통한 GsMTx4 유전자의 발현을 유도하는 것이다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 GsMTx4 유전자를 증폭하여 클로닝하고 발현 벡터를 제작하기 위하여 공지의 GsMTx4 펩타이드의 아미노산 서열을 기초로 하고 효모에서 통상적으로 많이 사용되는 코돈 및 전체 염기서열의 안정성을 고려하여 재조합 벡터에 삽입되기 위한 제한 효소 절단 부위를 갖는 4개의 올리고뉴클레오티드를 합성하여 사용하였다. 상기 증폭된 유전자를 발현하는 재조합 플라스미드로는 발현벡터에 삽입된 GsMTx4 유전자를 과발현하기 위해, 기존의 GAL 프로모터보다 훨씬 강력하며 메탄올을 탄소원으로 이용하여 발현을 유도할 수 있는 AOX 프로모터를 가지고 선별 표지 유전자로서 항생제 지오신 저항성 유전자를 가지는 피키아 발현 벡터(pPICZαB, Invitrogen사)를 사용하였다. 상기와 같이 증폭된 GsMTx4 유전자를 pPICZαB 벡터의 Xho1/Xba1 위치에 삽입하여 GsMTx4 유전자를 발현하는 재조합 플라스미드를 제조하였으며, 이를 pGSMTX4로 명명하였다. 이후 상기 재조합 플라스미드로 E.coli DH5α을 형질전환하였다. 본 발명자들은 상기 GsMTx4 유전자를 포함하는 대장균 형질전환체를 2005년 4월 9일자로 한국미생물보존센터(KCCM, 서울시 서대문구 홍제1동 361-221 소재)에 기탁번호 KCCM 10652p로 기탁하였다.

한편, 대장균에서 대량 증식된 상기 재조합 플라스미드를 제한효소로 절단하여 선형으로 만든 후 전기천공법(electroporation)을 이용하여 메탄올 자화 효모인 피키아 속 효모 게놈 DNA의 AOX 유전자 자리로 도입하였다. 본 발명의 실시예에서는 형질전환되는 피키아 패스토리스 효모의 바람직한 예로서 피키아 패스토리스 GS115(his4, His- Mut+, Invitrogen사)를 사용하였다. 이후, 항생제 배지에서 콜로니를 형성한 개체를 선별하고 PCR로 확인하여 형질전환된 개체를 선택하였다. 이를 최소 배지(minimal media)에 접종시킨 후, 메탄올을 첨가함으로써 효모 게놈 DNA에 삽입된 메탄올에 의해 유도되는 AOX 프로모터가 활성화되고, AOX 프로모터 하류에 연결된 GsMTx4 유전자의 전사가 일어나 GsMTx4 펩타이드가 생산되도록 하였다. 배양액을 수득하여 크로마토그래피로 분석한 결과, 단일 피크의 단백질을 확인하고(도 4 참조) 분광측색계(spectrophotometer)를 이용하여 GsMTx-4 펩타이드의 최종 생산량이 리터당 약 100mg임을 확인하였다. 추가로 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight)를 실시하여 GsMTx-4 펩타이드의 분자량이 유전자 크기로부터 예상된 값인 4,094Da임을 확인하였다(도 5 참조). 이로써 본 발명의 발현벡터로 상기 발현벡터로 형질전환된 효모에 의해 GsMTx4 펩타이드의 대량생산에 성공하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> GsMTx4 유전자 염기서열의 설계

알려진 펩타이드 GsMTx4의 34개 아미노산 서열을 이용하여 효모 내에서 유전자 발현을 증가시키기 위해, GsMTx4 펩타이드의 아미노산 서열에는 변화 없이 효모 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)가 선호하는 코돈을 선택하여 펩타이드 GsMTx4를 코딩하는 염기서열을 하기와 같이 설계하였다(Protein Expr Purif. 26, 96-105, 2002).

5′-GGT TGT TTG GAG TTC TGG TGG AAG TGC AAC CCA AAC GAC GAC AAG TGT TGC AGA CCA AAG TTG AAG TGT TCC AAG TTG TTC AAG TTG TGC AAC TTC TCT TTT- 3′(서열번호 2)

상기 염기서열을 갖는 GsMTx4 유전자가 발현벡터 pPICZαB(invitrogen사)에 용이하게 삽입되고 발현된 GsMTx4 펩타이드가 세포외로 다량 분비될 수 있도록 하기 위하여, 상기 GsMTx4 펩타이드의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 2)를 하기 서열을 갖는 4개의 올리고뉴클레오티드 (I), (II), (III) 및 (IV)로 나누어 DNA 합성기(Model 391, Applied Biosystems사)로 합성하였다.

5′- tc ga g aaa aga gag gct gaa gct GGT TGT TTG GAG TTC TGG TGG AAG TGC AAC CCA AAC GAC GAC AAG -3′(I) (서열번호 3)

3′-c ttt tct ctc cga ctt cga CCA ACA AAC CTC AAG ACC ACC TTC ACG TTG GGT TTG CTG CTG TTC -5′(II) (서열번호 4)

5′-TGT TGC AGA CCA AAG TTG AAG TGT TCC AAG TTG TTC AAG TTG TGC AAC TTC TCT TTT tga t -3′(III) (서열번호 5)

3′-ACA ACG TCT GGT TTC AAC TTC ACA AGG TTC AAC AAG TTC AAC ACG TTG AAG AGA AAA act a gat c -5′(IV) (서열번호 6)

Xho1 제한효소 인지부위( tc ga g )를 포함한 알파 인자(α factor)의 프리프로리더(preproleader, ppL) 서열이 GsMTx4 구조유전자(센스)의 5′말단에 연결되도록 하였으며, 1개의 종료(stop)코돈 및 Xal1 제한효소 인지부위( a gat c )가 GsMTx4 구조유전자(안티센스)의 5′말단에 연결되도록 하였다.

<실시예 2> GsMTx4 유전자를 포함하는 발현벡터의 제작

상기 올리고뉴클레오티드 (I), (II), (III) 및 (IV) 각각 1㎕(100pmoles)를 혼합하여 폴리뉴클레오티드 인산화효소(T4 polynucleotide kinase, Boehringer Mannheim사)로 인산화시킨 다음 회합(annealing) 반응으로 이중쇄를 형성시켰다. 리가아제(T4 DNA ligase, Boehringer Mannheim사)로 각각의 이중쇄 올리고뉴클레오티드를 연결한 다음, 아가로스 젤 전기영동하여 젤로부터 GsMTx4 펩타이드를 코딩하는 약 129 염기쌍의 단편 1를 분리하였다.

플라스미드 pPICZαB(Invitrogen사)를 제한효소 Xho1 및 Xba1으로 절단하여 AOX1 프로모터, ppL 분비 서열, AOX1 터미네이터 및 선별 표지 유전자로서 지오신 저항성 유전자를 포함하는 약 3,300 염기쌍의 단편 2를 얻은 다음, T4 리가제를 이용하여 단편 2에 단편 1을 연결하여 본 발명에 따른 재조합 플라스미드를 제작하였다(도 1a 및 도 1b).

상기와 같은 과정을 통해 제작된, GsMTx4 유전자가 AOX1 프로모터 및 알파 입자 분비서열인 ppL 분비 서열의 하류에 연결되고, AOX1 터미네이터 및 지오신 저항성 유전자를 선별 표지 유전자로 갖는 발현 플라스미드를 pGSMTX4로 명명하였다. 상기 플라스미드의 제작과정 및 구조를 도 1 및 도 2에 나타내었다. 도 1 및 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 재조합 발현 플라스미드 pGSMTX4는 차례대로 AOX1 프로모터::ppL 분비 시그날 배열::34개의 아미노산으로 구성된 GsMTx4 펩타이드 유전자::AOX1 터미네이터로 이루어져 있으며, 선별 표지 유전자로서 지오신 저항성 유전자를 포함하고 있다. 이상 제작된 플라스미드의 염기서열은 생거(sanger)의 DNA 염기서열 결정법(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 5463-5476(1977))으로 그 염기서열을 확인하였다.

한편, 재조합 플라스미드를 이용하여 E. coli DH5α를 형질전환하여 대장균 형질전환체를 제조하였으며 이를 pGSMTX4라 명명하고 2005년 4월 9일자로 기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하였다(수탁번호 KCCM 10652p).

<실시예 3> 대장균에서 pGSMTX4의 대량 증식

상기 실시예 2에서 제작된 GsMTx4 펩타이드 발현 플라스미드 pGSMTX4를 대장균에서 대량으로 증식시키기 위해, 상기 플라스미드로 E.coli DH5α를 형질전환시켰다. 먼저, pGSMTX4를 전기천공법(electroporation)을 이용하여 E. coli DH5α에 도입한 후, 25㎍/㎖의 지오신을 포함하는 저염(low salt) LB 배지에서 도말하여 37 ℃에서 배양하고, 콜로니(colony)를 형성한 형질전환체를 선별하였다. 이들 중 GsMTx4 유전자가 제대로 클로닝된 형질전환체를 선별하기 위해 이들 콜로니를 대상으로 PCR을 수행하여 PCR 산물에 대한 아가로스 젤 전기영동 결과로부터 약 129 염기쌍의 GsMTx4 유전자가 삽입되었음이 확인된 콜로니를 선별하였다. 상기에서 선별된 콜로니를 지오신 함유 LB 배지에서 배양시킨 후, GsMTx4 유전자가 올바르게 삽입된 형질 전환체를 미디프렙(midi-prep)하여 플라스미드 DNA를 대량으로 분리 정제하였다.

<실시예 4> 효모 균주의 형질전환 및 선별

GsMTx4 펩타이드의 대량 생산을 위해 상기에서 제조한 발현 플라스미드 pGSMTX4를 이용하여 메탄올 자화 효모 균주인 피키아 패스토리스를 형질전환시켰다.

우선, 형질전환될 효모 균주로 피키아 패스토리스 GS115(Invitrogen사)를 YPD(yeast, peptone, dextrose) 배지 5ml에 접종하고 30 ℃에서 하룻밤 동안 진탕배양하였다. 배양액 5ml를 다시 YPD 배지 25 ml에 접종하여 OD₆₀₀=1.0이 될 때까지 30 ℃에서 진탕배양하였다. 배양액을 1,800 rpm으로 5분간 원심분리하여 배지를 제거하고 균체 침전물을 얻은 후, 이를 증류수 25 ml로 1회 세척하였다. 이후 1M 농도의 소르비톨(sorbitol) 25 ml로 균체를 4회 세척하여 균체 현탁액을 얻었다.

다음으로, 상기 실시예 3에서 대량 정제된 pGSMTX4를 제한효소 pme1으로 처리하여 선형 DNA 상태로 만들고 에탄올 침전을 수행하여 이를 20ug/10ul로 농축시켰다. 상기 균체 현탁액에 pme1으로 처리하여 선형으로 만든 pGSMTX4를 혼합하여 전기천공법(electroporation)(Gene pulsur 2 기기, Bio-Rad사)을 통해 효모 피키아 패스토리스 GS115를 형질전환시켰다. 배양액을 지오신을 함유하는 YPDS(yeast extract peptone dextrose sorbitol) 고체 배지에 도말한 후 30℃에서 콜로니가 형성될 때까지 2~3일간 배양하였다.

형성된 콜로니 중 GsMTx4 유전자가 효모의 게놈 내로 삽입된 것을 선별하기 위하여 게놈 DNA를 추출한 다음 PCR을 수행하여 PCR 산물에 대한 아가로스 젤 전기영동 결과로부터 GsMTx4 유전자가 제대로 증폭되었음이 확인된 콜로니를 선별하였다.

<실시예 5> GsMTx4 펩타이드의 발현

재조합 플라스미드로 형질전환된 효모 피키아 패스토리스에서 GsMTx4 펩타이드를 발현시키기 위해, 상기 실시예 4에서 선별된 재조합 효모의 콜로니를 취한 다음 포도당을 탄소원으로 하는 최소 선택 배지(yeast nitrogen base without amino acid 0.67%, 포도당 2%, Leu 0.003%, His 0.002%)에 소량 접종하고 30℃, 3일간 배양하여, pGsMTx4/GS115의 형질전환 콜로니 약 100개를 수득하였다. 이 100개의 콜로니를 메탄올 최소 선택 배지(yeast nitrogen base without amino acid 0.67 %, 메탄올 0.5 %, Leu 0.003 %, His 0.002 %)에 접종하여 생육이 양호한 균주 pGSMTX4/GS115를 최종 선택하였다.

pGSMTX4/GS115를 100ml의 YPD 배지에 접종하고, 30℃에서 48시간 진탕 배양하였다. 상기 배양액을 원심분리하여 배지를 제거한 후, 1,000ml의 BMMY(yeast extract, peptone, yeast nitrogen base, biotin, methanol) 배지에 접종하고 매 24 시간 마다 메탄올 농도가 0.5%가 되도록 메탄올 첨가하면서, 30℃에서 120시간 진탕배양하여 AOX1 프로모터에 의해 조절되는 GsMTx4 유전자의 발현을 유도하였다.

배양 후 배양액 1 ml를 회수하여 6,000 rpm에서 5분간 원심 분리하여, 배양액과 균체를 각각 회수하였다. 배양액을 동결건조하여 우레아 용해 완충액(urea lysis buffer; 50mM Tris-Cl pH 6.8, 100mM dithiothreitol, 2% SDS, 5% mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue) 10㎕에 용해시키고, 100℃에서 2분간 가열하였다. 생성된 용액을 배양 배지 단백질 분획으로 명명하였다. 배양 배지 단백질 분획을 17% 분리젤(separating gel, pH 8.8, 가로 10cm, 세로 5cm, 두께 1mm) 위에 5% 저장젤(stocking gel, pH 6.8, 가로 10cm, 세로 1 cm, 두께 1mm)을 덮은 우레아 폴리아크릴 아마이드젤에서 전압 100V, 전류 20mA로 20분간 전기영동하고 쿠마시 블루 염색액으로 염색하였다.

그 결과, 4kDa 부근에서 GsMTx4 펩타이드 밴드가 관찰되었는데 이는 재조합 벡터 내의 ppL 시그날을 사용하였을 때 효모 피키아 내에서 발현된 GsMTx4가 배지로 분비되었음을 의미하고, 그 효율이 매우 높음을 확인하였다(도 3).

<실시예 6> GsMTx4 펩타이드의 정제

상기 실시예 5에서 120시간 배양한 배양액을 8,000g에서 30분간 원심 분리하 여 균체를 제거한 후, 상등액을 3MM 여과지(whatman사)를 통과시켜 현탁 부유물을 제거한 후, 다시 공경 25um 정도의 필터를 사용하여 미세 부유물을 제거하였다. GsMTx4 펩타이드의 등전점(pI)은 9.1 근처이므로 빙초산(acetic acid)으로 배양액의 산도(pH)를 4.0으로 조정한 다음, SP-세파로스 양이온 교환수지(Pharmacia Biotech사)를 pH 4의 초산나트륨(sodium acetate) 50mM로 평형화시킨 후, 상기의 배양액을 통과시켰다. 다시 상기 초산나트륨 완충액으로 컬럼을 세정 후, pH 4.0, 0-2M까지 염농도의 변화를 주면서 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 그 결과 약 1.2~1.6M의 염에서 용출물을 수득하여 초산나트륨 완충액으로 5배 희석 후, 모노(mono) S 양이온 교환수지(Pharmacia Biotech사)로 양이온 교환 크로마토그래피를 다시 한번 수행하였다. 용출물을 수득하여 C-14 컬럼을 이용하여 HPLC(Waters사)로 분석한 결과 단일 피크를 수득하였는데(도 4) 분광측색계(spectrophotometer)를 이용하여 280nm에서 흡광도를 측정하여 최종 생산량을 계산한 결과 리터당 약 100 mg의 GsMTx4가 수득된 것을 확인하였다.

<실시예 7> GsMTx4 펩타이드의 분석

상기 실시예6에서 정제한 GsMTx-4 펩타이드를 우레아 폴리아크릴 아미드 젤에서 전기영동한 후, 이모빌리온 P 막(Immobilion P membrane, Millipore사)으로 전달하고, 어플라이드 바이오시스템즈 494 시퀀싱 시스템(Applied Biosystems 494 Sequencing System, Perkin Elmer사)을 이용하여 에드만 분해법(Edman degradation)으로 N-말단 서열 분석(N-Terminal sequence analysis)을 수행하였다. 그 결과, 첫 번째 아미노산은 Gly이었으나, 그 다음부터는 어떠한 아미노산도 검출되지 않았는데, 이는 GsMTx-4의 두번째 아미노산인 시스테인(Cys)이 다른 시스테인과 이황화 결합을 형성하기 때문이다.

또한, 보이저-DE STR 질량 분광계(PE Biosystems사)를 이용하여 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight) 분광법으로 GsMTx-4 단백질의 분자량을 측정하였으며, 그 결과, 분자량이 4,094Da으로서, 계산치와 정확히 일치하였다(도 5).

본 발명의 재조합 효모 발현 시스템을 이용하여 칠레산 타란툴라 거미로부터 분리되는 천연의 GsMTx4 펩타이드에 비해 다량의 발현율이 높으며, 효율적인 GsMTx4 펩타이드를 대량 생산함으로써 메카노센시티브 이온 채널을 차단하는 특이 억제제로서의 임상적 사용의 범위가 넓은 GsMTx4 펩타이드를 대량 생산하는 것이 가능하여 심장마비 등 관련된 다양한 질병의 치료에 사용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (11)

1. 메탄올 자화 효모 발현용 프로모터, 분비 신호 서열 및 서열번호 2로 기재되며 GsMTx4 펩타이드의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 컨스트럭트.
2. 제 1항에 있어서, 메탄올 자화 효모 발현용 프로모터는 AOX1 프로모터인 것을 특징으로 하는 유전자 컨스트럭트.
3. 제 1항에 있어서, 분비 신호 서열은 알파-인자 분비 신호 서열인 것을 특징으로 하는 유전자 컨스트럭트.
4. 제 1항에 있어서, 상기 효모는 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)인 것을 특징으로 하는 유전자 컨스트럭트.
5. 제 1항의 유전자 컨스트럭트를 포함하는 메탄올 자화 효모 발현용 재조합 플 라스미드.
6. 제 1항의 유전자 컨스트럭트를 포함하는 메탄올 자화 효모 발현용 재조합 플라스미드 pGSMTX4(수탁번호 KCCM 10652p).
7. 1) 제 5항의 재조합 플라스미드로 메탄올 자화 효모를 형질전환시키는 단계,

   2) 단계 1)의 메탄올 자화 효모의 배양액에 메탄올을 첨가하여 GsMTx4 유전자 발현을 유도하는 단계; 및

   3) 단계 2)의 배양액으로부터 GsMTx4 펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 거미독 펩타이드 GsMTx4의 생산 방법.
8. 제 7항에 있어서, 단계 1)의 재조합 플라스미드가 pGSMTX4(수탁번호 KCCM 10652p)인 것을 특징으로 하는 거미독 펩타이드 GsMTx4의 생산 방법.
9. 제 7항에 있어서, 단계 1)의 메탄올 자화 효모가 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)인 것을 특징으로 하는 거미독 펩타이드 GsMTx4의 생산 방법.
10. 제 7항에 있어서, 단계 2)의 발현 유도는 메탄올의 농도가 일정하도록 메탄올을 첨가하면서 배양함으로써 GsMTx4 유전자의 발현을 유도하는 것을 특징으로 하는 거미독 펩타이드 GsMTx4의 생산 방법.
11. 제 10항에 있어서, 일정하게 유지되는 메탄올 농도는 0.5%인 것을 특징으로 하는 거미독 펩타이드 GsMTx4의 생산 방법.

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