JP3490125B2 - 巨核球増幅因子をコードする遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は遺伝子に関し、さらに詳
しくは、多能性血液幹細胞より分化した巨核球コロニー
形成細胞 (Megakaryocyte Colony-Forming Unit.) に作
用しインターロイキン−３（ＩＬ−３）等の巨核球コロ
ニー刺激因子 (Megakaryocyte Colony-Stimulating Fac
tor : Ｍｅｇ−ＣＳＦと略記する）活性を有する物質の
存在下に巨核球の成熟を促進するヒト由来の巨核球増幅
因子 (Megakaryocyte Potentiator 〔以下Ｍｅｇ−ＰＯ
Ｔと略記することあり〕）活性を有するポリペプチドを
コードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換ベクター、
該ベクターによる形質転換体、及び該遺伝子を用いた巨
核球増幅因子の製造方法に関する。

【０００２】本発明の遺伝子は、in vitroにおいてＩＬ
−３存在下、用量依存的に巨核球コロニーを増幅させる
作用を有する巨核球増幅因子をコードする。本発明の遺
伝子を、適当なベクターに挿入した後、常用の宿主細胞
を形質転換することにより大量に均一な巨核球増幅因子
を製造することが可能となる。このことから、本発明
は、例えば血小板減少あるいは血小板の機能低下を伴う
疾患に対して臨床上の有用性が期待される治療剤の提供
が可能となる。

【０００３】

【従来の技術】血小板は、生体の止血、血栓形成に重要
な意義を持つ血液有形成分の一つである。血小板は、骨
髄中の造血幹細胞から巨核球系前駆細胞を経て巨核芽球
となり、さらに成熟した巨核球から血液中に放出され
る。

【０００４】骨髄細胞から巨核球コロニーを形成させる
には、２種類の異なった作用を持つ因子が必要であると
考えられている(Williams,N et al.「J.Cell Physiol.
」110 . 101 (1982)) 。すなわち、それを加えるだけ
で巨核球コロニーが形成されるＭｅｇ−ＣＳＦと、それ
だけでは巨核球コロニーを形成させる活性はないが、Ｍ
ｅｇ−ＣＳＦとともに加えると巨核球コロニー数を増や
したり、その成熟を促進する作用を示すＭｅｇ−ＰＯＴ
である。

【０００５】ヒトではＭｅｇ−ＣＳＦ活性を有するもの
としてＩＬ−３(Teramura,M et al.「Exp.Hematol.」1
6, 843 (1988)) や顆粒球・マクロファージコロニー刺
激因子(Teramura,M et al.「Exp.Hematol.」17, 1011
(1989))等が知られている。また、ヒトでＭｅｇ−ＰＯ
Ｔ活性を有するものとしては、インターロイキン６(Ter
amura,M and Mizoguchi,H 「Int.J.Cell Cloning」8, 2
45 (1990))、インターロイキン１１(Teramura,M et al.
「Blood 」79, 327 (1992)) 、エリスロポエチン(Brun
o,E et al. 「Blood 」73, 671 (1989)) 等が知られて
いる。

【０００６】しかし、これらのものは巨核球・血小板系
に特異的な因子ではなく、むしろ他の血球系や血球系以
外の細胞にも作用を有していることが知られている。従
って、これらのものを医薬品として巨核球・血小板系へ
の作用を期待して投与した場合、それとは別の作用をも
発現してしまうことが危惧される。このようなことか
ら、巨核球・血小板系に特異的に作用し、医薬品として
の有用性の高い生理活性物質が望まれている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】そこで巨核球・血小板
系に作用する新規な巨核球増殖因子を見出すと同時に、
該巨核球増幅因子を医薬用途に用いるために、それを大
量に得る必要があった。巨核球増幅因子を産生細胞の培
養上清から単離する方法では、培養上清中の巨核球増幅
因子濃度が低く、均一な巨核球増幅因子を得るには複雑
な精製工程を必要とし、かつ微量にしか得られない等の
難点があった。従って上記利用目的のため、組換えＤＮ
Ａ技術を用いて、巨核球・血小板系に作用する新規な巨
核球増幅因子を大量に製造することが望まれていた。

【０００８】

【課題を解決するための手段】かかる状況において、本
発明者らは、ヒト膵臓癌細胞由来の株化細胞「ＨＰＣ−
Ｙ５」の培養上清中に巨核球増幅活性を見い出し、該培
養上清中から巨核球増幅活性を指標として目的とする新
規な巨核球増幅因子を精製し、その性状を明らかにした
（国際出願番号：ＰＣＴ／ＪＰ９２／０１６８９、国際
公開番号：ＷＯ９３／１３１３２）。

【０００９】さらに、そのアミノ酸配列の情報をもとに
オリゴヌクレオチドプライマーを合成し、「ＨＰＣ−Ｙ
５」より調製したｍＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブ
ラリーから、上記合成プライマーを用いて、ポリメラー
ゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略記する）により、巨核球増
幅因子をコードするＤＮＡ断片を得た。次いで、このＤ
ＮＡ断片をプローブとして、ｃＤＮＡライブラリーをス
クリーニングにかけ、目的とする新規な巨核球増幅因子
をコードする遺伝子を単離することに成功し、その全塩
基配列を明らかにした。

【００１０】また、この遺伝子を適当なベクターに挿入
した後、この発現ベクターにより形質転換された形質転
換体を培養し、次に、産生された目的蛋白質を分離・精
製することにより新規な巨核球増幅因子を大量に製造す
ることができることも明らかにした。

【００１１】従って、本発明は、ヒト巨核球増幅因子活
性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を提供す
る。

【００１２】本発明はさらに、ヒト巨核球増幅因子活性
を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換え
ベクターを提供する。

【００１３】本発明はまた、ヒト巨核球増幅因子活性を
有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換えベ
クターによって形質転換された原核もしくは真核宿主細
胞を提供する。

【００１４】本発明はさらに、ヒト巨核球増幅因子活性
を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換え
ベクターによって形質転換して得られた形質転換株を培
養し、産生された目的蛋白質、好ましくはヒト巨核球増
幅因子活性を有する蛋白質の製造方法を提供する。

【００１５】

【具体的な説明】巨核球増幅因子の遺伝子は、例えば巨
核球増幅因子を産生する細胞等からｍＲＮＡを調製した
後、既知の方法により二本鎖ｃＤＮＡに変換することに
より得られる。このｍＲＮＡの供給源となる細胞は、本
発明においてはヒト膵臓癌腫瘍細胞由来の株化細胞「Ｈ
ＰＣ−Ｙ５」 (Nozomi Yamaguchi et al. CANCER RESEA
RCH 50 7008 1990) 〔１９９１年１２月２７日 工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第３７０３号
（ＦＥＲＭ ＢＰ−３７０３）としてブタペスト条約に
基づき国際寄託〕を用いたが、腫瘍細胞株に限らず、哺
乳動物から分離できる細胞、あるいは樹立した他の細胞
株でもよい。

【００１６】また、ｍＲＮＡの調製は本発明においては
グアニジンチオシアネート処理後、塩化セシウム密度勾
配遠心を行い(Chirgwin et al. Biochemistry 18 5294
1979）全ＲＮＡを得たが、すでに他の生理活性蛋白の遺
伝子をクローン化する際に用いられた方法、例えばバナ
ジウム複合体等のリボヌクレアーゼインヒビター存在下
に界面活性剤処理、フェノール処理を行う (Berger & B
irkenmeier, Biochemistry, 18 5143 1979) 方法を用い
ることができる。

【００１７】全ＲＮＡからのpoly（Ａ) ⁺ＲＮＡの調製
はオリゴ（ｄＴ）を結合した担体、例えばセファロース
やセルロース等を用いたアフィニティーカラムクロマト
グラフィーかバッチ法により行うことができる。また、
ショ糖密度勾配遠心法等によりpoly（Ａ) ⁺ＲＮＡをさ
らに精製することもできる。その他、いったんＲＮＡを
調製せずに直接poly（Ａ) ⁺ＲＮＡを得る方法もある。

【００１８】上記の如くして得たｍＲＮＡから二本鎖ｃ
ＤＮＡを得るには、例えばｍＲＮＡを鋳型にして、３′
端にあるpolyＡ−鎖に相補的なオリゴ（ｄＴ）またはラ
ンダムプライマー或いは巨核球増幅因子のアミノ酸配列
の一部に相応する合成オリゴヌクレオチドをプライマー
として逆転写酵素で処理してｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ
（ｃＤＮＡ）を合成する。

【００１９】ｍＲＮＡをアルカリ処理により分解・除去
した後、得られた一本鎖ｃＤＮＡを鋳型にして逆転写酵
素あるいはＤＮＡポリメラーゼ（例えばKlenow断片等）
処理後、Ｓ１ヌクレアーゼなどで処理するか、直接ＲＮ
ａｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ等で処理すること
によっても二本鎖ｃＤＮＡを得ることができる(Maniati
s et al. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab
oratory 1982およびGubler & Hoffman, Gene 25 263 1
983)。

【００２０】巨核球増幅因子をコードするｃＤＮＡを単
離するには、例えば巨核球増幅活性を指標とするか抗体
を用いて直接発現クローニング等の方法で行うことがで
きる。

【００２１】巨核球増幅活性の測定は、ＩＬ−３存在下
で骨髄細胞を用いた軟寒天培養法を適用して実施でき
る。

【００２２】即ち、ウマ血清（５６℃ ３０分処理、 B
iocell社製）０．２ml、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ系雄
性、６〜１２週齢）大腿骨骨髄細胞浮遊液０．１ml（２
×１０⁵ 有核細胞）、組換え型マウスＩＬ−３を５ng／
ml含むIscove's Modified Dulbecco's培養液（ＩＭＤ
Ｍ）０．２ml、寒天を０．７５％含む改変McCoy's ５Ａ
培養液０．４ml、および被検検体（１０％ウマ血清を含
むＩＭＤＭで希釈したもの）０．１mlを混合して、直径
３５mmの組織培養プラスチックディッシュに入れて固ま
らせたのち、３７℃，５％炭酸ガス／９５％空気、１０
０％湿度の条件で培養を行う。

【００２３】培養６日目に寒天層ごとスライドガラス上
に取出し乾燥させ、フィルム状標本としたものを５％グ
ルタルアルデヒドで固定し、Nakeffらの方法 (Proc.So
c.Exp.Biol.Med. 151 587 1976)に従って、アセチルコ
リンエステラーゼ染色し、巨核球コロニー数の算定を行
う。この際、アセチルコリンエステラーゼ染色陽性細胞
を４個以上含む集塊を巨核球コロニーとする。検鏡の倍
率は４０倍である。なお、Ｍｅｇ−ＰＯＴ活性は、被検
検体を添加して生じた巨核球コロニー数と被検検体を添
加せずに（１０％ウマ血清を含むＩＭＤＭのみ添加）組
換え型ＩＬ−３単独で生じた巨核球コロニー数との差を
指標とする。

【００２４】本発明者らは、巨核球増幅因子を産生する
株化細胞の培養上清から巨核球増幅因子を単離精製し、
そのアミノ酸配列の情報をもとにプライマーを合成し、
ＰＣＲを用いて、ヒト由来巨核球増幅活性を有するポリ
ペプチドをコードする遺伝子断片をクローニングした。
そのＤＮＡをプローブとして既知の方法によりｃＤＮＡ
ライブラリーから目的とする新規な巨核球増幅因子をコ
ードする完全長ｃＤＮＡを含むクローンをスクリーニン
グした。

【００２５】なお、これらのｃＤＮＡをpBlue script S
K(-)のEcoRI, XhoI 切断部位間に挿入したｐＫＰＯ２７
を含有する大腸菌(E. coli) ＪＭ１０９株、およびｐＫ
ＰＯ２１を含有する大腸菌(E. coli）ＪＭ１０９株は、
工業技術院微生物工業技術研究所に、各々、平成４年１
０月１２日に微工研条寄第４０２９号（ＦＥＲＭ ＢＰ
−４０２９）、平成４年１１月１０日に微工研条寄第４
０７１号（ＦＥＲＭＢＰ−４０７１）としてブタペスト
条約に基づき国際寄託されている。

【００２６】また、本発明で用いたＰＣＲを繰り返し行
うことで、完全長のｃＤＮＡを得ることもできる。ま
た、ＰＣＲによらずアミノ酸配列の情報からプローブを
合成し、直接ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
し、目的とするｃＤＮＡを得ることもできる。

【００２７】このようにして、クローン化された巨核球
増幅因子をコードする遺伝子は適当なベクターＤＮＡに
組み込むことにより、他の原核細胞または真核細胞の宿
主細胞を形質転換させることができる。

【００２８】さらに、これらのベクターに適当なプロモ
ーターおよび形質発現に係る配列を導入することによ
り、それぞれの宿主細胞において遺伝子を発現すること
が可能である。また、目的とする遺伝子に他のポリペプ
チドをコードする遺伝子を連結して、融合蛋白質として
発現させ、精製を容易にしたり、発現量を上げ、精製工
程中で適当な処理をほどこすことにより、目的とする蛋
白質を切り出すことも可能である。また、連結する遺伝
子を他の生理活性因子のものを用い融合蛋白質のまま、
巨核球増幅活性を増強するような試みも可能である。

【００２９】一般に、真核生物の遺伝子はヒトインター
フェロン遺伝子等で知られているように、多形現象を示
すと考えられ（例えば、 Nishi等、 J.Biochem. 97 153
1985)、この多形現象によって１個またはそれ以上のア
ミノ酸が置換される場合もあれば、塩基配列の変化はあ
ってもアミノ酸は全く変わらない場合もある。

【００３０】また、配列番号１２もしくは１３のアミノ
酸配列の中の１個またはそれ以上のアミノ酸を欠くかま
たは付加したポリペプチドあるいはアミノ酸が１個もし
くはそれ以上のアミノ酸で置換されたポリペプチドでも
巨核球増幅活性を有することがある。例えば、ヒトイン
ターロイキン２（ＩＬ−２）遺伝子のシステインに相当
する塩基配列をセリンに相当する配列に変換して得られ
たポリペプチドがＩＬ−２活性を保持することも既に公
知となっている (Wang等、Science, 224 14311984）。

【００３１】また、真核細胞で発現させた場合その多く
は糖鎖が付加されるが、アミノ酸を１ないしそれ以上変
換することにより糖鎖付加を調節することができるがこ
の場合も、巨核球増幅活性を有することがある。それゆ
え、本発明における巨核球増幅因子の遺伝子を人工的に
改変したものを用いて得られたポリペプチドをコードす
る遺伝子は全て本発明に含まれる。その際、無作為にア
ミノ酸を変換したポリペプチドをコードする遺伝子を作
製することもできるが、例えば、ヒト以外の動物種（マ
ウス、ラット、サル等）の巨核球増幅因子活性を有する
タンパク質のアミノ酸配列を参考にして塩基配列を置
換、欠除して種々の修飾体をコードする遺伝子を作製す
ることも可能である。

【００３２】さらに、得られたポリペプチドが巨核球増
殖活性を有し、配列番号１２もしくは１３に示されたア
ミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする遺伝子とハ
イブリダイズする遺伝子も本発明に含まれる。なお、ハ
イブリダイゼーション条件は、通常行われているプロー
ブハイブリダイゼーションの条件を適用することもでき
る（例えばMolecular Cloning : A Laboratory Manual,
Sambrook ら、Cold spring Habor Laboratory Press,
1989) 。

【００３３】本発明の発現ベクターは、複製起源、選択
マーカー、発現させようとする遺伝子の前に位置するプ
ロモーター、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化シ
グナルなどを含んでいる。

【００３４】哺乳動物細胞における遺伝子発現のプロモ
ーターとしてはレトロウイルス、ポリオーマウイルス、
アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）な
どのウイルスプロモーターやヒト・ポリペプチド・チェ
ーン・エロンゲーション・ファクター１α（ＨＥＦ−１
α）などの細胞由来のプロモーターを用いればよい。例
えばＳＶ４０のプロモーターを使用する場合は、Mullig
anなどの方法(Nature277 108 (1979)) に従えば容易に
実施することができる。

【００３５】複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマ
ウイルス、アデノウイルス、牛パピローマウイルス（Ｂ
ＰＶ）等の由来のものを用いることができ、選択マーカ
ーとしては、ホスホトランスフェラーゼＡＰＨ（３′）
IIあるいはＩ(neo) 遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）
遺伝子、大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシルト
ランスフェラーゼ（Ecogpt) 遺伝子、ジヒドロ葉酸還元
酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子等を用いることができる。

【００３６】また、原核宿主細胞、例えば大腸菌の場合
には、それを宿主とするベクターであるｐＢＲ３２２を
用いて形質転換することができる(Boliver等 : Gene ２
95(1975)) 。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテト
ラサイクリン耐性の遺伝子を含んでおり、どちらかの耐
性を利用することによって形質転換細胞を同定すること
ができる。原核生物宿主の遺伝子発現に必要なプロモー
ターとしては、β−ラクタマーゼ遺伝子のプロモーター
(Chang等：Nature 275 615 (1978))、やラクトースプロ
モーター(Goeddel等 : Nature 281 544 (1979)) および
トリプトファンプロモーター(Goeddel等 : Nucleic Aci
d Res.８ 4057 (1980)) ，ｔａｃプロモーター等があげ
られ、どのプロモーターも本発明のヒト巨核球増幅因子
の発現に使用できる。

【００３７】本発明の発現系に用いる宿主のうち原核生
物宿主細胞としては、例えば、大腸菌 (Escherichia
coli) 、バシルス・ズブチリス (Bacillus subtilis)
、バシルス・サーモフィルス（Bacillus thermophilu
s) 等が挙げられる。また真核生物のうち、真核微生物
の宿主細胞としては、例えばサッカロミセス・セレビシ
エー（Saccharomyces cerevisiae）等が挙げられ、哺
乳動物由来の宿主細胞としては、例えばＣＯＳ細胞、チ
ャイニーズ ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃ１２７
細胞、３Ｔ３細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＢＨＫ細胞、ナバル
バ細胞などが挙げられる。なお、本発明の形質転換体の
培養は、宿主細胞に適した培養条件を適宜選択して行え
ばよい。

【００３８】以上のようにして目的とする巨核球増幅因
子をコードする遺伝子で形質転換した形質転換体を培養
し、産生した巨核球増幅因子は、細胞内または細胞外か
ら分離し均一にまで精製することができる。

【００３９】なお、本発明の目的蛋白質であるヒト巨核
球増幅因子の分離・精製は、通常の蛋白質で用いられる
分離・精製方法を使用すればよく、何ら限定されるもの
ではない。例えば各種クロマトグラフィー、限外濾過、
塩折、透析等を適宜選択、組合せれば、ヒト巨核球増幅
因子は分離・精製することができる。

【００４０】

【実施例】本発明の巨核球増幅因子をコードする遺伝子
を得る方法、該遺伝子を有する組換えベクター及びこれ
を含有する形質転換体並びにこの形質転換体を培養し取
得した目的の蛋白質、並びに夫々の製造方法について、
以下の実施例によって詳細に説明するが、この実施例に
よって本発明が限定されるものではない。

【００４１】実施例１．Ｍｅｇ−ＰＯＴ産生細胞株ＨＰ
Ｃ−Ｙ５の樹立 膵臓癌患者のリンパ節より得られた腫瘍を１０％ウシ胎
児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用い、
炭酸ガスインキュベーター（炭酸ガス濃度５％、湿度１
００％）中にて培養することにより樹立した。この細胞
株を１％ＦＢＳ含有Ham's Ｆ１０培地に順化させ、さら
にＦＢＳ濃度を徐々に低下させ、最終的に蛋白不含のHa
m's Ｆ１０培地中にて増殖し得るまで順化させた。本細
胞株はプラスチックディッシュ上で単層状に増殖し、倍
化時間は約３３時間であった (Nozomi Yamaguchi et a
l. CANCER RESEARCH 50 7008 1990）。この細胞株をＨ
ＰＣ−Ｙ５細胞と称する。

【００４２】実施例２．ＨＰＣ−Ｙ５の継代培養および
ローラーボトルによる大量培養 実施例１で述べたＨＰＣ−Ｙ５細胞の継代培養は以下に
示す如く行った。プラスチック培養フラスコ（１５０cm
², Corning社製）を用い、１０^-8Ｍ亜セレンナトリウ
ム、１００Ｕ／mlペニシリンＧカリウムおよび１００μ
ｇ／ml）硫酸カナマイシンを含む Ham's Nutrient Mixt
ure Ｆ１２培地５０ml中でＨＰＣ−Ｙ５細胞を培養し、
４日毎に培養液を交換した。

【００４３】細胞継代時に培養液を除去し、あらかじめ
３７℃に加温した０．１２５％トリプシン（ＧＩＢＣＯ
社製）、０．０１％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）（和光純薬社製）を含むカルシウム，マグネシウム
不含Dulbecco's Phosphate-buffered saline(ＰＢＳ）
溶液を加え３７℃で５分間加温した。ピペッティング操
作により細胞を剥離し、１５ml容量のプラスチック製遠
心管に細胞を移し、１５００回転／分、５分間の遠心に
より細胞を回収した。細胞を上記培地に懸濁し、新しい
フラスコ４〜５本に継代した。一晩静置後、培養液を非
付着性細胞と共に除去し、新たに上記培地を加えて培養
を継続した。以後４日毎に培養液を交換した。

【００４４】また、実施例３で述べるＭｅｇ−ＰＯＴの
精製に供するためのＨＰＣ−Ｙ５細胞のローラーボトル
による大量培養を以下の如く実施した。

【００４５】上記の如く継代されたＨＰＣ−Ｙ５細胞が
完全に密に増殖した１５０cm² のプラスチック培養フラ
スコより上記の如くトリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞
を回収し、これを０．２％ウシ胎児血清(Hyclone社製)
を含有する上記培地２５０mlに浮遊させ、１７００cm²
のプラスチック製ローラーボトル(Corning社製）に移
し、０．５回転／分の速度で回転培養を行った。７日後
に培養液を血清を含まない上記培地に交換し、以後４日
毎に上記無血清培地の交換を行うことにより、精製用無
血清培養上清を回収した。

【００４６】実施例３．ＨＰＣ−Ｙ５株培養上清からの
Ｍｅｇ−ＰＯＴの精製 実施例２で述べた方法に従って得たＨＰＣ−Ｙ５細胞の
培養上清（２７．３リットル）にTween ２０を終濃度
０．０１％となるように加えた後、人工腎臓ＰＡＮ１２
００（旭メディカ）を用いて、約２００倍に濃縮した。
濃縮液を０．０１％Tween ２０を含む１０mM酢酸緩衝液
（pH５．０）に対し、４℃で一晩透析した。透析内液に
遠心操作（１００００×ｇ，６０分）を施し不溶物を除
去し上清を以下の精製に用いた。

【００４７】（ステップ−１） Ｓ−Sepharose イオン
交換クロマトグラフィー 上述の遠心上清を０．０１％Tween ２０を含む２０mM酢
酸緩衝液（pH５．０）で平衡化したＳ−Sepharose Fast
Flow (Pharmacia社製）カラム（５×１０cm）に添加し
た。同緩衝液でカラムを洗浄した後、同緩衝液中、Ｎａ
Ｃｌの濃度を０．１５Ｍ，０．５Ｍ及び１．０Ｍと順次
上げて吸着蛋白質を溶出した。素通り画分、洗浄画分お
よび各塩濃度における溶出画分について前述の方法に従
って活性を測定した結果、０．１５Ｍ−ＮａＣｌ溶出画
分にＭｅｇ−ＰＯＴ活性が認められた。

【００４８】（ステップ−２） ＤＥＡＥ−Sepharose
イオン交換クロマトグラフィー ステップ−１で得た活性画分を０．０１％Tween ２０を
含む１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）に対し４℃
で一晩透析した。透析内液を同緩衝液で平衡化したＤＥ
ＡＥ−Sepharose Fast Flow (Pharmacia社製）カラム
（２．２×１３cm）に添加し、同緩衝液でカラムを洗浄
した。同緩衝液中ＮａＣｌの濃度を０．１５Ｍ，０．５
Ｍおよび１．０Ｍと順次上げて吸着蛋白質を溶出した。
素通り画分、洗浄画分および各塩濃度における溶出画分
について前述の方法に従って活性を測定した結果、０．
１５Ｍ−ＮａＣｌ溶出画分にＭｅｇ−ＰＯＴ活性が認め
られた。

【００４９】（ステップ−３） 逆相ＨＰＬＣ（Ｉ） ステップ−２で得た活性画分に５％トリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）を加えてpHを約２に調整し、０．１％ＴＦＡ
を含む５％アセトニトリルで平衡化した逆相ＨＰＬＣカ
ラム (Protein Ｃ４，１０×２５０mm， Vydac社製）に
流速１．０ml／分で添加した。吸着蛋白質はアセトニト
リルの直線濃度勾配（５％→６５％、１２０分、０．５
％アセトニトリル／分）により流速１．０ml／分で溶出
した。溶出蛋白質の検出は２２０nmおよび２８０nmにお
ける吸光度を追跡することにより行い、１mlずつ分画し
た。各画分について活性測定を行った結果、アセトニト
リル濃度４０−４５％の画分にＭｅｇ−ＰＯＴ活性が認
められた。

【００５０】（ステップ−４） 逆相ＨＰＬＣ（II） ステップ−３で得た活性画分を０．１％ＴＦＡで２倍希
釈し、０．１％ＴＦＡを含む３５％アセトニトリルで平
衡化した逆相ＨＰＬＣカラム (Protein Ｃ４，４．６×
２５０mm， Vydac社製）に流速１．０ml／分で添加し
た。吸着蛋白質はアセトニトリルの直線濃度勾配（３５
％→５０％、７５分、０．２％アセトニトリル／分）に
より流速１．０ml／分で溶出した。溶出蛋白質の検出は
２２０nmおよび２８０nmの吸光度を追跡することにより
行い、１mlずつ分画した。各画分について活性測定を行
った結果、アセトニトリル濃度４０−４５％の画分にＭ
ｅｇ−ＰＯＴ活性が認められた。

【００５１】 （ステップ−５） ＤＥＡＥ・イオン交換ＨＰＬＣ ステップ−４で得た活性画分を凍結乾燥した後、０．０
１％Tween ２０を含む１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH
８．０）に溶解し、同緩衝液で平衡化したProtein Pak
Ｇ−ＤＥＡＥカラム (Waters社製、８．２×７５mm）に
流速０．７ml／分で添加した。吸着蛋白質はＮａＣｌの
直線濃度勾配（０．０Ｍ→０．２Ｍ、４０分、５mM Ｎ
ａＣｌ／分）により流速０．７ml／分で溶出した。溶出
蛋白質は２２０nmで検出し、０．７mlずつ分画した。各
画分について活性を測定した結果、ＮａＣｌ濃度７５mM
以下の画分にＭｅｇ−ＰＯＴ活性が認められた。

【００５２】（ステップ−６） ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０
００ＳＷゲル濾過 ステップ−５で得た活性画分を、０．０１％Tween ２０
及び０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０mlトリス−塩酸緩
衝液（pH７．４）で平衡化したＴＳＫｇｅｌＧ３０００
ＳＷカラム（東ソー社製 ２１．５×６００nm、ガード
カラム２１．５×７５nm）に流速３ml／分でカラムに流
し、溶出蛋白質は２２０nmで検出した。３mlずつ分画し
た各画分について、活性測定した結果、Ｍｅｇ−ＰＯＴ
活性は溶出時間４９〜５４分の画分に認められたので、
その画分を回収した。

【００５３】（ステップ−７） 逆相ＨＰＬＣ（III) ステップ−６で得た活性画分を５％ＴＦＡを加えてpHを
約２に調整し、ステップ−４の逆相ＨＰＬＣ（II）と同
一条件下にクロマトグラフィーを行った。各画分につい
て活性を測定した結果、主ピーク（アセトニトリル濃度
４０％−４５％）にＭｅｇ−ＰＯＴ活性が認められた。
この結果を図１に示す。図１において横棒で示す画分を
精製Ｍｅｇ−ＰＯＴとして回収した。

【００５４】実施例４．巨核球増幅因子（Ｍｅｇ−ＰＯ
Ｔ）のアミノ酸配列 （ｉ）Ｎ末端アミノ酸配列の決定 実施例３で得た精製Ｍｅｇ−ＰＯＴ試料を気相式プロテ
インシークエンサー４７０Ａ型（Applied Biosystems社
製）を用いてエドマン分解を行い、得られたフェニルチ
オヒダントイン（ＰＴＨ）−アミノ酸をＰＴＨアナライ
ザー１２０型（Applied Biosystems社製）を用いて同定
した。その結果、Ｎ末端近傍のアミノ酸配列（配列−１
〜３）は以下に示す３種が認められた。

【００５５】

【表１】 配列−１ （配列番号：１） Leu Ala Gly Glu Xaa Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu 1 5 10 15 （なお、Ｘａａは未同定のアミノ酸を示す。以下同じ。） 配列−２ （配列番号：２） Ala Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu Ala 1 5 10 15 配列−３ （配列番号：３） Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu Ala Asn 1 5 10 15 （配列の下に示す数字はエドマン分解時のサイクル数である） 上記配列−１〜配列−３のアミノ酸配列において以下の
アミノ酸配列が共通していることが認められた。

【００５６】Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Le
u Asp Gly Val Leu （配列番号：４）。

【００５７】 （ii）エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ消化 試料を０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム緩衝液（pH７．
８）に溶解し、尿素およびジチオスライトール（ＤＴ
Ｔ）をそれぞれ終濃度が、７．８Ｍおよび５０mMとなる
ように加え、３７℃で２時間インキュベートした。そこ
に、 Endo Ｇｌｕ−Ｃ(Boehringer-Mannheim社製) を
０．５μｇ加え、３７℃で２時間反応させた後、さらに
同量の酵素を加え、再度３７℃で１８時間反応させた。
反応液に１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えてpH
を２とした後、０．１％ＴＦＡで平衡化したＣ１８カラ
ム（４．６×２５cm， Vydac社製）にかけた。

【００５８】ペプチドの溶出は０．１％ＴＦＡ中、アセ
トニトリルの濃度を１２８分間に０から６４％まで、そ
の後１６分間に８０％まで直線的に上げて行った。ペプ
チドは２２０nmおよび２８０nmの二波長で検出した。得
られた部分消化ペプチド断片について順次、気相式プロ
テインシークエンサー４７３Ａ型 (Applied Biosystems
社製) を用いてアミノ酸配列を分析した。

【００５９】その結果、部分消化断片のうちのひとつは
以下に示す配列を有することがわかった。

【００６０】Leu-Ala-Val-Ala-Leu-Ala-Gln-Lys-Asn-Va
l-Lys-Leu-Ser-Thr-Glu-Gln-Leu-Arg-Xaa-Leu-Ala-His-
Arg-Leu-Ser-Glu-Pro-Pro-Glu-Asp-Leu-Asp-Ala-Leu-Pr
o- - -（配列番号５）。

【００６１】実施例５．ＨＰＣ−Ｙ５細胞からのpoly
（Ａ） ⁺ＲＮＡの調製 ＨＰＣ−Ｙ５細胞からChirgwin等 (Biochemistry, 18 5
294 (1979)) により記載されている方法に従って全ＲＮ
Ａを調製した。すなわち、約１×１０⁹ 個のＨＰＣ−Ｙ
５細胞を４９mlの３１．２５mMクエン酸ナトリウム及び
０．６２５％ラウリルサルコシンナトリウムを含む５Ｍ
グアニジンチオシアネート(Fulka社製)溶液中で完全に
ホモジナイズした。ホモジネートを遠心管中の０．１Ｍ
ＥＤＴＡを含む５．３Ｍ塩化セシウム溶液層上に重層
し、次にこれをＳＷ４０ローター(Beckman社製) で３
１，０００rpm にて２０℃で１７時間遠心分離すること
によりＲＮＡを沈澱させた。

【００６２】ＲＮＡ沈澱物を８０％エタノールにて洗浄
し、１mM ＥＤＴＡ及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）を含有する１０mMトリス塩酸緩衝液（pH
７．５）２．４ml中に溶解し、プロナーゼ(Boehringer
Mannheim社製) を０．５mg／mlとなるように添加した
後、３７℃にて２０分間保温した。ＲＮＡ溶液をフェノ
ール処理することにより蛋白質を除いた。溶液中の残存
フェノールをクロロホルムで抽出した後、ＲＮＡをエタ
ノールで沈澱させた。

【００６３】全ＲＮＡからpoly（Ａ） ⁺ＲＮＡをoligo
(dT) cellulose spun columnからなるｍＲＮＡ Separat
or(Clontech laboratories社製）を用いて精製した。キ
ット添付の処方に従って、二度精製を繰り返すことによ
り精製度を高めた。

【００６４】上記操作を２回行い、それぞれ３７μｇ及
び１９０μｇのpoly（Ａ） ⁺ＲＮＡを得た。

【００６５】実施例６ ．ＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラリーの構築 上記poly（Ａ） ⁺ＲＮＡ １０μｇを材料としてｃＤＮ
Ａ合成キットｃ−CLONE (Clontech laboratories社製）
を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成し末端にはＥｃｏＲＩリ
ンカーを付着した。遊離のＥｃｏＲＩリンカーはアガロ
ースゲル電気泳動にて分離した後、６００塩基対以上の
長さを持つｃＤＮＡはGeneluter(Invitrogen社製) を用
いた電気溶出により回収した。このリンカー付加二本鎖
ｃＤＮＡと予めＥｃｏＲＩ及びアルカリフォスファター
ゼ（宝酒造社製）処理したλＺＡＰIIベクター (Strata
gene社製) とを、７mM塩化マグネシウム、１mM ＤＴ
Ｔ，１mM ＡＴＰ及び２単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造社製）を含む５０mMトリス塩酸緩衝液（pH７．
５）中で４℃にて２４時間保温して連結した。

【００６６】これをGigapack Gold II packaging extra
ct (Stratagene社製) を用いてパッケージングし、ＨＰ
Ｃ−Ｙ５細胞のｃＤＮＡライブラリーを構築した。さら
にこのライブラリーを７つのプール（Ａ−Ｇ）に分け、
増幅し、５．８ｇ／ｌ塩化ナトリウム、２ｇ／ｌ硫酸マ
グネシウム・７水和物および０．０１％ゼラチンを含む
５０mMトリス塩酸緩衝液（pH７．５）中に回収した。

【００６７】実施例７．ＰＣＲによるクローニング λＺＡＰIIのＥｃｏＲＩサイト近傍のＴ７プロモーター
配列のプライマーＴ７，Ｔ３プロモーター近傍配列のプ
ライマーＴ３−２及び本因子のＮ末端近傍の部分アミノ
酸配列 Gly-Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-Alaをコードする遺伝
子として可能性のある全てのコドンを含むミックスプラ
イマーＮ１を３８１Ａ ＤＮＡ Synthesizer(Applied
Biosystems社製) 用いて合成した。

【００６８】さらに実施例４（ii）に示したように、本
因子の Endo Ｇｌｕ−Ｃ断片（配列番号５）中に Ala-G
ln-Lys-Asn-Val-Lys-Leu-Ser-Thr-Glu-Gln-Leu-Arg-Xaa
-Leu-Ala-His-Arg-Leu-Ser- Glu-Pro-Pro-Glu-Asp-Leu-
Asp-Ala という比較的コドンusage の低い配列（下線
部）が見いだされたため、このアミノ酸配列をもとにこ
れらをコードする遺伝子として可能性のある全ての塩基
配列を含むミックスプライマーＫ４Ｓ及びＫ４−２Ａも
同様に合成した。これらプライマーの塩基配列を以下に
示す。

【００６９】Ｔ７：５′−TAATACGACTCACTATAGGG−３′ Ｔ３−２：５′−CATGATTACGCCAAGCTCGAA −３′ Ｎ１：５′−GG(GATC)GA(GA)AC(GATC)GG(GATC)CA(GA)GA
(GA)GC−３′（センス） Ｋ４Ｓ：５′−GC(GATC)CA(AG)AA(AG)AA(TC)GT(GATC)AA
(AG)(TC)T −３′（センス） Ｋ４−２Ａ：５′−GC(GA)TC〔(GATC)AG or (TC)AA〕(A
G)TC(TC)TC(GATC)GG(GATC)GG(TC)TC−３′（アンチセン
ス） 増幅したｃＤＮＡライブラリーの７つのプールのファー
ジ懸濁液に、プロナーゼ、ＥＤＴＡ、およびＳＤＳを、
それぞれ終濃度が０．５mg／ml，２０mM，０．５％とな
るように加え、３７℃で１時間保温した。この溶液から
フェノール処理により蛋白質を除き、続いてクロロホル
ムでフェノールを抽出した後、ＤＮＡをエタノールで沈
澱させた。このようにして精製したＤＮＡを鋳型として
ＤＮＡ Thermal Cycler(Perkin Elmer Cetus社製) を用
いて一段階目のＰＣＲを行った。

【００７０】ライブラリーＤＮＡ ５００ngを１０mMト
リス塩酸緩衝液（pH８．３）、５０mM塩化カリウム、
１．５mM塩化マグネシウム、０．０１％ゼラチン、１０
０μＭデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）及び
プライマーＴ７とＮ１それぞれ１μＭを含む５０μｌの
ＰＣＲ反応溶液中で増幅した。まず９５℃で７分間変性
後、８５℃に冷却し１．２５単位のAmpliTaq DNAポリメ
ラーゼ（Perkin Elmer Cetus社製) を加えた。その後、
変性９４℃ １分間、アニール６０℃ １分間、伸長７
２℃ ２分間の４０サイクルのＰＣＲを行なった。さら
にこれらのＰＣＲ反応液の１／２０量に対してプライマ
ーＫ４Ｓ及びＫ４−２Ａを用いて上記と同様の条件で二
段階目のＰＣＲを行なった。

【００７１】二段階目のＰＣＲ反応液を１２％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動で分析し、増幅された８４bpの
ＤＮＡ断片を含むゲル部分を切出し０．１％ＳＤＳ，１
０mM酢酸マグネシウム、０．１mM ＥＤＴＡを含む５０
０mM酢酸ナトリウム中で破砕し、３７℃で１６時間保温
してＤＮＡを抽出した。エタノールで沈殿させたＤＮＡ
を１mMスベルミジン、０．１mM ＥＤＴＡを含む２０mM
トリス塩酸緩衝液（pH９．５）７５μｌに溶解し９０℃
で２分間加熱後、急冷し１００mM ２−メルカプトエタ
ノール、１００mM塩化マグネシウムを含む５００mMトリ
ス塩酸緩衝液（pH９．５）を１０μｌ、１０mM ＡＴＰ
を１３μｌ、ポリヌクレオチド キナーゼ (東洋紡社
製）を２０単位添加後３７℃ １時間反応させて５′端
をリン酸化した。

【００７２】ＤＮＡ溶液をフェノール処理することによ
り蛋白質を除いた。溶液中の残存フェノールをクロロホ
ルムで抽出した後、ＤＮＡをエタノールで沈澱させた。
制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）及びアルカリフォスフ
ァターゼ（宝酒造社製）で処理したベクターｐＳＰ７３
(Promega社製）とこのＤＮＡ試料を７mM塩化マグネシウ
ム、１mM ＤＴＴ，１mM ＡＴＰ及び２単位のＴ４ Ｄ
ＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を含む５０mMトリス塩酸緩
衝液（pH７．５）２０μｌ中で１６℃にて１６時間保温
して連結した。

【００７３】次に上記連結混合物のうち１０μｌを大腸
菌ＪＭ１０９のコンピテント細胞１００μｌに加え、氷
上で３０分間、４２℃にて１分間そして再び氷上で１分
間静置した。次いで４００μｌのＳＯＣ培地 (Molecula
r Cloning: A Laboratory Manual, Sambrookら、Cold S
pring Harbor Laboratory Press, 1989)を加え、３７℃
にて３０分間保温した後５０μｇ／mlのアンピシリンを
含むＬＢ寒天培地 (Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989)上にこの大腸菌を広げ、３７℃にて１６時
間保温して大腸菌形質転換体を得た。

【００７４】現われた形質転換体のうち５クローンにつ
いてそれぞれを５０μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢ
培地５ml中で３７℃にて１６時間培養し、その培養物か
らアルカリ法 (Molecular Cloning: A Laboratory Manu
al, Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s, 1989)にてプラスミドＤＮＡを調製した。それぞれの
挿入塩基配列をSequenase Version 2.0 (United States
Biochemical社製) を用いてジデオキシ・シーケンシン
グ法にて決定したところ、配列番号６に示したようにプ
ライマーＫ４Ｓ及びＫ４−２Ａに挟まれた４０塩基対の
配列が明らかとなった。

【００７５】この塩基配列をもとにセンス・プライマー
７Ｄ−１Ｓ：５′−CTCTCAACAGAGCAGCTGCG−３′及び７
Ｄ−３Ｓ：５′−CTGGCTCACCGGCTCTCTGA−３′とアンチ
センス・プライマー７Ｄ−１Ａ：５′−AGAGCCGGTGAGCC
AGACAG−３′及び７Ｄ−２Ａ：５′−GCGCAGCTGCTCTGTT
GAGA−３′を合成した。上記と同様の条件でライブラリ
ーＤＮＡを鋳型にＴ７と７Ｄ−１Ｓ及びＴ３−２と７Ｄ
−１Ａの組合せで一段階目のＰＣＲを行なった。さらに
二段階目のＰＣＲをそれぞれプライマーＴ７と７Ｄ−３
Ｓ及びＴ３−２と７Ｄ−２Ａの組合せで行なった。

【００７６】ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動
で分析し、増幅されたＤＮＡ断片を含むゲル部分を切出
し、Sephaglas BandPrep Kit(Pharmacia社製) を用いて
ＤＮＡを抽出した。これらのＤＮＡについてfmol DNA S
equencing System(Promega社製) を用いて直接塩基配列
を決定したところ、配列番号７及び８に示したように本
因子をコードする遺伝子の一部が確認された。

【００７７】この塩基配列をもとにセンス・プライマー
３ＡＳ１：５′−AACTCCTTGGCTTCCCGTGTG −３′とアン
チセンス・プライマー７ＳＡ１−５′−CGCATCTGGGTTGA
GGAATAG −３′を合成し、上記の条件でプールＤについ
てＰＣＲを行なったところ１９７塩基対（配列番号９）
のＤＮＡ断片の増幅が確認され、このＤＮＡ断片がコー
ドするアミノ酸配列は実施例３で得た精製Ｍｅｇ−ＰＯ
Ｔを用いて決定したアミノ酸配列と一致した。このＤＮ
Ａ断片（Ｑ１９７Ａ）を以下のスクリーニングにプロー
ブとして用いた。

【００７８】実施例８．ｃＤＮＡライブラリーのプロー
ブＱ１９７Ａによるスクリーニング 実施例５で得られたpoly（Ａ） ⁺ＲＮＡ ５μｇを材料
としてＺＡＰ−ｃＤＮＡ SYNTHESIS KIT (Stratagene社
製) を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成し、λＺＡＰIIベク
ター (Stratagene社製) のアームに連結した。これをGi
gapack Gold IIpackaging extract (Stratagene社製)
を用いてパッケージングし、新たにＨＰＣ−Ｙ５細胞の
ｃＤＮＡライブラリーを構築した。

【００７９】実施例７のＰＣＲで増幅された１９７bpの
ＤＮＡをアクリルアミドゲル電気泳動後ゲルから回収
し、このＤＮＡ断片Ｑ１９７ＡをランダムプライマーＤ
ＮＡラベリングキット (宝酒造社製) を用いて³²Ｐで標
識した。但し、添付のランダムプライマーの代りにプラ
イマー３ＡＳ１及び７ＳＡ１を４００nMの濃度で用い標
識した。遊離のｄＮＴＰはＮＩＣＫ−Column(Pharmacia
社製) に通搭して除いた。次に、Bentonと Davisの方法
(Science 196, 180, 1977)に準じてプラークハイブリダ
イゼーションを行なった。

【００８０】ファージプラークの生じた寒天培地上にHy
bond−Ｎ＋フィルター (Amersham社製）をのせてファー
ジを移し、以下の順序でフィルターを処理した。１．５
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶
液にて５分間ＤＮＡを変性させ、１．５Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で１分間続い
て１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍトリス塩酸緩
衝液（pH７．４）で１分間２回、最後に２×ＳＳＣＰ
（２４０mM ＮａＣｌ，３０mM Ｎａ₃ citrate,２６mM
ＫＨ₂ ＰＯ₄,２mM ＥＤＴＡ）で１分間処理した。

【００８１】次いでフィルターを乾燥し、０．４Ｎ水酸
化ナトリウム水溶液で２０分間、５×ＳＳＰＥ（Molecu
lar Cloning: A Laboratory Manual, Sambrookら、Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989)で１分間２回
処理した。５０％ホルムアミド，５×ＳＳＰＥ，５×De
nhardt's Solution(Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1989)，０．１％ＳＤＳ及び０．１mg／ml変性Ｄ
ＮＡ（鮭精巣ＤＮＡ, Boehringer Mannheim 社製）を含
むプレハイブリダイゼーション溶液中で４２℃，４時間
保温した。

【００８２】上記の様にして標識したＱ１９７Ａプロー
ブを含むハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムア
ミド, ５×ＳＳＰＥ，５×Denhardt's Solution, ０．
１mg／ml変性ＤＮＡ（鮭精巣ＤＮＡ），０．１％ＳＤ
Ｓ）中で４２℃にて１６時間ハイブリダイゼーションを
行なった。フィルターを室温下に０．０５％ＳＤＳを含
む２×ＳＳＣで１時間２回洗浄し、次いで６８℃で０．
１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣで１時間２回、さらに６８
℃で０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣで１時間洗浄
した後、オートラジオグラフィーで検出した。

【００８３】その結果、２３個の陽性ファージクローン
が得られた。得られたファージクローンのうち完全長ｃ
ＤＮＡを含むと思われるクローンについてヘルパーファ
ージＲ４０８を用いてプラスミドへの切出しをＺＡＰ−
ｃＤＮＡ SYNTHESIS KIT (Stratagene社製) 添付の処方
に従って行なった。得られたプラスミドｐＫＰＯ２７
（図２）についてクローン化ＤＮＡの塩基配列をSequen
ase Version 2.0 (United States Biochemical社製) を
用いてジデオキシ・シーケンシング法にて調べたとこ
ろ、配列番号１０に示す塩基配列が得られた。また、他
のプラスミドｐＫＰＯ２１についてクローン化ＤＮＡの
塩基配列を同様の方法で調べたところ、配列番号１０に
示す塩基配列の内、１８７３番目のＧ（グアニン）がＡ
（アデニン）に変化しており（従って５９３番目のＶａ
ｌ（バリン）がＭｅｔ（メチオニン）に変化してい
る）、配列の他の部分はｐＫＰＯ２７のそれと同一であ
った。

【００８４】これらの塩基配列およびそれらによりコー
ドされているアミノ酸配列をGen Bank Re 1.71により調
査したところ、塩基配列及びアミノ酸配列はいずれも新
規であることが確認された。

【００８５】なお、前記プラスミドｐＫＰＯ２７を含有
する大腸菌はEscherichia coli JM109 (pKPO27) 、およ
びプラスミドｐＫＰＯ２１を含有する大腸菌はEscheric
hiacoli JM109 (pKPO21) として工業技術院微生物工業
技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、各
々、平成４年１０月１２日に微工研条寄第４０２９号
（ＦＥＲＭ ＢＰ−４０２９）、および平成４年１１月
１０日に微工研条寄第４０７１号（ＦＥＲＭ ＢＰ−４
０７１）としてブダペスト条約に基き国際寄託された。

【００８６】実施例９．ｐＲＶＨＫＰＯ２７ベクターの
構築（動物細胞用） 実施例８で得られたｐＫＰＯ２７を１０mM ＭｇＣｌ
₂ ，１mM ＤＴＴ，１００mM ＮａＣｌを含む２０mMト
リス塩酸緩衝液（pH７．５）中３７℃にて制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ（宝酒造社製）で２時間処理しエタノール沈殿と
してＤＮＡを回収し、さらに１０mM ＭｇＣｌ₂ ，１mM
ＤＴＴ，１００mM ＫＣｌを含む２０mMトリス塩酸緩
衝液（pH８．５）中３７℃にて制限酵素ＢａｍＨＩ（宝
酒造社製）で２時間処理した後、アガロースゲル電気泳
動を行ない１．８ｋbp のＤＮＡ断片を回収した。

【００８７】ベクターＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１を上記と
同様に制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにて処理した
後アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）を加えて６
５℃にて２時間保温することにより脱リン酸してアガロ
ースゲル電気泳動を行ない回収した８．７kbp ＤＮＡを
先の１．８kbp のＤＮＡ断片と混合後６．６mM ＭｇＣ
ｌ₂ ，５mM ＤＴＴ，１mM ＡＴＰを含む６６mMトリス
塩酸緩衝液（pH７．５）中１６℃にてＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼを一晩反応させ、これを大腸菌ＪＭ１０９株に導入
してｐＲＶＨＫＰＯ２７を得た（図３）。

【００８８】図３に示されるごとくこのプラスミドはＥ
Ｆ１αプロモーター、ヒトイムノグロブリンＨ鎖定常領
域遺伝子、ＳＶ４０エンハンサープロモーター、ｐＢＲ
３２２由来の複製開始領域およびβ−ラクタマーゼ遺伝
子（Ａｍｐ^r ) を含みＥＦ１αプロモーターとヒトイム
ノグロブリンＨ鎖定常領域遺伝子の間にヒトＭｅｇ−Ｐ
ＯＴ ｃＤＮＡの一部が接続されている。

【００８９】なお、前記ベクターＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ
ｌは次の様にして作製した。

【００９０】ベクターＨＥＦ−１２ｈ−ｇγｌの構成要
素である２．５kbpのＨＥＦ−１αプロモーター−エン
ハンサー領域は、該遺伝子の５′−末端に接する約１．
５kbpのＤＮＡ、第一エクソン中の３３bp、第一イント
ロン中の９４３bp、及び第二エクソンの最初の部分の１
０bpから成る。この２．５kbpのＨｉｎｄIII −Ｅｃｏ
ＲＩ断片をプラスミドｐＥＦ３２１−ＣＡＴ(D.W.Kim
ら、Gene 91, 217 (1990)；及びT. Uetsukiら、J. Bio
l. Chem. 264, 5791 (1989))から切り出し、そしてｐｄ
ＫＣＲベクター(M. Tsuchiyaら、Embo J. ６, 611 (198
7)), K. O' Haraら、Proc. Natl, Acad. Sci. USA 78,
1527 (1981), (R. Fukunaga ら、Proc.Natl. Acad. Sc
i. USA. 81, 5086 (1984))にクローニングして、ＳＶ４
０前期プロモーター−エンハンサーを含有する約３００
bpのＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩ断片と置き換えてｐＴＥ
Ｆ−１を得た。

【００９１】ｐＴＥＦ−１をＥｃｏＲＩで消化し、Ｋｌ
ｅｎｏｗポリメラーゼでフィルーインし、そしてＨｉｎ
ｄIII リンカーに連結した。次に、この修飾されたｐＴ
ＥＦ−１ベクターＤＮＡから約１．６kbpのＨｉｎｄIII
−ＳｍａＩ断片を切り出した。

【００９２】ＨＣＭＶ−１２ｈ−ｇγ１(Maedaら、Huma
n Antibodies and Hybridomas ２,124 (1991) ; C. A.
Kettleboroughら、Protein Engeneering ４, 773 (199
1))をＥｃｏＲＩにより部分消化し、Ｋｌｅｎｏｗポリ
メラーゼによりフィルーインし、そして自己連結するこ
とにより、ＨＣＭＶ−１２ｈ−ｇγ１からプラスミドＨ
ＣＭＶ−１２ｈ−ｇγ１（ΔＥ２）を作製した。

【００９３】プラスミドＨＣＭＶ−１２ｈ−ｇγ１（Δ
Ｅ２）をＥｃｏＲＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗポリメラー
ゼでフィルーインし、そしてＨｉｎｄIII で消化した。
ヒトα−ＩＣ領域をコードするＤＮＡ配列を含有する約
７kbpの断片を、ＨＥＦ−１αプロモーター−エンハン
サーを含有する前記の１．６kbp ＨｉｎｄIII −Ｓｍ
ａＩ断片に連結してＨＥＦ−１２ｈ−ｇγ１を得た。こ
のベクター中のＨＥＦ−１αプロモーター・エンハンサ
ー領域は、５′−領域に接する３８０bpのＤＮＡを除
き、ｐＴＥＦ−１中のそれと同一であった。

【００９４】実施例１０．ＣＯＳ細胞での巨核球増幅因
子（Ｍｅｇ−ＰＯＴ）遺伝子の発現Ｉ ＣＯＳ細胞を１×１０⁷ 個／mlになるようにＰＢＳに懸
濁し、この細胞浮遊液０．８mlにｐＲＶＨＫＰＯ２７
１０μｇを加えた。１９００Ｖ、２５μＦ、０．４msec
の条件でGenePulsar (BioRad社製) を用いて電気穿孔法
(electroporation) によりプラスミドをＣＯＳ細胞に導
入した。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロ
ポレーションした細胞を１％ウシ胎児血清を含むDulbec
co's Minimum Essential Medium(ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣ
Ｏ社製）２５mlに加えた。７２時間培養後、培養上清を
集めた。

【００９５】こうして得られたＣＯＳ細胞の培養上清の
一部をセントリプレップー１０ (Amicon社製) で約１０
倍に濃縮し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥにて分析した。コントロ
ールとして同様に無処理のＣＯＳ細胞およびベクターの
み導入したＣＯＳ細胞の培養上清も同様にそれぞれ約１
０倍に濃縮したものについても並べて泳動した。ゲル濃
度は１２％で、 Laemmliの方法Nature, 227 , 680 (197
0)に従って泳動し、一枚は２Ｄ−銀染色試薬・II「第
一」（第一化学薬品製）を用いて蛋白質を染色した。

【００９６】なお分子量マーカーはバイオラッド社製低
分子量マーカー〔ホスホリラーゼＢ（９２．５kd）、ウ
シ血清アルブミン（６６．２kd）、オボアルブミン（４
５．０kd）、炭酸脱水素酵素（３１．０kd）、大豆トリ
プシンインヒビター（２１．５kd）、リゾチーム（１
４．４kd）〕を用いた。

【００９７】もう一枚はウエスタンブロット法により巨
核球増幅因子を検出した。

【００９８】このときの分子量マーカーは、バイオラッ
ド社製プレステインド分子量マーカー〔ホスホリラーゼ
Ｂ（１０６．０kd）、ウシ血清アルブミン（８０．０k
d）、オボアルブミン（４９．５kd）、炭酸脱水素酵素
（３２．５kd）、大豆トリプシンインヒビター（２７．
５kd）、リゾチーム（１８．５kd）〕を用いた。一次抗
体は、ＨＰＣ−Ｙ５の培養上清より精製した巨核球増幅
因子のＮ末端配列分析より得られた配列をもとに合成し
た１８残基のペプチドを抗原として家兎に免疫して得た
ポリクローナル抗体を用いた。

【００９９】その結果、銀染色法により染色されたバン
ドを３者で比較したところ、分子量約３３，０００にみ
られたバンドは巨核球増幅因子の遺伝子を導入したＣＯ
Ｓ細胞の培養上清にのみ認められた。さらに、ウエスタ
ンブロット法でもこの分子量約３３，０００のバンドの
み強く発色したことから、このバンドが組換え型巨核球
増幅因子であると考えられた。

【０１００】実施例１１．ＣＯＳ細胞の培養上清中の巨
核球増幅因子（Ｍｅｇ−ＰＯＴ）活性測定Ｉ 実施例１０で得られたＣＯＳ細胞の培養上清の巨核球増
幅因子活性を前述した方法に従って測定した。但し、Ｃ
ＯＳ細胞への遺伝子の導入刺激で、その培養上清中にＩ
Ｌ−６が誘導されることが知られているので、測定はマ
ウスＩＬ−６受容体に対する抗体を添加した系で行っ
た。

【０１０１】その結果、表２に示したように、遺伝子を
導入しなかった無処理のＣＯＳ細胞の培養上清もＭｅｇ
−ＰＯＴのｃＤＮＡを含まないベクターを導入した対照
ＣＯＳ細胞の培養上清も巨核球増幅因子活性を示さなか
ったが、Ｍｅｇ−ＰＯＴのｃＤＮＡを含むベクターを導
入したＣＯＳ細胞の培養上清は明らかに巨核球増幅因子
活性を示した。

【０１０２】

【表２】 ＣＯＳ細胞の培養上清中の巨核球増幅因子活性 ＣＯＳ細胞 巨核球増幅因子活性 ^a) 培養上清濃度（％） ５０ ０．５ ０．００５ 無処理ＣＯＳ １．５ ３ ＮＤ ^b) 対照ＣＯＳ ０ ２．５ ＮＤ Meg−POT cDNA 導入ＣＯＳ ８．５ ７ ３．５ ａ） 形成されたコロニー数からＩＬ−３単独で形成さ
れたコロニー数 （２６．５個）を引いた値。

【０１０３】ｂ） 測定せず。

【０１０４】実施例１２．ＣＯＳ細胞の培養上清からの
組換え型巨核球増幅因子（Ｍｅｇ−ＰＯＴ）の精製Ｉ 実施例１０で得られたＣＯＳ細胞の培養上清３５０mlに
Tween ２０を終濃度が０．０１％になるように加え、 A
micon ＰＭ−１０ (Amicon社製）を用いた限外濾過法に
より約１０倍濃縮した。この濃縮液から以下の手順で組
換え型巨核球増幅因子（Ｍｅｇ−ＰＯＴ）を精製した。

【０１０５】（ｉ）０．０１％Tween ２０を含む１０mM
トリス塩酸緩衝液（pH８．４）、１０ｌに対し前記濃縮
液を一晩４℃にて透析した後、同緩衝液にて平衡化した
ＤＥＡＥ−Sepharose fast flow カラム（２．２×１８
cm, Pharmacia 社製）に添加した。カラムを同緩衝液で
洗浄後、同緩衝液中、ＮａＣｌ濃度を段階的に０，０．
１，０．１５，０．２，０．５Ｍと上げてカラムに吸着
した蛋白質を溶出させた。得られた画分をＳＤＳ／ＰＡ
ＧＥで分析した結果、実施例１０で認めた分子量約３
３，０００のバンドはＮａＣｌ濃度が０．１Ｍの画分の
前半部分にのみ検出された。この画分を集め、次の逆相
ＨＰＬＣでの精製にかけた。

【０１０６】（ii）上記画分に１０％ＴＦＡを加えpHを
３以下とした後、０．１％ＴＦＡを含む２４％アセトニ
トリルで平衡化したVydac Ｃ４カラム（４．６×２５０
mm）に添加し、同溶離液にてカラムを洗浄後、０．１％
ＴＦＡ中アセトニトリル濃度を８０分間に２４〜６４
％、さらに１０分間に８０％まで直線的に上げてカラム
に吸着した蛋白質を溶出させた。流速は約１ml／min
で、蛋白質の検出は２２０nmおよび２８０nmの二波長で
行った。得られたピークについてＳＤＳ／ＰＡＧＥで分
析した結果、アセトニトリルの濃度で約４１％に分子量
約３３，０００のバンドが認められた。この画分を０．
１％ＴＦＡで希釈した後、再び同条件で逆相ＨＰＬＣを
行い、メインピークを回収した。

【０１０７】実施例１３．組換え型巨核球増幅因子（Ｍ
ｅｇ−ＰＯＴ）のアミノ酸配列分析 実施例１２で得られた組換え型Ｍｅｇ−ＰＯＴについ
て、気相式プロテインシークエンサー４７３Ａ型（Appl
ied Biosystems社製）を用いてＮ末端アミノ酸配列分析
を行った。その結果、以下に示す（ａ）〜（ｃ）の３種
類のＮ末端アミノ酸配列が認められ実施例１０で認めた
分子量約３３，０００のバンドが組換え型巨核球増幅因
子であることが確認された。

【０１０８】（ａ）Ser-Arg-Thr-Leu-Ala-Gly-Glu-Thr-
Gly-Gln-Glu-Ala-Ala-Pro-Leu-Asp-………（配列番号１
１） （ｂ）Leu-Ala-Gly-Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-Ala-Ala-Pro-
Leu-Asp-Gly-Val-Leu-Ala-Asn-Pro-Pro-Xaa-Ile-Ser-Xa
a-Leu-Xaa-Pro-Arg-……… （ｃ）Gly-Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-Ala-Ala-Pro-Leu-Asp-
Gly-Val-Leu-Ala-Asn-Pro-Pro-Xaa-Ile-Ser-Xaa-Leu-Xa
a-Pro-Arg-Gln-Leu-……… これらの内、（ｂ）および（ｃ）は実施例４（ｉ）にお
ける、ＨＰＣ−Ｙ５細胞の培養上清からのポリペプチド
の配列−１（配列番号：１）および配列−３（配列番
号：３）にそれぞれ対応する。

【０１０９】また、組換え型Ｍｅｇ−ＰＯＴに１０mg／
mlの臭化シアンを含む７０％ギ酸溶液１００μｌを加
え、室温にて２４時間臭化シアン分解した後、遠心濃縮
機にて過剰の試薬を除いた。その残渣を０．１％ＴＦＡ
１mlに溶解し、０．１％ ＴＦＡで平衡化したVydac Ｃ
４カラム（４．６×２５０mm）に添加し、０．１％ＴＦ
Ａ中、アセトニトリル濃度を４０分間に８０％まで直線
的に上げ、カラムに吸着した臭化シアン断片を溶出させ
た。得られた断片のうちＣ末側の断片について気相式プ
ロテインシーケンサー４７３Ａ型を用いてアミノ酸配列
分析を行ったところ、以下に示す配列が得られた。この
配列は、ＨＰＣ−Ｙ５の培養上清から得られた巨核球増
幅因子（Ｍｅｇ−ＰＯＴ）を同様に臭化シアン分解して
得られた臭化シアン断片の部分配列と、次記に示すごと
く一致した。

【０１１０】

【表３】

【０１１１】上表の「ｃＤＮＡ」表記のアミノ酸配列は
Ｍｅｇ−ＰＯＴをコードするｃＤＮＡの塩基配列から演
えきされるアミノ酸配列であり、また「ＣＯＳ」表記の
アミノ酸配列はＭｅｇ−ＰＯＴをコードするｃＤＮＡを
ＣＯＳ細胞で発現させた蛋白質を、アミノ酸配列分析で
得られた部分配列であり、さらに「ＨＰＣ−Ｙ５」表記
のアミノ酸配列は、ヒト膵臓癌細胞由来の株化細胞「Ｈ
ＰＣ−Ｙ５」の培養上清から得られたＭｅｇ−ＰＯＴの
アミノ酸配列分析で得られた部分配列である。

【０１１２】実施例１４．ｐＲＶＨＫＰＯ２７ｆベクタ
ーの構築（動物細胞用） 実施例８で得られたｐＫＰＯ２７を１０mM ＭｇＣｌ
₂ ，１mM ＤＴＴおよび１００mM ＮａＣｌを含む５０
mMトリス塩酸緩衝液（pH７．５）中３７℃にて制限酵素
ＸｈｏＩ (東洋紡社製）で２時間処理しエタノール沈殿
としてＤＮＡを回収した。次に５mM ＭｇＣｌ₂ ，１０
mM ＤＴＴ，１mMのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄ
ＴＴＰを含む２０mMトリス塩酸緩衝液（pH７．４）中１
０℃にてＤＮＡポリメラーゼのKlenow断片で１時間処理
し末端を平滑化した。エタノール沈殿としてこのＤＮＡ
を回収し、次いで１０mM ＭｇＣｌ₂ ，１mM ＤＴＴ，
１００mM ＮａＣｌを含む５０mMトリス塩酸緩衝液（pH
７．５）中３７℃にて制限酵素ＳａｌＩ (東洋紡社製）
で２時間処理しアガロースゲル電気泳動を行ない、１．
３Kbp のＤＮＡ断片を回収した。

【０１１３】実施例９で得られたｐＲＶＨＫＰＯ２７を
１０mM ＭｇＣｌ₂ ，１mM ＤＴＴ，１００mM ＫＣｌ
を含む２０mMトリス塩酸緩衝液（pH８．５）中３７℃に
て制限酵素ＢａｍＨＩ (宝酒造社製）で２時間処理した
後エタノール沈殿としてＤＮＡを回収した。次に５mM
ＭｇＣｌ₂ ，１０mM ＤＴＴ，１mMのｄＡＴＰ，ｄＣＴ
Ｐ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰを含む２０mMトリス塩酸緩衝液
（pH７．４）中１０℃にてＤＮＡポリメラーゼのKlenow
断片で１時間処理し末端を平滑化した。

【０１１４】エタノール沈殿としてこのＤＮＡを回収
し、次いで１０mM ＭｇＣｌ₂ ，１mMＤＴＴ，１００mM
ＮａＣｌを含む５０mMトリス塩酸緩衝液（pH７．５）
中３７℃にて制限酵素ＳａｌＩ (東洋紡社製）で２時間
処理し、アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）を加
えて６５℃にて２時間保温することにより脱リン酸して
アガロースゲル電気泳動を行ない８．５Kbp のＤＮＡ断
片を回収した。この８．５Kbp のＤＮＡ断片と先の１．
３Kbp のＤＮＡ断片とを混合した後、６．６mMＭｇＣｌ
₂ ，５mM ＤＴＴ，１mM ＡＴＰを含む６６mMトリス塩
酸緩衝液（pH７．５）中１６℃にてＴ４ＤＮＡリガーゼ
を一晩反応させ、これを大腸菌ＪＭ１０９株に導入して
ｐＲＶＨＫＰＯ２７ｆを得た（図４）。

【０１１５】なおｐＲＶＨＫＰＯ２７ｆは、図４に示さ
れるごとく、ＥＦ１αプロモーター、ヒトイムノグロブ
リンＨ鎖定常領域遺伝子、ＳＶ４０エンハンサープロモ
ーター、ｐＢＲ３２２由来の複製開始領域およびβ−ラ
クタマーゼ遺伝子（Ａｍｐ^r）を含み、ヒトＭｅｇ−Ｐ
ＯＴｃＤＮＡはＥＦ１αプロモーターとヒトイムノグロ
ブリンＨ鎖定常領域遺伝子の間に接続されている。

【０１１６】実施例１５．ＣＯＳ細胞での巨核球増幅遺
伝子（Ｍｅｇ−ＰＯＴ）遺伝子の発現II ＣＯＳ細胞を１×１０⁷ 個／mlになるようにＰＢＳに懸
濁し、この細胞浮遊液０．８mlにｐＲＶＨＫＰＯ２７ｆ
１０μｇを加えた。１９００Ｖ，２５uFD ０．４msec
の条件でGenePulsar（BioRad社製）を用いて電気穿孔法
（electroporation)によりプラスミドをＣＯＳ細胞に導
入した。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクトロ
ポレーションした細胞を１％ウシ胎児血清を含むDulbec
co's Minimum Essential Medium(DMEM) (GIBCO社製）２
５mlに加えた。７２時間培養後、培養上清を集めた。

【０１１７】こうして得られたＣＯＳ細胞の培養上清の
一部をセントリプレップ−１０（Amicon社製）で約１０
倍に濃縮し、ＳＤＳ／ＰＡＧＥにて分析した。コントロ
ールとしてベクターのみ導入したＣＯＳ細胞の培養上清
も同様にそれぞれ約１０倍に濃縮したものについて並べ
て泳動した。ゲル濃度は１２％で、Laemmli の方法Natu
re, 227 , 680(1970) に従って泳動し、一枚は２Ｄ−銀
染色試薬・II「第１」（第１化学薬品製）を用いて蛋白
質を染色した。

【０１１８】なお分子量マーカーはバイオラッド社製低
分子量マーカー〔ホスホリラーゼＢ（９２．５kd) 、ウ
シ血清アルブミン（６６．２kd）、オボアルブミン（４
５．０kd）、炭酸脱水素酵素（３１．０kd）、大豆トリ
プシンインヒビター（２１．５kd）、リゾチーム（１
４．４kd）〕を用いた。

【０１１９】もう一枚はウエスタンブロット法により巨
核球増幅因子を検出した。

【０１２０】このときの分子量マーカーは、バイオラッ
ド社製プレステインド分子量マーカー〔ホスホリラーゼ
Ｂ（１０６．０kd）、ウシ血清アルブミン（８０．０k
d）、オボアルブミン（４９．５kd）、炭酸脱水素酵素
（３２．５kd）、大豆トリプシンインヒビター（２７．
５kd）、リゾチーム（１８．５kd）〕を用いた。一次抗
体は、ＨＰＣ−Ｙ５の培養上清より精製した巨核球増幅
因子のＮ末端配列分析より得られた配列をもとに合成し
た１８残基のペプチドを抗原として家兎に免疫して得た
ポリクローナル抗体を用いた。

【０１２１】その結果、銀染色法により染色されたバン
ドを両者で比較したところ、分子量約３３，０００にみ
られたバンドは巨核球増幅因子の遺伝子を導入したＣＯ
Ｓ細胞の培養上清にのみ認められた。さらに、ウエスタ
ンブロット法でもこの分子量約３３，０００のバンドの
み強く発色したことから、このバンドが組換え型巨核球
増幅因子であると考えられた。

【０１２２】実施例１６．ＣＯＳ細胞の培養上清中の巨
核球増幅因子（Ｍｅｇ−ＰＯＴ）活性測定II 実施例１５で得られたＣＯＳ細胞の培養上清の巨核球増
幅因子活性を前述した方法に従って測定した。但し、Ｃ
ＯＳ細胞への遺伝子の導入刺激で、その培養上清中にＩ
Ｌ−６が誘導されることが知られているので、測定はマ
ウスＩＬ−６受容体に対する抗体を添加した系で行っ
た。

【０１２３】その結果、表４に示したように、遺伝子を
導入しなかった無処理のＣＯＳ細胞の培養上清もＭｅｇ
−ＰＯＴのｃＤＮＡを含まないベクターを導入した対照
ＣＯＳ細胞の培養上清も巨核球増幅因子活性を示さなか
ったが、Ｍｅｇ−ＰＯＴのｃＤＮＡを含むベクターを導
入したＣＯＳ細胞の培養上清は明らかに巨核球増幅因子
活性を示した。

【０１２４】

【表４】 ＣＯＳ細胞の培養上清中の巨核球増幅因子活性 ＣＯＳ細胞 巨核球増幅因子活性 ^a) 培養上清濃度（％） ２ ０．２ ０．０２ ０．００２ 無処理ＣＯＳ ０ ＮＤ ^b) ＮＤ ＮＤ 対照ＣＯＳ ２ ＮＤ ＮＤ ＮＤ Meg−POT cDNA 導入ＣＯＳ ７ ４ ７ １ ａ） 形成されたコロニー数からＩＬ−３単独で形成さ
れたコロニー数 （１０個）を引いた値。

【０１２５】ｂ） 測定せず。

【０１２６】実施例１７．ＣＯＳ細胞の培養上清からの
組換え型巨核球増幅因子（Ｍｅｇ−ＰＯＴ）の精製II 実施例１５で得られたＣＯＳ細胞の培養上清３５０mlに
Tween ２０を終濃度が０．０１％になるように加え、 A
micon ＰＭ−１０ (Amicon社製）を用いた限外濾過法に
より約１０倍濃縮した。この濃縮液から以下の手順で組
換え型巨核球増幅因子（Ｍｅｇ−ＰＯＴ）を精製した。

【０１２７】（ｉ）０．０１％Tween ２０を含む１０mM
トリス塩酸緩衝液（pH８．４）、１０ｌに対し前記濃縮
液を一晩４℃にて透析した後、同緩衝液にて平衡化した
ＤＥＡＥ−Sepharose fast flow カラム（２．２×１８
cm, Pharmacia 社製）に添加した。カラムを同緩衝液で
洗浄後、同緩衝液中、ＮａＣｌ濃度を段階的に０，０．
１，０．１５，０．２，０．５Ｍと上げてカラムに吸着
した蛋白質を溶出させた。得られた画分をＳＤＳ／ＰＡ
ＧＥで分析した結果、実施例１５で認めた分子量約３
３，０００のバンドはＮａＣｌ濃度が０．１Ｍの画分に
検出され、この画分を次の逆相ＨＰＬＣでの精製にかけ
た。

【０１２８】（ii）上記画分に１０％ＴＦＡを加えpHを
３以下とした後、０．１％ＴＦＡを含む２４％アセトニ
トリルで平衡化したVydac Ｃ４カラム（４．６×２５０
mm）に添加し、同溶離液にてカラムを洗浄後、０．１％
ＴＦＡ中アセトニトリル濃度を８０分間に２４〜６４
％、さらに１０分間に８０％まで直線的に上げてカラム
に吸着した蛋白質を溶出させた。流速は約１ml／min
で、蛋白質の検出は２２０nmおよび２８０nmの二波長で
行った。得られたピークについてＳＤＳ／ＰＡＧＥで分
析した結果、アセトニトリルの濃度で約４１％に分子量
約３３，０００のバンドが認められた。この画分を０．
１％ＴＦＡで希釈した後、再び同条件で逆相ＨＰＬＣを
行い、メインピークを回収した。

【０１２９】実施例１８．精製組換え型Ｍｅｇ−ＰＯＴ
の巨核球増幅因子活性測定 実施例１７で精製された組換え型巨核球増幅因子（Ｍｅ
ｇ−ＰＯＴ）を１０％ウマ血清を含むIscove's Modifie
d Dulbecco's培養液（ＩＭＤＭ）で所定濃度（５０．
１，３．１，０．２ng／ml）に希釈した被検検体０．１
ml，ウマ血清（５６℃ ３０分処理、Biocell 社製）
０．２ml、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ系雄性、６〜１２
週齢）大腿骨骨髄細胞浮遊液０．１ml（２×１０⁵ 有核
細胞）、組換え型マウスＩＬ−３を５ng／mlを含むＩＭ
ＤＭ ０．２ml、および寒天を０．７５％含む改変McCo
y's ５Ａ培養液０．４mlを混合した。次いで、これらを
直径３５mmの組織培養プラスチックディッシュに入れて
固まらせたのち、３７℃、５％炭酸ガス／９５％空気、
１００％湿度の条件で培養を行った。

【０１３０】培養６日目に寒天層ごとスライドガラス上
に取出し乾燥させ、フィルム状標本としたものを５％グ
ルタルアルデヒドで固定し、Nakeffらの方法（Proc. So
c. Exp. Biol. Med. 151 587 1976)にしたがって、アセ
チルコリンエステラーゼで染色し、巨核球コロニー数の
算定を行った。この際、アセチルコリンエステラーゼ染
色陽性細胞を４個以上含む集塊を巨核球コロニーとした
（コロニーの検鏡は４０倍の倍率で行なった）。

【０１３１】なお、巨核球増幅因子活性は、組換え型Ｍ
ｅｇ−ＰＯＴを添加して生じた巨核球コロニー数と組換
え型Ｍｅｇ−ＰＯＴ無添加（１０％ウマ血清を含むＩＭ
ＤＭのみ添加）で組換え型ＩＬ−３単独で生じた巨核球
コロニー数との差を指標とした。

【０１３２】その結果、表５に示したように、精製組換
え型Ｍｅｇ−ＰＯＴは巨核球増幅因子活性を示した。

【０１３３】

【表５】 精製組換え型Ｍｅｇ−ＰＯＴの巨核球増幅因子活性 Ｍｅｇ−ＰＯＴ濃度 巨核球増幅因子活性 ^b) （ｎｇ／ｍｌ）^a) ５０．１ ９．５ ３．１ ８．５ ０．２ ３ ａ）アミノ酸分析法により測定。

【０１３４】ｂ）形成されたコロニー数からＩＬ−３単
独で形成されたコロニー数（１９．５）を引いた値。

【０１３５】実施例１９．巨核球増幅因子（Ｍｅｇ−Ｐ
ＯＴ）をコードする遺伝子の試験管内転写翻訳 実施例８で得られたｐＫＰＯ２７を１０mM ＭｇＣｌ
₂ ，１mM ＤＴＴ，１００mM ＫＣｌを含む２０mMトリ
ス塩酸緩衝液（pH８．５）中３７℃にて制限酵素Ｘｈｏ
Ｉ (東洋紡社製）で２時間処理し、次いでアガロースゲ
ル電気泳動を行ない、１．９Kbp のＤＮＡ断片を回収し
た。ベクターｐＣＩＴＥ−２ｃ（Novagen社製) を１０m
M ＭｇＣｌ₂ ，１mM ＤＴＴ，１００mM ＫＣｌを含
む２０mMトリス塩酸緩衝液（pH８．５）中３７℃にて制
限酵素ＸｈｏＩ (東洋紡社製）で２時間処理した後アル
カリフォスファターゼ（宝酒造社製）を加えて６５℃に
て２時間保温することにより脱リン酸して得られたＤＮ
Ａをフェノール処理を行なうことにより精製した。これ
と先の１．９Kbp のＤＮＡ断片と混合後、６．６mMＭｇ
Ｃｌ₂ ，５mM ＤＴＴ，１mM ＡＴＰを含む６６mMトリ
ス塩酸緩衝液（pH７．５）中１６℃にてＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを一晩反応させ、大腸菌ＪＭ１０９株に導入してｐ
ＣＩＴＥ・ＫＰＯ２７を得た（図５）。

【０１３６】ｐＣＩＴＥ・ＫＰＯ２７を１０mM ＭｇＣ
ｌ₂ ，１mM ＤＴＴを含む１０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
７．５）中３７℃にて制限酵素ＮａｅＩ（東洋紡社製）
で２時間処理した後、ＤＮＡをフェノール処理を行なう
ことにより精製した。この鋳型ＤＮＡに２mM spermidi
ne, ６mM ＭｇＣｌ₂ ，１０mM ＮａＣｌ，１単位／μ
l RNasin ribonuclease inhibitor(Promega社製）、
０．５mMのＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ，ＵＴＰを含む４０
mMトリス塩酸緩衝液（pH７．５）中３７℃にてＴ７ Ｒ
ＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを反応させて転写を行なっ
た。これをフェノール処理を行なうことにより精製し、
エタノール沈殿としてＲＮＡを回収した。つづいてRed
Nova Lysate (Novagen社製）を用いて³⁵Ｓ−メチオニン
を含む標識体としてＲＮＡを翻訳させた。この反応物を
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、オート
ラジオグラフィーをとったところ約７０，０００の分子
量のバンドが認められた。

【０１３７】実施例２０．ｐＭＢＰＫＰＯ２７ベクター
の構築（大腸菌用） 実施例８で得られたｐＫＰＯ２７を１０mM ＭｇＣｌ
₂ ，１mM ＤＴＴ，１００mM ＫＣｌを含む２０mMトリ
ス塩酸緩衝液（pH８．５）中３７℃にて制限酵素Ｘｈｏ
Ｉ (東洋紡社製）で２時間処理しエタノール沈殿として
ＤＮＡを回収し、５mM ＭｇＣｌ₂ ，１０mM ＤＴＴ，
１mMのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰを含む
２０mMトリス塩酸緩衝液（pH７．４）中１０℃にてＤＮ
ＡポリメラーゼのKlenow断片で１時間処理し末端を平滑
化した。次いでアガロースゲル電気泳動を行ない、１．
９Kbp のＤＮＡ断片を回収した。

【０１３８】ベクターｐＭＡＬ−ｃ(New England BioLa
bs社製）を１０mM ＭｇＣｌ₂ ，１mM ＤＴＴ，５０mM
ＮａＣｌを含む２０mMトリス塩酸緩衝液（pH７．５）
中３７℃にて制限酵素ＳｔｕＩで２時間処理した後アル
カリフォスファターゼ（宝酒造社製）を加えて６５℃に
て２時間保温することにより脱リン酸した。ＤＮＡをフ
ェノール処理を行なうことにより除蛋白し、エタノール
沈澱として回収した。

【０１３９】これと先の１．９Kbp のＤＮＡ断片と混合
後６．６mM ＭｇＣｌ₂ ，５mM ＤＴＴ，１mM ＡＴＰ
を含む６６mMトリス塩酸緩衝液（pH７．５）中１６℃に
てＴ４ ＤＮＡリガーゼを一晩反応させ、これを大腸菌
ＪＭ１０９株に導入してｐＭＢＰＫＰＯ２７を得た（図
６）。図６に示されるごとくこのプラスミドは発現ユニ
ットとしてｔａｃプロモーターの下流にマルトース結合
蛋白質（ＭＢＰ）遺伝子（ｍａｌＥΔ２−２６）、 Fac
tor Ｘａの認識配列およびＭｅｇ−ＰＯＴの３４番めの
アミノ酸Ｓｅｒ以降のｃＤＮＡがフレームが一致するよ
うに接続されている。

【０１４０】実施例２１ ．大腸菌ＪＭ１０９株での融合蛋白質の発現 実施例２０においてｐＭＢＰＫＰＯ２７で形質転換した
大腸菌を５０ug／mlのアンピシリンおよび０．２％グル
コースを含むＬＢ培地５ml中で３７℃にて１６時間培養
し、この培養液４mlを５０ug／mlのアンピシリンおよび
０．２％グルコースを含むＬＢ培地４００mlに加えた。
３７℃にて約２時間培養後、０．３mMになるようにイソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドを加えさらに３時
間培養を続けた。この培養菌体を実施例１０と同様にＳ
ＤＳポリアクリルアミド電気泳動にかけ、上記抗Ｍｅｇ
−ＰＯＴペプチド血清または抗ＭＢＰ血清によるウエス
タンブロッティングをおこなったところＭＢＰとＭｅｇ
−ＰＯＴの融合蛋白質の発現が確認された。

【０１４１】発現された組換え型巨核球増幅因子（Ｍｅ
ｇ−ＰＯＴ）を菌体より下記のとおり精製した。

【０１４２】10mM ＥＤＴＡを含む20mM トリス塩酸緩
衝液（pH 7.5）中、超音波処理（20分間）により破砕し
た懸濁液を遠心操作（10,000rpm x 30min, ４゜C, SA 60
0ローター、Sorvall社製）にかけ、集めた沈澱を蒸留水
に懸濁した。懸濁液を再び遠心操作（10,000g x 90mi
n）にかけ、集めた沈澱を１% ２−メルカプトエタノー
ル(2-ME)及び８Ｍ尿素を含む25mM トリス塩酸緩衝液（p
H 8.0）に溶解し、再び遠心操作(35,000rpm x 60min)を
行い不溶物を除去した後、10mM 2-ME, 10mM EDTA, 200m
M NaClを含む10mM トリス塩酸緩衝液(pH 8.0)で２倍希
釈した。この溶液を同緩衝液にて平衡化したアミロース
カラム（75ml,BioLabs社製）に添加し、同緩衝液にてカ
ラムを洗浄した。10mM マルトースを含む同緩衝液にて
カラムに結合している蛋白を溶出させた。この画分をFa
ctor Xa の消化緩衝液である２mMCaCl₂及び150mM NaCl
を含む20mM トリス塩酸緩衝液(pH 7.4)に対して透析し
た。透析内液にFactor Xaを加え、37゜Cで16時間酵素消
化した。反応液を、メンブランフィルターＰＭ−１０
（アミコン社製）にて濃縮後、上記アミロースカラムの
平衡化緩衝液で平衡化したＰＤ−１０カラムに通した
後、再びアミロースカラムに添加し、同緩衝液にてカラ
ムを洗浄して、素通り画分及び洗浄画分を集めた。セン
トリプレップー１０にて上記画分を濃縮した。

【０１４３】このようにして得た組換え型巨核球増幅因
子を、Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバンドとともに家兎に
２週間ごとに５回感作した。最終感作後１０日目に、け
い動脈より全採血し、抗巨核球増幅因子抗血清を得た。

【０１４４】実施例２２. ｐＥＦＤＫＰＯｆベクターの
構築（動物細胞用） ｐＫＰＯ２７を１０mM ＭｇＣｌ₂ ，１mM ＤＴＴ，１
００mM ＫＣｌを含む２０mMトリス塩酸緩衝液（pH８．
５）中３７℃にて制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ (宝
酒造社製）で処理した後、アガロースゲル電気泳動を行
い１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。

【０１４５】ベクターＤＨＦＲ-ΔＥ-ＲＶｈをＥｃｏＲ
Ｉ、ＢａｍＨＩにて同様に処理した後、アルカリフォス
ファターゼ（宝酒造社製）で６０℃、２時間処理するこ
とにより脱リン酸してアガロースゲル電気泳動を行ない
回収した７ｋｂｐＤＮＡを先の１．８ｋｂｐのＤＮＡ断
片と連結させｐＥＦＤＫＰＯ５’を得た。

【０１４６】これを１０mM ＭｇＣｌ₂、１mM ＤＴ
Ｔ、１００mM ＫＣｌを含む２０mMトリス塩酸緩衝液(ｐ
Ｈ８．５）中３７℃にて制限酵素ＢａｍＨＩ処理した
後、６．７mM ＭｇＣｌ₂、１６．６mM(ＮＨ₄）₂Ｓ
Ｏ₄、１０mM ２−メルカプトエタノール、６．７mM
ＥＤＴＡ、３３０mM ｄＮＴＰを含む６７mMトリス緩衝
液中３７℃、５分間Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し末
端を平滑化した。さらにＫｐｎＩリンカー（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ社製）と連結しｐＥＦＤＫＰＯ５’Ｋを得た。新
たにｐＫＰＯ２７を１０mM ＭｇＣｌ₂、１mM ＤＴ
Ｔ、１００mM ＫＣｌを含む２０mMトリス塩酸緩衝液
(ｐＨ８．５）中３７℃にて制限酵素ＸｈｏＩで切断
後、６．７mM ＭｇＣｌ₂、１６．６mM(ＮＨ₄）₂Ｓ
Ｏ₄、１０mM ２−メルカプトエタノール、６．７mM
ＥＤＴＡ、３３０mM ｄＮＴＰを含む６７mMトリス緩衝
液中３７℃、５分間Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し末
端を平滑化した。これをさらに１０mM ＭｇＣｌ₂、１m
M ＤＴＴ、１００mM ＮａＣｌを含む５０mMトリス塩
酸緩衝液(ｐＨ７．５）中３７℃にて制限酵素ＳａｌＩ
で処理しアガロースゲル電気泳動を行い１．３ｋｂｐの
ＤＮＡ断片を回収した。ベクターｐＣＤＭ８（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ社製）を１０mM ＭｇＣｌ₂、１mM ＤＴ
Ｔ、１００mM ＫＣｌを含む２０mMトリス塩酸緩衝液
(ｐＨ８．５）中３７℃にて制限酵素ＸｈｏＩで処理し
た後さらに１０mM ＭｇＣｌ₂、１mM ＤＴＴ、１００m
M ＫＣｌを含む２０mMトリス塩酸緩衝液(ｐＨ８．５）
中３７℃にて制限酵素ＨｐａＩで切断後、アガロースゲ
ル電気泳動を行ない回収した３．３ｋｂｐＤＮＡを先の
１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片と連結しｐＣＤＭＫＰＯ３’
を得た。ｐＥＦＤＫＰＯ５’ＫとｐＣＤＭＫＰＯ３’を
１０mM ＭｇＣｌ₂、１mM ＤＴＴを含む１０mMトリス
塩酸緩衝液(ｐＨ７．５）中３７℃にて制限酵素Ｋｐｎ
Ｉで処理しアガロースゲル電気泳動を行ない、それぞれ
１０ｋｂｐ、０．９ｋｂｐの断片を回収して、これらを
連結しｐＥＦＤＫＰＯｆを得た（図７）。図に示される
ごとくこのプラスミドはジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子
（ｄｈｆｒ）を含みＥＦ１αプロモーターとＳＶ４０ｐ
ｏｌｙＡシグナルの間にヒトＭｅｇ−ＰＯＴ ｃＤＮＡ
が接続されている。

【０１４７】なお、前記ベクターＤＨＦＲ−ΔＥ−ＲＶ
ｈは国際公開ＷＯ９２／１９７５９号公報に記載のＤＨ
ＦＲ−ΔＥ−ＰＭｈ−ｇγ１及びＲＶｈ−ＰＭ１ｆ−４
を用いて次の様に作製した。

【０１４８】ＤＨＦＲ−ΔＥ−ＰＭｈ−ｇγｌ及びＲＶ
ｈ−ＰＭ１ｆ−４を１０mM ＭｇＣｌ₂、１mM ＤＴ
Ｔ、１００mM ＫＣｌ、０．０１％ＢＳＡを含む２０mM
トリス塩酸緩衝液(ｐＨ８．５）中３７℃にて制限酵素
ＰｖｕＩ，ＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で処理しアガロー
スゲル電気泳動を行い４ｋｂｐ、３ｋｂｐの断片を回収
して、これらを連結することによりＤＨＦＲ−ΔＥ−Ｒ
Ｖｈを作製した。

【０１４９】実施例２３. ＣＨＯ細胞での巨核球増幅因
子（Ｍｅｇ−ＰＯＴ）遺伝子の発現 ＣＨＯ細胞ＤＸＢ−１１を１×１０^７個／ｍｌになるよ
うにｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉ
ｎｅ（ＰＢＳ）に懸濁し、この細胞浮遊液０．８ｍｌに
ｐＥＦＤＫＰＯｆを１０μｇ加えた。１９００Ｖ、２５
μＦの条件でＧｅｎｅＰｕｌｓａｒ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社
製）を用いて電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉ
ｏｎ）によりプラスミドをＣＨＯ細胞に導入した。室温
にて１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション
した細胞を１０％ウシ胎児血清を含むα-ＭＥＭ培地
（ＧＩＢＣＯ社製）２５ｍｌに加えた。３７℃, ２４時
間培養後、トリプシン処理にて回収した細胞を１００倍
に希釈し、１０％ウシ胎児血清添加リボヌクレオシド及
びデオキシリボヌクレオシド非含有α-ＭＥＭ培地（Ｇ
ＩＢＣＯ社製）で３週間培養した。この時３〜４日に一
度の割合で培地交換を行った。コロニーが肉眼で確認で
きるまでに成長したのでクローンを拾い、クローン毎に
培養を続けた。その後、先の培地にｍｅｔｈｏｔｒｅｘ
ａｔｅ（ＭＴＸ）（Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、選択培
養を続けた。一次選択時のＭＴＸ濃度は１０ｎＭとし、
得られた耐性クローンに対してＭＴＸ濃度５０ｎＭの培
地で二次選択を行った。最終的に得られたクローンを５
０ｎＭ ＭＴＸ及び２％ＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地（Ｇ
ＩＢＣＯ社製）にて大量培養し、その培養上清を精製に
供した。

【０１５０】培養上清をＳＤＳ／ＰＡＧＥにて分析し、
Ｎ末近傍の合成ペプチドを抗原として作製した抗体を用
いたウエスタンブロッテイング法によりＭｅｇ−ＰＯＴ
を検出した。なお、分子量マーカーとしては、実施例１
５に示すバイオラッド社製プレステインド分子量マーカ
ーを使用した。図８に示すように、分子量約３３ｋｄ、
３０ｋｄ、２７．５ｋｄに３本のバンドが検出された。

【０１５１】実施例２４. ＣＨＯ細胞の培養上清からの
組換え型巨核球増幅因子（Ｍｅｇ−ＰＯＴの精製I 実施例２３で調製したＣＨＯ細胞の培養上清１０ｌにTw
een２０を、終濃度が０．０１％になるように加え、５
μｍのメンブランフィルター（富士フィルム社製）を通
して不溶物を除去した。この培養上清から以下の手順に
より組換え型巨核球増幅因子を精製した。

【０１５２】（i） 上記培養上清を０．０１％ Tween
２０及び０．２Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ ８）で平衡化したＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗカラム（５．０×２０ｃ
ｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製)に添加した。カラムを同
緩衝液で洗浄した後、０．０１％ Tween ２０及び２Ｍ
ＫＣｌを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ９）で
カラムに吸着した蛋白を溶出させた。この画分を集め、
ミニタン（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）にて濃縮し、０．
０１％ Tween ２０を含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
５）を加えて希釈する操作を繰り返し脱塩した後、生じ
た不溶物を遠心操作（１０，０００ｒｐｍ × ３０ｍｉ
ｎ）により除去した。上清を次のカチオン交換クロマト
グラフィーでの精製にかけた。

【０１５３】（ii） ０．０１％ Tween ２０を含む２
０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ ５）で平衡化したＳ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗカラム（５．０×１
２ｃｍ）に上記画分を添加し、同緩衝液にてカラムを洗
浄した後、同緩衝液中、ＮａＣｌ濃度を０．1、０．
２、０．３、０．５Ｍと上げてカラムに吸着したタンパ
ク質を溶出させた。

【０１５４】（iii） 組換え型Ｍｅｇ−ＰＯＴを含む
０．１Ｍ ＮａＣｌ画分を、あらかじめ０．１％ＴＦＡ
を含む２４％アセトニトリルで平衡化したＶｙｄａｃ
Ｃ４カラム（１０×２５０ｍｍ）に添加し、同溶離液に
てカラムを洗浄した後、０．１％ＴＦＡ中アセトニトリ
ル濃度を４８分間に２４〜４８％まで直線的に上げてカ
ラムに吸着したタンパク質を溶出させた。流速は１ｍｌ
／ｍｉｎで、タンパク質の検出は２２０ｎｍ及び２８０
ｎｍの二波長で行った。アセトニトリル濃度が４０〜４
５％の組換え型Ｍｅｇ−ＰＯＴを含む画分を集め、次の
Ｇｅｌ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ
ａｐｈｙにかけた。

【０１５５】（iv） 組換え型Ｍｅｇ−ＰＯＴを含む画
分を０．０１％ＴＦＡを含む４０％アセトニトリルで平
衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラム（２１．
５×６０ｃｍ）に添加した。流速は３ｍｌ／ｍｉｎでタ
ンパク質の検出は２８０ｎｍで行った。３７〜４４分に
溶出された主要ピークを集め、０．１％ＴＦＡにて希釈
後、（iii）と同条件にて逆相ＨＰＬＣを行い主要ピー
クを回収した。

【０１５６】こうして得られた組換え型巨核球増幅因子
（Ｍｅｇ−ＰＯＴ）をＳＤＳ／ＰＡＧＥにて分析した。
ゲル濃度は１２％で、Ｌａｅｍｍｌｉの方法Ｎａｔｕｒ
ｅ，２２７，６８０（１９７０）に従って泳動し、２Ｄ
−銀染色試薬・「第一」（第一化学薬品製）を用いてタ
ンパク質を染色した。なお分子量マーカーはバイオラッ
ド社製低分子量マーカー［ホスホリラーゼＢ（９２．５
ｋｄ）、ウシ血清アルブミン（６６．２ｋｄ）、オボア
ルブミン（４５．０ｋｄ）、炭酸脱水素酵素（３１．０
ｋｄ）、大豆トリプシンインヒビター（２１．５ｋ
ｄ）、リゾチーム（１４．４ｋｄ）］を用いた。

【０１５７】その結果、精製された組換え型Ｍｅｇ−Ｐ
ＯＴは分子量約３３，０００に単一バンドを与えた。

【０１５８】実施例２５. 組換え型巨核球増幅因子（Ｍ
ｅｇ−ＰＯＴ）のＮ末端及びＣ末端 アミノ酸配列分析 （i） 実施例２４で得られた組換え型Ｍｅｇ−ＰＯＴ
について、気相式プロテインシークエンサー４７６Ａ型
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い
てＮ末端アミノ酸配列分析を行った。その結果、以下に
示す（ａ）〜（ｃ）の３種類のＮ末端アミノ酸配列が認
められた。

【０１５９】（ａ）Ser-Arg-Thr-Leu-Ala-Gly-Glu-Thr-
Gly-Gln-Glu-Ala-Ala-・・・・ （ｂ）Leu-Ala-Gly-Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-Ala-Ala-Pro-
Leu-Asp-・・・・ （ｃ）Gly-Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-Ala-Ala-Pro-Leu-Asp-
Gly-Val-・・・・ これらの配列は実施例１３における、配列（ａ）〜
（ｃ）に対応する。

【０１６０】（ii） 組換え型Ｍｅｇ−ＰＯＴのＣ末端
アミノ酸配列分析を行った。

【０１６１】組換え型Ｍｅｇ−ＰＯＴに１０ｍｇ／ｍｌ
の臭化シアンを含む７０％ギ酸溶液１００μｌを加え、
室温にて２４時間臭化シアン分解した後、遠心濃縮機に
て過剰の試薬を除いた。その残渣を０．１％ＴＦＡに溶
解し、０．１％ＴＦＡ中で平衡化したＶｙｄａｃ Ｃ４
カラム（４．６×２５０ｍｍ）に添加し、０．１％ＴＦ
Ａ中アセトニトリル濃度を４０分間に８０％まで直線的
に上げ、カラムに吸着した臭化シアン断片を溶出させ
た。得られた２本のピークのうち、Ｃ末ペプチド断片に
ついて更に Ｅｎｄｏ Ａｓｐ−Ｎ消化した。Ｃ末ペプ
チドを５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ８．０）に溶解
し、Ｅｎｄｏ Ａｓｐ−Ｎ を加え、室温にて１６時間
酵素消化した。反応液に１０％ＴＦＡを加えｐＨを３と
した後、０．１％ＴＦＡで平衡化したＶｙｄａｃ Ｃ１
８カラムに添加し、アセトニトリル濃度を４８分間に０
〜４８％に直線的に上げカラムに吸着したペプチドを溶
出させた。得られた断片を気相式プロテインシークエン
サー４７６Ａ型にて分析した結果、Ｃ末断片のアミノ酸
配列は以下に示す如くであった。

【０１６２】Asp-Pro-Ser-Trp-Arg-Gln-Pro-Glu-Arg実施例２６. ＣＨＯ細胞の培養上清中の巨核球増幅因子
（Ｍｅｇ−ＰＯＴ） 活性の測定 実施例２３で得られたＣＨＯ細胞の培養上清及び、実施
例２４で精製した組換え型巨核球増幅因子の巨核球増幅
因子活性を前述した方法に従って測定した。

【０１６３】その結果表６に示したように、巨核球増幅
因子のｃＤＮＡを含むベクターを導入したＣＨＯ細胞の
培養上清は明らかに巨核球増幅因子活性を示し、それよ
り精製した組換え型巨核球増幅因子も巨核球増幅因子活
性を示した。

【０１６４】なお、精製品の蛋白量はアミノ酸分析法に
よりＡｌａ＝２８として算出した。

【０１６５】

【表６】 ＣＨＯ細胞の培養上清中及び精製組換え型Ｍｅｇ−ＰＯＴ の巨核球増幅因子活性 被検々体終濃度 巨核球コロニ−数 ＣＨＯ細胞培養上清 ０．０８％ ４^a) ０．３１％ １１^a) １．２５％ １０．５^a) ５％ １２^a) 精製品 ０．０１ｎｇ／ｍｌ ０^b) ０．１ｎｇ／ｍｌ ６^b) １ｎｇ／ｍｌ ８^b) １０ｎｇ／ｍｌ １１^b) ａ） 形成されたコロニー数からＩＬ−３単独で形成さ
れたコロニー数（２５個）を引いた値。

【０１６６】ｂ） 形成されたコロニー数からＩＬ−３
単独で形成されたコロニー数（２０．５個）を引いた
値。

【０１６７】実施例２７. ＣＨＯ細胞の培養上清から
の組換え型巨核球増幅因子（Ｍｅｇ−ＰＯＴ）の精製II 実施例２３で調製したＣＨＯ細胞の培養上清１０ｌ（１
０リットル）にＴｗｅｅｎ ２０を終濃度が０．０１％
になるように加え、５μｍのメンブランフィルター（富
士フィルム社製）を通して不溶物を除去した。この培養
上清から以下の手順により組換え型巨核球増幅因子を精
製した。

【０１６８】(i) 上記培養上清を、スパイラルカートリ
ッジ（アミコン社製）を用いて20倍に濃縮した。濃縮液
を４゜Cにて撹拌しながら硫安を最終的に50%飽和濃度に
なるように加え、析出した蛋白を遠心操作（10,000g x
30min）により沈澱として集め、10mM トリス塩酸緩衝液
(pH 7.4)に溶解した。その画分に、終濃度が１Mとなる
ように硫安を加え、次の疎水クロマトグラフィーにかけ
た。

【０１６９】(ii)１M 硫安を含む10mM トリス塩酸緩衝
液(pH 7.4)で平衡化したPhenyl-sepharose 6FFカラム
（5.0 x 15cm，Pharmacia 社製）に添加した。カラムを
同緩衝液で洗浄した後、硫安濃度を0.1M まで下げてカ
ラムを再び洗浄後、0.1% Tween 20を含む10mM トリス塩
酸緩衝液(pH 8.5)で組換え型Ｍｅｇ−ＰＯＴを溶出させ
た。この画分をメンブランフィルターＰＭ−１０（アミ
コン社製）にて濃縮後、0.01% Tween 20を含む10mM ト
リス塩酸緩衝液(pH 8.5)で10倍希釈し、アニオン交換ク
ロマトグラフィーにかけた。

【０１７０】(iii)上記画分を希釈に用いた緩衝液にて
平衡化したDEAE-sepharose fast flowカラム（５ x 13c
m）に添加し、同緩衝液にてカラムを洗浄後、同緩衝液
中NaCl濃度を0.1Mに上げてカラムに吸着した蛋白を溶出
した。組換え型Ｍｅｇ−ＰＯＴを含むこの画分を10% TF
Aを加えてｐＨを３とし、次に、下記に示す条件で逆相
ＨＰＬＣにかけた。

【０１７１】(iv)0.1% TFAを含む32%アセトニトリルで
平衡化したVydac C4カラム(10 x 250mm)に上記画分を添
加し、同溶離液にてカラムを洗浄後、0.1% TFA中アセト
ニトリル濃度を64分間に32〜48%まで直線的に上げ、カ
ラムに吸着した蛋白を溶出した。流速は1.0 ml/minで、
蛋白の検出は220nm及び280nmの２波長で行った。40-45%
のアセトニトリル濃度で溶出される画分を集め、0.1% T
FAで２倍に希釈した。この溶液を同条件で逆相ＨＰＬＣ
を行い、40-45%のアセトニトリル濃度に溶出する主要ピ
ークを集め、次のGel Permeation Chromatographyにか
けた。

【０１７２】(v)0.1% TFA を含む40% アセトニトリルで
平衡化したTSK G3000SWカラム(21.5 x60cm)に上記画分
を添加した。流速３ml/minで蛋白の検出は280nmで行っ
た。42-47分間に溶出された主要ピークを集め、0.1% TF
Aで希釈した。

【０１７３】(vi)上記画分を(iv)と同条件にて逆相ＨＰ
ＬＣを行い、主要画分を回収した。

【０１７４】必要に応じて、この画分をカチオン交換ク
ロマトグラフィーにかけ、有機溶媒及びTFAを除いた。
上記画分を0.01% Tween 20 を含む20mM 酢酸緩衝液(pH
5.0)で10倍希釈し、同緩衝液にて平衡化したS-sepharos
e fast flowカラムに添加し、同緩衝液でカラムを洗浄
後、0.3M NaClを含む同緩衝液にて組換え型Ｍｅｇ−Ｐ
ＯＴを溶出させた。

【０１７５】こうして得られた組換え型巨核球増幅因子
（Ｍｅｇ−ＰＯＴ）をＳＤＳ／ＰＡＧＥにて分析した。
ゲル濃度は１２％で、Laemmliの方法 Nature, 227, 680
(1970)に従って泳動し、２Ｄ−銀染色試薬・「第一」
（第一化学薬品製）を用いてタンパク質を染色した。な
お分子量マーカーは実施例１５で使用したバイオラッド
社製低分子量マーカーを用いた。

【０１７６】その結果、精製された組換え型Ｍｅｇ−Ｐ
ＯＴは分子量約３０，０００に単一バンドを与えた。

【０１７７】このものの巨核球増幅因子活性を前述した
方法に従って測定し、実施例２４で得た分子量約３３，
０００のものと比較した。その結果、表７に示したよう
に、分子量約３０，０００のものは測定したいずれの濃
度においても活性を示さなかった。

【０１７８】

【表７】 精製された巨核球増幅因子の巨核球増幅因子活性 分子量 巨核球増幅因子活性^a) 終濃度(ng/ml) 40 10 2.5 0.625 約３３，０００ 11 8.5 5 7 約３０，０００ 1 0.5 0 1.5 a) 形成されたコロニー数からIL-3単独で形成されたコ
ロニー数(25)を引いた値。

【０１７９】実施例２８．組換え型巨核球増幅因子（Ｍ
ｅｇ−ＰＯＴ）のＮ末端及びＣ末端アミノ酸配列分析II (i)実施例２７で得られた分子量約３０，０００の組換
え型Ｍｅｇ−ＰＯＴについて、気相式プロテインシーク
エンサー476A型（Applied Biosystems社製）を用いてＮ
末端アミノ酸配列分析を行った。その結果、以下に示す
（ａ）〜（ｃ）の３種類のＮ末端アミノ酸配列が認めら
れた。

【０１８０】（ａ）Ser-Arg-Thr-Leu-Ala-Gly-Glu-Thr-
Gly-Gln-Glu-Ala-Ala-・・・・ （ｂ）Leu-Ala-Gly-Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-Ala-Ala-Pro-
Leu-Asp-・・・・ （ｃ）Gly-Glu-Thr-Gly-Gln-Glu-Ala-Ala-Pro-Leu-Asp-
Gly-Val-・・・・ これらの配列は、実施例２５における、配列（ａ）〜
（ｃ）に対応する。

【０１８１】(ii)組換え型Ｍｅｇ−ＰＯＴのＣ末端アミ
ノ酸配列分析を行った。

【０１８２】分子量約３０，０００の組換え型Ｍｅｇ−
ＰＯＴに１０ｍｇ／ｍｌの臭化シアンを含む７０％ギ酸
溶液100μlを加え、室温にて２４時間臭化シアン分解し
た後、遠心濃縮機にて過剰の試薬を除いた。その残渣を
０.１％ＴＦＡに溶解し、０.１％ＴＦＡで平衡化したVy
dac Ｃ4カラム（4.6 x 250mm）に添加し、０.１％ＴＦ
Ａ中アセトニトリル濃度を４０分間に８０％まで直線的
に上げ、カラムに吸着した臭化シアン断片を溶出させ
た。流速は１ml/min、ペプチドの検出は220nm及び280nm
で行った。得られた２本のピークについて気相式プロテ
インシークエンサー476A型にて分析した結果、Ｃ末断片
のアミノ酸配列は以下に示す如くであった。

【０１８３】Asp-Ala-Leu-Arg-Gly-Leu-Leu-Pro-Val-Le
u-Gly-Gln-Pro-Ile-Ile-Arg 実施例２５から実施例２８より、分子量約３３，０００
と分子量約３０，０００のアミノ酸配列のＮ末端は同等
であるが、Ｃ末端のみが相違する。一方、巨核球増幅因
子活性については、分子量約３３，０００のものは活性
を示すが、分子量約３０，０００のものは活性を示さな
い。したがって、分子量約３３，０００と約３０，００
０の間のＣ末端のアミノ酸配列中に巨核球増幅因子活性
に関与する重要な部位が存在することが考えられる。

【０１８４】実施例２９． 組換え型巨核球増幅因子
（Ｍｅｇ−ＰＯＴ）の精製III (i)実施例２４のBlue sepharose fast flow カラムから
２Ｍ ＫＣｌにより溶出されたＭｅｇ−ＰＯＴ画分をミ
ニタン（millipore）にて脱塩後、４゜Cにて硫安を50%飽
和になるように加え３０分撹拌し、生じた沈澱を遠心操
作（10,000g x30分間）により集め、蒸留水で溶解し
た。この溶液を４゜Cにて一晩、0.01% Tween 20 を含む1
0mM トリス塩酸緩衝液（pH 8.0）に対して透析し、同緩
衝液にて平衡化したQ-sepharose fast flow カラム（５
x 10cm、Pharmacia）に添加した。同緩衝液にてカラム
を洗浄後、同緩衝液中NaCl濃度を0.1, 0.2, 0.3, 0.5,
1.0M と段階的に上げてカラムに吸着した蛋白質を溶出
させた。各画分をＳＤＳ／ＰＡＧＥにかけた後、実施例
２３で作製したＭｅｇ−ＰＯＴに対する抗体を用いてウ
エスタンブロッティング法でＭｅｇ−ＰＯＴを検出し
た。この時の分子量マーカーは、バイオラッド社製プレ
ステインド分子量マーカー〔ホスフォリラーゼＢ（１０
６ｋｄ）、ウシ血清アルブミン（８０.０ｋｄ）、オボ
アルブミン（４９.５ｋｄ）、炭酸脱水素酵素（３２.５
ｋｄ）、大豆トリプシンインヒビター（２７.５ｋ
ｄ）、リゾチーム（１８.５ｋｄ）〕を用いた。その結
果、分子量約７０，０００にもバンドが染色された（図
９）。この分子種にもＭｅｇ−ＰＯＴ活性が認められる
か否か確認するため、分子量約３３，０００の分子種と
分離すべく以下に示す如く精製を行った。

【０１８５】(ii)分子量約７０，０００の分子種が含ま
れる0.2M NaCl画分に酢酸を加えｐＨを５とした後、0.1
% TFA を含む32% アセトニトリルで平衡化したVydac C4
カラムに添加した。同溶離液にてカラムを洗浄後、0.1%
TFA 中アセトニトリル濃度を32-48% まで40分間に直線
的に上げ、カラムに吸着した蛋白を溶出させた。アセト
ニトリルの濃度が39-41%の画分を集め、次のゲル濾過に
かけた。

【０１８６】(iii)上記画分を0.01% Tween 20 を含むPB
Sで希釈し、セントリプレップ−１０で濃縮し、同緩衝
液にて平衡化したTSK G3000SWカラムに添加した。流速
は３ml/minで、蛋白の検出は220nm及び280nmの２波長で
行った。１ｍｌずつ分画し、一部をコロニー形成法によ
りMeg-POT活性を測定し、またSDS/PAGE後ウエスタンブ
ロティング法により、Ｍｅｇ−ＰＯＴの検出を行った。
その結果、分子量約７０，０００の分子種は、４２〜４
６分に溶出され、その画分には分子量約３３，０００の
分子種は検出されなかった（図１０）。なお、分子量マ
ーカーは前述のバイオラッド社製分子量マーカーを用い
た。

【０１８７】実施例２６と同様に４２〜４６分の画分の
Ｍｅｇ−ＰＯＴ活性を測定したところ、表８に示すごと
く、この４２〜４６分の画分にもＭｅｇ−ＰＯＴ活性が
認められたことから、分子量約７０，０００の分子種に
もＭｅｇ−ＰＯＴ活性があると推定された。

【０１８８】

【表８】 ＣＨＯ細胞の培養上清の各精製画分の巨核球増幅因子活性 ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷ画分（分） 42-43 43-44 44-45 45-46 巨核球増幅因子活性^a) 12 9 10.5 5.5 ａ）：形成されたコロニー数から、ＩＬ−３単独で形成
されたコロニー数（１９．５）を引いた値。

【０１８９】実施例３０． 修飾体の発現ベクターの構
築及びＣＯＳ細胞での発現 （１）pEFNKPOSベクターの構築 修飾体のMeg-POT遺伝子を得るためにPCRを用いた。PCR
に用いるプライマーとして次に示すオリゴヌクレオチド
を配列番号１０に示した遺伝子の塩基配列をもとに381A
DNA Synthesizer(Applied Biosystems社製)を用いて合
成した。

【０１９０】 プライマ−3S :5'-CTGGCTCACCGGCTCTCTGA-3' 組換えCHO細胞の培養上精から精製されたMeg-POTのC末
端付近に存在する動物細胞内プロセシング酵素Furinの
認識配列Arg-x-Arg-Arg²⁹⁵までをコ−ドするMeg-POT遺
伝子を作製し、これを用いてその発現ベクターを構築し
た。

【０１９１】pKPO27を鋳型としてDNA Thermal Cycler(P
erkin Elmer Cetus社製)を用いてPCRを行なった。pKPO2
7 1μgを20mM Tris-HCl(pH8.8),10mM KCl,6mM (NH₄)₂SO
₄,2mM MgCl₂,0.1% Triton X-100,0.1mg/ml BSA,100mM d
eoxynucleotide triphosphate(dNTP),プライマ−3S及び
G982Aそれぞれ100pmolを含む100μlのPCR反応溶液中で
増幅した。まず95℃で6分間変性後、85℃に冷却し2.5単
位のPfu DNA Polymerase(Stratagene社製)を加えた。そ
の後、変性94℃ 1分間、アニ−ル60℃ 30秒間、伸長72
℃、2分間のサイクルを30回繰返してPCRを行なった（図
１１）。サンプルはアガロ−スゲル電気泳動し、増幅さ
れた590bpDNA断片を抽出した。Polynucleotide kinase
を用いてDNAの5'端をリン酸化し、予め制限酵素SmaIと
アルカリフォスファタ−ゼで処理したベクタ−pSP73と
連結し、pSP982Aを得た。この挿入塩基配列をDideoxy s
equencing法にて決定し、982番目のGがTに置換されその
3'側にBamHIサイトがあり、その他に変異がないことを
確認した。

【０１９２】pSP982AとpRVHKPO27を制限酵素SalI、BamH
I処理した後、アガロ−スゲル電気泳動を行ないそれぞ
れより190bp、9.5kbpのDNA断片を回収し、これらを連結
させpEFNKPOSを得た（図１２）。

【０１９３】（２）COS細胞での発現 COS細胞を1×10⁷個／mlになるようにPBSに懸濁し、この
細胞浮遊液0.8mlにpEFNKPOSを20μg加えた。1500V、25
μFDの条件でGenePulsar(BioRad社製)を用いて電気穿孔
法（electroporation）によりプラスミドをCOS細胞に導
入した。エレクトロポレ−ションした細胞を1％ウシ胎
児血清を含むDMEM培地（GIBCO社製）に加え、72時間培
養後培養上清を集めた。それぞれの培養上清をセントリ
プレップ−10で約10倍に濃縮し、SDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動にかけた。実施例２１で得られた大腸菌
にて発現させ精製したMeg-POT蛋白質を抗原として家兎
に免疫して得た抗巨核球増幅因子抗血清を用いて、ウエ
スタンブロッティングを行ない、培養上清中にMeg-POT
修飾体の蓄積を確認した。

【０１９４】この培養上清の巨核球増幅因子活性を前述
した方法に従って測定した。その結果を表９に示した。

【０１９５】

【表９】 COS細胞の培養上清中の巨核球増幅因子活性 COS細胞 巨核球増幅因子活性^a) 培養上清濃度（％） 10 5 2.5 1.25 0.625 対照COS 1 0 0 1 1 pRVHKPO27f導入COS 9.5 9.5 6.5 12 0 pEFNKPOS導入COS 9.5 0.5 1 0 0 a) 形成されたコロニー数からIL-3単独で形成されたコ
ロニー数(40.5)を引いた値。

【０１９６】（３）アミノ酸置換Meg-POT発現ベクター
の構築 PCRに用いるプライマーとして次に示すオリゴヌクレオ
チドを配列番号１０に示した遺伝子の塩基配列をもとに
381A DNA Synthesizer(Applied Biosystems社製)を用い
て合成した。

【０１９７】 プライマ−T3-2 :5'-CATGATTACGCCAAGCTCGAA-3' プライマ−754GA :5'-GCTGCCTCCTCCTGGTCCTGGTCCAGG
GGTCC-3' プライマ−754GS :5'-CCAGGACCAGGAGGAGGCAGCCAGGGC
GGC-3' プライマー850GA :5'-AGCACGGGCACCAGGCCCCGCAGAGCG
TCC-3' プライマー850GS :5'-CTGCGGGGCCTGGTGCCCGTGCTGGGC
CAGCCC-3' pEFNKPOSの252番目のLeuをValに置換したMeg-POT修飾体
発現ベクタ−pEFNKPOL252Vを構築した。上記と同様の条
件でpKPO27 をプライマ−T3-2と850GAの組み合わせと85
0GSとG982Aの組み合わせでそれぞれPCRを行なった。サ
ンプルはゲル電気泳動を行い、それぞれ0.9kbp、150bpD
NAを抽出した。これらDNA断片を混合後、プライマーT3-
2とG982Aを用いて再度PCRを行なった（図１１）。アガ
ロ−スゲル電気泳動を行い、増幅された1kbpDNAを抽出
した。Polynucleotide kinaseを用いてDNAの5'端をリン
酸化し、予め制限酵素SmaIとアルカリフォスファタ−ゼ
で処理したベクタ−pSP73と連結しpSP850Gを得た。この
挿入塩基配列をDideoxy sequencing法にて決定し、850
番目のCがGに、982番目のGがTに置換されその3'側にBam
HIサイトがあり、その他に変異がないことを確認した。
pSP850GとpRVHKPO27を制限酵素SalI、BamHI処理した
後、アガロ−スゲル電気泳動を行ないそれぞれより190b
p、9.5kbpのDNA断片を回収し、これらを連結させpEFNKP
OL252Vを得た（図１２）。

【０１９８】またpEFNKPOSの220番目のGlnをGluに置換
したMeg-POT修飾体発現ベクタ−pEFNKPOQ220Eを構築し
た。上記と同様の条件でpKPO27 をプライマ−T3-2と754
GAの組み合わせと754GSとG982Aの組み合わせでそれぞれ
PCRを行なった。サンプルはゲル電気泳動を行い、それ
ぞれ0.9kbp、150bpDNAを抽出した。これらDNA断片を混
合後、プライマーT3-2とG982Aを用いて再度PCRを行なっ
た。アガロ−スゲル電気泳動を行い、増幅された1kbpDN
Aを抽出した。Polynucleotide kinaseを用いてDNAの5'
端をリン酸化し、予め制限酵素SmaIとアルカリフォスフ
ァタ−ゼで処理したベクタ−pSP73と連結しpSP754Gを得
た。この挿入塩基配列をDideoxy sequencing法にて決定
し、754番目のCがGに、982番目のGがTに置換されその3'
側にBamHIサイトがあり、その他に変異がないことを確
認した。pSP754GとpRVHKPO27を制限酵素EcoRI、BamHI処
理した後、アガロ−スゲル電気泳動を行ないそれぞれよ
り1kbp、8.7kbpのDNA断片を回収し、これらを連結させp
EFNKPOQ220Eを得た（図１２）。

【０１９９】 （４）アミノ酸置換Meg-POTのCOS細胞での発現 上記と同様にして電気穿孔法（electroporation）によ
りpEFNKPOL252V、pEFNKPOQ220E をCOS細胞に導入した。
それぞれの72時間培養上清をセントリプレップ−10で約
10倍に濃縮し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に
かけた。同様に実施例２１で得られた大腸菌にて発現さ
せ精製したMeg-POT蛋白質を抗原として家兎に免疫して
得た抗巨核球増幅因子抗血清を用いてウエスタンブロッ
ティングを行ない、培養上清中にMeg-POT修飾体の蓄積
を確認した。

【０２００】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 配列： Leu Ala Gly Glu Xaa Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu 1 5 10 15 配列番号：２ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 配列： Ala Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu Ala 1 5 10 15 配列番号：３ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 配列： Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu Ala Asn 1 5 10 15 配列番号：４ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 配列： Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu Asp Gly Val Leu 1 5 10 配列番号：５ 配列の長さ：３５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 配列： Leu Ala Val Ala Leu Ala Gln Lys Asn Val Lys Leu Ser Thr Glu 1 5 10 15 Gln Leu Arg Xaa Leu Ala His Arg Leu Ser Glu Pro Pro Glu Asp 20 25 30 Leu Asp Ala Leu Pro 35 配列番号：６ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ＤＮＡ 配列： CTCAACAGAG CAGCTGCGCT GTCTGGCTCA CCGGCTCTCT 40 配列番号：７ 配列の長さ：６９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列： CGC CAA CTC CTT GGC TTC CCG TGT GCG GAG GTG TCC GGC CTG AGC 45 Arg Gln Leu Leu Gly Phe Pro Cys Ala Glu Val Ser Gly Leu Ser 1 5 10 15 ACG GAG CGT GTC CGG GAG CTG GCT 69 Thr Glu Arg Val Arg Glu Leu Ala 20 配列番号：８ 配列の長さ：７５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列： CTC TCT GAG CCC CCC GAG GAC CTG GAC GCC CTC CCA TTG GAC CTG 45 Leu Ser Glu Pro Pro Glu Asp Leu Asp Ala Leu Pro Leu Asp Leu 1 5 10 15 CTG CTA TTC CTC AAC CCA GAT GCG TTC TCG 75 Leu Leu Phe Leu Asn Pro Asp Ala Phe Ser 20 25 配列番号：９ 配列の長さ：１９７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：ヒト 特徴：ヒト膵臓癌患者のリンパ節から得られた培養細胞
に由来し、ヒト巨核球増幅因子活性を有するポリペプチ
ドの一部分をコードするｃＤＮＡ。

【０２０１】 配列： AA CTC CTT GGC TTC CCG TGT GCG GAG GTG TCC GGC CTG AGC ACG 44 Leu Leu Gly Phe Pro Cys Ala Glu Val Ser Gly Leu Ser Thr 1 5 10 GAG CGT GTC CGG GAG CTG GCT GTG GCC TTG GCA CAG AAG AAT GTC 89 Glu Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala Gln Lys Asn Val 15 20 25 AAG CTC TCA ACA GAG CAG CTG CGC TGT CTG GCT CAC CGG CTC TCT 134 Lys Leu Ser Thr Glu Gln Leu Arg Cys Leu Ala His Arg Leu Ser 30 35 40 GAG CCC CCC GAG GAC CTG GAC GCC CTC CCA TTG GAC CTG CTG CTA 179 Glu Pro Pro Glu Asp Leu Asp Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Leu 45 50 55 TTC CTC AAC CCA GAT GCG 197 Phe Leu Asn Pro Asp Ala 60 65 配列番号：１０ 配列の長さ：２１２９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：ヒト 直接の起源：プラスミドｐＫＰＯ２７ 特徴：ヒト膵臓癌患者のリンパ節から得られた培養細胞
に由来し、ヒト巨核球増幅因子活性を有するポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡ。

【０２０２】 配列： GAATTCGGCA CGAGGCCACT CCCGTCTGCT GTGACGCGCG GACAGAGAGC 50 TACCGGTGGA CCCACGGTGC CTCCCTCCCT GGGATCTACA CAGACC ATG GCC 102 Met Ala 1 TTG CCA ACG GCT CGA CCC CTG TTG GGG TCC TGT GGG ACC CCC GCC 147 Leu Pro Thr Ala Arg Pro Leu Leu Gly Ser Cys Gly Thr Pro Ala 5 10 15 CTC GGC AGC CTC CTG TTC CTG CTC TTC AGC CTC GGA TGG GTG CAG 192 Leu Gly Ser Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Leu Gly Trp Val Gln 20 25 30 CCC TCG AGG ACC CTG GCT GGA GAG ACA GGG CAG GAG GCT GCA CCC 237 Pro Ser Arg Thr Leu Ala Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro 35 40 45 CTG GAC GGA GTC CTG GCC AAC CCA CCT AAC ATT TCC AGC CTC TCC 282 Leu Asp Gly Val Leu Ala Asn Pro Pro Asn Ile Ser Ser Leu Ser 50 55 60 CCT CGC CAA CTC CTT GGC TTC CCG TGT GCG GAG GTG TCC GGC CTG 327 Pro Arg Gln Leu Leu Gly Phe Pro Cys Ala Glu Val Ser Gly Leu 65 70 75 AGC ACG GAG CGT GTC CGG GAG CTG GCT GTG GCC TTG GCA CAG AAG 372 Ser Thr Glu Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala Gln Lys 80 85 90 AAT GTC AAG CTC TCA ACA GAG CAG CTG CGC TGT CTG GCT CAC CGG 417 Asn Val Lys Leu Ser Thr Glu Gln Leu Arg Cys Leu Ala His Arg 95 100 105 CTC TCT GAG CCC CCC GAG GAC CTG GAC GCC CTC CCA TTG GAC CTG 462 Leu Ser Glu Pro Pro Glu Asp Leu Asp Ala Leu Pro Leu Asp Leu 110 115 120 CTG CTA TTC CTC AAC CCA GAT GCG TTC TCG GGG CCC CAG GCC TGC 507 Leu Leu Phe Leu Asn Pro Asp Ala Phe Ser Gly Pro Gln Ala Cys 125 130 135 ACC CGT TTC TTC TCC CGC ATC ACG AAG GCC AAT GTG GAC CTG CTC 552 Thr Arg Phe Phe Ser Arg Ile Thr Lys Ala Asn Val Asp Leu Leu 140 145 150 CCG AGG GGG GCT CCC GAG CGA CAG CGG CTG CTG CCT GCG GCT CTG 597 Pro Arg Gly Ala Pro Glu Arg Gln Arg Leu Leu Pro Ala Ala Leu 155 160 165 GCC TGC TGG GGT GTG CGG GGG TCT CTG CTG AGC GAG GCT GAT GTG 642 Ala Cys Trp Gly Val Arg Gly Ser Leu Leu Ser Glu Ala Asp Val 170 175 180 CGG GCT CTG GGA GGC CTG GCT TGC GAC CTG CCT GGG CGC TTT GTG 687 Arg Ala Leu Gly Gly Leu Ala Cys Asp Leu Pro Gly Arg Phe Val 185 190 195 GCC GAG TCG GCC GAA GTG CTG CTA CCC CGG CTG GTG AGC TGC CCG 732 Ala Glu Ser Ala Glu Val Leu Leu Pro Arg Leu Val Ser Cys Pro 200 205 210 GGA CCC CTG GAC CAG GAC CAG CAG GAG GCA GCC AGG GCG GCT CTG 777 Gly Pro Leu Asp Gln Asp Gln Gln Glu Ala Ala Arg Ala Ala Leu 215 220 225 CAG GGC GGG GGA CCC CCC TAC GGC CCC CCG TCG ACA TGG TCT GTC 822 Gln Gly Gly Gly Pro Pro Tyr Gly Pro Pro Ser Thr Trp Ser Val 230 235 240 TCC ACG ATG GAC GCT CTG CGG GGC CTG CTG CCC GTG CTG GGC CAG 867 Ser Thr Met Asp Ala Leu Arg Gly Leu Leu Pro Val Leu Gly Gln 245 250 255 CCC ATC ATC CGC AGC ATC CCG CAG GGC ATC GTG GCC GCG TGG CGG 912 Pro Ile Ile Arg Ser Ile Pro Gln Gly Ile Val Ala Ala Trp Arg 260 265 270 CAA CGC TCC TCT CGG GAC CCA TCC TGG CGG CAG CCT GAA CGG ACC 957 Gln Arg Ser Ser Arg Asp Pro Ser Trp Arg Gln Pro Glu Arg Thr 275 280 285 ATC CTC CGG CCG CGG TTC CGG CGG GAA GTG GAG AAG ACA GCC TGT 1002 Ile Leu Arg Pro Arg Phe Arg Arg Glu Val Glu Lys Thr Ala Cys 290 295 300 CCT TCA GGC AAG AAG GCC CGC GAG ATA GAC GAG AGC CTC ATC TTC 1047 Pro Ser Gly Lys Lys Ala Arg Glu Ile Asp Glu Ser Leu Ile Phe 305 310 315 TAC AAG AAG TGG GAG CTG GAA GCC TGC GTG GAT GCG GCC CTG CTG 1092 Tyr Lys Lys Trp Glu Leu Glu Ala Cys Val Asp Ala Ala Leu Leu 320 325 330 GCC ACC CAG ATG GAC CGC GTG AAC GCC ATC CCC TTC ACC TAC GAG 1137 Ala Thr Gln Met Asp Arg Val Asn Ala Ile Pro Phe Thr Tyr Glu 335 340 345 CAG CTG GAC GTC CTA AAG CAT AAA CTG GAT GAG CTC TAC CCA CAA 1182 Gln Leu Asp Val Leu Lys His Lys Leu Asp Glu Leu Tyr Pro Gln 350 355 360 GGT TAC CCC GAG TCT GTG ATC CAG CAC CTG GGC TAC CTC TTC CTC 1227 Gly Tyr Pro Glu Ser Val Ile Gln His Leu Gly Tyr Leu Phe Leu 365 370 375 AAG ATG AGC CCT GAG GAC ATT CGC AAG TGG AAT GTG ACG TCC CTG 1272 Lys Met Ser Pro Glu Asp Ile Arg Lys Trp Asn Val Thr Ser Leu 380 385 390 GAG ACC CTG AAG GCT TTG CTT GAA GTC AAC AAA GGG CAC GAA ATG 1317 Glu Thr Leu Lys Ala Leu Leu Glu Val Asn Lys Gly His Glu Met 395 400 405 AGT CCT CAG GTG GCC ACC CTG ATC GAC CGC TTT GTG AAG GGA AGG 1362 Ser Pro Gln Val Ala Thr Leu Ile Asp Arg Phe Val Lys Gly Arg 410 415 420 GGC CAG CTA GAC AAA GAC ACC CTA GAC ACC CTG ACC GCC TTC TAC 1407 Gly Gln Leu Asp Lys Asp Thr Leu Asp Thr Leu Thr Ala Phe Tyr 425 430 435 CCT GGG TAC CTG TGC TCC CTC AGC CCC GAG GAG CTG AGC TCC GTG 1452 Pro Gly Tyr Leu Cys Ser Leu Ser Pro Glu Glu Leu Ser Ser Val 440 445 450 CCC CCC AGC AGC ATC TGG GCG GTC AGG CCC CAG GAC CTG GAC ACG 1497 Pro Pro Ser Ser Ile Trp Ala Val Arg Pro Gln Asp Leu Asp Thr 455 460 465 TGT GAC CCA AGG CAG CTG GAC GTC CTC TAT CCC AAG GCC CGC CTT 1542 Cys Asp Pro Arg Gln Leu Asp Val Leu Tyr Pro Lys Ala Arg Leu 470 475 480 GCT TTC CAG AAC ATG AAC GGG TCC GAA TAC TTC GTG AAG ATC CAG 1587 Ala Phe Gln Asn Met Asn Gly Ser Glu Tyr Phe Val Lys Ile Gln 485 490 495 TCC TTC CTG GGT GGG GCC CCC ACG GAG GAT TTG AAG GCG CTC AGT 1632 Ser Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Glu Asp Leu Lys Ala Leu Ser 500 505 510 CAG CAG AAT GTG AGC ATG GAC TTG GCC ACG TTC ATG AAG CTG CGG 1677 Gln Gln Asn Val Ser Met Asp Leu Ala Thr Phe Met Lys Leu Arg 515 520 525 ACG GAT GCG GTG CTG CCG TTG ACT GTG GCT GAG GTG CAG AAA CTT 1722 Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val Ala Glu Val Gln Lys Leu 530 535 540 CTG GGA CCC CAC GTG GAG GGC CTG AAG GCG GAG GAG CGG CAC CGC 1767 Leu Gly Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala Glu Glu Arg His Arg 545 550 555 CCG GTG CGG GAC TGG ATC CTA CGG CAG CGG CAG GAC GAC CTG GAC 1812 Pro Val Arg Asp Trp Ile Leu Arg Gln Arg Gln Asp Asp Leu Asp 560 565 570 ACG CTG GGG CTG GGG CTA CAG GGC GGC ATC CCC AAC GGC TAC CTG 1857 Thr Leu Gly Leu Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn Gly Tyr Leu 575 580 585 GTC CTA GAC CTC AGC GTG CAA GAG GCC CTC TCG GGG ACG CCC TGC 1902 Val Leu Asp Leu Ser Val Gln Glu Ala Leu Ser Gly Thr Pro Cys 590 595 600 CTC CTA GGA CCT GGA CCT GTT CTC ACC GTC CTG GCA CTG CTC CTA 1947 Leu Leu Gly Pro Gly Pro Val Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Leu 605 610 615 GCC TCC ACC CTG GCC TGA 1965 Ala Ser Thr Leu Ala 620 GGGCCCCACT CCCTTGCTGG CCCCAGCCCT GCTGGGGATC CCCGCCTGGC 2015 CAGGAGCAGG CACGGGTGAT CCCCGTTCCA CCCCAAGAGA ACTCGCGCTC 2065 AGTAAACGGG AACATGCCCC CTGCAGACAC GTAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2115 AAAAAAAACT CGAG 2129 配列番号：１１ 配列の長さ：１７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド 配列： Ser Arg Thr Leu Ala Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu 1 5 10 15 Asp Gly 配列番号：１２ 配列の長さ：５８４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro 1 5 Leu Asp Gly Val Leu Ala Asn Pro Pro Asn Ile Ser Ser Leu Ser 10 15 20 Pro Arg Gln Leu Leu Gly Phe Pro Cys Ala Glu Val Ser Gly Leu 25 30 35 Ser Thr Glu Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala Gln Lys 40 45 50 Asn Val Lys Leu Ser Thr Glu Gln Leu Arg Cys Leu Ala His Arg 55 60 65 Leu Ser Glu Pro Pro Glu Asp Leu Asp Ala Leu Pro Leu Asp Leu 70 75 80 Leu Leu Phe Leu Asn Pro Asp Ala Phe Ser Gly Pro Gln Ala Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Phe Ser Arg Ile Thr Lys Ala Asn Val Asp Leu Leu 100 105 110 Pro Arg Gly Ala Pro Glu Arg Gln Arg Leu Leu Pro Ala Ala Leu 115 120 125 Ala Cys Trp Gly Val Arg Gly Ser Leu Leu Ser Glu Ala Asp Val 130 135 140 Arg Ala Leu Gly Gly Leu Ala Cys Asp Leu Pro Gly Arg Phe Val 145 150 155 Ala Glu Ser Ala Glu Val Leu Leu Pro Arg Leu Val Ser Cys Pro 160 165 170 Gly Pro Leu Asp Gln Asp Gln Gln Glu Ala Ala Arg Ala Ala Leu 175 180 185 Gln Gly Gly Gly Pro Pro Tyr Gly Pro Pro Ser Thr Trp Ser Val 190 195 200 Ser Thr Met Asp Ala Leu Arg Gly Leu Leu Pro Val Leu Gly Gln 205 210 215 Pro Ile Ile Arg Ser Ile Pro Gln Gly Ile Val Ala Ala Trp Arg 220 225 230 Gln Arg Ser Ser Arg Asp Pro Ser Trp Arg Gln Pro Glu Arg Thr 235 240 245 Ile Leu Arg Pro Arg Phe Arg Arg Glu Val Glu Lys Thr Ala Cys 250 255 260 Pro Ser Gly Lys Lys Ala Arg Glu Ile Asp Glu Ser Leu Ile Phe 265 270 275 Tyr Lys Lys Trp Glu Leu Glu Ala Cys Val Asp Ala Ala Leu Leu 280 285 290 Ala Thr Gln Met Asp Arg Val Asn Ala Ile Pro Phe Thr Tyr Glu 295 300 305 Gln Leu Asp Val Leu Lys His Lys Leu Asp Glu Leu Tyr Pro Gln 310 315 320 Gly Tyr Pro Glu Ser Val Ile Gln His Leu Gly Tyr Leu Phe Leu 325 330 335 Lys Met Ser Pro Glu Asp Ile Arg Lys Trp Asn Val Thr Ser Leu 340 345 350 Glu Thr Leu Lys Ala Leu Leu Glu Val Asn Lys Gly His Glu Met 355 360 365 Ser Pro Gln Val Ala Thr Leu Ile Asp Arg Phe Val Lys Gly Arg 370 375 380 Gly Gln Leu Asp Lys Asp Thr Leu Asp Thr Leu Thr Ala Phe Tyr 385 390 395 Pro Gly Tyr Leu Cys Ser Leu Ser Pro Glu Glu Leu Ser Ser Val 400 405 410 Pro Pro Ser Ser Ile Trp Ala Val Arg Pro Gln Asp Leu Asp Thr 415 420 425 Cys Asp Pro Arg Gln Leu Asp Val Leu Tyr Pro Lys Ala Arg Leu 430 435 440 Ala Phe Gln Asn Met Asn Gly Ser Glu Tyr Phe Val Lys Ile Gln 445 450 455 Ser Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Glu Asp Leu Lys Ala Leu Ser 460 465 470 Gln Gln Asn Val Ser Met Asp Leu Ala Thr Phe Met Lys Leu Arg 475 480 485 Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val Ala Glu Val Gln Lys Leu 490 495 500 Leu Gly Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala Glu Glu Arg His Arg 505 510 515 Pro Val Arg Asp Trp Ile Leu Arg Gln Arg Gln Asp Asp Leu Asp 520 525 530 Thr Leu Gly Leu Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn Gly Tyr Leu 535 540 545 Val Leu Asp Leu Ser Val Gln Glu Ala Leu Ser Gly Thr Pro Cys 550 555 560 Leu Leu Gly Pro Gly Pro Val Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Leu 565 570 575 Ala Ser Thr Leu Ala 580 584 配列番号：１３ 配列の長さ：２４８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro 1 5 Leu Asp Gly Val Leu Ala Asn Pro Pro Asn Ile Ser Ser Leu Ser 10 15 20 Pro Arg Gln Leu Leu Gly Phe Pro Cys Ala Glu Val Ser Gly Leu 25 30 35 Ser Thr Glu Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala Gln Lys 40 45 50 Asn Val Lys Leu Ser Thr Glu Gln Leu Arg Cys Leu Ala His Arg 55 60 65 Leu Ser Glu Pro Pro Glu Asp Leu Asp Ala Leu Pro Leu Asp Leu 70 75 80 Leu Leu Phe Leu Asn Pro Asp Ala Phe Ser Gly Pro Gln Ala Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Phe Ser Arg Ile Thr Lys Ala Asn Val Asp Leu Leu 100 105 110 Pro Arg Gly Ala Pro Glu Arg Gln Arg Leu Leu Pro Ala Ala Leu 115 120 125 Ala Cys Trp Gly Val Arg Gly Ser Leu Leu Ser Glu Ala Asp Val 130 135 140 Arg Ala Leu Gly Gly Leu Ala Cys Asp Leu Pro Gly Arg Phe Val 145 150 155 Ala Glu Ser Ala Glu Val Leu Leu Pro Arg Leu Val Ser Cys Pro 160 165 170 Gly Pro Leu Asp Gln Asp Gln Gln Glu Ala Ala Arg Ala Ala Leu 175 180 185 Gln Gly Gly Gly Pro Pro Tyr Gly Pro Pro Ser Thr Trp Ser Val 190 195 200 Ser Thr Met Asp Ala Leu Arg Gly Leu Leu Pro Val Leu Gly Gln 205 210 215 Pro Ile Ile Arg Ser Ile Pro Gln Gly Ile Val Ala Ala Trp Arg 220 225 230 Gln Arg Ser Ser Arg Asp Pro Ser Trp Arg Gln Pro Glu Arg 235 240 245 248

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は実施例３におけるステップ−７の逆相Ｈ
ＰＬＣ(III）の結果を示す。

【図２】図２はプラスミドｐＫＰＯ２７の構造を示す。

【図３】図３はプラスミドｐＲＶＨＫＰＯ２７の構造を
示す。

【図４】図４はプラスミドｐＲＶＨＫＰＯ２７ｆの構造
を示す。

【図５】図５はプラスミドｐＣＩＴＥ・ＫＰＯ２７の構
造を示す。

【図６】図６はプラスミドｐＭＢＰＫＰＯ２７の構造を
示す。

【図７】図７はプラスミドｐＥＦＤＫＰＯｆの構造を示
す。

【図８】図８は、ＣＨＯ細胞を用いて発現した培養上清
をＳＤＳ／ＰＡＧＥにて分析して、Ｎ末近傍の合成ペプ
チドを抗原として作成した抗体を用いたウエスタンブロ
ットの図（電気泳動図）を示す。レーン１：分子量マー
カー、レーン２：サンプル。

【図９】図９は、ＣＨＯ細胞を用いて発現した培養上清
の各精製画分（実施例２９（i）参照）をＳＤＳ／ＰＡ
ＧＥにて分析して、実施例２４で作製するＭｅｇ−ＰＯ
Ｔに対する抗体を用いて行ったウエスタンブロットの図
（電気泳動図）を示す。レーン１：分子量マーカー、レ
ーン２：素通りおよび洗浄画分、レーン３：０．１Ｍ
ＮａＣｌ画分、レーン４：０．２Ｍ ＮａＣｌ画分、レ
ーン５：０．３ＭＮａＣｌ画分、レーン６：０．５Ｍ
ＮａＣｌ画分、レーン７：１．０Ｍ ＮａＣｌ画分。

【図１０】図１０は、ＣＨＯ細胞を用いて発現した培養
上清の各精製画分（実施例２９（iii）参照）をＳＤＳ
／ＰＡＧＥにかけた後行ったウエスタンブロットの図
（電気泳動図）を示す。レーン１：溶出時間４２〜４３
分の画分、レーン２：溶出時間４３〜４４分の画分、レ
ーン３：溶出時間４４〜４５分の画分、レーン４：溶出
時間４５〜４６分の画分。

【図１１】図１１は、修飾体Ｍｅｇ−ＰＯＴ発現ベクタ
ー構築のために実施したＰＣＲのプライマーの位置を示
す。

【図１２】図１２は、修飾体Ｍｅｇ−ＰＯＴ発現ベクタ
ーｐＥＦＮＫＰＯＳ、ｐＥＦＮＫＰＯＬ２５２Ｖ、ｐＥ
ＦＮＫＰＯＱ２２０Ｅの構造を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｋ 38/00 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 服部 有宏 静岡県御殿場市駒門１丁目135番地 中 外製薬株式会社内 (56)参考文献 特開 平６−92997（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−295500（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−247095（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−255396（ＪＰ，Ａ) Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．（1987）, Ｖｏｌ．15，Ｎｏ．８，ｐ．845−853 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 C07K 14/00 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (18)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の (a) 又は (b) のタンパク質をコード
   するＤＮＡ： (a) 配列番号１２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質 (b) アミノ酸配列 (a) において、１若しくは数個のアミノ
   酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含
   み、かつ巨核球増幅因子活性を有するタンパク質。
2. 【請求項２】 配列番号１２に示すアミノ酸配列からな
   るタンパク質をコードするＤＮＡとストリンジェントな
   条件下でハイブリダイズし、かつ巨核球増幅因子活性を
   有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項１又は２記載のＤＮＡを含有する
   組換えベクター。
4. 【請求項４】 請求項３記載の組換えベクターにより形
   質転換された原核または真核宿主細胞。
5. 【請求項５】 請求項４記載の宿主細胞を培養し、産生
   されたタンパク質を分離することを特徴とする組換えタ
   ンパク質の製造方法。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の方法により製造された
   組換えタンパク質。
7. 【請求項７】 以下の (a) 又は (b) の組換えタンパク質： (a) 配列番号１２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質 (b) アミノ酸配列 (a) において、１若しくは数個のアミノ
   酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含
   み、かつ巨核球増幅因子活性を有するタンパク質。
8. 【請求項８】 請求項２に記載のＤＮＡによりコードさ
   れ、かつ巨核球増幅因子活性を有する組換えタンパク
   質。
9. 【請求項９】 以下の (a) 又は (b) のタンパク質をコード
   するＤＮＡ： (a) 配列番号１３に示すアミノ酸配列を含むタンパク質 (b) アミノ酸配列 (a) において、１若しくは数個のアミノ
   酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含
   み、かつ巨核球増幅因子活性を有するタンパク質。
10. 【請求項１０】 配列番号１３に示すアミノ酸配列から
    なるタンパク質をコードするＤＮＡとストリンジェント
    な条件下でハイブリダイズし、かつ巨核球増幅因子活性
    を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
11. 【請求項１１】 請求項９又は１０記載のＤＮＡを含有
    する組換えベクター。
12. 【請求項１２】 請求項１１記載の組換えベクターによ
    り形質転換された原核または真核宿主細胞。
13. 【請求項１３】 請求項１２記載の宿主細胞を培養し、
    産生されたタンパク質を分離することを特徴とする組換
    えタンパク質の製造方法。
14. 【請求項１４】 請求項１３に記載の方法により製造さ
    れた組換えタンパク質。
15. 【請求項１５】 以下の (a) 又は (b) の組換えタンパク
    質： (a) 配列番号１３に示すアミノ酸配列を含むタンパク質 (b) アミノ酸配列 (a) において、１若しくは数個のアミノ
    酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含
    み、かつ巨核球増幅因子活性を有するタンパク質。
16. 【請求項１６】 請求項１０に記載のＤＮＡによりコー
    ドされ、かつ巨核球増幅因子活性を有する組換えタンパ
    ク質。
17. 【請求項１７】 配列番号１２又は１３に示すアミノ酸
    配列からなるタンパク質に結合する抗体。
18. 【請求項１８】 配列番号１２又は１３に示すアミノ酸
    配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換
    若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ巨核球増
    幅因子活性を有するタンパク質に結合する抗体。