WO2005025600A1

WO2005025600A1 - 接着性を有する細胞の末梢血への動員を阻害する薬剤

Info

Publication number: WO2005025600A1
Application number: PCT/JP2004/013593
Authority: WO
Inventors: Haruchika Masuda; Takayuki Asahara; Kiyoshi Ando; Seiji Sugimoto; Kazuhiro Sakurada
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.; Tokai University
Priority date: 2003-09-11
Filing date: 2004-09-10
Publication date: 2005-03-24
Also published as: JPWO2005025600A1

Abstract

癌をはじめとする血管形成の異常により病態が進行する疾患、動脈硬化などの疾患を治療することが求められている。ＳＣＧＦを有効成分として含有する接着性を有する細胞の末梢血中への動員を阻害する薬剤を用いることにより、固形腫瘍の増殖または転移形成、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症および乾せんなどの血管形成の異常により病態が進行する疾患、動脈硬化などを治療することができる。

Description

接着性を有する細胞の末梢血への動員を阻害する薬剤技術分野

本発明は、造血幹細胞増殖因子（Stem Cell Growth Factor；以下、 SCGFと称す）を有効成分として含有する接着性を有する細胞の末梢血への動員を阻害する薬斉 |Jおよびその用途に関する。明背景技術書

' SCGFは慢性骨髄性白血病の患者から樹立された骨髄球系細胞株 KPB-M15より分離同定された因子である（HiraokaA., Ohkubo T, Fukuda M, Cancer Res. 1987; 47: 5025-5030.) 。

SCGFは N型糖鎖を持たない 29- kDaの蛋白であり、 C型レクチンのフアミリーに属する (HiraokaA, SugimotoA, Seki Tet al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997; 94:7577-7582.) 。

SCGF遺伝子は in situ hybridizationの解析から骨ならびに骨髄で発現していることが示されている（HiraokaA, Yano K, Kagami N et al. Hematol. J. 2001; 2: 307-315.) 。 SCGF は単独では造血系細胞のコロニー形成促進活性を有していないが、エリスロポエチンある' レは GM-CSF (Granulocyte-Macrophage - colony - stimulating- fator)と組み合わせると、赤芽球系や、顆粒球'マクロファージ系のコロニー形成促進活性が観察される（Hiraoka A, Sugimoto A, Seki T et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997; 94:7577-7582.) 。また、同様に VEGF (vascular endothelial growth factor)と組み合わせることで、 AC133陽性の前駆細胞の血管内皮細胞への分化が促進される（Gehling UM, Ergun S, Schumacher U, et al. Blood 2000; 95:3106-3112.) 。

一方、骨髄移植に伴う造血系の回復と並行して血清中の SCGF量が増力 Πすることも観察されている (ItoC, SatoH, Ando K, et al. Bone Marrow Transplantation 20O3; 31:391-398.)。また RT-PCRを用いた解析から骨髄中の CD34陽性細胞、 CD34陰性かつ CD33陽性の細胞では SCGFが生産されているが、スト口一マ細胞や末梢血の造血系細胞では生産されないことも見出されている (Ito C, Sato H, Ando K, et al. Bone Marrow Transplantation 2003; 31:391-398.) 。従って、血清中の SCGFの増加は造血幹細胞の増加に伴 ¾誘導されると推定される。このように SCGFの in vitroでの活性や発現部位に関してはある程度明らかにされているが、生体内での働きについては現在まで解明されていない。

近年、種々の成体内組織において、幹細胞、前駆細胞の存在が認められ、これら幹細胞、前駆細胞が病理学的ノ生理学的な組織 ·器官の再生を司っていると考えられるようになつてきた。例えば、悪性腫瘍の発生に血管形成が関与していることや（Sussman LK, Upalakalin JN， Roberts MJ， Kocher 0， and Benjamin LE. Cancer Biol. Ther. 2003 ;2:255-6.) 、動脈硬化における血管閉塞に骨髄幹細胞が関与していることが示されており（Sata M， Saiura A, Kunisato A, To jo A, Okada S， Tokuhisa T， Hirai H， Makuuchi M, Hirata Y, and Nagai R. Nat. Med. 2002;8:403-9.) 、このような幹細胞の末梢血中への動員を抑制することができれば動脈硬化等の疾患が治療できると考えられる。しかし、このような幹細胞の末梢血中への動員を阻害する因子は現時点では見出されていない。発明の開示

本発明の目的は、 SCGFを有効成分として含有する骨髄幹細胞または前駆細胞などの接着性を有する細胞の末梢血中への動員を阻害する薬剤およびその用途を提供することにある。本発明は、以下の（1) 〜（17) に関する。

(1) 造血幹細胞増殖因子（SCGF) を有効成分として含有する接着性を有する細胞の末梢血への動員を阻害する薬剤。

(2) 造血幹細胞増殖因子（SCGF) が、配列番号 1記載のアミノ酸配列を有する夕ンパク質である上記 (1) 記載の薬剤。

(3) 造血幹細胞増殖因子（SCGF) が、配列番号 1記載のアミノ酸配列において 1 以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ造血幹細胞増殖活性を有する上記 (1) 記載の薬剤。

(4) 造血幹細胞増殖因子（SCGF) が、化学修飾された造血幹細胞増殖因子（SC GF) である、上言己 (1) 〜（3) のいずれか 1項に記載の薬剤。

(5) 化学修飾がポリアルキレングリコ一ル修飾である、上記（4) 記載の薬剤。

(6) 接着性を有する細胞が成体多能性幹細胞である、上記（1) 〜（5) のいずれか 1項に記載の薬剤。 ( 7 ) 接着性を有する細胞が骨髄中の接着性を有する多能性幹細胞または前駆細胞である、上記（1) 〜（6) のいずれか 1項に記載の薬剤。

(8) 前駆細胞が、血管前駆細胞、単球，顆粒球共通前駆細胞および平滑筋前駆細胞からなる群から選ばれる細胞である、上記（7) 記載の薬剤。

(9) 上記（ 1) 〜（8) のいずれか 1項に記載の薬剤を有効成分とする血管形成阻害剤。

(10) 上記 (1) 〜（8) のいずれか 1項に記載の薬剤を有効成分とする顆粒球 ·単球新生阻害剤。

(11) 上記 (1) 〜（8) のいずれか 1項に記載の薬剤を有効成分とする抗腫瘍剤。 (12) 上記 (1) 〜（8) のいずれか 1項に記載の薬剤を有効成分とする抗炎症剤。

(13) 上記 (1) 〜（8) のいずれか 1項に記載の薬剤を有効成分とする動脈硬化治療剤。 •

(14) 上記 (1) 〜（8) のいずれか 1項に記載の薬剤を有効成分とする血管形成の異常により病態力 S進行する疾患の治療剤。

(15) 血管形成の異常により病態が進行する疾患が、固形腫瘍の増殖または転移形成、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症および乾せんからなる群から選ばれる疾患である、上記（14) 記載の治療剤。

(16) 造血幹細胞増殖因子（SCGF) を投与することを特徴とする、接着性を有する細胞の末梢血への動員を阻害する方法。

(17) 接着 4生を有する細胞の末梢血への動員を阻害する薬剤を製造するための造血幹細胞増殖因子（SCGF) の使用。本発明は造血幹細胞増殖因子（以下、 SCGFと称す）を有効成分として含有する接着性を有する細胞の末梢血への動員を阻害する薬剤に関する。

SCGFとしては、

( 1 ) 配列番号 1記載のアミノ酸配列を有するポリぺプチド

(2) 配列番号 1記載のアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ造血幹細胞増殖活性を有するポリぺプチド (3) 配列番号 1記載のアミノ酸配列と 60%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ造血幹細胞増殖活性を有するポリぺプチド

( 4 ) 配列番号 1記載で表されるァミノ酸配列を有するポリペプチドの自然に生ずるァレル変異体

などがあげられる。

本発明のポリペプチドは、造血幹細胞増殖活性を有するポリペプチドである。上記（2) 〜（4) に記載のポリペプチドは、上記（1) 記載のポリペプチドと実質的に同一の活性を有していれよく、性質的に同一であれば、活性の強度の程度、分子量などの量的要素は（1) 記載のポリペプチドと異なっていてもよい。

配列番号 1記載のアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ造血幹細胞増殖活性を有するポリペプチドは、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (以下、モレキュラー 'クロ一ニング第 2版と略す）、 CurrentProtocols inMolecular Biology, ： iohn Wiley & Sons (1987-1997) (以下、カレント 'プロトコ一ルズ ·イン 'モレキユラ一 ·/ヽ、ィォロジ一と略す）、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号 1で示されるァミノ酸配列を有するポリぺプチドコ一ドする D NA'に咅立特異的変異を導入することにより、取得することができる。

欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、 1個から数十個、好ましくは：！〜 20個、より好ましくは 1〜10個、さらに好ましくは 1〜5個である。また、本発明のポリペプチドが造血幹細胞増殖活性を有するためには、配列番号 1記載のアミノ酸配列と、 60%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上、特に好ましくは 95 %以上の相同性を有する。

ァミノ酸配歹リや塩基配列の相同性は、 Kar 1 i n and Al t s chu 1によるァルゴリズム BLAST [Pro Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]や FASTA[Methods Enzymol., 183> 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズム BLASTに基づいて、 BLASTNや BLASTXとよばれるプログラムが開発されている [J. Mol. Biol., 215, 403(1990)] 。 BLASTに基づいて BLASTN よって塩基配列を解析する場合には、パラメータ一は例えば Score= 100 word l ength = 12とする。また、 BLASTに基づいて BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータ一は例えば score= 50 dl ength= 3とする。 BLASTと Gapped BLAST プログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である (ht tp : //w . ncbi . nlm. nih. gov. )

また、 SCGFが、配列番号 1記載のアミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列からなるとは、 BLAST (Bas i c Local Al ignment Search Too l) によって、 SCGFとのアミノ酸配列の相同性を検索した際に、 6 0 %、好ましくは 8 0 %、より好ましくは 9 0 %、特に好ましくは 9 5 %以上の相同性を有するタンパク質があげられる。ここで該タンパク質は SCGFのアミノ酸配列と比較して、その配列中のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入のいずれによって変ィ匕していてもよい。

また本発明に用いられる SCGFは、化学修飾されていてもよい。化学修飾の方法としては、例えば W00O/51626に記載の方法等があげられ、 SCGFをポリエチレングリコール（PEG) 等で修飾したものも本発明に用いられる SCGFに包含される。

, 本発明における接着性を有する細胞とは、骨髄、血管などの組織または細胞に対して接着する性質を有する細胞のことをいい、具体的には成体多能性細胞があげられる。成体多能性幹糸 H胞とは、生体内の各組織に存在し、種々の成熟細胞になることが可能な幹細胞をいう。

また、骨髄中に存在する接着性の多能性幹細胞、前駆細胞なども本発明の接着性を有する細胞として包含される。前駆細胞としては、血管前駆細胞（以下、 EPCとも称す）、単球 · 顆粒球共通前駆細胞、平滑筋前駆細胞などがあげられる。

接着性を有する細胞の末梢血への動員は、末梢血由来細胞を遠心分離により回収後、接着性細胞を培養するための培養皿を用いて接着細胞のみを選択的に培養することで同定することができる。

上述した接着性を有する細胞は組織の再生 ·修復に重要な役割を果たすとともに、悪性腫瘍での血管形成促進、血管の閉塞などの病理に関係している。したがって、本発明の薬剤は接着 'i'feを有する細胞を末梢血中への動員を阻害することにより、血管形成阻害剤、単球 ·顆粒球新生阻害剤、組織の炎症または腫瘍形成などを抑制する抗炎症剤または抗腫瘍剤、血管形成の異常により病態が進行する疾患、動脈硬化などの疾患の治療剤として用いることができる。血管形成の異常により病態が進行する疾患としては、固形腫瘍の増殖または転移形成、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、乾せんなどがあげられる。

本発明の薬剤は、治療剤として単独で投与することも可能であるが、通常は薬理学的に許容される一つまたはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。

投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、例えば経口投与、または口空内、気道内、直腸内、筋肉内、皮下、皮内もしくは静脈内等の非経口投与等があげられ、好ましくは筋肉内、皮下、皮内、静脈内または気道内投与等があげられる。投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、注射剤、軟膏、テープ剤、ドラィパウダ一、エアロゾル等の吸入剤等があげられる。

錠剤等の固形製剤の製造には、例えば乳糖等の賦形剤、澱粉等の崩壊剤、ステアリン酸' マグネシウム等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いることができる。

筋肉内、皮下、皮内、静脈内または気道内投与に適当な製剤としては、注射剤、噴霧剤等があげられる。 . 注射剤の製造にあたっては、例えば水、生理食塩水、大豆油等の植物油、溶剤、可溶ィ匕剤、等張ィ匕剤、保存剤、抗酸化剤等を用いることができる。

また、吸入剤は SCGFそのもの、または受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ SCGF を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。担体として具体的には乳糖、ダリセリン等があげられる。 SCGFおよび用いる担体の性質により、ェァロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。

投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人 1日当たり 0 . 0 1 g / k g〜l O m g / k gを投与するのが好ましい。発明を実施するための最良の形態

以下、実施例により、本発明を具体的に説明する実施例 1 マトリゲルの移植により誘発される血管形成に対する SCGFの効果

8 - 1 0週齢の C57BL/6 Jマウス（日本クレア社製）の皮下に 500 のマトリゲルを移植し、毎日 5 At,gのヒト SCGFを 7日間投与した。 7日後、移植したマトリゲルを摘出し 4¾のパラホルムアルデヒドで固定した後に、血管内皮のマーカ一である抗マウス CD31抗体で染色を行った。

その結果、対照群と比較してヒト SCGFを投与したマウスでは顕著に血管形成が抑制されることが観察された。この結果は SCGFに血管形成を阻害する活性があることを示している。実施例 2 SCGFによるガンの生着阻害

8〜1 0週齢の C57BL/6 Jマウスの皮下に 1. 5 X 10⁶の B16メラノ一マ細胞を移植し、毎日 5 gのヒ卜 SCGFを 2 1日間投与し続けた。

その結果、 SCGFを投与しない対照群と比較してヒト SCGFを投与したマウスでは顕著に腫瘍の形成が阻害された。この結果は SCGFが血管形成阻害を介して、ガン細胞の生着を阻害する活性があることを示している。実施例 3 SCGFによる骨髄単核細胞の遊走

C57BL/6J マウスをペン卜パルビタ—ルで麻酔後、大腿骨から骨髄細胞を抽出した。次に、 Hi s t opaque 1038s (シグマ社製）を用いた密度勾配遠心分離により、骨髄単核細胞を取得した。骨髄単核細胞の SCGFに対する走化性を、 Boydenチヤンバーおよび Transwe l 1チヤンバ一（ともに Corning Cos t er社製）を用いて解析した。

上部のチャンバ一には、 100 /Uの培養液にけん濁した 1 X 10⁶の骨髄単核細胞を注入し、下部チヤンノ一には、 SCGFを含む培養液 600 1を注入した。境界部位には直径 3 ^ mの穴を持つ膜（Corning Cos t a社製）で仕切った。骨髄単核細胞の走化性は 37°Cで 5 % C0₂インキュベータ一で 1時間ィンキュベートした後に、下部に遊走した骨髄単核細胞の数を血球測定板により測定した。結果を表 1に示す。表 1

その結果、 SCGFは濃度依存的に顕著に骨髄単核細胞を遊走させることが示された。実施例 4 EPCの末梢血中への動員に及ぼす SCGFの影響（1)

8〜1 0週齢の C57BL/6Jマウスに毎日 5 gのヒト SCGFをそれぞれ 1日間、 4日間、 7 日間投与した。投与終了後、対象のマウスをベントパルピタールで麻酔し、 ΙΟΟ'Οϋ/mlのへパリンでコ一トした注射針で心臓より全血を採取した。同時に、ヒト SCGFを投与しないマウスの血液も採取した。取得した血液の一部は溶血後、実施例 5に示す FACS解析に使用し、残りの血液は以下の EPCの培養による解析に用いた。

培養による解析は、以下のように行った。

血液に Hi st opaque 1083 (シグマ社製）を用いて単核細胞を取得した。マウス 1匹中の全末稍血由来単核細胞を 500 /1の体積になるように濃縮した後、ラット由来のビトロネクチン (シグマ社製) でコートした Lab Tek 4ゥエルのスライド ·ガラス (Nalge Nunc社) 上に投入して 7日間 37°C5%C0₂インキュベータ一で培養を行った。得られた細胞をァセチル LDL-Dil標識 (Biomedical Technology社製) および isolectinB4レクチン (Vector Lab 社製）で染色し、 EPCを蛍光顕微鏡下で同定しこ。結果を表 2に示す。

表 2 ウエノレあたりの EPCの数

その結果、 SCGFの投与日数に比例して末梢血中の EPCの数が減少していることが明らかとなった。実施例 5 EPCの末梢血中への動員に及ぼす SCGFの影響（2) マウス ·ラット ilklおよびマウス CD34はともに EPCの代表的な表面マ一カーである。抗マウス 'ラット ilklモノクロ一ナル抗体および抗マウス CD34抗体を用いて EPCの FACS による解析を行なった。

実施例 7で取得した血液を溶血後、 1% BSA (牛血清アルブミン）、 0.01% NaN₃を含む Hank' s Balanced Salt Solution(HBSS)で洗浄し、マウス血清中で 30分間氷冷した。該細胞を phycoerythrin(PE)で標識した抗マウス ·ラット flklモノクローナル抗体（Pharaingen社製）またはピオチン標識した抗マウス CD34抗体（Pharmingen社製）を用いて染色した。該抗体で染色した細胞は Facstar(Becton Dickinson製）を用いて解析を行った。結果を表 3に示す。

表 3 ₁ 各マウス末梢血 1 ml中の CD34または flkl陽性細胞数

その結果、 EPCを含む CD34陽性細胞および Flkl陽性細胞が SCGFの投与により顕著に減少することが明らかとなつた。実施例 6 血管内皮系細胞の増殖に及ぼす SCGFの効果

ヒ卜微小血管内皮細胞 (Human microvacular endothelial cells；以下、 HMVECsと称す）は、ヒト臍帯静脈内皮細胞 (Human umbilical vein endothelial cells；以下、 HUVECsと称す）に比べて未熟な血管前駆細胞を多く含んでいると考えられている。

HUVECs (Clonetics社製）および HMVECs (Clonetics社製）を、それぞれフイブロネクチンでコートした培養皿上で EGMMV2増殖因子カクテル（Clonetics社製）、ヒト SCGFおよび 5 % FBS (Clonetics社製）を含む EBM- 2培地（Clonet ics社製）を用い、 37°C7日閩 5 %C0₂インキュベータ一内で培養した後、 MTSアツセィにより細胞密度を測定した。結杲を表 4に示す。表 4

細胞密度は 0D490の吸光度で測定した相対値その結果、 HMVECsでは SCGF濃度に依存して細胞の増殖が促進されたが、 HUVECsでは SCGF は細胞の増殖に影響を及ぼさなかった。

この結果は、 SCGFによる血管形成阻害が血管内皮細胞の増殖を阻害することによらないことを示している。実施例 7 SCGFの末梢血単核細胞の増殖に及ぼす影響

' 単核細胞は以下の方法で取得した。なお、単核細胞には、骨髄幹細胞、 EPCなどが含まれている。

採取したヒト末梢血から、シグマ社の Hi s topaquel077を用いた密度勾配遠心法により単核細胞を 1 X 10⁷個取得した。得られた単核細胞を、フイブロネクチンでコートした培養皿上で EGMMV2増殖因子力クテル (Cl one t i cs社製）およびヒト SCGFおよび 5 % FBS (Clonet ics 社製）を含む EBM- 2培地（Clonet ics社製）で 3 7 °C 4日間培養した後、 MTSアツセィにより細胞密度を測定した。結果を表 5に示す。

表 5

細胞密度は OD490の吸光度で測定その結果、 SCGFは単核細胞に対しては顕著な細胞増殖促進または抑制活性を持たないことが示された。このことから、 SCGFの血管形成阻害作用は、幹細胞や血管前駆細胞の増殖を阻害することに起因するのではなく、実施例 4および 5に示すように幹細胞や血管前駆細胞の末梢血への動員を阻害することに起因することが示唆された。実施例 8 血管内皮系細胞の遊走に及ぼす SCGFの効果

HMVECs, HUVECsおよび 7日間培養したヒト EPCを、 Boydenチヤンパ一および Transwe l l チャンバ一を用いて解析を行なった。二つのチャンパ一との間を仕切る膜としては、ポリカーボネート製の膜に、 0. 1%のゼラチンおよび S /z g/mlのヒトフイブロネクチンをー晚コ ―トした後に乾燥を行なったものを用いた。

各細胞をリン酸緩衝液で洗浄後、細胞密度が 1 X 10V100 n 1になるように 0. 1%の BSAを含む EBM- 2培地にけん濁し、チャンパ一の上部に注入した。下部のチャンバ一には 0， 1, 10, 100 ng/mlの濃度のヒト SCGFをそれぞれ投入して 6時間 3 7 °Cの 5 %C0₂インキュベータで静置した。遊走能は、ポリカーボネート膜を 100%メタノールで固定した後、水で洗浄'し、 DAPIを含む Vec tor Lab. 社製の Vec tashieldマウント .メディアで処理してスライド ·ガラス上に乗せ、蛍光顕微鏡（ォリンパス社製）で画像を取得し、フォトショップで細胞数を解析することにより測定した。結果を表 6に示す。

表 6 顕微鏡で観察した DAPI陽性細胞の膜上の細胞数

その結果、 SCGFは HMVECに対しては遊走を促進したが、 HUVECに対しては影響を与えず、逆に Ί日間培養した EPCに対しては遊走を阻害した。実施例 9 HMVECsおよび HUVECsの管腔形成に対する SCGFの影響 ' 1 X 10⁵個の HUVECsまたは HMVECsを、 SCGFを含む 50 1の EBM-2培地にけん濁後、 50 1 のマトリゲルと混合して 96ゥエルの培養皿にそれぞれまいた。 13時間 37°C 5%C0₂インキュベータ一で培養後、顕微鏡下で 1ゥエルあたりに形成された血管様チューブ数を数えた。血管様チューブの存在は管腔形成を示している。結果を表 7に示す。

表 7 ゥエル当たりの血管様チューブの数

その結果、 SCGFは HMVECsおよび HUVECsの管腔形成に影響を及ぼさなかった。

したがって、実施例 3〜 9の結果から、 SCGFによる血管形成阻害は、血管内皮細胞等が関与する Angiogenesis (血管新生）ではなく、幹細胞や血管前駆細胞等が関与する Vasculogenesis (脈管新生）の特異的阻害に起因することが明らかになった。実施例 1 0 SCGF長期投与による末梢血への影響

ォスの C57BL/6Jマウスに、 5 gのヒト SCGFを 1日 1回、 2 1日間投与した。投与終了翌日、心臓より全血を採取し、血球算定および血液像解析を行った。血球算定の結果を表 8に示す。 . 表 8

その結果、 SCGF投与による白血球数の減少が確認された。

血液像解析の結果を表 9に示す。表 9 好中球単球好酸球好塩基球

X ( X lOV L) 対照群 3 o. 7 0, 4 0. 2 0. 1

SCGF投与群 1. 2 0. 1 0. 1 0. 1 その結果、白血球のうち顆粒球の一種である好中球および単球数の減少が確認された。以上の結果は、 SCGF長期間投与により、単球 ·顆粒球前駆細胞（GMP) の末梢血への動員が阻害されることを示している。 '

X

産業上の利用可能性、

本発明の SCGFを有効成分として含有する骨髄幹細胞または前駆細胞などの接着性を有する細胞の末梢血中への動員を阻害する薬剤を用いることにより、癌をはじめとする血管形成の異常により病態が進行する疾患、動脈硬化などの疾患を治療することが可能となる。

Claims

請求の範囲

I . 幹細胞増殖因子（S C G F) を有効成分として含有する接着性を有する細胞の末梢 Ιίΐ への動員を阻害する薬剤。

2, 造血幹細胞増殖因子（S C G F) が、配列番号 1記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である請求項 1記載の薬剤。

3. 造血幹細胞増殖因子（S C G F) が、配列番号 1記載のアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ造血幹細胞増活性を有する請求項 1記載の薬剤。

4. 造血幹細胞増殖因子（ S φ G F )が、化学修飾された造血幹細胞増殖因子（S C G F ) である、請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の薬剤。

5. 化学修飾がポリアルキレングリコール修飾である、請求項 1記載の薬剤。

6. 接着性を有する細胞が成体多能性幹細胞である、請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の薬剤。 .

7. 接着性を有する細胞が骨髄中の接着性を有する多能性幹細胞または前駆細胞である、請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載の薬剤。

8. 前駆細胞が、血管前駆細胞、単球 ·顆粒球共通前駆細胞および平滑筋前駆細胞からなる群から選ばれる細胞である、請求項 7記載の薬剤。

9. 請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載の薬剤を有効成分とする血管形成阻害剤。

10. 請求項 1〜 8のいずれか 1 項に記載の薬剤を有効成分とする顆粒球 ·単球新生阻害剤。

I I . 請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載の薬剤を有効成分とする抗腫瘍剤。

12. 請求項 1〜8のいずれか 1項に記載の薬剤を有効成分とする抗炎症剤。

13. 請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載の薬剤を有効成分とする動脈硬化治療剤。

14. 請求項 1〜8のいずれか 1 項に記載の薬剤を有効成分とする血管形成の異常により病態が進行する疾患の治療剤。 '

15. 血管形成の異常により病態が進行する疾患が、固形腫瘍の増殖または転移形成、 '慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症および乾せんからなる群から選ばれる疾患である、請求項 1 4記載の治療剤。

16. 造血幹細胞増殖因子（SCGF) を投与することを特徴とする、接着性を有する細胞の末梢血への動員を阻害する方法。

17. 接着性を有する細胞の末梢血への動員を阻害する薬剤を製造するための造血幹細胞増殖因子（SCGF) の使用。