KR101810191B1

KR101810191B1 - 세포 접착의 저해를 위한 줄기세포 성장 인자 또는 그의 단편의 용도

Info

Publication number: KR101810191B1
Application number: KR1020160120757A
Authority: KR
Inventors: 송정식
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2016-09-21
Filing date: 2016-09-21
Publication date: 2017-12-19

Abstract

일 양상에 따른 세포 접착과 연관된 질환 또는 증상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 세포 접착 촉진용 약학적 조성물, 및 이들을 이용하는 방법을 제공한다. 이에 따르면, 생체 내 또는 시험관 내에서 세포 접착을 촉진하거나 세포 접착을 저해함으로써 세포 접착과 연관된 질환 또는 증상을 치료하거나 또는 세포 접착을 촉진하는데 이용할 수 있다.

Description

세포 접착의 저해를 위한 줄기세포 성장 인자 또는 그의 단편의 용도{Use of stem cell growth factor or fragments thereof for the inhibition of cell adhesion}

세포 접착의 길항제 또는 촉진제에 관한 것으로서, 세포 접착과 연관된 질환 또는 증상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 세포 접착 촉진용 약학적 조성물, 및 이들을 이용한 방법에 관한 것이다.

세포는 세포-세포간 그리고 세포-세포외 기질(extracellular matrix: ECM) 간의 접착(adhesion)에 의한 세포 상호인식(recognition)을 통하여 분화, 증식 및 사멸을 겪으며, 조직의 항상성(homeostasis)을 유지한다. 예를 들어, 염증 반응에서 혈관내피 세포에 백혈구의 부착 및 인식은 병원체의 침입으로부터 조직을 보호하고, 조직 손상으로 생기는 조직 파편을 제거하거나 손상 조직을 재생하는 기능을 담당하게 된다. 이러한 세포 부착의 이상은 염증성 질환, 예를 들어 관절염, 자가면역 질환, 신경퇴화, 혈전 이상, 심장 마비와 혈관 생성의 이상 등과 같은 질환들을 유발할 수 있다.

조혈 전구 세포의 성장 인자는 관절 조직에서 염증 세포의 생존 및 분화를 촉진함으로써 류마티스 관절염과 같은 만성 염증성 질환에 중요한 역할을 담당한다. 줄기세포 성장 인자(stem cell growth factor: SCGF)는 조혈 세포에서 주로 발현되는 분비성 당단백질로서, 조혈 전구 세포의 성장 인자로서 기능을 하는 것으로 알려져 있다. SCGF는 C-유형 렉틴 수퍼패밀리에 속하고, CLEC11A 유전자에서 발현되는 것으로 알려져 있다. SCGF는 줄기세포 인자(stem cell factor: SCF)와 구별되어야 하는데, SCF는 CD117(KIT 또는 C-KIT으로도 불림) 수용체에 결합하는 사이토카인인 점에서 SCGF와 상이하다. SCGF는 GM-CSF 또는 에리트리포이에틴과 조합하여 VEGF와 조합하여 골수 또는 적혈구 콜로니의 형성을 촉진하거나 (Hematol J. 2001;2(5):307-315), 혈관내피 전구세포로부터 혈관내피 세포로의 분화를 촉진할 수 있다는 것이 알려져 있다 (Blood. 2000;95(10):3106-3112). 그러나, SCGF가 세포 접착에 관련되어 있는지는 알려진 바가 없다.

따라서, 세포 접착을 저해 또는 촉진할 수 있는 물질을 발굴하여 세포 접착과 관련된 질환 또는 증상을 예방 또는 치료하는 방법을 개발할 필요가 있다.

세포 접착과 연관된 질환 또는 증상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

세포 접착 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.

세포 접착과 관련된 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

세포 접착을 촉진하는 방법을 제공한다.

일 양상은 줄기세포 성장 인자 또는 그의 단편을 포함하는 세포 접착(cell adhesion)과 연관된 질환 또는 증상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

용어 "줄기세포 성장 인자(stem cell growth factor: SCGF)"는 줄기 세포, 예를 들어 배아 줄기 세포, 중간엽 줄기세포, 조혈모세포, 신경 줄기세포, 유방 줄기 세포, 및 전립선 줄기세포에서 발현되는 C-유형 렉틴 패밀리의 사이토카인을 말한다. 상기 SCGF는 CLEC11A, CLECSF3, LSLCL, P47, 또는 C-유형 렉틴 도메인 패밀리 11 멤버 A로도 불린다. 상기 SCGF는 인간에서 CLEC11A 유전자에 의해 암호화될 수 있다. SCGF는 인간에서 Uniprot Accession No. Q9Y240의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 SCGF는 마우스에서 Uniprot Accession No. O88200의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 SCGF는 원시 조혈 전구 세포에 대한 성장인자로서 기능할 수 있다.

상기 SCGF의 단편은 SCGF 폴리펩티드의 연속된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 말한다.

용어 "세포 접착(cell adhesion)"은 세포가 세포끼리 또는 다른 물질에 부착하는 현상을 말한다. 세포 접착은 세포 접착 분자라고 불리는 막관통 당단백질의 작용으로 일어날 수 있다. 상기 세포 접착 분자는 예를 들어, 셀렉틴(selectin), 인테그린(integrin), 신데칸(syndecan), 및 카드헤린(cadherin)이다. 세포 접착은 세포를 다양한 방식으로 연결(link)할 수 있고, 신호전달 과정이 수반될 수 있다. 세포 접착은 예를 들어 발생 과정에서 세포의 분화, 병원성 미생물의 감염, 면역 반응, 암세포의 전이, 상처의 회복 등 다양한 반응과 관련된다.

상기 세포 접착에서 "세포"는 혈관내피 세포, 백혈구, 면역 세포, 암세포, 상피 세포, 생식 세포, 섬유아세포, 근육 세포, 골수 세포, 표피 세포, 줄기 세포, 골아세포, 및 신경세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 세포 접착은 동일한 종류의 세포 간 또는 다른 종류의 세포 간, 또는 세포와 물체의 표면 간의 세포 접착일 수 있다. 상기 세포 접착은 예를 들어, 혈관내피 세포와 백혈구 간, 암세포와 혈관내피 세포 간, 및 암세포 간의 세포 접착이다. 상기 백혈구는 예를 들어 중성 백혈구, 염기성 백혈구, 산성 백혈구, 단핵구, 대식세포, 또는 림프구이다.

상기 세포 접착과 연관된 질환 또는 증상은 염증, 자가면역 질환, 심혈관계 질환, 암, 감염성 질환, 또는 이들의 조합일 수 있다.

염증은 생체 조직의 유해한 자극원, 예를 들어 병원성 미생물, 손상된 세포, 자극물질 등에 대한 생체 반응 중 하나이다. 상기 염증은 미생물에 의한 감염 또는 상처, 수술, 화상, 동상, 전기자극, 화학물질 등 다양한 원인에 의하여 발생할 수 있다. 예를 들어, 혈액 중의 단핵구는 염증 부위 근처의 혈관내피 세포에 접착하여 혈관내피를 침윤하여 염증 부위로 이동할 수 있다. 예를 들어, SCGF 또는 그의 단편을 생체 내에 투여할 경우, 혈액 중의 단핵구와 혈관내피 세포의 접착을 저해하여 염증 반응을 매개하는 단핵구 및 이로부터 분화된 대식세포의 기능을 저해할 수 있다.

자가면역 질환은 자신의 항원에 대하여 항체를 만드는 비정상적 면역 반응으로 인해 야기되는 면역 질환이다. 상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 혈구탐식성 림프조직구증(Hemophagocytic lymphohistiocytosis), 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus), 기쿠치(Kikuchi) 병, 혈관염(vasculitis), 성인 스틸 병(Adult onset Still's disease), 염증성 근육염(Inflammatory Myositis), 베체트 병(Behcet disease), IgG4-연관성 질환, 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 거대세포 동맥염(Giant cell arteritis), 측두 동맥염(Temporal arteritis), 제1형 당뇨병, 아토피 피부염, 크론병(Crohn's disease), 전신성 경화증(systemic sclerosis), 건선(psoriasis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 그레이브스 갑상선 항진증(Graves hyperthyroidism), 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어, SCGF 또는 그의 단편을 생체 내에 투여할 경우, 혈액 중의 단핵구와 혈관내피 세포의 접착을 저해하여 류마티스 관절염을 예방 또는 치료할 수 있다.

심혈관계 질환은 심장과 주요 동맥에 발생하는 질환을 말한다. 심혈관계 질환은 예를 들어 심근 경색, 죽상동맥경화증, 허혈 재관류 손상, 및 동종이식 맥관장애(allograft vasculopathy)이다.

상기 암은 원발성 종양 또는 전이성 종양일 수 있다. 상기 암은 예를 들어 유방암, 피부암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 대장암, 결장직장암, 위암, 난소암, 전립선암, 방광암, 요도암, 간암, 신장암, 투명세포 육종, 흑색종, 뇌척수종양, 뇌암, 흉선종, 중피종, 식도암, 담도암, 고환암, 생식세포종, 갑상선암, 부갑상선암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 골수형성이상 증후군(myelodysplastic syndromes: MDS), 골수섬유증(myelofibrosis), 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 호치킨병 (Hodgkin's Disease), 내분비계암, 육종, 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어, SCGF 또는 그의 단편을 생체 내 투여할 경우, 암 세포의 전이, 이동, 및 침윤을 저해하여 암을 치료할 수 있다.

감염성 질환의 "감염"은 병원성 미생물이 사람을 포함한 동물, 식물 조직, 체액, 표면 등에 정착하여 증식하는 일을 말한다. 감염성 질환은 세균, 바이러스 등 감염원의 감염에 의해 야기되는 질환을 말한다. 세포 접착은 감염원의 발병에 역할을 담당할 수 있다. 예를 들어, SCGF 또는 그의 단편을 생체 내 투여할 경우, 감염원이 조직에 감염되는 것을 저해하여 암을 치료할 수 있다.

상기 SCGF는 셀렉틴-결합 활성을 갖거나 또는 셀렉틴과 셀렉틴-특이적 결합 물질의 결합을 저해할 수 있다. 셀렉틴은 CD62로도 불리는 세포 접착 분자 중 하나이다. 셀렉틴은 단쇄 막통과 당단밸질이고, P-셀렉틴, E-셀렉틴, 또는 L-셀렉틴의 아종이 있다. 상기 셀렉틴은 P-셀렉틴, E-셀렉틴, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 셀렉틴-특이적 결합 물질은 P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(P-selectin glycoprotein ligand-1: PSGL-1)일 수 있다. PSGL-1은 백혈구 및 혈관내피 세포에 존재하는 당단백질이다.

상기 SCGF 또는 그의 단편은 세포 접착 길항제(antagonist)일 수 있다. 상기 SCGF는 세포 접착을 저해하는 활성을 가질 수 있다. 상기 SCGF는 세포 접착을 저해함으로써 세포 접착이 요구되는 작용, 예를 들어 암의 전이, 이동, 침윤, 감염원의 감염, 염증 반응 등을 저해할 수 있다.

상기 용어 "예방"은 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 세포 접착과 연관된 질환 또는 증상을 억제하거나 그의 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 상기 용어 "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 세포 접착과 연관된 질환 또는 증상의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 희석제 또는 보조제를 포함하는 의미로 사용된다. 상기 담체는 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 생리식염수, PBS와 같은 완충액, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 풍미제, 유화제, 보존제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 임의의 제형으로 준비될 수 있다. 상기 조성물은 예를 들면, 경구 투여 제형(예, 분말, 정제, 캡슐, 시럽, 알약, 또는 과립), 또는 비경구 제형(예, 주사제)으로 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 전신 제형 또는 국부 제형으로 제조될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 경구, 경피(transdermal), 점막, 코안(intranasal), 기관내(intratracheal), 피하, 또는 이들의 조합으로 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 상기 SCGF 또는 그의 단편을 유효한 양으로 포함할 수 있다. 용어 "유효한 양"은 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우 예방 또는 치료의 효과를 나타내기에 충분한 양을 말한다. 상기 유효한 양은 당업자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 유효한 양은 상기 약학적 조성물 당 약 0.1 ㎍ 내지 약 2 g, 약 0.5 ㎍ 내지 약 1 g, 약 1 ㎍ 내지 약 500 mg, 약 10 ㎍ 내지 약 100 mg, 또는 약 100 ㎍ 내지 약 50 mg일 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내 일 수 있다. 상기 투여는 1일 1회, 1일 다회, 또는 1주일에 1회, 2주일에 1회, 3주일에 1회, 또는 4주일에 1회 내지 1년에 1회 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 시험관 내(in vitro)에서 세포 접착을 저해하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, SCGF가 코팅된 세포 배양 접시에 세포가 접종되면, 배양 접시의 바닥, 세포 간, 및 이들의 조합의 세포 접착이 저해될 수 있다.

다른 양상은 항-SCGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 세포 접착 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 SCGF, 세포, 및 세포 접착은 전술한 바와 같다.

상기 항-SCGF 항체는 SCGF 또는 그의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 말한다. 상기 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 상기 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 갖는 전장 항체일 수 있다. 상기 용어 "항원 결합 단편(antigen-binding fragment)"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 말한다. 예를 들어, 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)₂, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂, 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 항-SCGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 세포의 이동, 세포 분화, 상처 치유, 또는 이들의 조합을 촉진하는 활성을 가질 수 있다. 항-SCGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 조직 공학 분야 예를 들어, 생체적합성 소재, 약물 전달 물질, 인공 장기 등에 이용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 항-SCGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효한 양으로 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 전술한 바와 같은 제형, 투여 경로, 및 투여량으로 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 시험관 내(in vitro)에서 세포 접착을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포가 항-SCGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 코팅된 세포 배양 접시에 접종되면, 배양 접시의 바닥, 세포 간, 및 이들의 조합의 세포 접착이 촉진될 수 있다.

다른 양상은 SCGF 또는 그의 단편을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 세포 접착과 관련된 질환 또는 증상을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

SCGF, SCGF의 단편, 세포, 세포접착, 세포 접착과 관련된 질환 또는 증상, 예방, 및 치료는 전술한 바와 같다.

상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 세포 접착과 관련된 질환 또는 증상, 예를 들어 염증, 자가면역 질환, 또는 암을 앓거나 앓을 가능성이 큰 개체일 수 있다.

상기 SCGF 또는 그의 단편은 경구, 정맥내, 근육내, 경구, 경피, 점막, 코안, 기관내 또는 피하 투여될 수 있다. 상기 SCGF 또는 그의 단편의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 상기 투여량은 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내 일 수 있다. 상기 투여는 1일 1회, 1일 다회, 또는 1주일에 1회, 2주일에 1회, 3주일에 1회, 또는 4주일에 1회 내지 1년에 1회 투여될 수 있다.

상기 방법과 유사하게, 시험관 내에서 세포와 SCGF 또는 그의 단편을 접촉시킴으로써 세포 접착을 저해할 수 있다.

다른 양상은 항-SCGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 개체 또는 세포에 투여하는 단계를 포함하는 세포 접착을 촉진하는 방법을 제공한다.

항-SCGF 항체, 그의 항원 결합 단편, 개체, 세포, 및 세포접착은 전술한 바와 같다.

상기 방법에 의해, 생체 내 또는 시험관 내에서 세포와 항-SCGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 접촉시킴으로써 세포 접착을 촉진시킬 수 있다.

일 양상에 따른 세포 접착과 연관된 질환 또는 증상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 세포 접착 촉진용 약학적 조성물, 및 이들을 이용하는 방법에 따르면, 생체 내 또는 시험관 내에서 세포 접착을 촉진하거나 세포 접착을 저해함으로써 세포 접착과 연관된 질환 또는 증상을 치료하거나 또는 세포 접착을 촉진하는데 이용할 수 있다.

도 1a는 류마티스 관절염 및 골관절염 환자의 관절액에서 SCGF의 양(ng/㎖)을 ELISA로 측정한 결과를 나타내는 그래프이고(*: P<0.05), 도 1b는 정상인(음성 대조군) 및 류마티스 관절염 환자의 혈장에서 SCGF의 양(ng/㎖)을 ELISA로 측정한 결과를 나타내는 그래프이고(N.S.: non-significant), 도 1c는 항-SCGF 항체 또는 대조군 항체 (IgG)로 염색한 류마티스 관절염 환자의 관절 조직의 이미지 및 파란색 상자 부분을 확대한 이미지이다.
도 2a는 류마티스 관절염 환자의 관절 조직에서 vWF의 발현(녹색) 및 SCGF의 발현(적색)을 확인하는 공초점 현미경 이미지이고, 도 2b는 HUVEC에서 튜불린의 발현(녹색) 및 SCGF의 발현(적색)을 확인하는 형광 현미경 이미지이다.
도 3a 내지 도 3d는 TNF-알파, SCGF, 항-SCGF 항체, 및 항-PSGL-1 항체의 조합의 존재 시 혈관내피세포 EA hy.926 세포에 접착된 단핵구 U937 세포의 수를 나타내는 그래프이다(*: P<0.05, **: P< 0.01).
도 4a 내지 도 4c는 SCGF, P-셀렉틴, E-셀렉틴, 및 항-SCGF 항체의 조합의 존재 시 셀렉틴에 접착된 U937 세포의 수를 나타내는 그래프이다(*: P<0.05, **: P<0.01).
도 5a 및 도 5b는 SCGF의 존재 시 P-셀렉틴 및 E-셀렉틴에 대한 PSGL-1의 결합을 ELISA로 측정한 결과를 나타내는 그래프이다(**: P< 0.01).
도 6a 및 도 6b는 플레이트에 접착된 암세포를 각각 광학 현미경 및 형광 현미경 하에서 수득한 이미지이고, 도 6c는 SCGF 농도에 따른 접착된 암세포의 수를 나타내는 그래프이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 류마티스 관절염 환자에서 줄기세포 성장 인자의 기능

1. 시료의 준비

인간 혈장, 관절액(synovial fluid), 관절 조직 시료는 미국 류마티스 학회 분류기준(American College of Rheumatology classification criteria)을 만족하는 류마티스 관절염 환자 및 정상인(대조군)으로부터 수집하였다. 모든 시료는 임상 시험 심사 위원회에서 승인된 프로토콜에 따라 시료를 수집 및 이용하였다.

2. 류마티스 관절염의 관절 조직에서 줄기세포 성장 인자의 발현 수준의 확인

정상인(n=38), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis: RA) 환자 (n=25) 및 골관절염(osteoarthritis: OA) 환자 (n=25)의 관절액 또는 혈장 시료를 준비하고, 시료에서 줄기세포 성장 인자(stem cell growth factor: SCGF)의 발현 수준을 확인하였다.

구체적으로, 실시예 1.1에서 준비된 시료를 1:100으로 희석하고, 류마티스 인자에 의한 비특이적 결합을 막기 위해 시료를 3 ㎍/㎖의 HeteroBlock(Omega Biologicals, USA)와 인큐베이션하여 블로킹시켰다. 폴리스티렌 마이크로웰 플레이트(Maxisorp, Nunc, Sigma-Aldrich)에 웰에 각각 100 ㎕의 코팅 완충액(15　mM Na₂CO₃ 및 35　mM NaHCO₃, pH 9.6)을 가하였다. 웰에 코팅 완충액 ㎖ 당 5　㎍의 모노클로날 항-SCGF 항체(R&D systems, USA)를 가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그후 항-SCGF 항체로 코팅된 웰을 세척 완충액(5 mM EDTA, 10 mM Tris 및 145 mM NaCl, pH 7.4)으로 세척하였다. 각 웰에 1 ㎎/㎖의 BSA를 함유한 세척 완충액 중 0.5 ㎍/㎖의 농도로 희석된 비오틴화된 폴리클로날 항-SCGF 항체(R&D systems, USA)를 가하였다. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, 각 웰을 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 1 ㎎/㎖의 BSA를 함유한 세척 완충액에 1:12,000배 희석된 HRP(horseradish peroxidase)-접합된 스텝타비딘을 각 웰에 가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 각 웰을 세척 완충액으로 3회 세척하고, 각 웰에 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine)(Sigma-Aldrich)을 함유한 기질 완충액(35 mM 시트르산, 67 mM Na₂HPO₄, 및 0.012%(v/v) H₂O₂, pH 5.0)을 가하였다. 15분 후, 각 웰에 1 M의 H₂SO₄를 가하여 반응을 종료시키고, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 데이터는 SoftMax Pro 소프트웨어(Molecular Devices, USA)를 사용하여 가공하고, 그 결과를 도 1a 및 도 1b에 나타내었다.

도 1a 및 도 1b에 나타난 바와 같이, 류마티스 관절염(RA) 환자와 정상인의 혈장에서는 SCGF 수준에 유의한 차이가 없었지만, 류마티스 관절염(RA) 환자의 관절액의 SCGF 수준은 골관절염(OA) 환자의 관절액에 비해 유의하게 높다는 것을 확인하였다.

또한, 항-SCGF 항체(R&D systems, USA)를 사용하여 관절 조직에서 SCGF의 발현을 면역조직화학법(immunohistochemisty)으로 확인하였다. 구체적으로, 파라핀 포매된 RA 관절 조직 단편을 자일렌(Sigma-Aldrich) 및 알콜로 세척하고 물로 수화시켰다. 내재적 과산화효소의 활성은 3%(v/v) H₂O₂ 용액(EMD chemicals)으로 퀀칭(quench)하고, 무혈장 단백질 블록킹 용액(Dako)으로 블로킹하였다. 조직 절편을 모노클로날 항-SCGF 항체(R&D systems, USA) 또는 마우스 IgG(Santa Cruz biotechnology, USA)으로 인큐베이션하고, 그후 Envision+ 래빗-HRP 폴리머(Dako, USA)로 표지하였다. 조직 절편을 DAB+ 기질-크로모겐 용액(Dako, USA)으로 발색시키고, 헤마톡실린(Dako, USA)으로 대비염색(counterstaining)하였다. 염색된 관절 조직의 이미지를 도 1c에 나타내었다 (좌: 항-SCGF 항체로 염색, 우: 대조군 항체로 염색, 위: x100 확대, 아래: 파란색 상자 부분의 x400 확대). 도 1c에서 나타난 바와 같이, SCGF 단백질은 혈관 및 관절막(synovial lining) 주위의 관절염 환자의 관절 조직에 존재하는 것을 확인하였다.

3. 혈관내피 세포에서 SCGF의 발현

SCGF와 혈관내피세포 마커인 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor: vWF)의 검출을 위해, 관절 치환 수술에서 나온 관절 조직을 사용하였다. 관절을 OCT(Optimal Cutting Temperature) 화합물에 즉시 담그고 드라이 아이스에서 5 분 동안 방치한 후, -80℃에서 보관하였다. 관절 조직을 cryostat(Leica, Solms, Germany)을 사용하여 10 ㎛ 두께의 절편으로 절단하고, 4%(v/v) 포름알데히드로 고정하였다. 절편은 2%(w/v) BSA를 함유한 PBS로 블로킹하였다. 조직 절편에 모노클로날 항-SCGF 항체(R&D systems, USA) 및 항-vWF 항체(Abcam, USA)를 사용하여 면역염색하고, 항 마우스 및 항-래빗 이차 항체로 염색하였다. 염색된 조직 절편은x100 Apo PLA 오일용 대물 렌즈가 장착된 Leica TCS SP2 공초점 현미경(Leica, Solms, Germany)을 사용하고, 0.2 ㎛ 간격으로 Z-stack 이미지를 수득하였다.

또한, 혈관내피 세포에서 SCGF의 발현을 확인하기 위해, 인간 탯줄 정맥 내피 세포(Human umbilical vein endothelial cell: HUVEC)를 항-SCGF 항체 및/또는 항-튜불린 항체(Abcam, USA)로 염색하였다.

공초점 현미경 이미지와 형광 현미경 이미지를 각각 도 2a 및 도 2b에 나타내었다. 도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이, SCGF는 류마티스 관절염 관절 조직 중 혈관내피 세포에 주로 발현하였고, HUVEC의 세포 가장자리 주변에서 강하게 발현하였다.

한편, SCGF가 혈관내피 세포의 염증 반응과 연관되는지 확인하기 위해, 불멸화된 HUVEC인 EA.hy926 세포에 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor: TNF)-α(Peprotech)를 가하고 24 시간 동안 인큐베이션하여 염증 반응을 유도하였다. 그후, EA.hy926를 용해시키고, EA.hy926 세포 용해물에 대해 비오틴화된 폴리클로날 항-SCGF 항체(R&D systems) 및 모노클로날 항-β-액틴 항체(Sigma-Aldrich)를 사용하여 면역블로팅을 수행하였다. 면역블로팅 결과를 도 2c에 나타내었다. 도 2c에 나타난 바와 같이, SCGF 발현은 EA.hy926 세포에서 TNF-α의 처리에 의해 감소하였다. 따라서, 혈관내피 세포가 염증자극을 받을 때 SCGF가 감소되는 것을 확인하였고, 이는 SCGF가 혈관내피 세포의 염증 반응과 연관되는 것을 나타낸다. 유사한 결과를 FACS 분석에서 얻었다.

4. 혈관내피 세포에 단핵구의 접착에서 SCGF의 활성

SCGF가 혈관내피 세포와 단핵구의 접착(adhesion)에 어떠한 기능을 하는지 확인하하였다.

구체적으로, EA hy.926 세포를 조직 배양 플레이트에서 컨플루언트하게(confluent) 배양하고, 배양된 세포에 0.025 ㎍/㎖의 TNF-알파(Sigma-Aldrich), SCGF(㎍/㎖)(Sigma-Aldrich), 항-SCGF 항체, 또는 항-P 셀렉틴 당단백질 리간드-1(P-selectin glycoprotein ligand-1: PSGL-1) 항체를 가하였다. 인간 단핵구 세포인 U937 세포를 칼세인과 함께 배양한 후, RPMI-1640 배지로 3회 세척하였다. 약 1x105개의 U937 세포를 상기 플레이트의 각 웰에 가하고, 37℃에서 30분 동안 더 인큐베이션하였다. 각 웰을 3회 세척하여 접착되지 않은 U937 세포를 제거하였다. 각 웰을 형광 현미경 하에서 관찰하고, ImageJ 프로그램을 이용하여 검출된 형광 강도로부터 EA hy.926 세포에 접착된 세포의 수를 산출하였다. 산출된 결과를 도 3a 내지 도 3d에 나타내었다.

도 3a 내지 도 3d에 나타난 바와 같이, SCGF는 혈관내피 세포에 대한 단핵구의 접착을 저해하였고, 반면에 항-SCGF 항체는 혈관내피 세포에 단핵구의 접착을 현저하게 증가시켰다. 항-SCGF 항체에 의한 접착 촉진 효과는 SCGF의 첨가에 의해 중화되었고, 항-SCGF 항체의 세포 접착 촉진 효과는 항-PSGL-1 항체의 첨가에 의해 중화되었다. 따라서, SCGF는 혈관내피 세포와 단핵구의 접착을 저해하고, 반면에 항-SCGF 항체는 혈관내피 세포와 단핵구의 접착을 촉진함을 확인하였다.

5. SCGF와 셀렉틴 간의 상호작용

도 3d에 나타난 바와 같이, 항-PSGL-1 항체는 항-SCGF 항체의 세포 접착 촉진 효과를 감소시키기 때문에, SCGF와 셀렉틴(selectin) 간의 상호작용을 확인하였다.

구체적으로, 재조합 가용성 P-셀렉틴(R&D systems, USA) 또는 E-셀렉틴(R&D systems, USA)을 0.9 mM Ca² ⁺ 및 0.5 mM Mg² ⁺를 함유한 인산염 완충 용액(PBS)에 희석하고, 96 웰 플레이트에 가한 후 4℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 각 웰을 0.05%(v/v) Tween 20을 함유한 PBS(T-PBS)로 4회 세척하고, 0.5%(w/v) BSA를 함유한 PBS를 가한 후 4℃에서 4시간 동안 인큐베이션하여 블로킹하였다. U937 세포를 칼세인과 인큐베이션하였다. 2x10⁴개의 U937 세포를 각 웰에 가하고, 37℃에서 약 30분 동안 인큐베이션하였다. SCGF 또는 항-SCGF 항체를 각 웰에 가한 후 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 각 웰을 3회 세척하여 접착되지 않은 U937를 제거하고, 각 웰을 형광 현미경 하에서 확인하였다. 접착된 U937 세포의 수를 ImageJ 프로그램을 이용하여 산출하고, 그 결과를 도 4a 내지 도 4c에 나타내었다.

도 4a 내지 도 4c에 나타난 바와 같이, SCGF는 P-셀렉틴 또는 E-셀렉틴에 대한 U937 세포의 접착을 저해하였고, 반면에, 항-SCGF 항체는 SCGF의 세포 접착 억제 효과를 중화시켰다. 따라서, SCGF는 혈관내피 세포와 셀렉틴의 결합을 저해할 수 있음을 확인하였다.

또한, P-셀렉틴 또는 E-셀렉틴을 96 웰 ELISA 플레이트에 코팅하고, 2 ㎍/㎖의 PSGL-1 Fc 키메라 (PBS 중)(R&D systems, USA)을 각 웰에 가한 후 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. SCGF를 각 웰에 가한 후 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 5 mM EDTA(Sigma-Aldrich)를 함유한 PBS로 세척하고 HRP-접합된 항-인간 IgG (1:5000)로 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 웰을 3회 세척하고, 각 웰에 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘을 함유한 기질 완충액을 가하였다. 15분 후, 각 웰에 1 M H2SO4를 가하여 발색 반응을 종결시키고, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정될 결과는 SoftMax Pro 소프트웨어(Molecular Devices, USA)를 이용하여 가공하고, 그 결과를 도 5a 및 도 5b에 나타내었다. 도 5a 및 도 5b에 나타난 바와 같이, SCGF는 P-셀렉틴 및 E-셀렉틴에 대한 PSGL-1의 결합을 저해할 수 있음을 확인하였다.

그러므로, SCGF는 세포 부착을 위한 셀렉틴 리간드 결합을 저해함으로써 혈관내피 세포에 대한 단핵구의 접착을 조절하는 길항제로서 작용할 수 있음을 확인하였다.

실시예 2. 암세포의 접착에서 SCGF의 기능

실시예 1에서 SCGF가 셀렉틴과 그의 리간드 간의 결합을 저해함으로써 세포 부착을 억제함을 확인하였다. SCGF가 암세포 간의 접착도 저해할 수 있는지 여부를 확인하였다.

재조합 가용성　SCGF을　0.9 mM Ca² ⁺　및　0.5 mM Mg² ⁺를 함유한 인산염 완충 용액(PBS)에 희석하고, 96　웰 플레이트에 가한 후　4℃에서 밤새 인큐베이션 하였다.각 웰을　0.05%(v/v) Tween 20을 함유한　PBS(T-PBS)로　4회 세척하고, 0.5%(w/v) BSA를 함유한　PBS를 가한 후　4℃에서　4시간 동안 인큐베이션하여 블로킹하였다. 유방암 세포주　MCF7(ADCC, USA)　또는　MDA MB231(ADCC, USA)를 세포 배양 플레이트에 접종하고,　37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다.　그 후,　플레이트를　3회 세척하여 접착되지 않은 암세포를 제거하고,　플레이트에 접착된 세포를 광학 현미경으로 확인하였다. 광학 현미경으로 수득한 이미지를 도　6a에 나타내었다. 또한, 같은 방법으로 SCGF를 플레이트에 밤새 코팅하고, 다음날 MDA MB231 cell을 칼세인으로 염색후　세포 배양 플레이트에 접종하고,　37℃에서 30분　동안 인큐베이션하였다.　그 후,　플레이트를　3회 세척하여 접착되지 않은 암세포를 제거하고,　플레이트에 접착된 세포를 형광 현미경으로 확인하였다.　형광 현미경으로 수득한 이미지를 도　6b에 나타내었다.　또한,　측정된 형광 강도로부터 플레이트에 접착된 암세포의 수를 산출하고, SCGF　농도에 따른 접착된 암세포의 수를 도　6c에 나타내었다. 그러므로 SCGF는 암세포의 접착을 억제하는 작용이 있음을 확인하였다.

Claims

줄기세포 성장 인자(stem cell growth factor: SCGF) 또는 그의 단편을 포함하고, 시험관 내에서(in vitro) 세포 접착(cell adhesion)을 저해하는데 사용하기 위한 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 세포는 혈관내피 세포, 백혈구, 면역 세포, 암세포, 상피 세포, 생식 세포, 섬유아세포, 근육 세포, 골수 세포, 표피 세포, 줄기세포, 골아세포, 및 신경세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 세포 접착은 혈관내피 세포와 백혈구 간의 접착 또는 암세포간 접착인 것인 조성물.
청구항 3에 있어서, 상기 백혈구는 단핵구 또는 대식세포인 것인 조성물.
삭제
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 SCGF는 셀렉틴(selectin)-결합 활성을 갖거나 또는 셀렉틴과 셀렉틴-특이적 결합 물질의 결합을 저해하는 것인 조성물.
청구항 7에 있어서, 상기 셀렉틴은 P-셀렉틴, E-셀렉틴, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
청구항 7에 있어서, 상기 셀렉틴-특이적 결합 물질은 P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(P-selectin glycoprotein ligand-1: PSGL-1)인 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 SCGF 또는 그의 단편은 세포 접착 길항제인 것인 조성물.
항-SCGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하고, 시험관 내에서 세포 접착을 촉진하기 위한 조성물.
삭제
시험관 내에서 SCGF 또는 그의 단편을 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 세포 접착을 저해하는 방법.
시험관 내에서 항-SCGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 세포에 투여하는 단계를 포함하는 세포 접착을 촉진하는 방법.
항-SCGF 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하고, 조직 공학에 이용하기 위한 조성물.
청구항 15에 있어서, 상기 조직 공학은 생체적합성 소재, 약물 전달 물질, 또는 인공 장기인 것인 조성물.