CN105675893A - 一种基于血清及共同基于血清和唾液中蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片和试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

一种基于血清或唾液蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片和试剂盒及其应用，涉及一种用于血清或唾液中检测糖链标志物的凝集素芯片，具体涉及一种基于血清和唾液中蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片及其应用。目的在于提供一种非损伤，通过鉴别唾液或血清中蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片及其方法。本发明提供一种基于血清糖结合蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片，包括测试凝集素探针组，测试凝集素探针组至少包括PTL-I、PNA、AAL、LTL、STL、BS-I、PTL-II、SBA、ACA、UEA-I、MAL-I、PHA-E+L。该凝集素芯片可以快速检测出血清和唾液样品中特有的糖蛋白糖链结构，可以迅速判断出样品中糖链的特异性结合，确定对应的人群是否患有肝炎，并确定是否为ACHBLF患者。

Description

一种基于血清及共同基于血清和唾液中蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片和试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于检测糖链标志物的凝集素芯片，具体涉及一种基于血清及共同基于血清和唾液中蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片及其应用。

背景技术

重型乙型肝炎是指肝细胞发生大块变性坏死，肝功能衰竭，肝脏的生物合成、转化、解毒功能丧失，体内代谢产物累积，体内环境严重紊乱，一般发病后10日或28日内发展为肝性脑病，有明显出血现象，或继发感染，出现脑水肿、急性肾功能衰竭等。所以临床上有病情重、发展快、来势凶险的特点，如未积极救治，预后极差。重型肝炎的发病机制可能与宿主的免疫反应亢进及内毒素的作用有关，其发病率约占乙型肝炎的1%左右，以青年居多，劳累、酗酒、感染、营养不良、末期妊娠、病毒重叠感染等均可促使急、慢性肝炎的病情转重，重型乙型肝炎临床上主要分为三类：慢性重型乙肝、亚急性重型乙肝和急性重型乙肝。

慢性重型乙肝，在慢性活动性肝炎或肝炎后肝硬变的基础上病情急剧恶化，主要表现为黄疸进行性加深，凝血酶原活动度进行性下降，出现难以消退的大量腹水、反复严重感染，难以纠正的电解质紊乱。此型病人常有低氧血症，存在通气换气障碍，近年由于治疗的加强，半数以上病人不出现肝性脑病，或仅在临终前出现，常因上消化道出血、肝-肾综合征及严重感染而死亡，临床表现同亚急性、急性重型乙肝，病死率极高。

亚急性重型乙肝，此病在发病10天以上及8周以内，会出现极度乏力、厌油、重度腹胀、食欲明显减退、恶心及出现腹水。当病情不断加重时，黄疸进行性加深，慢慢的会出现肝臭、凝血酶原时间延长，还会出现明显出血倾向和精神神经系统表现，查血清白蛋白降低，白球蛋白倒置，电解质紊乱，血氨升高，尿少，肝肾功能趋向衰竭，还会并发各种感染，预后甚差。部分患者经抢救可望恢复，容易发展为坏死后肝硬化。

急性重型乙肝，又叫爆发性肝坏死。在发病10天内会出现烦燥、神智不清到浓度昏迷。肝脏进行性缩小，凝血酶原时间明显延长，活动度骤降，血氨增高，转氨酶随黄疸上升反而下降，即所谓酶胆分离现象。在后期可出现腹膜炎、出血、脑水肿及脑疝。病情危急，预后甚差。

目前，原位肝移植是治疗重型肝炎最有效的治疗方法，术后5年内存活率达85%左右。但由于术后可能出现感染性并发症，很多患者并没有成功接受肝移植手术，甚至有些患者在等待合适供体期间就已死亡。抗病毒治疗可以在一定程度上维系患者生命,即使部分患者体内乙肝病毒DNA显著降低，但其存活时间仍旧较短，由于一些其他因素，如：凝血酶原延时、高含量胆红素、血液中低白蛋白水平、血小板数过少以及肝性脑病、腹水等都是导致患者死亡的危险因素。

由于重型肝炎的病情重，变化快，病死率高，因此，重型肝炎早诊断，早治疗，是防控重型肝炎的关键。

蛋白质糖基化是一种最常见的蛋白翻译后修饰，是在糖基转移酶作用下将糖类转移至蛋白质，和蛋白质上特殊的氨基酸残基形成糖苷键的过程。研究表明，70%人类蛋白包含一个或多个糖链，1%的人类基因组参与了糖链的合成和修饰。哺乳动物中蛋白质的糖基化类型可分为三种：N-糖基化、O-糖基化和GPI糖基磷脂酰肌醇锚。大多数糖蛋白质只含有一种糖基化类型，但是有些蛋白多肽同时连有N-糖链、O-糖链或糖氨聚糖。

目前在糖基化研究多在其他肝病（乙肝、肝硬化、肝癌）中报道，如在乙肝病毒（HBV）感染后肝纤维化患者血清中Gal化双天线型N-糖链水平明显高于健康志愿者，同时血清中双天线型和三天线型N-糖链水平伴随肝纤维化程度的加重而降低，另有研究表明随着肝纤维化的发展，血清中平分型核心α(1,6)Fuc化双天线型N-糖链水平升高，而三天线型N-糖链降低，表明血清中特定N-糖链水平的变化可以用来监测纤维化的发展，但在重型乙型肝炎中未见报道。

凝集素由于其可特异性识别不同糖链结构并可以多价形式与糖链高亲和性结合的特性被广泛用于糖组学的研究，凝集素芯片通过固定于芯片上的凝集素探针与样品中糖蛋白糖链特异性结合，可以高通量地检测出样品中糖蛋白糖链结构和连接方式的变化，是研究糖蛋白糖链结构变化最有效的分析工具之一，其有助于发展新的诊断和监测疾病的方法。

申请号为201110021447.3发明专利，是采用芯片点样仪将凝集素点制于环氧衍生化的玻片载体上，经固定化处理，制备出高覆盖率凝集素芯片，采用凝集素芯片技术对临床样本中糖蛋白糖链与凝集素进行特异性结合的研究，分析各种样本中的糖蛋白糖链谱及其识别的凝集素，并借鉴基因芯片数据分析方法对糖蛋白糖链的表达谱进行数据统计分析，确定临床样本和正常对照组中糖蛋白糖链的差异结构，该方法首先采用标准糖蛋白RNaseB和Fetuin，验证了凝集素芯片在检测糖蛋白糖链方面的可行性和可靠性，并应用凝集素芯片对Chang’sliver正常肝细胞总蛋白中的糖蛋白进行了初步分析，发现糖蛋白上有多价Sia或GlcNAc、末端α-1,3man、GalNAc和Galβ1-4GlcNAc糖链结构，然后应用高覆盖率凝集素芯片研究转录生长因子活化的肝星状细胞（LX-2）中糖蛋白糖链谱的变化，发现AAL，PHA-E和ECA识别的Fuc、N-GlcNAc和Gal糖链结构在活化态细胞的胞膜上表达明显增强应用芯片技术研究CCl4诱导小鼠肝纤维化模型中糖基因表达与肝细胞表面糖链谱之间的关联性，发现纤维化肝脏中有10个糖基转移酶基因转录水平发生改变，首次揭示在肝纤维化发生过程中O-Glycan的合成通路“Tnantigen→Tantigen(core-1)→sialyl-Tantigen”被激活，从糖组学角度揭示了肝纤维化形成过程中蛋白糖基化发生变化的分子机理。

该分子机理并未在重型乙型肝炎上应用，并发现相应的糖蛋白糖链变化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种非损伤，通过鉴别唾液或血清中蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片及其方法。

本发明提供一种基于血清糖结合蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片，包括测试凝集素探针组，所述测试凝集素探针组至少包括PTL-I、PNA、AAL、LTL、STL、BS-I、PTL-II、SBA、ACA、UEA-I、MAL-I、PHA-E+L。

所述测试凝集素探针组还包括WFA、GSL-II、MAL-II、SJA、EEL、LEL、PWM、BPL。

本发明还提供一种共同基于血清和唾液中糖蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片，包括测试凝集素探针组，所述测试凝集素探针组至少包括STL、SBA、ACA、WFA、GSL-II。

本发明提供上述凝集素芯片在检测糖蛋白检测糖链标志物的应用。

更进一步地，本发明提供含有上述凝集素探针组的试剂盒。

应用上述凝集素时，以经过医学检测健康人群为对照，采用凝集素芯片对样本和健康人的血清或唾液样本进行检测，通过软件获取芯片数据病归一化处理后，将样本和健康人对照组的结果进行对比，即每个凝集素对应的归一化后荧光强度（NFI）的样本分别比对照组得到Fold-change值，确定荧光图像中值分析的Fold-change＞2和Fold-change＜0.5分别为上调和下调表达的糖链，Fold-change在0.5-2之间表示无变化。

基于血清检测时，当PTL-I、PNA、AAL、LTL、STL、BS-I、PTL-II、SBA、UEA-I、MAL-I、PHA-E+L都上调，同时ACA下调时可以将其与健康人区别，即患有肝病；在此基础上，当WFA、GSL-II、MAL-II、SJA、LEL、PWM、BPL都上调，同时EEL下调时，可以确定样品对应的人群患有重型乙型肝炎。

基于血清和唾液共同检测时，当STL、SBA、WFA、GSL-II都上调，同时ACA下调时可以将其与健康人区别，即患有肝病。

本发明具有如下有益效果：

本发明通过固定于芯片上的特定凝集素探针与样品中糖蛋白糖链特异性结合，可以快速检测出血清和共同基于血清和唾液样品中特有的糖蛋白糖链结构，可以迅速判断出样品中糖链的特异性结合，确定对应的人群是否患有肝炎，并确定是否为重型乙型肝炎。

附图说明

图1为凝集素芯片点样阵列图及应用于糖蛋白糖链的荧光检测图，图中A为凝集素芯片点样阵列图，B为健康人（HC）、慢乙肝（cHB）、重型乙肝（ACHBLF）患者血清糖蛋白糖链荧光检测结果图；

图2为健康人（HC）、慢乙肝（cHB）、重型乙肝（ACHBLF）患者唾液糖蛋白糖链荧光检测结果；

图3为验证结果图，图中A为lectinblotting图，B左侧为凝集素WFA与血清芯片结合的荧光检测结果图，右侧为WFA对应健康人、慢乙肝、重型乙肝血清结合强度比较。

具体实施方式

下面通过给出的具体实施例对本发明做进一步说明，但不作为对本发明的限定。

本发明中采用如表1所示的凝集素进行测试。

表1

采用的设备包括：电热鼓风干燥箱：天津泰斯特公司；高压灭菌锅：日本TOMY公司；超速冷冻离心机5804R：德国Eppendorf公司；微量核酸蛋白测定仪：德国Implen公司；生物芯片扫描仪4000B：美国Axon公司；芯片点样仪：博奥晶芯SmartArrayer48点样仪；芯片杂交箱HL-2000：美国UVP公司。

具体测试步骤如下：

（1）研究人群和全血清/唾液采集

志愿者无其它疾病，一周之内没有服用任何药物。已确诊的ACHBLF炎患者40例，cHB患者30例，HC80例，如表2所示，由于肝病患者年龄为42±10岁，20例健康志愿者年龄为40±5.5岁。全血、唾液采集至少1ml并立即置于冰上，加入蛋白酶抑制剂（每毫升唾液加入1μL）防止蛋白降解。

表2重型乙型肝炎，慢乙肝患者临床情况表

Thedataareshownasmeanstandarddeviation(SD).ACHBLF=acute-on-chronichepatitisBliverfailure,AFP=alpha-fetoprotein,ALB=albumin,ALP=alkalinephosphatase,ALT=alaninetransaminase,AST=aspartatetransaminase,CHB=chronichepatitisB,DBIL=directbilirubin,GGT=gammaglutamyltranspeptidase,GLB=globulin,HBeAg=HepatitisBeAntigen,HBsAg=hepatitisBsurfaceantigen,HBV=hepatitisBvirus,HC=healthycontrols,IBIL=indirectbilirubin,INR=internationalnormalizedratio,MELD=modelforend-stageliverdisease,NA=notavailable,PT=pro-thrombintime,PTA=prothrombinactivity,TBIL=totalbilirubin,TP=totalprotein,–=Not

（2）血清、唾液蛋白处理和荧光标记

收集到的全血经12000rpm4℃离心10min后吸取上清血清，收到的全唾液经12000rpm4℃离心10min后吸取上清弃去不溶沉淀物，上清再经0.22μm孔径的滤膜过滤掉细菌和其他微生物，为了减小个体差异并归一化个体样本，按照不同分组每例样本各取100μL混合，BCA法蛋白定量，混合样本经Cy3荧光染料标记后用SephadexG-25除盐柱去掉游离荧光，标记好的蛋白准备用于凝集素芯片孵育，个例样本用于血清/唾液芯片的点制。

（3）凝集素芯片和数据分析

凝集素芯片的制备，Cy3荧光标记的样本蛋白与凝集素芯片的孵育步骤及凝集素芯片数据获取与归一化分析与专利申请号为201110021447.3发明专利描述的凝集素芯片和数据分析过程一致。

（4）血清/唾液芯片的制备和数据分析

参见图3，血清/唾液芯片由个例血清/唾液样本点制而成，样本根据HC、cHB、ACHBLF患者分成三组，各20例，Cy3标记的凝集素用以检测这些血清/唾液样本中凝集素特异识别的糖链结构表达水平。血清/唾液蛋白溶于点样缓冲液（0.5mg/mLBSA溶于1×PBS,pH7.4）中至终浓度1mg/mL，并用芯片点样仪点制于环氧化修饰的玻片上。血清/唾液芯片的布局图显示在图3中A部分。每个样本区内重复三次，每张片基三个重复区。点好的片基在50%湿度中孵育过夜，然后37°C真空干燥3h固定，固定好的芯片可4°C避光密封保存备用。芯片首先在封闭缓冲液中常温封闭1h，1×PBST和1×PBS各清洗两次，每次5min，离心甩干。后加入配好的含Cy3标记凝集素的孵育缓冲液，在芯片杂交箱内4rpm缓慢旋转3h，1×PBST和1×PBS各清洗两次，每次10min，离心甩干。通过芯片扫描仪设置光电倍增管70%和激光强度100%，在532nm波长处扫描芯片图像。图像经Genepix3.0软件分析获取原始数据。原始数据中小于两倍背景标准偏差的值去掉，每张芯片上每个样本九个重复点的有效值再取平均值（AS），每组平均值表示为组内每个样本平均值（AS）的均值（AG）±标准偏差（SDG）。任意两组或多组间借助SPSSstatistics19软件进行t检验或单方面方差分析（one-wayANOVA）寻找显著差异，参见图3中A和B部分。

结果分析

重型乙肝、慢乙肝及健康志愿者血清糖蛋白糖链谱的变化

利用凝集素芯片分别对健康志愿者、慢乙肝、重型乙肝血清样本进行检测，通过专业软件获取芯片数据并归一化处理后，首先将两组肝病结果与健康组结果进行比较，即每个凝集素对应的归一化后NFI在ACHBLF、cHB分别比HC得到Fold-change值，我们将Fold-change>2和Fold-change<0.5作为肝病患者相较于健康人在血清中上调和下调表达的糖链。

结果发现，有26种凝集素识别的糖链在HC，cHB，ACHBLF患者血清中差异表达（表3和图1B）。其中WFA识别的terminatinginGalNAcα/β1-3/6Gal,GSL-II和GSL-I识别的theGlcNAcandαGal,PTL-II识别的theGal，PWM识别的thebranched(LacNAc)n,和BPL识别的theGalβ1-3GalNAc,TerminalGalNAc糖链结构在ACHBLF患者血清中较HC，cHB中高表达(allfoldchange≥2,p=0.005)(图1)。

其中，12种凝集素（如：MAL-II,PTL-I,SJA,PNA,andAAL）识别的糖链在ACHBLF患者血清中较HC高表达，3种凝集素（EEL,LTL,andACA）识别的糖链在ACHBLF患者血清中较HC低表达，但是BS-I识别的theα-Gal,α-GalNAc,Galα-1,3Gal,Galα-1,6Glc,UEA-I识别的theFucα1-2Galβ1-4Glc(NAc)糖链在ACHBLF患者血清中较cHB中低表达，其他凝集素在ACHBLF与cHB患者血清中表达无显著差异。

除此之外，MPL识别的theGalβ-1,4GlcNAc(typeII),Galβ1-3GlcNAc(typeI)binderECA,theGalβ1-3GalNAc,GalNAc,DBA识别的theαGalNAc,Tnantigen,GalNAcα1-3(Fucα1-2)Gal,和NPA识别的theHigh-Mannose,Manα1-6Man糖链在ACHBLF患者血清中较cHB显著高表达，而这些糖链在ACHBLF和HC血清中表达无显著差异。

重型乙肝、慢乙肝及健康志愿者血清糖蛋白糖链谱之间的比较

通过对ACHBLF、cHB及HC血清凝集素芯片结果比较，发现10种凝集素（如：ECA，WFA，GSL-II，MPL）识别的糖链在ACHBLF患者血清中表达水平显著高于cHB患者，而BS-I和UEA-I识别的糖链在ACHBLF患者血清中的表达水平显著低于cHB患者，20种凝集素（如：WFA，GSL-II，MAL-II，PTL-I）识别的糖链在ACHBLF患者血清中较HC中差异性表达。

表3重型乙型肝炎，慢乙肝患者血清糖蛋白糖链谱的表达

^aSignalintensitiesobtainedfor9repeatedblocksinthreerepeatedslideswerenormalizedandaveraged,andtheratiosofACHBLFvs.HC,cHB(ACHBLF/HCANDACHBLF/cHB)werecalculated.HC:healthycontrol;cHB:HBV-infectedpatientswithchronicliverdiseases;ACHBLF:acute-on-chronichepatitisBliverfailure

^b/,negativesignal;－,nosignificantdifference;*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

乙肝、肝硬化和肝癌患者唾液糖蛋白糖链谱的变化

利用凝集素芯片分别对HC、cHB、ACHBLF患者唾液样本进行检测，通过专业软件获取芯片数据并归一化处理后，首先将两组肝病结果与健康组结果进行比较，即每个凝集素对应的归一化后NFI在ACHBLF、cHB分别比HC得到Fold-change值。我们认为Fold-change>2和Fold-change<0.5为肝病患者相较于健康人在血清中上调和下调表达的糖链。(图2)

结果发现，有16种凝集素识别的糖链在HC，cHB，ACHBLF患者唾液中差异表达（表4和图2）。其中GSL-I识别的αGalNAc,αGal,anti-AandB,STL识别的trimersandtetramersofGlcNAc,core(GlcNAc)ofN-glycan,oligosaccharidecontainingGlcNAcandMurNAc，ConA识别的High-Mannose,Manα1-6(Manα1-3)Man,terminalGlcNAc等糖链在ACHBLF和cHB患者中差异性高表达，而Jacalin识别的Galβ1-3GalNAcα-Ser/Thr(T),GalNAcα-Ser/Thr(Tn),GlcNAcβ1-3-GalNAcα-Ser/Thr(Core3),sialyl-T(ST).notbindtoCore2,Core6,andsialyl-Tn(STn)，WFA识别的terminatinginGalNAcα/β1-3/6Gal等糖链只在ACHBLF患者中差异性高表达。

表4重型乙型肝炎，慢乙肝患者唾液糖蛋白糖链谱的表达

^aSignalintensitiesobtainedfor9repeatedblocksinthreerepeatedslideswerenormalizedandaveraged,andtheratiosofACHBLFvs.HC,cHB(ACHBLF/HCANDACHBLF/cHB)werecalculated.HC:healthycontrol;cHB:HBV-infectedpatientswithchronicliverdiseases;ACHBLF:acute-on-chronichepatitisBliverfailure

^b/,negativesignal;－,nosignificantdifference;*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

凝集素探针组确定

通过上述结果分析得到凝集素探针筛选血清的结果，指标参见表5。

表5

本发明凝集素探针筛选唾液的结果，指标参见表6。

表6

本发明凝集素探针筛选血清和唾液共有的结果，指标参见表7。

表7

凝集素芯片结果验证

为进一步验证凝集素芯片的结果，验证凝集素探针与HC、cHB、ACHBLF患者血清样本中识别糖链的结合。以凝集素WFA为例，将Cy3荧光标记的WFA与转膜后的血清蛋白或者点制好的血清芯片孵育，经扫描仪扫描（见图3B）和Genepix3.0软件分析，根据1.6所述方法对原始数据深入分析。结果显示，WFA与20例cHB，20例ACHBLF患者血清样本中识别糖链的结合强度明显高于健康人血清样本的结合（见图3A和3B），经studentt-test发现P值小于0.05。其余凝集素探针验证方法参照此方法，结果均显示与凝集素芯片结果一致。证明这些凝集素可以作为探针通过对血清中的糖蛋白糖链的检测鉴别肝系列病。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种基于血清糖结合蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片，包括测试凝集素探针组，其特征在于：所述测试凝集素探针组至少包括PTL-I、PNA、AAL、LTL、STL、BS-I、PTL-II、SBA、ACA、UEA-I、MAL-I、PHA-E+L。

2.根据权利要求1所述基于血清糖结合蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片，其特征在于：所述测试凝集素探针组还包括WFA、GSL-II、MAL-II、SJA、EEL、LEL、PWM、BPL。

3.一种共同基于血清和唾液中糖蛋白检测糖链标志物的凝集素芯片，包括测试凝集素探针组，其特征在于：所述测试凝集素探针组至少包括STL、SBA、ACA、WFA、GSL-II。

4.一种权利要求1-2所述凝集素芯片在检测血清中糖蛋白检测糖链标志物的应用。

5.一种权利要求3所述凝集素芯片在共同检测血清和唾液中糖蛋白检测糖链标志物的应用。

6.一种含有权利要求1或2或3所述凝集素探针组的试剂盒。