NO170908B - Immunokjemisk fremgangsmaate for paavisning og bestemmelse av diagnostisk relevante substanser samt anvendelse av fremgangsmaaten - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for påvisning og bestemmelse av nærvær av diagnostisk relevante substanser, spesielt antistoffer eller antigener, i prøvevæsker, fortrinnsvis efter en ELISA-metode, ved fotometrisk vurdering av de fra prøvevæskene fremstilte prøver, med innfarvede, enzymatisk markerte antigen-antistoff-komplekser hvor det bare fremstilles en eneste prøvefortynning av prøvene, i denne prøvefortynning utløses en antigen-antistoff-bindings-reaksjon idet fortrinnsvis en reaksjonsdeltager er fiksert til en fast overflate, og antigen-antistoff-komplekset underkastes en enzymatisk tilveiebragt farvereaksjon, for å fremstille en farveoppløsning, og fra det på denne farve-oppløsningen målte spektrale absorbsjonsmål fastslås under anvendelse av på forhånd målte referansedataer, en til sluttfortynningstiteren svarende titer.

Oppfinnelsen angår også fremgangsmåtens anvendelse ved

. påvisning av stoffer som angitt ovenfor.

Med "spektralt absorbsjonsmål" menes ovenfor og i det følgende det begrep som tidligere gikk under betegnelsen "ekstinksjon".

Oppfinnelsen tjener til påvisning og trinnløs kvantifisering av diagnostisk relevante stoffer idet en eneste prøveblanding er tilstrekkelig for prøvens undersøkelse. Som prøve kan man anvende den "enzym-linked"-immunosorbent-analyse (ELISA), radio-immunoanalysen (RIA), nukleinsyre-hybridisering, nephelometri eller andre bestemmelsesmetoder. Som diagnostisk relevante stoffer anses for eksempel antigener, antistoffer av de forskjellige immunglobulinklasser, nukleinsyrer eller også stoffskifteprodukter av medisinsk betydning.

De vanlige kvantifiseringsfremgangsmåter av diagnostisk relevante stoffer, lar seg tilbakeføre på til to prinsipper. På den ene side kan kvantifiseringen av stoffet som skal bestemmes foregå over en referansekurve som på forhånd ble konstruert'av prøver med kjent stoffinnhold. Den alternative mulighet består i en titrering av stoffet som skal bestemmes ved hjelp \ av sluttpunktfortynning. Sistnevnte måte lønner seg alltid når det for ufortynnede eller bare svakt fortynnede prøver skal undersøkes, er vanskelig å oppstille den ovenfor nevnte referansekurve eller bare til utilfreds-stillende å benytte den. Dette er for eksempel tilfelle ved

i

bestemmelse av prøvespesifikke antistoffer i ELISA.

i

i

Av denne grunn anvendes fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen også fortrinnsvis i dette tilfellet, og forklares nedenfor nærmere i denne utførelsesform. Som eksempel for diagnostisk relevante stoffer, anvendes altså antistoffer som eksempler for den innledningsvis nevnte prøve, ELISA. Følgelig betyr i

i

beskrivelse og krav et "spesifikt farvesignal" på samme måte for andre prøver, for eksempel også radioaktiv nedbrytning, (counts), eller relativt spredningslys-signal.

ELISA-metpden er en kjent enzym-immun-prøve som tjener til påvisning! av antistoffer eller antigener ved parasitære bakterielle eller virale infeksjoner. Oppfinnelsen tjener til forbedring av vurderingen av farveoppløsninger som for eksempel 1 dannes ved kontakt mellom ~det serum som skal undersøkes på bestemte antistoffer i en spesiell prøvefortyn-ning, og ; til mikrotitreringsplater fikserte antigener, med efterfølgende enzymatisk påvisning av det eventuelt dannede antistoff-antigen-kompleks.

Spesielt vedrører oppfinnelsen den fotometriske vurdering av slike oppløsninger, hvor det spektrale absorpsjonsmål for de således fremstilte oppløsninger måles, og som er et mål for de dannede enzymatiske markerte farvedannende immunkomplekser i oppløsningen. Vanligvis vurderes et serum som positivt når det spektrale absorpsjonsmål for for den ovenfor omtalte dannede oppløsning overskrider en bestemt grense- eller terskelverdi. Diskusjoner over denne type av vurdering finnes for eksempel i "Immun.Infekt." 9, 33-39 1981.

Det er imidlertid ønskelig ikke bare å fastslå overskridelse eller underskridelsen av grenseverdien, men også å kunne gjøre kvantitative uttalelser over nærvær av antistoffer i serumet som skal undersøkes. Det er kjent for dette formål å gjennomføre såkalte "fortynningsrekker", det vil si ved forskjellig prøvefortynninger å gjennomføre ELISA og å måle det spektrale absorpsjonsmål for de respektive resulterende farveoppløsninger. Ved forbinding av de enkelte fotometriske måleverdier i en grafikk, fremkommer for hver serumprøve en såkalt prøvefortynningskurve (fig. 1). De prøvefortynninger hvor prøvefortynningskurven skjærer den på forhånd gitte grenseverdi, angir sluttfortynningen for antistoffet som skal bestemmes sluttfortynningen, idet denne sluttfortynning er den resiproke verdi av antistofftiteren (sluttfortynnings-tid). Kvantifiseringen av antistoffet foregår altså over angivelse av prøvefortynning, hvorved man oppnår påvisningsgrensen. For målepunktene av prøvefortynningskurven anvendes ofte de målte spektrale absorpsjonsmål, ikke i den direkte målte tallverdi, men det foregår for det meste en måleverdi-korrektur. Typen av korrekturen kan bestå i substraksjon av måleverdien av en i ELISA medført egnet kontroll (buffer, negativt serum), eller av en parallellblanding av serumet som skal bestemmes med til mikrotitreringsplater fiksert kontroll antigen eller en startekstinksjon ved iakttagelse av en farvefremkallingskinetikk. Videre er det mulig med multi-plikasjoner av den direkte målte måleverdi med en korrektur-faktor som fremkommer på egnet måte fra en medført standard eller også angivelsen av en koeffesient respektivt indeks som fremkommer ved divisjon av den direkte målte måleverdi, med den av en medført negativ prøve. Denne korrigerte måleverdi betegnes i det følgende som spesifikt farvesignal, og ligger til grunn for angivelsen av sluttfortynningstiteren.

Den vesentlige ulempe av en kvantitativ vurdering på den omtalte måte er at gjennomføringen er tids- og reagens-krevende. Det ble derfor foretatt forsøk, fra den på en eneste prøvefortynning i ELISA målte spektrale absorpsjonsmål, å slutte til serumets sluttfortynningstiter. Således omtaler for eksempel van Loon og van der Veen i "J.Clin. Pathol." l 33, 635-639 (1980), påvisning av toksoplasma-antistoffer med ELISA-metoden under anvendelse av en eneste serumfortynning i forbindelse med en referansekurve. Derved sammenlignes det spektrale absorbsjonsmål som ble målt ved ELISA ved en serumfortynning på 1:800, med den samme spektrale absorbsjonsmål i referansekurven som angir de på en rekke av sera i prøvefortynning 1:800 fundne spektrale absorbsjonsmål som funksjon av sluttfortynningstiteren. Derved ble denne referansekurve konstruert grafisk som middelverdi av måleverdiene for flertallet av sera. En forbedring av denne fremgangsmåte omtales av van Loon et al., i "J.Clin.Pathol." 34, 1981, 665-669, hvor verdiene for de spektrale absorbsjonsmål erstattes med de spesifikke farvesighaler som fåes ved subtrahering av det spektrale absorbsjonsmål for et til 1:800 fortynnet negativt kontrollserum fra det spektrale absorbsjonsmål for prøveserumet. På denne måte kunne avvikene for eksperimentelt målte sera fra referansekurven forbedres, i det minste i noen tilfeller. I andre tilfeller var forbedringen imidlertid så liten at sammenligning med negativt kontrollserum var unødvendig.

1

Skjønt iman ved denne kjente fremgangsmåte for praksis allerede hadde oppnådd en forenkling idet det bare måtte fremstilles en eneste prøvefortynning, har denne fremgangsmåten dog betraktelige ulemper. Den for denne fremgangsmåte egnede og anbefalte prøvefortynning på 1:800, er meget høy, således at for det første er fremgangsmåtens følsomhet for liten (se svak positiv serum på fig. 1), og for det andre potensierer pipetteringsfeil seg. Dessuten er i praksis arbeidet med en referansekurve omstendelig og krever ved automatisk måledatavurdering en komputer.

i

OppfinnéIsens oppgave er å tilveiebringe, en. fremgangsmåte til kvantitativ bestemmelse av antistoffer eller antigener, for eksempel ved ELISA, hvor det kan anvendes en lavest mulig fortynning av prøven som skal undersøkes, og titerbestemmel-sen kan gjennomføres på enkel måte, for eksempel ved hjelp av en lommekalkulator.

Dessuten skal anvendelsesområdene for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen angis.

I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse en immunokjemisk fremgangsmåte for påvisning og bestemmelse av diagnostisk relevante substanser, spesielt en ELISA-metode, og fremgangsmåten karakteriseres ved at det pr. prøve kun fremstilles en eneste prøvefortynning på ca. 1:150 og at det spektrale absorbsjonsmål (Aqd) for farveoppløsningen måles og at man fra det oppnådde signal bestemmer sluttfortynningstiteren i henhold til formelen:

hvorved i formel (1), sluttfortynningstiteren er den resiproke verdi av den sluttfortynning som ved signalet Aqd tilsvarer grenseverdisignalet ved påvisningsgrensen overfor negative kontrollprøver, og verdien for a og p bestemmes adskilt, eksperimentelt ved forsøksrekker på prøver med kjent sluttfortynningstiter for analyttene ved fastlagt prøvefor-tynning for den angjeldende kombinasjon av Immunologisk reaktiv overflate og enzymmarkert immunglobulin, henholdsvis antigen som detektor ved like omsetnings- og fikserings-betingelser, hvorved det for a anvendes verdier i området 3,0 til 3,6 og for e-verdier i området 0,10 til 0,27 og verdi-paret for a og p fastslås der den angjeldende kvotient <T>målt/Tberegnet for de enkelte prøver ligger i et område på 0,8 - 1,25.

Fortrinnsvis anvender man ved denne fremgangsmåte, som signal Aqd for det spektrale absorbsjonsmål, det ovenfor definerte spesifikke farvesignal i formel 1.

Som antydet ovenfor angår oppfinnelsen også anvendelsen av den beskrevne fremgangsmåte for bestemmelse av nærværet av rubella-antistoffer, cytomegalovirus-antistoffer eller hepatitt-B-overflate-antigen (HBsAg) i sera ved hjelp av mikrotitreringsplater på hvilke tilsvarende rubella-antigener, cytomegalovirus-antigener eller antistoffer mot HBsAg er fiksert.

i

Videre angår oppfinnelsen anvendelsen av denne fremgangsmåte

i

der man som indikatorsystem anvender alkalisk fosfatase eller peroksydase.

Som prøvefortynninger kan det anvendes prøvefortynninger i området fra ufortynnet til 1:800, idet en prøvefortynning på bare 1:150 er å foretrekke. I sistnevnte tilfelle er prøvef ortynningen ennu så liten at det er sikret en høy følsomhet av immunprøvefremgangsmåten, for det andre, har

i

eksprimenter vist at med en prøvefortynning på 1:150 kan det fåes relativt godt reproduserbare resultater.

Lavere prøvefortynninger er mulig, krever imidlertid såvel ved den immunologisk reaktive overflate for eksempel av de antigenbelagte mikrotitreringsplater som også konjugatet, en høy renhet ved høy reaktivitet.

Det har vist seg at brukbare verdier for a ligger i området på 3,0 til 3,6, og for p i området på 0,10 til 0,27.

Den riktige bestemmelse av disse verdier a og P danner grunnlag for den fordelaktige anvendelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen i praksis. Når først optimale verdier for a og p er funnet, kan vurderingen, det vil si titer-bestemmelsen av prøven, gjennomføres regnemessig meget

i

enkelt. Verdiene for a og 3 kan for eksempel bestemmes ved reagensfremstilleren ved hjelp av forsøksrekker på et flertall av undersøkelsesprøver, idet man på disse sera måler respektivt det spesifikke farvesignal ved den ønskede

prøvefortynning og i tillegg bestemmer titeren på i og for seg kjent måte ved sluttpunktfortynning. Det for hver prøve dannede verdipar søkes derefter ved iterativ tilpasning av egnede verdier for ot og p, for hvilke det oppnås et optimum for den overensstemmelsen mellom den ved sluttpunktfortynning målte titer Tm^^t- og den fra formel (I) efter anvendelse av det spesifikke farvesignal beregnede titer TDer. Ved en slik iterativ fremgangsmåte beregner man for eksempel den tilhørende titer TDer med i første rekke vilkårlig antatte tallverdier for a og P via formel (I) fra det spesifikke farvesignal av hver prøve. Dessuten bestemmes titeren T^ it ved sluttpunktfortynning.

Når kvotienten ^ mål/^ er <=> 1>0» ville dette bety at den riktige titer av det spektrale absorpsjonsmål ved prøvefor-tynningen er oppnådd. Under realistiske betingelser må en koeffesient mellom 0,8 og 1,25 anses som "titernøyaktig truffet". Koeffesienter under 0,5 og over 2,0 betyr at den

for en klassisk titrering tillatelig reproduserbarhetsgrense ble overskredet.

Efter det første forsøk som vanligvis gir en ennu dårlig regnemessig titer-forhåndsutsagn, endres så a og p trinnvis, og sammenlignes derefter igjen for hver serumprøve av den beregnede titer med den målte titer. Denne interasjonsfrem-gangsmåte fortsettes inntil overensstemmelsen er tilfreds-stillende .

Forsøkene viser at man kan gå ut fra at optimum oppnås når i en forsøksrekke ligningen

gjelder for ca. 5OSé av de prøvede sera.

Disse erfaringer gjelder seg til prøverekker med alkalisk fosfatase som indikatorenzym. Når peroksydase kan anvendes som indikatorenzym, kan " tref fgraden" økes til ca. 65%. Disse grenser ligger imidlertid innen området for spredningen ved selve 1ELISA-metoden, og kan således ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ikke overvinnes for kvantitativ vurdering av måleresultatene.

Videre har det vist seg at verdiene for a og p ikke hare avhenger av typen av den diagnostiske prøve, men også av fremstillingschargene av de anvendte immunologisk reaktive faste faser og konjugatet. De to konstanter må følgelig for den praktiske anvendelse av fremgangsmåten for eksempel bestemmes på ny for kombinasjonen av en prøveplate- og en konjugatcharge, muliggjør da imidlertid rekkemålinger på prøver som skal undersøkes, med god reproduserbarhet, og for praksis meget god nøyaktighet.

I det følgende forklares oppfinnelsen nærmere ved hjelp av eksempler, og måleresultater. Derved henvises det også til tegningene.

På fig. viser:

Fig. 1 i henhold til teknikkens stand gjennomførte fortynningsrekker i form av prøvefortynningskurver som viser det spesifikke farvesignal som funksjon av prøvefortynningene; Fig. 2 avhengigheten av det spesifikke farvesignal ved en prøvefortynning på 1:150 av den faktiske ved sluttfortynning bestemte titer (Tm^n)5 Fig. 3 avhengigheten av den ifølge formel (1) beregnede titer (Ttøer) av det spesifikke farvesignal ved en prøvefortynning på 1:150 på de samme prøvereagenser som på fig. 2; og Fig. 4 den målte titer T m^^ fra fig. 2, sammenlignet med den beregnede titer T^er fra fig. 3, ved identisk spesifikt farvesignal av de 1:150 fortynnede undersøkelsesprøver.

Til utprøving av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ble det gjennomført forsøk for bestemmelse av antistoffer mot cytomegaio-virus i sera ved hjelp av mikrotitreringsplater til hvis vegger det var fiksert cytomelagovirus-antigen og for bestemmelse av antistoffer mot rubella i sera ved hjelp av mikrotitreringsplater på hvis vegg det var fiksert rubella-antigen. Undersøkelsesprøvene i prøvefortynningen 1:150 ble bragt til reaksjon med de fikserte antigener, de ikke-bundne antistoffer ble vasket ut, et enzym bundet til de dannede antistoff-antigen-komplekser over en konjugatopp-løsning, og den overskytende konjugatoppløsning vasket ut, en innfarving bevirket ved hjelp av en kromogen substratopp-løsning, via enzymet, hvorefter reaksjonen avsluttes med en stopp-oppløsning. De således fremstilte, i avhengighet av innholdet av de virus-spesifikke antistoffer innfarvede prøver, ble derefter vurdert, idet deres spektrale absorbsjonsmål Aqd ble bestemt fotometrisk (ved en definert bølge-lengde ).

I fortynnelsesrekker ble, for de samme prøver, først sluttfortynningstiteren Tm^^ bestemt på i og for seg kjent måte, og så sammenlignet med den via formel (1) ifølge oppfinnelsen beregnede titer TDer.

For forbedring av reproduserbarheten og nøyaktigheten av fremgangsmåten, ble i alle tilfeller det spesifikke absorpsjonsmål eller det "spesifikke farvesignal Aqd" anvendt, anvendt den spesifikke ekstinksjon eller det "spesifikke

Fig. 1 viser en kurvegjengivelse av det spesifikke farvesignal Aqd i avhengighet av forskjellige prøvefortynninger (prøvefortynninger -<1>) for tre positive sera A,B og C, for et negativt serum D. Dette eksempel viser kurveforløp som bare i området for høyere prøvefortynninger, eksempelvis 1:800, kan parallelliseres. Dette er basis for en egnet referansekurve ifølge van Loon.

Mens knekken i prøvefortynningskurven ved et serum med høy antistofftiter (eksempel A) viser den litteraturkjente prozoneffekt, er det ikke helt klart hvorfor fortynnings-kurvene avflates i det nedre området i nærheten av sluttfortynningstiteren.

Det hie nu funnet at den ved en fortynnlngsrekke bestemte sluttfortynningstiter for et bredt flertall av prøver består i forhold til den ved en prøvefortynning på for eksempel 1:150 målte spektrale absorpsjonsmål:

idet konstantene a og p muliggjør en tilpasning til prøve- og undersøkelisesbetingelsene.

i

Dette faktum fremgår av fig. 2-4. På fig. 2 er avhengigheten av det spesifike farvesignal Aqd på 58 sera i en fortynning på 1:150 oppført som funksjon av den ved sluttfortynningen bestemte titer Tm^i. På den annen side viser fig. 3 titeren som er beregnet ifølge formel 1 fra det spektrale absorpsjonsmål Aqd ved optimale verdier for a og P. Det lille spredningsområdet av denne kurve fremgår av den matematiske oppstilling.

Fig. 4 viser nu tydelig at den ifølge formel I beregnede kurve og; titerverdiene midler måleverdiene fremragende. Herav fremgår det således at det med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan oppnås en optimal forutsigelse av sluttfortynningstiteren.

Denne gode overensstemmelse mellom T^er og T m^^ oppnås riktignok; bare når det legges omhyggelighet i bestemmelsen av verdiene for a og p.

i

Ved hjelp av følgende tabell over målte og beregnede data av en forsøksrekke på 60 sera forklares nu som eksempel fremgangsmåten for bestemmelse optimering av a og p.

i

I spalte' 1 1 tabellen er måleverdiene av spesifikke farvesignal på prøver i en prøvefortynning på 1:150 angitt for 60 sera. I spalte 2 er den ved sluttfortynningsrekker målte titer Tm4i angitt for de samme sera. Spalte 3 viser for de samme sera den efter formel (1) fra farvesignalet å spalte 1, under anvendelse av de efter optimering funnede verdier a = 3,4514 og p =0,2106, beregnede titer TDer.

Ved hjelp av moderne disponible regnemaskiner er det idag intet stort arbeide å programmere den anvendte interative fremgangsmåte for optimering av a og 3 for bestemte reagens-kombinasjoner.

Koeffesienten ^ mål/^ ber er derefter angitt, nemlig vurdert efter "for liten" (mindre enn 0,8) "ca. like 1" (i området 0,8-1,25), og "for stor" (større enn 1,25).

I det viste tilfellet ser man at for 4556 av de prøvede sera er det oppnådd en god tilnærming. Under hensyntagen til utbredningen av sluttfortynningstiteren, se fig. 2, kan derfor valget av verdiene for a og p anses som meget godt for praksis.

Claims (5)

1. Immunokjemisk fremgangsmåte for påvisning og bestemmelse av diagnostisk ; relevante substanser, spesielt en ELISA-metode, karakt jerisert ved at det per prøve kun fremstilles en eneste prøvefortynning på ca. 1:150 og at det spektrale abisorpsjonsmål (Aqd) for farveoppløsningen måles og at man f ra : det oppnådde signal bestemmer sluttfortynningstiteren i henhold til formelen: i hvorved i formel (1), sluttfortynningstiteren er den resiproke verdi av den sluttfortynning som ved signalet Aqd tilsvarer grenseverdisignalet ved påvisningsgrensen overfor i negative kontrollprøver, og verdien for a og p bestemmes adskilt, eksperimentelt ved forsøksrekker på prøver med kjent sluttfortynhingstiter for analyttene ved fastlagt prøvefor-tynning for den angjeldende kombinasjon av immunologisk reaktiv overflate og enzymmarkert immunglobulin henholdsvis antigen som detektor ved like omsetnings- og fikserings-betingelser', hvorved det for a anvendes verdier i området 3,0 til 3,6 og, for p-verdier i området 0,10 til 0,27 og verdi-paret for ' a og p fastslås der den angjeldende kvotient Tmålt/Tberegnet f°r de enkelte prøver ligger i et område på 0,8 - l,25.i

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at1 man som signal Aqd for det spektrale absorpsjonsmål anvender det spesifikke farvesignal i formel (1) som er oppnådd a) ved subtrahering av signalet for det spektrale absorpsjonsmål for en i ELISA medført kontroll (for eksempel buffer eller negativ prøve), eller signalene for de spektrale absorpsjonsmål til en parallellansats av prøven i som skal undersøkes på en med et kontrollpreparat belagt overflate eller signalet for det spektrale absorpsjonsmål som begynnelse av en farveøkningsmåling, fra signalet for det spektrale absorpsjonsmål i prøven som skal undersøkes, b) ved multiplisering av signalet for det spektrale absorpsjonsmål i prøven som skal undersøkes, med en korrektur-faktor som oppnås fra en medført forsøkskontroll (for eksempel standard), eller c) efter koeffisient- henholdsvis indeks-dannelse, av signalet for det spektrale absorpsjonsmål av prøven som skal undersøkes, og d) til en medført forsøkskontroll (for eksempel negativ prøve).

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakter is ert ved at verdiene for a og p bestemmes på et antall prøvevæsker eller prøver idet signalet Aqd måles på disse prøver ved den ønskede prøvefortynnelse og titeren i tillegg, på i og for seg kjent måte, bestemmes ved slutt-punktf ortynning , og derefter, fra de oppnådde verdipar (titer Aqd). for de enkelte prøvevæsker eller prøver ved iterativ tilpasning søker egnede verdier for a og P, for hvilke overensstemmelsen mellom den ved sluttpunktfortynningen målte titer (<T>måit) og den fra formel (1) ved innsetning av signalet Aqd utregnede titer (TDeregne-t) når et optimum.

4. Anvendelse av fremgangsmåten ifølge et av kravene 1-3, for bestemmelse av nærværet av rubella-antistoffer, cytomegalovirus-antistoffer eller hepatitt-B-overflate-antigen (HBsAg) i sera ved hjelp av mikrotitreringsplater på hvilke tilsvarende rubella-antigener, cytomegalovirus-antigener eller antistoffer mot HBsAg er fiksert.

5. Anvendelse av fremgangsmåten ifølge krav 4, der man som indikatorsystem anvender alkalisk fosfatase eller peroksi-dase. i