JP3537829B2 - １段階オールインワン乾燥試薬イムノアッセイ - Google Patents
１段階オールインワン乾燥試薬イムノアッセイInfo
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Description
本発明は、必要なアッセイ特異的成分の全てが、その
サンプルが添加される前に、その反応ウェルに事前に添
加され、そして乾燥されている新規なイムノアッセイに
関する。本発明は、さらに、上記アッセイを実施におい
て有用なデバイスにも関する。 発明の背景 本発明の背景を明らかにするために本明細書中に使用
する刊行物その他の材料、及び特に、その実施に関する
さらなる詳細を提供するためのケースを、引用により取
り込む。 ランタニド・キレート標識及び時間分解（time−reso
lved）フルオロメトリーは、10年以上も前に既にイムノ
アッセイの分野に導入された（Siitari et al.Nature 3
01,258−60,1983）。上記標識の高い比活性との組合せ
におけるモノクローナル抗体の利用可能性は、優れた感
度及びダイナミック・レンジをもつ非競合的イムノアッ
セイが実施されることを可能にした（Ekins and Dakub
u,Pure Appl Chem 57,473−82,1985,Lvgren and Pett
erssson in:Van Dyke K and Van Dyke R eds.Luminesce
ce Immunoassays and Molecular Applications.Boca Ra
ton,U.S.A:CRC Press Inc.,233−50,1990）。高い比活
性をもついくつかの異なる標識がその後に出現してきて
いる（Kricka Clin Chem 40,347−57,1994,Price and N
ewman eds.,Principles and Practice of Immunoassay
s.New York:Stockton Press,650pp,1991,Dickson et a
l.Pharmac Ther 66,207−35,1995）。モノクローナル抗
体は広くポリクローナル抗体の代りに使用され、そして
非競合的アッセイのデザインは、可能なときはいつも好
ましいものである。特に、新規の非アイソトープ標識の
有用性は、イムノアッセイの分野の現在の自動化レベル
に貢献した。 別の戦略も、イムノアッセイの感度及び信頼性を改善
するために選択されることができる（Kricka Clin Chem
40,347−57,1994,Price and Newman eds.,Principles
and Practice of Immunoasays.New York:Stockton Pres
s,650pp,1991,Dickson et al.Pharmac Ther 66,207−3
5,1995,Ekins and Chu Clin Chem 37,1955−67,199
1）。非競合的イムノアッセイの高い感度は、高アフィ
ニティー抗体と共に高比活性をもつ標識を使用すること
によってのみ具現化されることができるので（Ekins an
d Dakubu,Pure Appl Chem 57,473−82,1985,Ekins and
Chu Clin Chem 37,1955−67,1991）、より高い感度の検
出技術について探索についてかなりの努力が払われてい
る。検出器ノイズの如き要因に加えて、標識試薬の非特
異的シグナル及び非特異的結合を生じさせるサンプル中
の妨害が、全体のアッセイ感度を減少させる（Ekins an
d Dakubu,Pure Appl Chem 57,473−82,1985,Lvgren a
nd Petterssson in:Van Dyke K and Van Dyke R eds.Lu
minescece Immunoassays and Molecular Applications.
Boca Raton,U.S.A:CRC Press Inc.,233−50,1990）。新
規のイムノアッセイ戦略をデザインするための他の理由
は、高品質のキー試薬により信頼性を改善すること、そ
してより直接的な手順を得るために不必要な段階を取り
除くことによりアッセイを単純化することである。 時間分解フルオロメトリー及びランチニト・キレート
標識に基づくイムノアッセイ技術は、元来、解離強化ラ
ンタニド・フルオロイムノアッセイ（dissociation enh
anced lanthanide fluoroimmunoassay（DELFIA）のコン
セプトに基づくものであった（Hemmil et al.Anal Bi
ochem 137,335−43,1984）。そのアフィニティー及び特
異性に対するいかなる影響を伴わずにモノクローナル抗
体に共有結合することができるであろう高比活性の標識
（Ｌvgren and Petterssson in:Van Dyke K and Van
Dyke R eds.Luminescece Immunoassays and Molecular
Applications.Boca Raton,U.S.A:CRC Press Inc.,223−
50,1990）は、改善された感度をもついくつかの非競合
的アッセイのデザインにおいてひじょうに有用であるこ
とが証明された（Pettersson et al.Clin Chem 29,60−
4,1983,Nnt et al.Isr J Clin Biochem Lab Sci
４,36,1985,Suonp et al.Clin Chem Acta 145,341
−8,1985,Hemmil in:Wineforder ed.Chemical Analys
is,Vol 117.Toronto:Wiley ＆ Sons,343pp,1991,Xu et
al.Clin Chem 38,2038−43,1992）。さらに、良好な性
能特性をもつ競合アッセイ（Bertoft et al.FEBS Lett
173,313−6,1984,Eskola et al.Chin Chem 31,1731−4,
1985,Nnt et al.Isr J Clin Biochem Lab Sci ４,5
2,1985,Lvgren Steroid Biochem 27,47−51,1987）が
行われた。但し、その標識は、このアッセイ・デザイン
においてその感度に本質的に寄与しない（Ekins and Da
kubu,Pure Appl Chem 57,473−82,1985,Ekins and Chu
Clin Chem 37,1955−67,1991）。 日常的な実験室内で行われるイムノアッセイは、広く
自動化されている。アナライザーは、速いランダムな及
び連続的なアクセス・モードにおいて作動しなければな
らない。処理能力は、一般的な化学アナライザーのもの
と同様なものでなければならず、そして試薬の大きな搭
載（on−board）供給が、オペレーターの実地の時間を
減少させなければならない。自動化の要求は、ほとんど
の標識技術について困難であることが判明し、そして上
記パネル内の分析物（analytes）の性能特性は、行なわ
れなければならなかった妥協のために欠点をもってい
た。本発明において、我々は、乾燥形態において１のテ
ストにおいて必要なアッセイ特異的試薬の全てを入れた
マイクロタイトレーション・ウェル内の１段階手順にお
いて全てのアッセイが行われるところの自動化のために
好適な比較的速いイムノアッセイ技術について記載す
る。高比活性をもつ本発明に螢光性の安定性ランタニド
・キレートを、標識として使用する。モデル・アッセイ
の性能は、急性心筋梗塞（acute myocardial infarctio
n（AMI））の早期検出のための全血中の生化学的心臓マ
ーカーを、定量的計測においてテストされてきた。 AMIの早期確認又は除外は、正しい処置の決定のため
に不可欠である（Rozenman Y et al.,Annu Rev Med 199
4;45:31−44及びL Kristein Newby et al.,Clin Chem 1
995;41:1263−1265）。AMI患者の全てが入院時に非診断
的ECGsをとられるということを部分的原因として、生化
学的マーカーが、診断を確認するためにしばしば必要と
される。不幸なことに、生化学的マーカーに基づく実験
室結果は、通常、患者の最初の診断及び最終的な入院後
数時間まで利用されることができない。死の50％以上が
兆候の開始後最初の２時間以内に生じる。さらに、血栓
溶解治療の利用可能性及び早期介在の明らかな利点は、
速い診断のための必要性を高める。最適には、生化学的
マーカーに基づく結果は、ECGデータと同時に利用され
なければならない。さらに、クレアチン・キナーゼMBア
イソザイム（CK−MB）、最も多く認められたタンパク質
マーカー、活性計測の感度は、上記の早期時間の間の心
筋損傷を正確に決定し又は除外するためには低すぎる。 ミオグロビン（Myoglobin（Mb））は、心筋及び骨格
筋中に存在する17,800kDaのヘム・タンパク質である。
その低分子量の質量に因り、Mbは、損傷した心筋から早
期に（２〜４時間）放出され、そして血清に移動する。
AMIを患う患者におけるMbの速い上昇は、それを、AMIの
早期確認又は除外のために、そして心臓再灌流のモニタ
リングのために理想的なマーカーにしている（Ohman EM
et al.,Br Heart J 1990;63:335−338）。しなしなが
ら、定量結果の速い利用可能性の欠如が、その臨床的適
用を制限してきた。 Mbその他の生化学心臓マーカーの最適な利点は、臨床
医により分析されるであろうECGと同時に結果を提供す
るために十分に短い所要時間をもつ定量アッセイをもっ
て、得られるであろう。ほとんどの早期生化学マーカー
のアッセイにおける律速段階の中の１は、全血からの血
漿又は血清の手動分離を含む。血液サンプルについて直
接アッセイを使用する可能性は、血液採取から結果解析
までの全時間を顕著に短縮するであろう。それ故、我々
の目的は、AMIの早期診断のために利用可能な結果を得
るためにMbその他の生化学心臓マーカーに基づく高再現
性の定量結果を作り出すために、全血サンプルの簡単な
自動処理のために好適な速い時間分解免疫螢光計測アッ
セイ（rapid time−resolved immunofluorometric assa
y）を最適化することであった。 本発明の要約 例えば、血漿、血清又は全血サンプル中の分析物（an
alytes）を定量的に計測するためのイムノアッセイにそ
のウェルが使用される前に、アッセイ特異的成分の全て
が事前に反応ウェルに添加され、そして乾燥されるよう
なイムノアッセイが発明されてきた。本発明に従えば、
生化学マーカー、特に生化学心臓マーカーが、時間分解
フルオロイムノアッセイ及び本質的に螢光性のランタニ
ド・キレートの使用により急性心筋梗塞を早期に検出し
又は除外するために全血サンプルから直接的に計測され
ることができる。全血サンプルは、乾燥形態においてア
ッセイ特異的成分の全てを含む小さな反応ウェル又は普
通のマイクロタイトレーション・ウェル内の好適なアッ
セイ溶液又はバッファー中に添加される。イムノアッセ
イは、競合的又は非競合的のいずれかであることがで
き、そして２以上の心臓マーカーが、異なるランタニド
キレート標識（ユーロピウム、テルビウム、サマリウム
及びジスプロシウム）が個々の生化学心臓マーカーのア
ッセイについて同時に使用されるとき、１の反応ウェル
又はマイクロタイトレーション・ウェル内で計測される
ことができる。免疫反応が完結し（平衡に達し）、又は
中断された（速度計測）後、その反応ウェル又はマイク
ロタイトレーション・ウェルを、上記アッセイ溶液で洗
浄し、そして本質的に螢光性のランタニド・キレート標
識からの時間分解螢光を計測する。螢光は、上記反応ウ
ェル又はマイクロタイトレーション・ウェルの表面から
直接的に計測されるか、又は上記の本質的に螢光性のラ
ンタニド・キレートが溶液中に運ばれた後に計測され
る。上記の時間分解螢光シグナルのレベルは、測定され
た生化学心臓マーカーの定量的な尺度である。典型的に
は、計測された心臓マーカーは、ミオグロビン、クレア
チン・キナーゼMBアイソザイム（CK−MB）、トロポニン
Ｉ（troponin I）及びトロポニンＴである。 図面の簡単な説明 図1Aと1Bは、１段階オールインワン乾燥試薬非競合的
（サンドイッチ；図1A）及び競合的（図1B）イムノアッ
セイの主なデザインを示す。 図２は、本発明に従って測定された、＋36℃における
インキュベーション時間に対する、全血標準（黒四
角）、バッファー標準（黒三角）、全血サンプル（点四
角）及び血清サンプル（×）についてのシグナルを示
す。 図３は、バッファー標準（黒四角）、全血標準（黒三
角）についての、ミオグロビン濃度対シグナルを示す。
本図はさらに、本発明に従って測定された、バッファー
標準（白四角）と全血標準（白丸）についてのCV％を示
す。 図４は、LANFIA（溶液中の螢光性ランタニド・キレー
ト）を使用した本発明によるミオグロビンと、慣用のRI
Aによるミオグロビンの間の相関を示す。 図５は、本発明に従って測定された、全血からのミオ
グロビンと血漿からのミオグロビンの間の相関を示す。 図６は、本発明に従って測定された、電気パルス後の
時間に対する、電気的除細動（cardioversion）患者の
血漿からのミオグロビン濃度（黒丸）と全血からのミオ
グロビン濃度（黒四角）を示す。 発明の詳細な説明 非競合的及び競合的イムノアッセイは、血清及び血漿
サンプル中の生理学的に重要なタンパク質マーカーを計
測するために臨床実験室において日常的に使用される。
AMIの早期診断においては、全血サンプルを用いた定量
的な結果をもたらす実施し易い、１段階のイムノアッセ
イが、生化学的心臓マーカーの検出のために特に有用で
あろう。特に、MbだけでなくCK−MB、クレアチン・キナ
ーゼのイソ形態Ｓ、トロポニンＩ及びトロポニンＴが、
AMIの早期検出と再灌流のモニタリングのために好適で
あると考えられる。なぜなら、それは、兆候の開始直後
に血液中に上昇するからである（Johannes Mair et a
l.,Clin Chem 1995;41:1266−1272）。グリコーゲン・
ホスホリラーゼ・アイソザイムBBのための最近導入され
たアッセイは、心筋損傷のための他の速く、かつ、高感
度のマーカーを提示する（Georg Rabitzsch et al.,Cli
n Chem 1995;41:966−978）。これらの生化学心臓マー
カーの速い免疫螢光計測アッセイは、全血サンプルによ
る定量的で、高い再現性を有する結果を提供するために
使用されることができるであろう。 高い比活性をもつ本質的に螢光性のランタニド・キレ
ートにより標識されたモノクローナル抗体及び時間分解
フルオロメトリーの使用は、速い速度、良好な感度及び
広いダイナミック計測レンジをもたらす、小サンプル及
びアッセイ容量の使用を可能にする。達成された、全血
アッセイに伴う低検出限界は適当なものであり、そして
その標準曲線は、その全計測レンジにわたり線形であ
り、そしてさらにその高投与量のフック効果（hook eff
ect）は、そのアッセイを妨害しない。その上、可能性
のある小サンプル容量の使用は、全血サンプルによる潜
在的な妨害を最小化する。 全血サンプルを使用することができるということは、
血漿又は血清の手動の分離に要する時間を取り除く。 サンプルの事前希釈、その後の１段階アッセイは、20
分以内に定量結果を与えるように容易に自動化される。
本質的に同一の結果が、たった５分間のインキュベーシ
ョンを使用して得られることができる。但し、平衡なこ
のアッセイにおいて達成されない。さらに、使用される
小サンプル及び試薬容量の不正確な移しに因る手動手順
における可能性のある不正確さは、アッセイ・システム
の自動化により取り除かれるであろう。従って、生化学
心臓マーカーの定量的な結果が、ECGデータと同じ時間
枠内で入手できることとなる。AMIの診断のための生化
学マーカーの全パネルが全血サンプルから定量的に計測
されることができるということが実行可能である。生化
学血清マーカーのために、例えば、ミオグロビン、CK−
MB及びトロポニンＩに対する異なる放出パターンの速い
結果が、兆候の開始後に異なる時間に起こる患者の診断
を支援するであろう。 上記イムノアッセイのデザインは、非競合的アッセイ
と競合的アッセイの両方が実施されることを許容する
（図1Aと1B）。非競合的アッセイ（図１）においては、
分析物特異的な捕獲抗体（catching antibody）（10）
が、ウェルの表面上に直接的に固定化されるか、又はビ
オチン化捕獲抗体が、ストレプトアビジンでコートされ
たウェルの表面上に固定化されるかのいずれかである。
また、第２の固定化試薬に基づく他の間接的なコーティ
ング手順が、分析物特異的捕獲抗体を固定化するために
使用されることができる。炭水化物及び／又はタンパク
質及び任意的タンパク質添加物を含む遮断層（insulati
ng layer）（11）を、ウェルの底部にある捕獲抗体の上
部で乾燥させる。最終的に、標識された抗体（12）を、
上記遮断層の上部に小量添加し、そして乾燥させる。競
合的アッセイ（図1B）は、ウェルの表面上に固定化され
た第２抗体（13）と分析物特異的抗体（10）を含む。任
意的タンパク質添加物及びブロッキング剤を含む遮断層
（11）が使用され、そして標識された競合する分析物
（14）が、その遮断層の上部に小容量で乾燥される。あ
るいは、この遮断層は省かれ、そして標識された競合性
分析物が特異的抗体の上部に直接的に小容量で添加さ
れ、そして乾燥される。イムノアッセイを開始するため
には、サンプル（又は標準）と一般的なアッセイ・バッ
ファーだけが添加される必要がある。 イムノアッセイの実施に対する乾燥試薬ウェル内の遮
断層組成物の効果を調べた。いくつかの添加物、例えば
炭水化物、タンパク質及びブロッカー成分の影響力を、
さまざまな量、容量及び乾燥温度を使用してテストし
た。非競合的イムノアッセイにおいては、標識された成
分は、小容量でその遮断層の上部に小分けされ、そして
直ちに乾燥されなければならない。あるいは、競合的イ
ムノアッセイにおいては、標識された成分は、特異的抗
体の上部に直接的に添加されることができる。オールイ
ンワン乾燥試薬コンセプトの性能を、常に、溶液中の対
応成分を用いたイムノアッセイと比較した。タンパク質
と炭水化物から作られた遮断層は、他の代替法に比較し
たとき最低のバックグラウンドと最高のシグナル対ノイ
ズ比を提供する。適当な遮断層により、溶液中の全アッ
セイ成分により得られる性能と少なくとも等価であるア
ッセイ性能が達成される。 上記コンセプトに従うイムノアッセイは慣用のマイク
ロタイター・ウェル形式において行われることができる
けれども、現在の技術水準に従う性能特性が達成される
ということが証明されている。上記検出及び標識技術、
時間分解フルオロメトリー及び螢光性ユーロピウム・キ
レート（Soini and Lvgren CRC Crit Rev Anal Chem
18,105−154,1987,Dickson et al.Pharmac Ther 66,207
−35,1995）は、その高い感度により、不活性の、緩や
かな（lenient）、かつ、安定性の標識、並びに広いダ
イナミック・レンジが、これを可能にする。従って、比
較的小さなサンプル容量が、分析物についての低検出限
界を未だ未しながら、使用されることができる。上記ア
ッセイの動態又は反応速度は、全アッセイ容量を減少さ
せることにより、そして高温においてインキュベートす
ることにより、上昇されることができる。非競合性アッ
セイの反応速度は、高投与量のフック効果を同様に減少
させる標識された抗体の増加量を添加することにより、
さらに改善される。１段階オールインワン乾燥試薬コン
セプトの評価に含まれるモデル・アッセイの全てが、上
述した要因に関して最適化されたとき、15分以内に平衡
に達した。明らかに、より速いアッセイは、この平衡要
求が放棄される場合、同一コンセプトに従って行われる
ことができる。 提示されたコンセプトに従えば、２段階アッセイは全
く報告されない。なぜなら、その後、試薬添加段階が含
まれなければならないからである。普通の競合性アッセ
イは、通常、１段階手順において行われる。非競合性ア
ッセイにおいては、これは、時折、制限として考えられ
ることができる。標識された抗体の増加量の使用を許容
する固相及び標識技術の高い能力は、この制限を補償す
る。高投与量のフック効果により生じるシグナルは、着
目の分析物のために使用される最高の標準のために得ら
れたシグナルの下まで決して下降しないであろう。 本質的に螢光性のランタニド、例えばユーロピウム、
キレートは、インキュベーション期及び計測期の両者の
間に、イムノアッセイにおいて標識された成分に結合さ
れる。解離強化されたランタニド・フルオロイムノアッ
セイ（DELFIA）において、ユーロピウム・イオンは、新
たな螢光錯体が形成される溶液中に標識付けのために使
用されるキレートから解離される（Hemmil et al.Ana
l Biochem 137,335−43,1984）。新たな本質的に螢光性
のランタニド・キレートは、上記DELFIA手順において得
られたものに等価な比活性をもつ。固相から時間分解計
測のための溶液への螢光標識された成分の放出は、速い
ものである（Mitrunen et al.Clin Chem 41,1115−20,1
995,Diamandis et al.Chin Biochem 25,255−61,199
2）。外からの汚染についての危険は最小化される。な
ぜなら、ランタニド・イオンはその計測前にそのキレー
トから決して放出されないからである。螢光ユーロピウ
ム及びテルビウム・キレートを使用した２重標識（Dual
−label）アッセイが可能であり（Mitrunen et al.Clin
Chem 41,1115−20,1995）、そしてあるいは、その螢光
シグナルは、放出段階の全てを排除する固相表面から直
接的に計測されることができる。 本質的に螢光性のユーロピウム・キレートの中の１、
４−（２−（４−イソチオシアナトフェニル）エチニ
ル）−2,6−ビス（（N,N−ビス（カルボキシメチル）−
アミノ）メチル）ピリジンの検出限界が、計測された。
いくつかの同様の本質的に螢光性のランタニド・キレー
トが合成されている（Mukkala et al.Helv Chim Acta 7
5,1621−32,1992）。ユーロピウムの計測のためのDELFI
A強化原理に比較して、ランタニドは、常に、元のキレ
ートに結合し、そしてその励起エネルギーは、その分子
のエネルギー仲介部分により効率的に吸収される。螢光
性ユーロピウム・キレートについての検出限界（バック
グラウンド＋2SD）は、５×10-14mol/Lと推定され、こ
れは、DELFIA強化溶液中のユーロピウムの検出限界に対
応する（Hemmil et al.Anal Biochem 137,335−43,19
84）。 不活性、かつ、安定性の本質的に螢光性のランタニド
・キレート標識は、本１段階のオールインワン乾燥試薬
イムノアッセイを実行可能なものにする。可能性のあ
る、標識された成分の非特異性結合は、オールインワン
乾燥試薬ウェル内での遮断層の使用により防止される。
この遮断層が省かれる場合、非特異的結合が、特に、そ
のウェルの保存の間の高過剰の試薬の、非競合的アッセ
イにおいて、増加する。最適には、上記遮断層中に添加
されたタンパク質と炭水化物の両方による非競合性のイ
ムノアッセイが、液体の形態で試薬を使用する対応のア
ッセイよりも、よりよく行われる。上記添加物のいくつ
か及び明らかに上記ブロッカーは、分析物特異的であっ
た。遮断層の上部への標識された成分の添加も、決定的
である。特に、非競合性アッセイにおいては、標識され
た抗体は、その非特異的結合を有意にしないように速く
乾燥される小容量において添加されなければならない。
競合性アッセイにおいては、遮断層の使用は、そのアッ
セイが平衡まで行われる限り、不可欠ではない。一旦、
１段階オールインワン乾燥試薬ウェルの分析物特異的最
適化が行われれば、それらの使用は極めて簡単である。
なぜなら、サンプルと一般的なアッセイ・バッファー又
は溶液だけが、そのイムノアッセイが行われるときに、
要求されるからである。 以下の実施例を、限定のためではなく、説明のために
提供する。 実 験 実施例１ モノクローナル抗体の標識付け 検出において使用されるMabを、ユーロピウム（Eu）
の４−（２−（４−イソチオシアナト−フェニル）エチ
ニル）−2,6,−ビス（（N,N−ビス（カルボキシメチ
ル）−アミノ）メチル）−ピリジンの螢光性キレートで
標識した。標識付けを、50mmol/L NaHCO3を含むバッフ
ァー（pH 9.8）中に100倍モル過剰の上記Euキレートを
用いて、４℃で一夜、行った。（3.3mg/mLまでの）高タ
ンパク質濃度及びこれ故低過剰のキレートを、上記標識
付け反応の全容量を最小化するために使用した。高精度
ポンプＰ−500（Pharmacia LKB）を備えたSuperdex 200
HR 10/30カラム（Pharmacia LKB,Uppsala,Sweden）
を、過剰のキレートから標識された抗体を分離するため
に使用した。使用した溶出バッファーは、１リッター当
り、50mmolのTris−HCl、9gのNaCl、及び0.5gのNaN3を
含んでいた、pH7.75（TSA−バッファー）。標識された
タンパク質を含む画分をプールし、そしてその抗体の標
識付けの程度を測定した。既知量の上記標識mAbを、抗
−マウスIgGコート・ウェル（Wallac Oy）内でインキュ
ベートし、これらのウェルを６回洗浄し、そしてDELFIA
強化溶液〔DELFIA Enhancement solution（Wallac Oy）
を、Eu標準に対する結合したユーロピウムの螢光を計測
するために添加した。上記mAbは、IgG当り７〜8.3のEu
を含んでいた。1g/Lの最終濃度のジエチレントリアミン
ペンタ酢酸（DTPA）精製BSAを添加し、そしてこのプー
ルを、0.2μｍフィルターを通して濾過して凝集物を除
去した。標識されたmAbを４℃で保存した。 実施例２ モノクローナル抗体のビオチン化 捕獲において使用されるmAbを、50mmol/LのNaHCO3を
含むバッファー（pH 9.8）中のN,N−ジメチルホルムア
ミド（10mmol）中に溶解された100倍モル過剰の、ビオ
チンのイソチオシアネート誘導体（BITC,Wallac Oy）と
反応させ、そして室温において２〜４時間インキュベー
トした。遊離のビオチンを、溶出のためにTSA−バッフ
ァーを使用してNAP−10カラムを用いた。そしてその
後、PD−10カラム（Pharmacia LKB）を用いたゲル濾過
により分離した。最終的に1g/LのDTPA−処理BSAを添加
した。このビオチン化mAbを４℃で保存した。 実施例３ モノクローナル抗体による直接的コーティング 上記捕獲mAbを、物理的吸着を通じてマイクロタイト
レーション・ストリップ上に固定化した。これらのウェ
ルを、35℃で一夜、0.2mol/LのNaH2PO4バッファーを含
む100μＬのバッファー中の１μｇのmAbでコートした。
コートされたウェルを、Delfiaプレートウォッシュを使
用することによりDelfia Wash溶液で２回洗浄し、そし
て次に１リッター当り、1gのBSA、60gのトレハロース、
1gのGermall II、及び50mmolのNaH2PO4を含む溶液300μ
ｌで室温で３時間飽和させた。飽和後、上記ウェルを吸
引し、そして25℃で２時間乾燥させた。 実施例４ ストレプトアビジンによるコーティング及び上記捕獲mA
bの固定化 UV−吸収低螢光性Maxisorbストリップ（Nunc,Roskild
e,Denmark）を、１リッター当り9gのNaClを含む0.1mol/
Lのシトレート−ホスフェート・バッファー（pH 5.0）
中１μg/ウェルのストレプトアビジン（Porton Product
s,United Kingdom）で、35℃で一夜直接的にコートし
た。これらのプレートを、DELFIA Platewash（Wallac O
y）を使用して、0.05％Tween 20を補った、１リッター
当り、9gのNaCl、0.1gのGermall II、0.05gのTween 2
0、及び5mmolのTris−HCl（pH7.75）を含むDELFIA Wash
溶液（Wallac Oy）で２回洗浄した。室温での一夜の飽
和を、１リッター当り、50mmolのTris−HCl（pH 7.
0）、60gのソルビトール及び2gのDTPA−処理BSAを含む
バッファーを用いて行った。最終的にこれらのプレート
を吸引し、そして風乾した。 上記捕獲mAbを、１リッター当り、50mmolのTris−HCl
（pH7.75）、9gのNaCl、5gのBSA、0.5gのウシ−γ−グ
ロブリン、0.1gのTween 40、20μmolのジエチレントリ
アミンペンタ酢酸（DTPA）、0.5gのNaN3、及び20mgのチ
ェリー・レッド（cherry red）を含む、50μＬのDELFIA
Assayバッファー（Wallac Oy）中で200ngのビオチン化
mAbをインキュベートすることによりストレプトアビジ
ン・コートされたプレート上に固定化した。上記ストリ
ップを振とうしながら室温で30分間インキュベートし、
そして２回洗浄し、そして風乾した。 実施例５ オールインワン乾燥試薬マイクロタイトレーション・ウ
ェルの調製 上記遮断炭水化物層を、１リッター当り、5gのBSA又
はカゼイン、100gのソルビトール、9gのNaCl、0.5gのNa
N3、0.2gのTween 20、1.2gのウシ・ガンマグロブリン、
及び50mmolのTris−HClを含む溶液、pH 7.7の10μｌを
上記コートされたウェルに添加することにより、間接的
に又は直接的に固定化された特異的捕獲モノクローナル
抗体上で調製した。ウェル内の溶液を35℃で一夜乾燥さ
せた。例えば、生来のマウスIgG,HBR−２及びMAK−33の
ようなアッセイ特異的成分及びブロッカーが、この層に
添加されることができる。標識されたmAb（300ng）は、
１リッター当り、1gのジエチレントリアミンペンタ酢酸
（DTPA）−処理BSA、50gのトレハロース、9gのNaCl、0.
05gのチェリー・レッド（cherry red）、0.5gのNaN3、
及び50mmolのTris−HClを含む溶液、pH7.75の１μＬ
中、上記遮断層の上部に小分けした。小分けされた溶液
を、直ちに、上記ウェルに空気を吹きつけることにより
乾燥させた。オールインワン乾燥試薬ウェルを、乾燥剤
と共に密封された容器内に４℃で保存した。 競合性イムノアッセイにおいては、Euキレート標識さ
れた分析物が、１リッター当り、1gのジエチレントリア
ミンペンタ酢酸（DTPA）−処理BSA、50gのトレハロー
ス、9gのNaCl、0.05のチェリー・レッド、0.5gのNaN3、
及び50mmolのTris−HClを含む溶液、pH 7.5の小容量
（１μＬ）中、上記遮断層上にか又は上記分析物特異的
コート・ウェルに直接的に添加される。小分けされた溶
液を、直ちにウェルに空気を吹きつけることにより乾燥
させた。オールインワン乾燥試薬ウェルを、乾燥剤と共
に密封容器内に４℃で保存した。 実施例６ イムノアッセイ手順 イムノアッセイを、以下の手順に従って行った。標準
及び全血、血漿、又は血清のサンプルをアッセイ・バッ
ファー中で1:5に希釈した。20μＬのアッセイ・バッフ
ァー中の希釈サンプル10μＬアリコートを、上記１段階
オールインワン乾燥試薬ウェルに添加した。このウェル
を、iEMS Incubator/Shaker（Labsystem Oy,Helsimki,F
inland）を用いて900rpmの振とう速度を使用して36℃で
15分間振とうし、そして過剰の標識を、上記ウェルを６
回洗浄することにより除去した。螢光性Euキレートのシ
グナルを、１リッター当り、50mmolのブリシン−NaOH、
1.75molのNaSCN、2mmolのNa2CO3、50mLのグリセロー
ル、5mgのTween 40、4.5μmolのDTPA、及び200mLの１−
プロパノールを含む、200μＬのLANFIA溶液（Mitrunen
et al.Clin Chem 41,1115−20,1995）、pH10.0を添加し
た後に計測した。このウェルを３分間振とうし、そして
DELFIAプレート・フルオロメーター、モデル1234（Wall
ac Oy）を用いて計測した。あるいは、時間分解螢光シ
グナルを、その洗浄段階が完結した後に、そのウェルの
表面から直接読んだ。 結 果 動 態 １段階非競合性アッセイの反応レンジに影響を及ぼす
要因、すなわち、温度、成分濃度、アッセイ容量及び抗
体の品質、を最適化した。最適化されたアッセイ動態の
性能を、連続振とうしながら＋36℃で5,10,20,30及び60
分間、血清及び全血サンプル、並びにバッファー及び全
血標準を含むマイクロタイトレーション・ウェルをイン
キュベートすることにより、異なる標準及びサンプル材
料を用いて確認した。 レンジ及び線形性 バッファーと全血標準の両方についての換算曲線は、
２から1250μg/Lまでのレンジにわたり線形であった。
バッファー標準を用いたアッセイ内精度（ｎ＝12）は、
全血標準を用いて3.2−4.0％及び3.3−7.3％であった
（図３）。Mbの最低検出可能量は、ゼロ標準プラス3 SD
の、12反復の平均のシグナルに等しい投与量として推定
したとき、血清アッセイについて0.1μg/L、そして全血
アッセイについて0.6μg/Lであった。 精 度 血清とスパイクした全血サンプルの両方を用いたアッ
セイ内CVは、全て４％未満であり、そしてラン間のCV
（between−run CVs）は、それぞれ、５％未満と６％未
満であった（表１）。 線形性 計測レンジ内の線形性を、標準的な希釈剤で１〜32倍
希釈された、24.2μg/L、43μg/L及び1103.1μg/Lを含
む３つの血清サンプルを希釈し、そして観察（ｙ）対予
想（ｘ）ミオグロビン濃度をプロットすることにより確
認した。全ての希釈物を、元のサンプルから作った。上
記の３つの希釈された血清サンプルは、それぞれ、良好
な線形相関を示した;y＝0.94x−0.13（ｒ＝1.0）、ｙ＝
1.02x−0.38（ｒ＝0.99）及びｙ＝0.91x＋12.9（ｒ＝0.
99）。 妨害試験 ヘモグロビンとの交差反応を、Mb涸渇血清に溶血液
（hemolysate）の増加量（ヘモグロビン０〜75g/L）を
添加することにより調べた。１リッター当り75gのヘモ
グロビンまでの添加は、いかなる増加したアッセイ応答
をも引き起こさなかった。 回収率 血清及び全血サンプルを用いたアッセイは良好な回収
率を示した。全血（ｎ＝５）と血清（ｎ＝４）サンプル
による平均の分析的回収率は、それぞれ、96％と100％
であった（表２と表３）。 比較試験 血清サンプルを使用した非競合性免疫螢光計測LANFIA
アッセイにより得られた結果を、Vuori et al.（Clin.C
hem.37/12,2087−2092（1991））により報告されたDELF
IAアッセイにより得られたものと比較した（ｎ＝９）。
上記２のアッセイは、高い程度の相関:y＝0.68x＋7.31
（ｒ＝0.995）をもつ結果を与えた。LANFIAにより得ら
れた血清サンプルの結果と、Biomerica（Newport Beac
h,CA）から購入した商業的RIAキットにより得られた結
果との間にも密な相関が得られた（ｎ＝79）;y＝1.25x
−0.74、ｒ＝0.982（図４）。このRIAキットの検出下限
（20ng/mL）未満の結果を、上記回帰分析から除外し
た。 全血サンプルと血漿サンプルの間の相関 図５は、それぞれ、全血又は血漿のいずれかの同一サ
ンプルを使用した開発されたアッセイにより得られたMb
結果の比較を示す（ｙ＝0.87x＋13.3、ｒ＝0.981）。 ミオグロビンについての患者の結果 全血サンプルと血漿サンプルを、電気パルス処理後の
異なる時に電気除細動患者からも採取した。１の電気除
細動患者からのMb放出についての典型的な結果を図６に
示す。 全血サンプル中のCK−MB計測 同一患者からの血清サンプルと全血サンプルを、それ
らのCK−MB濃度について本発明に従って計測した。これ
らの結果を表４に示す。 本発明に係る方法がさまざまな態様で取り込まれるこ
とができ、その中のほんの数個が本明細書中に開示され
ているということが理解されよう。他の態様が存在し、
そして本の本質から逸脱しないということは当業者に明
らかであろう。従って、記載した態様は説明的なもので
あり、そして限定として解釈されてはならない。
サンプルが添加される前に、その反応ウェルに事前に添
加され、そして乾燥されている新規なイムノアッセイに
関する。本発明は、さらに、上記アッセイを実施におい
て有用なデバイスにも関する。 発明の背景 本発明の背景を明らかにするために本明細書中に使用
する刊行物その他の材料、及び特に、その実施に関する
さらなる詳細を提供するためのケースを、引用により取
り込む。 ランタニド・キレート標識及び時間分解（time−reso
lved）フルオロメトリーは、10年以上も前に既にイムノ
アッセイの分野に導入された（Siitari et al.Nature 3
01,258−60,1983）。上記標識の高い比活性との組合せ
におけるモノクローナル抗体の利用可能性は、優れた感
度及びダイナミック・レンジをもつ非競合的イムノアッ
セイが実施されることを可能にした（Ekins and Dakub
u,Pure Appl Chem 57,473−82,1985,Lvgren and Pett
erssson in:Van Dyke K and Van Dyke R eds.Luminesce
ce Immunoassays and Molecular Applications.Boca Ra
ton,U.S.A:CRC Press Inc.,233−50,1990）。高い比活
性をもついくつかの異なる標識がその後に出現してきて
いる（Kricka Clin Chem 40,347−57,1994,Price and N
ewman eds.,Principles and Practice of Immunoassay
s.New York:Stockton Press,650pp,1991,Dickson et a
l.Pharmac Ther 66,207−35,1995）。モノクローナル抗
体は広くポリクローナル抗体の代りに使用され、そして
非競合的アッセイのデザインは、可能なときはいつも好
ましいものである。特に、新規の非アイソトープ標識の
有用性は、イムノアッセイの分野の現在の自動化レベル
に貢献した。 別の戦略も、イムノアッセイの感度及び信頼性を改善
するために選択されることができる（Kricka Clin Chem
40,347−57,1994,Price and Newman eds.,Principles
and Practice of Immunoasays.New York:Stockton Pres
s,650pp,1991,Dickson et al.Pharmac Ther 66,207−3
5,1995,Ekins and Chu Clin Chem 37,1955−67,199
1）。非競合的イムノアッセイの高い感度は、高アフィ
ニティー抗体と共に高比活性をもつ標識を使用すること
によってのみ具現化されることができるので（Ekins an
d Dakubu,Pure Appl Chem 57,473−82,1985,Ekins and
Chu Clin Chem 37,1955−67,1991）、より高い感度の検
出技術について探索についてかなりの努力が払われてい
る。検出器ノイズの如き要因に加えて、標識試薬の非特
異的シグナル及び非特異的結合を生じさせるサンプル中
の妨害が、全体のアッセイ感度を減少させる（Ekins an
d Dakubu,Pure Appl Chem 57,473−82,1985,Lvgren a
nd Petterssson in:Van Dyke K and Van Dyke R eds.Lu
minescece Immunoassays and Molecular Applications.
Boca Raton,U.S.A:CRC Press Inc.,233−50,1990）。新
規のイムノアッセイ戦略をデザインするための他の理由
は、高品質のキー試薬により信頼性を改善すること、そ
してより直接的な手順を得るために不必要な段階を取り
除くことによりアッセイを単純化することである。 時間分解フルオロメトリー及びランチニト・キレート
標識に基づくイムノアッセイ技術は、元来、解離強化ラ
ンタニド・フルオロイムノアッセイ（dissociation enh
anced lanthanide fluoroimmunoassay（DELFIA）のコン
セプトに基づくものであった（Hemmil et al.Anal Bi
ochem 137,335−43,1984）。そのアフィニティー及び特
異性に対するいかなる影響を伴わずにモノクローナル抗
体に共有結合することができるであろう高比活性の標識
（Ｌvgren and Petterssson in:Van Dyke K and Van
Dyke R eds.Luminescece Immunoassays and Molecular
Applications.Boca Raton,U.S.A:CRC Press Inc.,223−
50,1990）は、改善された感度をもついくつかの非競合
的アッセイのデザインにおいてひじょうに有用であるこ
とが証明された（Pettersson et al.Clin Chem 29,60−
4,1983,Nnt et al.Isr J Clin Biochem Lab Sci
４,36,1985,Suonp et al.Clin Chem Acta 145,341
−8,1985,Hemmil in:Wineforder ed.Chemical Analys
is,Vol 117.Toronto:Wiley ＆ Sons,343pp,1991,Xu et
al.Clin Chem 38,2038−43,1992）。さらに、良好な性
能特性をもつ競合アッセイ（Bertoft et al.FEBS Lett
173,313−6,1984,Eskola et al.Chin Chem 31,1731−4,
1985,Nnt et al.Isr J Clin Biochem Lab Sci ４,5
2,1985,Lvgren Steroid Biochem 27,47−51,1987）が
行われた。但し、その標識は、このアッセイ・デザイン
においてその感度に本質的に寄与しない（Ekins and Da
kubu,Pure Appl Chem 57,473−82,1985,Ekins and Chu
Clin Chem 37,1955−67,1991）。 日常的な実験室内で行われるイムノアッセイは、広く
自動化されている。アナライザーは、速いランダムな及
び連続的なアクセス・モードにおいて作動しなければな
らない。処理能力は、一般的な化学アナライザーのもの
と同様なものでなければならず、そして試薬の大きな搭
載（on−board）供給が、オペレーターの実地の時間を
減少させなければならない。自動化の要求は、ほとんど
の標識技術について困難であることが判明し、そして上
記パネル内の分析物（analytes）の性能特性は、行なわ
れなければならなかった妥協のために欠点をもってい
た。本発明において、我々は、乾燥形態において１のテ
ストにおいて必要なアッセイ特異的試薬の全てを入れた
マイクロタイトレーション・ウェル内の１段階手順にお
いて全てのアッセイが行われるところの自動化のために
好適な比較的速いイムノアッセイ技術について記載す
る。高比活性をもつ本発明に螢光性の安定性ランタニド
・キレートを、標識として使用する。モデル・アッセイ
の性能は、急性心筋梗塞（acute myocardial infarctio
n（AMI））の早期検出のための全血中の生化学的心臓マ
ーカーを、定量的計測においてテストされてきた。 AMIの早期確認又は除外は、正しい処置の決定のため
に不可欠である（Rozenman Y et al.,Annu Rev Med 199
4;45:31−44及びL Kristein Newby et al.,Clin Chem 1
995;41:1263−1265）。AMI患者の全てが入院時に非診断
的ECGsをとられるということを部分的原因として、生化
学的マーカーが、診断を確認するためにしばしば必要と
される。不幸なことに、生化学的マーカーに基づく実験
室結果は、通常、患者の最初の診断及び最終的な入院後
数時間まで利用されることができない。死の50％以上が
兆候の開始後最初の２時間以内に生じる。さらに、血栓
溶解治療の利用可能性及び早期介在の明らかな利点は、
速い診断のための必要性を高める。最適には、生化学的
マーカーに基づく結果は、ECGデータと同時に利用され
なければならない。さらに、クレアチン・キナーゼMBア
イソザイム（CK−MB）、最も多く認められたタンパク質
マーカー、活性計測の感度は、上記の早期時間の間の心
筋損傷を正確に決定し又は除外するためには低すぎる。 ミオグロビン（Myoglobin（Mb））は、心筋及び骨格
筋中に存在する17,800kDaのヘム・タンパク質である。
その低分子量の質量に因り、Mbは、損傷した心筋から早
期に（２〜４時間）放出され、そして血清に移動する。
AMIを患う患者におけるMbの速い上昇は、それを、AMIの
早期確認又は除外のために、そして心臓再灌流のモニタ
リングのために理想的なマーカーにしている（Ohman EM
et al.,Br Heart J 1990;63:335−338）。しなしなが
ら、定量結果の速い利用可能性の欠如が、その臨床的適
用を制限してきた。 Mbその他の生化学心臓マーカーの最適な利点は、臨床
医により分析されるであろうECGと同時に結果を提供す
るために十分に短い所要時間をもつ定量アッセイをもっ
て、得られるであろう。ほとんどの早期生化学マーカー
のアッセイにおける律速段階の中の１は、全血からの血
漿又は血清の手動分離を含む。血液サンプルについて直
接アッセイを使用する可能性は、血液採取から結果解析
までの全時間を顕著に短縮するであろう。それ故、我々
の目的は、AMIの早期診断のために利用可能な結果を得
るためにMbその他の生化学心臓マーカーに基づく高再現
性の定量結果を作り出すために、全血サンプルの簡単な
自動処理のために好適な速い時間分解免疫螢光計測アッ
セイ（rapid time−resolved immunofluorometric assa
y）を最適化することであった。 本発明の要約 例えば、血漿、血清又は全血サンプル中の分析物（an
alytes）を定量的に計測するためのイムノアッセイにそ
のウェルが使用される前に、アッセイ特異的成分の全て
が事前に反応ウェルに添加され、そして乾燥されるよう
なイムノアッセイが発明されてきた。本発明に従えば、
生化学マーカー、特に生化学心臓マーカーが、時間分解
フルオロイムノアッセイ及び本質的に螢光性のランタニ
ド・キレートの使用により急性心筋梗塞を早期に検出し
又は除外するために全血サンプルから直接的に計測され
ることができる。全血サンプルは、乾燥形態においてア
ッセイ特異的成分の全てを含む小さな反応ウェル又は普
通のマイクロタイトレーション・ウェル内の好適なアッ
セイ溶液又はバッファー中に添加される。イムノアッセ
イは、競合的又は非競合的のいずれかであることがで
き、そして２以上の心臓マーカーが、異なるランタニド
キレート標識（ユーロピウム、テルビウム、サマリウム
及びジスプロシウム）が個々の生化学心臓マーカーのア
ッセイについて同時に使用されるとき、１の反応ウェル
又はマイクロタイトレーション・ウェル内で計測される
ことができる。免疫反応が完結し（平衡に達し）、又は
中断された（速度計測）後、その反応ウェル又はマイク
ロタイトレーション・ウェルを、上記アッセイ溶液で洗
浄し、そして本質的に螢光性のランタニド・キレート標
識からの時間分解螢光を計測する。螢光は、上記反応ウ
ェル又はマイクロタイトレーション・ウェルの表面から
直接的に計測されるか、又は上記の本質的に螢光性のラ
ンタニド・キレートが溶液中に運ばれた後に計測され
る。上記の時間分解螢光シグナルのレベルは、測定され
た生化学心臓マーカーの定量的な尺度である。典型的に
は、計測された心臓マーカーは、ミオグロビン、クレア
チン・キナーゼMBアイソザイム（CK−MB）、トロポニン
Ｉ（troponin I）及びトロポニンＴである。 図面の簡単な説明 図1Aと1Bは、１段階オールインワン乾燥試薬非競合的
（サンドイッチ；図1A）及び競合的（図1B）イムノアッ
セイの主なデザインを示す。 図２は、本発明に従って測定された、＋36℃における
インキュベーション時間に対する、全血標準（黒四
角）、バッファー標準（黒三角）、全血サンプル（点四
角）及び血清サンプル（×）についてのシグナルを示
す。 図３は、バッファー標準（黒四角）、全血標準（黒三
角）についての、ミオグロビン濃度対シグナルを示す。
本図はさらに、本発明に従って測定された、バッファー
標準（白四角）と全血標準（白丸）についてのCV％を示
す。 図４は、LANFIA（溶液中の螢光性ランタニド・キレー
ト）を使用した本発明によるミオグロビンと、慣用のRI
Aによるミオグロビンの間の相関を示す。 図５は、本発明に従って測定された、全血からのミオ
グロビンと血漿からのミオグロビンの間の相関を示す。 図６は、本発明に従って測定された、電気パルス後の
時間に対する、電気的除細動（cardioversion）患者の
血漿からのミオグロビン濃度（黒丸）と全血からのミオ
グロビン濃度（黒四角）を示す。 発明の詳細な説明 非競合的及び競合的イムノアッセイは、血清及び血漿
サンプル中の生理学的に重要なタンパク質マーカーを計
測するために臨床実験室において日常的に使用される。
AMIの早期診断においては、全血サンプルを用いた定量
的な結果をもたらす実施し易い、１段階のイムノアッセ
イが、生化学的心臓マーカーの検出のために特に有用で
あろう。特に、MbだけでなくCK−MB、クレアチン・キナ
ーゼのイソ形態Ｓ、トロポニンＩ及びトロポニンＴが、
AMIの早期検出と再灌流のモニタリングのために好適で
あると考えられる。なぜなら、それは、兆候の開始直後
に血液中に上昇するからである（Johannes Mair et a
l.,Clin Chem 1995;41:1266−1272）。グリコーゲン・
ホスホリラーゼ・アイソザイムBBのための最近導入され
たアッセイは、心筋損傷のための他の速く、かつ、高感
度のマーカーを提示する（Georg Rabitzsch et al.,Cli
n Chem 1995;41:966−978）。これらの生化学心臓マー
カーの速い免疫螢光計測アッセイは、全血サンプルによ
る定量的で、高い再現性を有する結果を提供するために
使用されることができるであろう。 高い比活性をもつ本質的に螢光性のランタニド・キレ
ートにより標識されたモノクローナル抗体及び時間分解
フルオロメトリーの使用は、速い速度、良好な感度及び
広いダイナミック計測レンジをもたらす、小サンプル及
びアッセイ容量の使用を可能にする。達成された、全血
アッセイに伴う低検出限界は適当なものであり、そして
その標準曲線は、その全計測レンジにわたり線形であ
り、そしてさらにその高投与量のフック効果（hook eff
ect）は、そのアッセイを妨害しない。その上、可能性
のある小サンプル容量の使用は、全血サンプルによる潜
在的な妨害を最小化する。 全血サンプルを使用することができるということは、
血漿又は血清の手動の分離に要する時間を取り除く。 サンプルの事前希釈、その後の１段階アッセイは、20
分以内に定量結果を与えるように容易に自動化される。
本質的に同一の結果が、たった５分間のインキュベーシ
ョンを使用して得られることができる。但し、平衡なこ
のアッセイにおいて達成されない。さらに、使用される
小サンプル及び試薬容量の不正確な移しに因る手動手順
における可能性のある不正確さは、アッセイ・システム
の自動化により取り除かれるであろう。従って、生化学
心臓マーカーの定量的な結果が、ECGデータと同じ時間
枠内で入手できることとなる。AMIの診断のための生化
学マーカーの全パネルが全血サンプルから定量的に計測
されることができるということが実行可能である。生化
学血清マーカーのために、例えば、ミオグロビン、CK−
MB及びトロポニンＩに対する異なる放出パターンの速い
結果が、兆候の開始後に異なる時間に起こる患者の診断
を支援するであろう。 上記イムノアッセイのデザインは、非競合的アッセイ
と競合的アッセイの両方が実施されることを許容する
（図1Aと1B）。非競合的アッセイ（図１）においては、
分析物特異的な捕獲抗体（catching antibody）（10）
が、ウェルの表面上に直接的に固定化されるか、又はビ
オチン化捕獲抗体が、ストレプトアビジンでコートされ
たウェルの表面上に固定化されるかのいずれかである。
また、第２の固定化試薬に基づく他の間接的なコーティ
ング手順が、分析物特異的捕獲抗体を固定化するために
使用されることができる。炭水化物及び／又はタンパク
質及び任意的タンパク質添加物を含む遮断層（insulati
ng layer）（11）を、ウェルの底部にある捕獲抗体の上
部で乾燥させる。最終的に、標識された抗体（12）を、
上記遮断層の上部に小量添加し、そして乾燥させる。競
合的アッセイ（図1B）は、ウェルの表面上に固定化され
た第２抗体（13）と分析物特異的抗体（10）を含む。任
意的タンパク質添加物及びブロッキング剤を含む遮断層
（11）が使用され、そして標識された競合する分析物
（14）が、その遮断層の上部に小容量で乾燥される。あ
るいは、この遮断層は省かれ、そして標識された競合性
分析物が特異的抗体の上部に直接的に小容量で添加さ
れ、そして乾燥される。イムノアッセイを開始するため
には、サンプル（又は標準）と一般的なアッセイ・バッ
ファーだけが添加される必要がある。 イムノアッセイの実施に対する乾燥試薬ウェル内の遮
断層組成物の効果を調べた。いくつかの添加物、例えば
炭水化物、タンパク質及びブロッカー成分の影響力を、
さまざまな量、容量及び乾燥温度を使用してテストし
た。非競合的イムノアッセイにおいては、標識された成
分は、小容量でその遮断層の上部に小分けされ、そして
直ちに乾燥されなければならない。あるいは、競合的イ
ムノアッセイにおいては、標識された成分は、特異的抗
体の上部に直接的に添加されることができる。オールイ
ンワン乾燥試薬コンセプトの性能を、常に、溶液中の対
応成分を用いたイムノアッセイと比較した。タンパク質
と炭水化物から作られた遮断層は、他の代替法に比較し
たとき最低のバックグラウンドと最高のシグナル対ノイ
ズ比を提供する。適当な遮断層により、溶液中の全アッ
セイ成分により得られる性能と少なくとも等価であるア
ッセイ性能が達成される。 上記コンセプトに従うイムノアッセイは慣用のマイク
ロタイター・ウェル形式において行われることができる
けれども、現在の技術水準に従う性能特性が達成される
ということが証明されている。上記検出及び標識技術、
時間分解フルオロメトリー及び螢光性ユーロピウム・キ
レート（Soini and Lvgren CRC Crit Rev Anal Chem
18,105−154,1987,Dickson et al.Pharmac Ther 66,207
−35,1995）は、その高い感度により、不活性の、緩や
かな（lenient）、かつ、安定性の標識、並びに広いダ
イナミック・レンジが、これを可能にする。従って、比
較的小さなサンプル容量が、分析物についての低検出限
界を未だ未しながら、使用されることができる。上記ア
ッセイの動態又は反応速度は、全アッセイ容量を減少さ
せることにより、そして高温においてインキュベートす
ることにより、上昇されることができる。非競合性アッ
セイの反応速度は、高投与量のフック効果を同様に減少
させる標識された抗体の増加量を添加することにより、
さらに改善される。１段階オールインワン乾燥試薬コン
セプトの評価に含まれるモデル・アッセイの全てが、上
述した要因に関して最適化されたとき、15分以内に平衡
に達した。明らかに、より速いアッセイは、この平衡要
求が放棄される場合、同一コンセプトに従って行われる
ことができる。 提示されたコンセプトに従えば、２段階アッセイは全
く報告されない。なぜなら、その後、試薬添加段階が含
まれなければならないからである。普通の競合性アッセ
イは、通常、１段階手順において行われる。非競合性ア
ッセイにおいては、これは、時折、制限として考えられ
ることができる。標識された抗体の増加量の使用を許容
する固相及び標識技術の高い能力は、この制限を補償す
る。高投与量のフック効果により生じるシグナルは、着
目の分析物のために使用される最高の標準のために得ら
れたシグナルの下まで決して下降しないであろう。 本質的に螢光性のランタニド、例えばユーロピウム、
キレートは、インキュベーション期及び計測期の両者の
間に、イムノアッセイにおいて標識された成分に結合さ
れる。解離強化されたランタニド・フルオロイムノアッ
セイ（DELFIA）において、ユーロピウム・イオンは、新
たな螢光錯体が形成される溶液中に標識付けのために使
用されるキレートから解離される（Hemmil et al.Ana
l Biochem 137,335−43,1984）。新たな本質的に螢光性
のランタニド・キレートは、上記DELFIA手順において得
られたものに等価な比活性をもつ。固相から時間分解計
測のための溶液への螢光標識された成分の放出は、速い
ものである（Mitrunen et al.Clin Chem 41,1115−20,1
995,Diamandis et al.Chin Biochem 25,255−61,199
2）。外からの汚染についての危険は最小化される。な
ぜなら、ランタニド・イオンはその計測前にそのキレー
トから決して放出されないからである。螢光ユーロピウ
ム及びテルビウム・キレートを使用した２重標識（Dual
−label）アッセイが可能であり（Mitrunen et al.Clin
Chem 41,1115−20,1995）、そしてあるいは、その螢光
シグナルは、放出段階の全てを排除する固相表面から直
接的に計測されることができる。 本質的に螢光性のユーロピウム・キレートの中の１、
４−（２−（４−イソチオシアナトフェニル）エチニ
ル）−2,6−ビス（（N,N−ビス（カルボキシメチル）−
アミノ）メチル）ピリジンの検出限界が、計測された。
いくつかの同様の本質的に螢光性のランタニド・キレー
トが合成されている（Mukkala et al.Helv Chim Acta 7
5,1621−32,1992）。ユーロピウムの計測のためのDELFI
A強化原理に比較して、ランタニドは、常に、元のキレ
ートに結合し、そしてその励起エネルギーは、その分子
のエネルギー仲介部分により効率的に吸収される。螢光
性ユーロピウム・キレートについての検出限界（バック
グラウンド＋2SD）は、５×10-14mol/Lと推定され、こ
れは、DELFIA強化溶液中のユーロピウムの検出限界に対
応する（Hemmil et al.Anal Biochem 137,335−43,19
84）。 不活性、かつ、安定性の本質的に螢光性のランタニド
・キレート標識は、本１段階のオールインワン乾燥試薬
イムノアッセイを実行可能なものにする。可能性のあ
る、標識された成分の非特異性結合は、オールインワン
乾燥試薬ウェル内での遮断層の使用により防止される。
この遮断層が省かれる場合、非特異的結合が、特に、そ
のウェルの保存の間の高過剰の試薬の、非競合的アッセ
イにおいて、増加する。最適には、上記遮断層中に添加
されたタンパク質と炭水化物の両方による非競合性のイ
ムノアッセイが、液体の形態で試薬を使用する対応のア
ッセイよりも、よりよく行われる。上記添加物のいくつ
か及び明らかに上記ブロッカーは、分析物特異的であっ
た。遮断層の上部への標識された成分の添加も、決定的
である。特に、非競合性アッセイにおいては、標識され
た抗体は、その非特異的結合を有意にしないように速く
乾燥される小容量において添加されなければならない。
競合性アッセイにおいては、遮断層の使用は、そのアッ
セイが平衡まで行われる限り、不可欠ではない。一旦、
１段階オールインワン乾燥試薬ウェルの分析物特異的最
適化が行われれば、それらの使用は極めて簡単である。
なぜなら、サンプルと一般的なアッセイ・バッファー又
は溶液だけが、そのイムノアッセイが行われるときに、
要求されるからである。 以下の実施例を、限定のためではなく、説明のために
提供する。 実 験 実施例１ モノクローナル抗体の標識付け 検出において使用されるMabを、ユーロピウム（Eu）
の４−（２−（４−イソチオシアナト−フェニル）エチ
ニル）−2,6,−ビス（（N,N−ビス（カルボキシメチ
ル）−アミノ）メチル）−ピリジンの螢光性キレートで
標識した。標識付けを、50mmol/L NaHCO3を含むバッフ
ァー（pH 9.8）中に100倍モル過剰の上記Euキレートを
用いて、４℃で一夜、行った。（3.3mg/mLまでの）高タ
ンパク質濃度及びこれ故低過剰のキレートを、上記標識
付け反応の全容量を最小化するために使用した。高精度
ポンプＰ−500（Pharmacia LKB）を備えたSuperdex 200
HR 10/30カラム（Pharmacia LKB,Uppsala,Sweden）
を、過剰のキレートから標識された抗体を分離するため
に使用した。使用した溶出バッファーは、１リッター当
り、50mmolのTris−HCl、9gのNaCl、及び0.5gのNaN3を
含んでいた、pH7.75（TSA−バッファー）。標識された
タンパク質を含む画分をプールし、そしてその抗体の標
識付けの程度を測定した。既知量の上記標識mAbを、抗
−マウスIgGコート・ウェル（Wallac Oy）内でインキュ
ベートし、これらのウェルを６回洗浄し、そしてDELFIA
強化溶液〔DELFIA Enhancement solution（Wallac Oy）
を、Eu標準に対する結合したユーロピウムの螢光を計測
するために添加した。上記mAbは、IgG当り７〜8.3のEu
を含んでいた。1g/Lの最終濃度のジエチレントリアミン
ペンタ酢酸（DTPA）精製BSAを添加し、そしてこのプー
ルを、0.2μｍフィルターを通して濾過して凝集物を除
去した。標識されたmAbを４℃で保存した。 実施例２ モノクローナル抗体のビオチン化 捕獲において使用されるmAbを、50mmol/LのNaHCO3を
含むバッファー（pH 9.8）中のN,N−ジメチルホルムア
ミド（10mmol）中に溶解された100倍モル過剰の、ビオ
チンのイソチオシアネート誘導体（BITC,Wallac Oy）と
反応させ、そして室温において２〜４時間インキュベー
トした。遊離のビオチンを、溶出のためにTSA−バッフ
ァーを使用してNAP−10カラムを用いた。そしてその
後、PD−10カラム（Pharmacia LKB）を用いたゲル濾過
により分離した。最終的に1g/LのDTPA−処理BSAを添加
した。このビオチン化mAbを４℃で保存した。 実施例３ モノクローナル抗体による直接的コーティング 上記捕獲mAbを、物理的吸着を通じてマイクロタイト
レーション・ストリップ上に固定化した。これらのウェ
ルを、35℃で一夜、0.2mol/LのNaH2PO4バッファーを含
む100μＬのバッファー中の１μｇのmAbでコートした。
コートされたウェルを、Delfiaプレートウォッシュを使
用することによりDelfia Wash溶液で２回洗浄し、そし
て次に１リッター当り、1gのBSA、60gのトレハロース、
1gのGermall II、及び50mmolのNaH2PO4を含む溶液300μ
ｌで室温で３時間飽和させた。飽和後、上記ウェルを吸
引し、そして25℃で２時間乾燥させた。 実施例４ ストレプトアビジンによるコーティング及び上記捕獲mA
bの固定化 UV−吸収低螢光性Maxisorbストリップ（Nunc,Roskild
e,Denmark）を、１リッター当り9gのNaClを含む0.1mol/
Lのシトレート−ホスフェート・バッファー（pH 5.0）
中１μg/ウェルのストレプトアビジン（Porton Product
s,United Kingdom）で、35℃で一夜直接的にコートし
た。これらのプレートを、DELFIA Platewash（Wallac O
y）を使用して、0.05％Tween 20を補った、１リッター
当り、9gのNaCl、0.1gのGermall II、0.05gのTween 2
0、及び5mmolのTris−HCl（pH7.75）を含むDELFIA Wash
溶液（Wallac Oy）で２回洗浄した。室温での一夜の飽
和を、１リッター当り、50mmolのTris−HCl（pH 7.
0）、60gのソルビトール及び2gのDTPA−処理BSAを含む
バッファーを用いて行った。最終的にこれらのプレート
を吸引し、そして風乾した。 上記捕獲mAbを、１リッター当り、50mmolのTris−HCl
（pH7.75）、9gのNaCl、5gのBSA、0.5gのウシ−γ−グ
ロブリン、0.1gのTween 40、20μmolのジエチレントリ
アミンペンタ酢酸（DTPA）、0.5gのNaN3、及び20mgのチ
ェリー・レッド（cherry red）を含む、50μＬのDELFIA
Assayバッファー（Wallac Oy）中で200ngのビオチン化
mAbをインキュベートすることによりストレプトアビジ
ン・コートされたプレート上に固定化した。上記ストリ
ップを振とうしながら室温で30分間インキュベートし、
そして２回洗浄し、そして風乾した。 実施例５ オールインワン乾燥試薬マイクロタイトレーション・ウ
ェルの調製 上記遮断炭水化物層を、１リッター当り、5gのBSA又
はカゼイン、100gのソルビトール、9gのNaCl、0.5gのNa
N3、0.2gのTween 20、1.2gのウシ・ガンマグロブリン、
及び50mmolのTris−HClを含む溶液、pH 7.7の10μｌを
上記コートされたウェルに添加することにより、間接的
に又は直接的に固定化された特異的捕獲モノクローナル
抗体上で調製した。ウェル内の溶液を35℃で一夜乾燥さ
せた。例えば、生来のマウスIgG,HBR−２及びMAK−33の
ようなアッセイ特異的成分及びブロッカーが、この層に
添加されることができる。標識されたmAb（300ng）は、
１リッター当り、1gのジエチレントリアミンペンタ酢酸
（DTPA）−処理BSA、50gのトレハロース、9gのNaCl、0.
05gのチェリー・レッド（cherry red）、0.5gのNaN3、
及び50mmolのTris−HClを含む溶液、pH7.75の１μＬ
中、上記遮断層の上部に小分けした。小分けされた溶液
を、直ちに、上記ウェルに空気を吹きつけることにより
乾燥させた。オールインワン乾燥試薬ウェルを、乾燥剤
と共に密封された容器内に４℃で保存した。 競合性イムノアッセイにおいては、Euキレート標識さ
れた分析物が、１リッター当り、1gのジエチレントリア
ミンペンタ酢酸（DTPA）−処理BSA、50gのトレハロー
ス、9gのNaCl、0.05のチェリー・レッド、0.5gのNaN3、
及び50mmolのTris−HClを含む溶液、pH 7.5の小容量
（１μＬ）中、上記遮断層上にか又は上記分析物特異的
コート・ウェルに直接的に添加される。小分けされた溶
液を、直ちにウェルに空気を吹きつけることにより乾燥
させた。オールインワン乾燥試薬ウェルを、乾燥剤と共
に密封容器内に４℃で保存した。 実施例６ イムノアッセイ手順 イムノアッセイを、以下の手順に従って行った。標準
及び全血、血漿、又は血清のサンプルをアッセイ・バッ
ファー中で1:5に希釈した。20μＬのアッセイ・バッフ
ァー中の希釈サンプル10μＬアリコートを、上記１段階
オールインワン乾燥試薬ウェルに添加した。このウェル
を、iEMS Incubator/Shaker（Labsystem Oy,Helsimki,F
inland）を用いて900rpmの振とう速度を使用して36℃で
15分間振とうし、そして過剰の標識を、上記ウェルを６
回洗浄することにより除去した。螢光性Euキレートのシ
グナルを、１リッター当り、50mmolのブリシン−NaOH、
1.75molのNaSCN、2mmolのNa2CO3、50mLのグリセロー
ル、5mgのTween 40、4.5μmolのDTPA、及び200mLの１−
プロパノールを含む、200μＬのLANFIA溶液（Mitrunen
et al.Clin Chem 41,1115−20,1995）、pH10.0を添加し
た後に計測した。このウェルを３分間振とうし、そして
DELFIAプレート・フルオロメーター、モデル1234（Wall
ac Oy）を用いて計測した。あるいは、時間分解螢光シ
グナルを、その洗浄段階が完結した後に、そのウェルの
表面から直接読んだ。 結 果 動 態 １段階非競合性アッセイの反応レンジに影響を及ぼす
要因、すなわち、温度、成分濃度、アッセイ容量及び抗
体の品質、を最適化した。最適化されたアッセイ動態の
性能を、連続振とうしながら＋36℃で5,10,20,30及び60
分間、血清及び全血サンプル、並びにバッファー及び全
血標準を含むマイクロタイトレーション・ウェルをイン
キュベートすることにより、異なる標準及びサンプル材
料を用いて確認した。 レンジ及び線形性 バッファーと全血標準の両方についての換算曲線は、
２から1250μg/Lまでのレンジにわたり線形であった。
バッファー標準を用いたアッセイ内精度（ｎ＝12）は、
全血標準を用いて3.2−4.0％及び3.3−7.3％であった
（図３）。Mbの最低検出可能量は、ゼロ標準プラス3 SD
の、12反復の平均のシグナルに等しい投与量として推定
したとき、血清アッセイについて0.1μg/L、そして全血
アッセイについて0.6μg/Lであった。 精 度 血清とスパイクした全血サンプルの両方を用いたアッ
セイ内CVは、全て４％未満であり、そしてラン間のCV
（between−run CVs）は、それぞれ、５％未満と６％未
満であった（表１）。 線形性 計測レンジ内の線形性を、標準的な希釈剤で１〜32倍
希釈された、24.2μg/L、43μg/L及び1103.1μg/Lを含
む３つの血清サンプルを希釈し、そして観察（ｙ）対予
想（ｘ）ミオグロビン濃度をプロットすることにより確
認した。全ての希釈物を、元のサンプルから作った。上
記の３つの希釈された血清サンプルは、それぞれ、良好
な線形相関を示した;y＝0.94x−0.13（ｒ＝1.0）、ｙ＝
1.02x−0.38（ｒ＝0.99）及びｙ＝0.91x＋12.9（ｒ＝0.
99）。 妨害試験 ヘモグロビンとの交差反応を、Mb涸渇血清に溶血液
（hemolysate）の増加量（ヘモグロビン０〜75g/L）を
添加することにより調べた。１リッター当り75gのヘモ
グロビンまでの添加は、いかなる増加したアッセイ応答
をも引き起こさなかった。 回収率 血清及び全血サンプルを用いたアッセイは良好な回収
率を示した。全血（ｎ＝５）と血清（ｎ＝４）サンプル
による平均の分析的回収率は、それぞれ、96％と100％
であった（表２と表３）。 比較試験 血清サンプルを使用した非競合性免疫螢光計測LANFIA
アッセイにより得られた結果を、Vuori et al.（Clin.C
hem.37/12,2087−2092（1991））により報告されたDELF
IAアッセイにより得られたものと比較した（ｎ＝９）。
上記２のアッセイは、高い程度の相関:y＝0.68x＋7.31
（ｒ＝0.995）をもつ結果を与えた。LANFIAにより得ら
れた血清サンプルの結果と、Biomerica（Newport Beac
h,CA）から購入した商業的RIAキットにより得られた結
果との間にも密な相関が得られた（ｎ＝79）;y＝1.25x
−0.74、ｒ＝0.982（図４）。このRIAキットの検出下限
（20ng/mL）未満の結果を、上記回帰分析から除外し
た。 全血サンプルと血漿サンプルの間の相関 図５は、それぞれ、全血又は血漿のいずれかの同一サ
ンプルを使用した開発されたアッセイにより得られたMb
結果の比較を示す（ｙ＝0.87x＋13.3、ｒ＝0.981）。 ミオグロビンについての患者の結果 全血サンプルと血漿サンプルを、電気パルス処理後の
異なる時に電気除細動患者からも採取した。１の電気除
細動患者からのMb放出についての典型的な結果を図６に
示す。 全血サンプル中のCK−MB計測 同一患者からの血清サンプルと全血サンプルを、それ
らのCK−MB濃度について本発明に従って計測した。これ
らの結果を表４に示す。 本発明に係る方法がさまざまな態様で取り込まれるこ
とができ、その中のほんの数個が本明細書中に開示され
ているということが理解されよう。他の態様が存在し、
そして本の本質から逸脱しないということは当業者に明
らかであろう。従って、記載した態様は説明的なもので
あり、そして限定として解釈されてはならない。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 レブグレン，ティモ
フィンランド国，エフイーエン―21610
キルヤラ，アリ―キルヤラ，ハカメー
エンティー 57
(56)参考文献 特開 昭51−70812（ＪＰ，Ａ)
特開 昭63−111467（ＪＰ，Ａ)
特開 昭53−131089（ＪＰ，Ａ)
特開 昭61−225651（ＪＰ，Ａ)
特開 昭62−269065（ＪＰ，Ａ)
特開 昭63−241352（ＪＰ，Ａ)
特開 昭59−31695（ＪＰ，Ａ)
特開 平７−140132（ＪＰ，Ａ)
特表 平４−503404（ＪＰ，Ａ)
国際公開90／007114（ＷＯ，Ａ１)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/53 - 33/579
Claims (15)
- 【請求項１】競合的又は非競合的イムノアッセイ法であ
って、以下のステップ： −反応ウェル内の固相上にアッセイ特異的成分を固定化
し； −標識されたアッセイ特異的成分を添加し； −上記成分を乾燥させ； −分析されるべきマーカーを含有するサンプルを添加
し； −上記マーカーが上記アッセイ特異的成分と反応するこ
とを許容し；そして −上記標識からのシグナルを検出する、 を含み、ここで、抗体又は抗原であることができる上記
標識された成分から上記固定化された成分を分離する遮
断層が、上記標識された成分が添加・乾燥される前に、
添加・乾燥されることを特徴とする、前記イムノアッセ
イ法。 - 【請求項２】競合的又は非競合的イムノアッセイ法であ
って、以下のステップ： −分析されるべきマーカーを含有するサンプルを、反応
ウェル；上記反応ウェル内の固相上に直接的に又はアフ
ィニティー対を介して固定化されたアッセイ特異的成
分；標識されたアッセイ特異的成分を含むデバイスに添
加し、ここで、そのデバイス内で、上記の固定化された
成分と上記の標識された成分が乾燥されており； −上記マーカーが上記アッセイ特異的成分と反応するこ
とを許容し；そして −上記標識からのシグナルを検出する、 を含み、ここで、抗体又は抗原であることができる上記
標識された成分から上記固定化された成分を分離する遮
断層が、上記標識された成分が添加・乾燥される前に、
添加・乾燥されることを特徴とする、前記イムノアッセ
イ法。 - 【請求項３】前記サンプル以外の全ての試薬が、乾燥前
に添加されることを特徴とする、請求項１又は２に記載
のアッセイ法。 - 【請求項４】前記反応ウェルが、通常のマイクロタイト
レーション・ウェルのサイズ又はそれより小さなサイズ
を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載のア
ッセイ法。 - 【請求項５】前記の免疫反応が１のインキュベーション
手順内で行われることを特徴とする、請求項１又は２に
記載のアッセイ法。 - 【請求項６】前記遮断層が、タンパク質及び／又は炭水
化物、並びに前記の必要なアッセイ特異的成分を含む、
請求項５に記載のアッセイ法。 - 【請求項７】前記の事前に添加されたアッセイ特異的成
分が風乾されることを特徴とする、請求項１又は２に記
載のアッセイ法。 - 【請求項８】前記のサンプルが、血清、血漿又は全血か
ら成る群から選ばれることを特徴とする、請求項１又は
２に記載のアッセイ法。 - 【請求項９】ランタニド・キレートが、アッセイ特異的
成分を標識するために使用されることを特徴とする、請
求項１又は２に記載のアッセイ法。 - 【請求項１０】前記ランタニド・キレートが、時間分解
フルオロメトリーにより計測されることを特徴とする、
請求項９に記載のアッセイ法。 - 【請求項１１】前記ランタニド・キレートが、時間分解
フルオロメトリーにより、 −溶液中で、又は −前記固相上で直接的に、 計測されることを特徴とする、請求項９に記載のアッセ
イ法。 - 【請求項１２】２以上の分析物が、異なる分析物につい
て異なるランタニド・キレート標識を使用することによ
り１の単反応ウェル内で計測されていることを特徴とす
る、請求項９に記載のアッセイ法。 - 【請求項１３】前記反応ウェル内の乾燥された成分が、 −ミオグロビン； −クレアチン・キナーゼ・アイソザイムMB; −心臓特異的トロポニンI; −ヒト・グリコーゲン・ホスホリラーゼ・アイソザイム
BB; −ミオグロビン及びクレアチン・キナーゼ・アイソザイ
ムMB;又は −ミオグロビン、クレアチン・キナーゼ・アイソザイム
MB及び心臓特異的トロポニンＩ、 に特異的であることを特徴とする、請求項１又は２に記
載のアッセイ法。 - 【請求項１４】競合的及び／又は非競合的イムノアッセ
イ法用デバイスであって； −反応ウェル； −上記反応ウェルの表面上に、直接的にか又は第２の固
定化試薬を介して、固定化されたアッセイ特異的成分； −標識されたアッセイ特異的成分；及び −上記の標識された成分から上記の固定化された成分を
分離する遮断層、 を含み、ここで上記デバイス内で、上記の固定化された
成分、上記の標識された成分及び上記の遮断層が全て乾
燥されていることを特徴とする、前記デバイス。 - 【請求項１５】前記サンプル以外の全ての試薬が、乾燥
前に添加されていることを特徴とする、請求項14に記載
のデバイス。
Applications Claiming Priority (3)
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