CN115078708A - 一种基于磁微粒时间分辨荧光免疫分析法的胰石蛋白检测方法 - Google Patents

一种基于磁微粒时间分辨荧光免疫分析法的胰石蛋白检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开的是一种基于磁微粒时间分辨荧光免疫分析法的胰石蛋白检测方法，属于免疫检测分析技术和纳米生物技术领域检测方法包括包被PSP抗体的磁微粒的制备，铕标记的PSP抗体的制备，将待测样本、铕标记抗体、抗体偶联的磁微粒混合孵育，反应后在磁力作用下洗涤，除去未结合物，之后加入增强液对铕进行解离增强，采用时间分辨荧光分析仪测定荧光值，本发明可以快速检测待测样本中PSP的含量，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等特点，可用于临床对脓毒症的辅助诊断，具有较好的应用前景。

Description

一种基于磁微粒时间分辨荧光免疫分析法的胰石蛋白检测 方法
技术领域
本发明涉及一种检测方法，更具体一点说，涉及一种基于磁微粒时间分辨荧光免疫分析法的胰石蛋白检测方法，属于生物技术检测领域。
背景技术
胰石蛋白(PSP)，也叫再生蛋白(Reg1α)，是一种由胰腺尖细胞分泌的C型凝集素蛋白。PSP最初用于确定胰腺损伤的严重程度。近年来，PSP主要在脓毒症中被报道。以前的研究表明，PSP不仅在诊断败血症前3天急剧增加，而且可以决定脓毒症的严重程度，预测严重患者的死亡率。因此，如何实现快速准确地检测人血清中的PSP含量的方法具有重要的意义。
发明内容
为了解决上述现有技术问题，本发明提供具有可以快速检测待测样本中PSP的含量，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等技术特点的一种基于磁微粒时间分辨荧光免疫分析法的胰石蛋白检测方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种基于磁微粒时间分辨荧光免疫分析法的胰石蛋白检测方法，将PSP包被抗体包被在磁珠表面，形成免疫磁珠-抗体复合物，其中，0.1mg抗体包被10mg磁珠，抗体与磁珠的孵育条件为室温避光旋转16h；
对磁珠进行洗涤和分离，去除未结合的抗体；
将铕标记到PSP检测抗体，并对抗体的使用量进行优化以确定适合的抗体使用剂量，用分析缓冲液进行稀释，避免检测抗体过量；
将优化剂量的磁珠，铕标检测抗体和待测样品，孵育条件为37℃震荡12min，最终形成磁珠-PSP包被抗体-PSP抗原-铕标PSP检测抗体荧光免疫复合物，经时间分辨仪进行荧光检测分析。
优选的，免疫磁珠具有羧基修饰的功能基团，羧基修饰的功能基团的活化条件为：分别配置N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，每10mg磁珠加入10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)各28μL和40μL，并在室温避光旋转反应30min。
优选的，利用离心管和磁力架对磁珠进行洗涤和分离。
优选的，利用酶标板和96孔板磁力架对磁珠进行洗涤和分离。
优选的，采用异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕(DTTA-Eu)为双功能螯合试剂，其一端螯合铕，另一端可与抗体的NH2连接，每1mg抗体连接0.2mg铕螯合物。
优选的，磁珠-PSP包被抗体-PSP抗原-铕标PSP检测抗体荧光免疫复合物以铕作为荧光示踪物，加入增强液使铕解离，再根据其荧光强度计算待测物含量。
优选的，通过识别利用时间分辨荧光测量法和光谱分离技术排除样品中非特异性干扰，测定最后产物中的荧光强度，实现有效地提高了检测的灵敏度。
有益效果：本发明可以快速检测待测样本中PSP的含量，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等特点，能够用于临床对脓毒症的检测，具有较好的应用前景。
附图说明
图1PSP检测标准曲线。
具体实施方式
以下结合说明书附图，对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
脓毒症是一种常见的、致命的疾病，是全球主要死亡原因之一。脓毒症在老龄化人群中很常见，它对患有癌症和潜在免疫抑制的患者的影响尤其大。在最严重的情况下，脓毒症会导致多器官功能障碍，从而导致以严重免疫功能障碍和分解代谢为特征的慢性危重疾病状态。因此，严重脓毒症的早期检测和诊断十分重要。本发明采用PSP作为提示脓毒症的生物标志物，结合利用免疫磁珠和铕检测待测样品的PSP浓度，能够快速准确地检测人血清中的PSP含量。
一种基于磁微粒时间分辨荧光免疫分析法的胰石蛋白(PSP)检测方法，固相载体为具有羧基修饰的功能基团的免疫磁珠，免疫磁珠表面修饰的羧基基团的活化条件：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)现配现用，每10mg磁珠加入10mg/mL的NHS和10mg/mL的EDC各28μL和40μL，并在室温避光旋转反应30min。免疫磁珠与PSP包被抗体形成偶联物过程的包被比例和孵育条件：0.1mg抗体包被10mg磁珠，抗体与磁珠的孵育条件为室温避光旋转16h，形成磁珠-抗体复合物后，利用离心管和磁力架对磁珠进行洗涤和分离，去除未结合抗体。PSP抗体共价偶联于免疫磁珠的表面，同时将铕标记到PSP检测抗体上，利用双抗体夹心法，形成磁珠-包被抗体-抗原-铕标记检测抗体的荧光免疫复合体，以铕作为荧光示踪物，加入增强液对铕进行解离，最后根据荧光强度进行检测分析(通过识别利用时间分辨荧光测量法和光谱分离技术排除样品中非特异性干扰，测定最后产物中的荧光强度，从而有效地提高了检测的灵敏度)。据荧光强度进行检测分析是指利用镧系稀土螯合物具有长寿命荧光这一特性，在样品被脉冲光激发后、荧光信号采集之前，根据样品中所包含的不同的荧光物质其荧光衰变时间的各不相同通过延迟一定时间，在此时间段内待测样本中短寿命的背景荧光完全淬灭后，再对长寿命的稀土螯合物特异性荧光信号进行收集检测。通过时间分辨延迟可以有效消除来自样品、试剂、仪器等其它非特异性荧光的干扰，从而极大地提高检测的灵敏度。本发明采用异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕(DTTA-Eu)为双功能螯合试剂，其一端螯合铕，另一端可与抗体的NH2连接。每1mg抗体连接0.2mg铕螯合物。
还包括检测试剂盒，包括试剂盒以及放在试剂盒内的多个药剂盒，其中，具有放置磁珠的药剂盒，磁珠包含有分别包被PSP抗体的磁珠；具有放置检测抗体的药剂盒，检测抗体包括分别标记铕的PSP抗体，具有放置PSP标准品溶液的药剂盒，具有放置缓冲液的药剂盒，所述缓冲液为pH 7.8的分析缓冲液和pH 3.2的增强液；试剂盒里设有可发性聚苯乙烯泡沫层，试剂盒包括盒体与盒盖，盒体与盒盖由酚醛塑料材质的连接轴连接，试剂盒底部预制有存放碎冰的冰槽。
以下结合附图1、实施例1-4对本申请作进一步详细说明。
实施例1磁珠-PSP包被抗体偶联
10mg微球为一个批次，将其加入至2mL离心管中，依次加入EDC和NHS溶液，在室温、酸性条件下活化微球表面30min，随后利用磁力架将微球清洗，加入0.1mg过滤浓缩后的抗体，室温避光震荡16h，利用磁力架去除未过量的抗体，加入TBST，在2-8℃下对抗体进行保存。
实施例2铕标记检测抗体
将待标记抗体原料加入带有滤膜的30KD离心管中，将浓缩后的抗体原料加入200μL铕标记蛋白缓冲液，10000rpm离心5min弃掉滤液，再加入200μL洗脱缓冲液，按上述离心步骤重复8次。将几次离心后的离心管取出，弃掉滤液，把离心管的滤膜返转，3000rpm，离心lmin，收集滤液。然后再次将滤膜反转过来，加入100μL标记缓冲液，静置片刻，使滤膜将标记蛋白缓冲液吸收，留在滤膜上的残余抗体原料溶解下来，而后将滤膜重新反转过来3000rpm离心1min，收集滤膜上的液体，使滤膜上抗体原料尽可能多的被回收，即所需要的浓缩抗体原料。整个过程收集抗体最佳体积为200μL左右。抗体完成浓缩去杂质后，按照质量比抗体：铕螯合物＝5:1的比例充分混匀分别进行标记，放入25℃恒温培养箱中避光震荡16小时。将反应液转移到用洗脱缓冲液预平衡的Sephadex-G50柱上进行纯化，收集洗脱液(1mL/管)。每管取5μL此加入96微孔板中，每孔再加入100μL增强液，置于振荡器上振荡5min后测值，根据荧光值高低选择几管合并收集并放于4℃冰箱保存。
实施例3磁珠-PSP包被抗体-铕标PSP检测抗体荧光免疫复合物形成
96孔酶标板中加入微球-PSP包被抗体偶联物，将铕标PSP检测抗体和待测样品同时与微球孵育，孵育条件为避光、37℃震荡12min，得到微球-PSP包被抗体-PSP抗原-铕标PSP检测抗体荧光免疫复合物，加入增强液震荡5min后上机检测荧光强度确定检测指标含量。
实施例4PSP检测的线性范围、灵敏度、特异性、精密度及回收率。
配制PSP标准品，利用本试剂盒进行检测，绘制标准曲线，利用荧光值和浓度值绘制标准曲线，PSP检测的线性方程为：Y＝7127X-22181，R2＝0.9999，结果图1所示。
平行测定10次0ng/mL参考标准品的荧光值，并计算其均值(mean)及标准差(SD)，采用mean+2SD代入标准曲线方程，计算得到本试剂盒对PSP的检测灵敏度为0.035ng/mL，因此，线性范围为0.035ng/mL～500ng/mL。
测定2次干扰因子肝素结合蛋白(HBP)，降钙素原(PCT)和白介素-6(IL-6)的抗原，并通过标准曲线计算其浓度。交叉反应率(％)＝检测浓度/实际浓度。结果如表1，计算得到本试剂盒对HBP，PCT和IL-6几乎没有交叉反应率，特异性较好。
表1PSP检测特异性
Figure BDA0003679395410000051
分别检测PSP低值样本、中值样本、高值样本各10次，结果如表2，得到PSP检测的批内变异系数为0.87％-2.07％(＜10％)，批间变异系数为3.72％-4.12％(＜15％)。
表2PSP分析精密度
Figure BDA0003679395410000052
Figure BDA0003679395410000061
将100ng/mL,200ng/mL,500ng/mL的PSP标准品分别与血清按1:9的比例混合。混合溶液的浓度通过标准曲线测量，设为实际测量的浓度。血清样品的初始浓度为112.17ng/mL。加入PSP标准溶液后，计算出血清样品中PSP的最终理论浓度分别为110.95、120.95和150.95ng/mL。回收率计算公式：回收率(％)＝实际浓度/理论浓度。结果如表3，回收率为90.33％-100.85％。
表3PSP检测回收率
Figure BDA0003679395410000062
Figure BDA0003679395410000071
最后，需要注意的是，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种基于磁微粒时间分辨荧光免疫分析法的胰石蛋白检测方法，其特点在于：将PSP包被抗体包被在磁珠表面，形成免疫磁珠-抗体复合物，其中，0.1mg抗体包被10mg磁珠，抗体与磁珠的孵育条件为室温避光旋转16h；
对磁珠进行洗涤和分离，去除未结合的抗体；
将铕标记到PSP检测抗体，并对抗体的使用量进行优化以确定适合的抗体使用剂量，用分析缓冲液进行稀释，避免检测抗体过量；
将优化剂量的磁珠，铕标检测抗体和待测样品，孵育条件为37℃震荡12min，最终形成磁珠-PSP包被抗体-PSP抗原-铕标PSP检测抗体荧光免疫复合物，经时间分辨仪进行荧光检测分析。
2.如权利要求1所述的一种基于磁微粒时间分辨荧光免疫分析法的胰石蛋白检测方法，其特点在于：免疫磁珠具有羧基修饰的功能基团，羧基修饰的功能基团的活化条件为：分别配置N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，每10mg磁珠加入10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)各28μL和40μL，并在室温避光旋转反应30min。
3.如权利要求1或2所述的一种基于磁微粒时间分辨荧光免疫分析法的胰石蛋白检测方法，其特点在于：利用离心管和磁力架对磁珠进行洗涤和分离。
4.如权利要求1或2所述的一种基于磁微粒时间分辨荧光免疫分析法的胰石蛋白检测方法，其特点在于：利用酶标板和96孔板磁力架对磁珠进行洗涤和分离。
5.如权利要求1所述的一种基于磁微粒时间分辨荧光免疫分析法的胰石蛋白检测方法，其特点在于：采用异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕(DTTA-Eu)为双功能螯合试剂，其一端螯合铕，另一端可与抗体的NH2连接，每1mg抗体连接0.2mg铕螯合物。
6.如权利要求1所述的一种基于磁微粒时间分辨荧光免疫分析法的胰石蛋白检测方法，其特点在于：磁珠-PSP包被抗体-PSP抗原-铕标PSP检测抗体荧光免疫复合物以铕作为荧光示踪物，加入增强液使铕解离，再根据其荧光强度计算待测物含量。
7.如权利要求6所述的一种基于磁微粒时间分辨荧光免疫分析法的胰石蛋白检测方法，其特点在于：通过识别利用时间分辨荧光测量法和光谱分离技术排除样品中非特异性干扰，测定最后产物中的荧光强度，实现有效地提高了检测的灵敏度。
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