CN115315628A - 体液样本中的杉变应原特异性IgE抗体的检测方法和检测用试剂盒 - Google Patents

Abstract

公开了可以在杉变应原特异性IgE抗体的检测中使检测值提高的、体液样本中的杉变应原特异性IgE抗体的检测方法和用于该检测方法的试剂盒。该方法包括下述工序：除去工序，从体液样本除去IgG抗体等非IgE抗体；反应工序，使在除去工序中获得的抗体除去后的体液样本与设置有反应槽的基板的反应槽接触，使变应原与变应原特异性IgE抗体的复合体形成，上述反应槽包含固定化了杉变应原的区域和固定化了除杉变应原以外的1种以上变应原的区域；以及检测工序，检测在反应工序中获得的杉变应原与杉变应原特异性IgE抗体的复合体。

Description

体液样本中的杉变应原特异性IgE抗体的检测方法和检测用 试剂盒

技术领域

本发明涉及体液样本中的杉变应原特异性IgE抗体的检测方法以及杉变应原特异性IgE抗体的检测用试剂盒。

背景技术

近年来，作为低侵袭并且安全的变态反应检查法，广泛应用了将从患者采取的体液样本中的特异性IgE抗体在体外进行检测的方法。该方法通过使固定化了各种变应原例如杉、螨或牛奶等的变应原(变态反应诱发物质)的载体与体液样本接触，从而使变应原与特异性IgE抗体的复合体形成，接着使用被酶、荧光色素或放射性物质等标记了的抗IgE抗体检测该复合体，从而检测体液样本中的特异性IgE抗体。

在将特异性IgE抗体在体外进行检测的情况下，已知体液样本中存在与特异性IgE抗体变应原特异性相同而共存的除特异性IgE抗体以外的特异性抗体，与特异性IgE抗体竞争而作为与变应原结合的竞争抗体起作用。即，在使体液样本与变应原固定化载体接触时，上述竞争抗体与变应原形成复合体，阻碍特异性IgE抗体与变应原的复合体形成，从而存在使特异性IgE抗体检测的灵敏度和准确性降低这样的课题。作为对该课题的解决方法，报导了导入使用特异性吸附上述竞争抗体的配体，在使体液样本与变应原固定化载体接触前，从体液样本预先除去上述竞争抗体的除去工序的方法(专利文献1、2)。在专利文献2中报导了，在使用固定化了牛奶变应原的96孔微孔板，检测体液样本中的牛奶变应原特异性IgE抗体时，通过除去工序的导入而检测值提高，不受由共存的竞争抗体带来的妨碍而可以测定特异性IgE抗体。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平3-25366号公报

专利文献2：日本特开2000-266746号公报

发明内容

发明所要解决的课题

本发明者们为了期待由在体液样本中共存的竞争抗体的除去带来的检测值提高的效果而检测杉变应原特异性IgE抗体，以专利文献2所记载的方法为参考，实施了使用了96孔微孔板的特异性IgE抗体的检测。具体而言，如后述比较例6那样，将杉变应原固定化于96孔微孔板，使预先除去了竞争抗体的体液样本接触，检测了杉变应原与特异性IgE抗体的复合体。其结果与在专利文献2中报导的检测牛奶变应原特异性IgE抗体的情况不同，本发明者们实施了的杉变应原特异性IgE抗体的检测未确认到由除去工序带来的检测值的提高。即，仅实施除去工序，不能在使用了96孔微孔板的杉变应原特异性IgE抗体的检测中使检测值提高。

用于解决课题的方法

本发明者们为了攻克上述课题而进行了深入研究，结果发现，通过使用在同一反应槽中独立地固定化了杉变应原和除杉变应原以外的1种以上变应原的基板，并且，使预先除去了竞争抗体的体液样本与该基板接触，从而可以在杉变应原特异性IgE抗体的检测中使检测值提高。

即，本发明由以下(1)～(8)的方案而构成。

(1)一种检测体液样本中的杉变应原特异性IgE抗体的方法，该方法包括下述工序：

除去工序，从体液样本除去选自IgG抗体、IgM抗体、IgA抗体和IgD抗体中的至少1种抗体；

反应工序，使在上述除去工序中获得的抗体除去后的体液样本与设置有反应槽的基板的该反应槽接触，使变应原与变应原特异性IgE抗体的复合体形成，上述反应槽包含固定化了杉变应原的区域和固定化了除杉变应原以外的1种以上变应原的区域；以及

检测工序，检测在上述反应工序中获得的杉变应原与杉变应原特异性IgE抗体的复合体。

(2)根据(1)所述的方法，被固定化在上述基板上的除杉变应原以外的变应原为选自由虾、蟹、大豆、花生、荞麦、核桃、牛奶、蛋清、小麦、鸭茅、犬、猫和螨构成的组的变应原中的至少1种变应原。

(3)根据(1)或(2)所述的方法，在同一反应槽中固定化了杉变应原和除杉变应原以外的1种以上变应原的上述基板为微阵列。

(4)根据(1)～(3)中任一项所述的方法，在上述除去工序中，将IgG抗体从体液样本除去。

(5)根据(4)中任一项所述的方法，上述除去工序中的IgG抗体的除去，是通过使固定化了蛋白G的载体吸附IgG抗体而除去来进行的。

(6)根据(1)～(5)中任一项所述的方法，上述检测工序中的变应原与变应原特异性IgE抗体的复合体的检测，是通过使被荧光色素标记的抗IgE抗体与上述复合体反应，检测与复合体结合了的荧光色素而进行的。

(7)根据(1)～(6)中任一项所述的方法，上述体液样本为血液、血清或血浆。

(8)一种用于检测体液样本中的杉变应原特异性IgE抗体的试剂盒，包含变应原微阵列和载体，上述变应原微阵列具备设置了反应槽的基板，上述反应槽包含固定化了杉变应原的区域和固定化了除杉变应原以外的1种以上变应原的区域，上述载体固相化了能够与选自IgG抗体、IgM抗体、IgA抗体和IgD抗体中的至少1种抗体选择性地结合的配体。

(9)根据(8)所述的试剂盒，固相化了能够与上述IgG抗体选择性地结合的配体的载体，是固相化了蛋白G的载体。

发明的效果

通过使预先除去了特异性IgG抗体、IgM抗体、IgA抗体或IgD抗体的体液样本与在同一反应槽中独立地固定化了杉变应原和除杉变应原以外的1种以上变应原的基板接触，从而可以在杉变应原特异性IgE抗体的检测中使检测值提高。

附图说明

图1为显示在本发明的方法中使用的、具有反应槽的基板的例子的图。

图2为显示在本发明的方法中使用的、在反应槽的外缘部设置了间隔壁的基板的例子的图。

图3为在实施例1中使用的、设置了反应槽的基板的概略图。

具体实施方式

作为在本发明中使用的体液样本，可举出全血、血浆、血清、汗、尿、泪液、唾液、吐痰/气道分泌液、母乳、羊水、脑脊髓液、腹水、胸腔积液、关节液、精液、阴道分泌物等，但优选为包含杉变应原特异性IgE抗体的可能性高的血液(全血)、血浆或血清。

从体液样本除去选自IgG抗体、IgM抗体、IgA抗体和IgD抗体中的至少1种抗体的除去工序，可以通过吸附体液样本中的选自IgG抗体、IgM抗体、IgA抗体和IgD抗体中的至少1种抗体(以下，为了方便有时称为“非IgE抗体”)而除去的方法来进行。特别是，IgG抗体由于为在体液样本中含量最多的抗体，因此为了消除与杉变应原特异性IgE抗体的竞争，优选为吸附IgG抗体而除去的形态。另外，也优选为除了IgG抗体以外还除去其它3种非IgE抗体中的至少任一者的形态。

作为吸附抗体而除去的方法，可举出亲和色谱法、离子交换色谱法等色谱法，但从所需时间短考虑优选为亲和色谱。在使用亲和色谱吸附体液样本中的非IgE抗体而除去时，只要使体液样本与固定化了能够与该非IgE抗体选择性地结合的配体的载体接触即可。具体而言，可举出将体液样本通液于填充了上述载体的柱，通过离心分离等将体液样本从载体回收的方法；使体液样本悬浮于上述载体，将该悬浮液离心分离而回收体液样本的方法，但优选为使用填充了上述载体的柱的方法。

在上述亲和色谱中，作为固定化于载体的配体，除了抗IgG抗体、抗IgM抗体、抗IgA抗体、抗IgD抗体这样的抗体以外，还可以使用来源于金黄色葡萄球菌的蛋白A、来源于G型溶血性链球菌的蛋白G、来源于革兰氏阳性厌氧球菌的蛋白L、来源于木菠萝的木菠萝素(Jacalin)等公知的配体。其中，在除去IgG抗体的情况下，从对IgG抗体的选择性地结合力高，便宜，获得容易方面考虑，优选使用蛋白G。

作为上述亲和色谱所使用的载体的材质，可以使用树脂、玻璃、金属、硅晶片等中的任一者，但从表面处理的容易性、大量生产性的观点考虑优选为树脂。作为成为载体的材质的树脂，可举出例如，琼脂糖、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚酯等，但优选为与体液样本中成分的非特异吸附少的琼脂糖。作为将上述配体固定化的载体的形态，可以使用粒子、基板等中的任意者，但在比表面积大、可以使上述配体的固定化量多方面优选为粒子。

上述载体可以购入GEヘルスケア社制等的市售品而使用，也可以购入配体未固定的载体，使所希望的配体固定化而使用。例如，如下述实施例所记载的那样，由于固定化了蛋白G的载体也被市售，因此可以优选使用这样的市售品。

在本发明中，在反应工序中，使抗体除去后的体液样本与设置有反应槽的基板接触，上述反应槽包含固定化了杉变应原的区域和固定化了除杉变应原以外的1种以上变应原的区域。接触的条件可以为在体液样本中的抗体与各固定化变应原之间发生抗原抗体反应的周知的条件，例如，可以通过使体液样本或其稀释物与各固定化变应原在室温～37℃下接触1小时～4小时左右来进行。

将这里使用的基板的一例示于图1中。在基板1中设置作为使体液样本接触的区域的反应槽2。反应槽2相互不重叠而区别地包含固定化了杉变应原的杉变应原固定化区域3、固定化了除杉变应原以外的1种以上变应原的除杉变应原以外的变应原固定化区域4的两区域。即，在本发明中使用的基板在同一反应槽内，体液样本能够与杉变应原和除杉变应原以外的变应原的两种变应原接触。

因此，由仅具有固定化了杉变应原的区域3的反应槽构成的基板、和由仅具有固定化了除杉变应原以外的变应原的区域4的反应槽构成的基板不相当于在本发明中使用的基板。此外，由杉变应原的固定化区域3、与除杉变应原以外的变应原的固定化区域4通过间隔壁而相互被物理地隔开的反应槽构成的基板由于不能使体液样本与杉变应原和除杉变应原以外的变应原的两变应原在同一反应槽接触，因此不相当于在本发明中使用的基板。这里所谓的间隔壁，是指将变应原固定化区域间物理地隔开的、设置在基板上的凸状的结构体。例如，在各孔固定化了不同的变应原的多孔板等，杉变应原的固定化区域与除杉以外的变应原的固定化区域通过间隔壁而被物理地隔开，不相当于在本发明中使用的基板。

抗体除去后的体液样本对反应槽的添加只要以体液样本可以与被固定化在反应槽内的全部变应原接触的方式实施即可，可以将体液样本用磷酸缓冲生理盐水等缓冲液稀释后添加于反应槽，也可以不将体液样本稀释而添加于反应槽。

在反应槽的内部中，只要体液样本可以与被固定化于反应槽的全部变应原接触，就可以设置流路等凹型的结构体。此外，如图2那样，为了在反应工序中抑制体液样本向反应槽的外部漏出，通过在反应槽的外缘部设置间隔壁5等结构体，从而可以将上述反应槽与其外部物理地隔开。

作为上述反应槽的内部和外缘部的加工方法，可举出使用钻或激光等将基板进行切削加工的方法、将在成型基板时使用的模具进行切削加工而进行注射成型、压缩成型、真空成型的方法等，但从品质的稳定性、大量生产的容易性考虑，更优选为将模具进行切削加工的上述方法。

作为具有上述反应槽的基板的具体形态，可举出变应原在2维上被固定化了的变应原微阵列、变应原被固定化在微细的流路中的微流路器件等，但优选为体液样本与被固定化于同一反应槽的全部变应原接触容易的变应原微阵列。

杉变应原和除杉变应原以外的1种以上变应原对反应槽的固定化可以通过使用点样装置将微量的变应原溶液点样于反应槽表面的方法、使包含各变应原的变应原溶液以互相不混合的方式与反应槽表面接触的方法等来进行。

固定化变应原对反应槽的结合可以为物理吸附也可以为共价键，但从抑制基板洗涤时变应原从基板的剥离、溶出的观点考虑期望为共价键。

作为将变应原通过共价键而固定化于反应槽的方法，可以使用使存在于变应原表面的氨基、羧基、羟基等官能团对存在于反应槽的表面的官能团进行反应而使共价键形成的方法。在基板为后述树脂制的情况下，作为存在于反应槽的表面的官能团，可举出氨基、羧基、异硫氰酸酯基等，作为共价键的样式，可以为酰胺键、硫脲键、醚键等中的任一者，但从键形成的容易性和牢固性的观点考虑优选为酰胺键。采用酰胺键的结合例如可以通过使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)那样的琥珀酰亚胺化合物、和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺那样的碳二亚胺化合物通过周知的方法来进行(参照下述实施例)。

固定化于杉变应原的固定化区域所存在的反应槽的区域的、除杉变应原以外的变应原，优选为选自虾、蟹、大豆、花生、荞麦、核桃、牛奶、蛋清、小麦、鸭茅、犬、猫和螨中的至少1种。优选将它们之中的3种以上、进一步优选为4种以上变应原固定化。各变应原可以购入GREER社制品等的市售品，溶解于磷酸缓冲生理盐水等缓冲液后作为变应原溶液而使用，也可以调制包含所希望的变应原的溶液。作为变应原溶液的调制方法，可以使用例如，可以将变应原原料供于使用了混合磨等的粉碎处理、或使用醚、丙酮、己烷等有机溶剂而供于脱脂处理，在磷酸缓冲生理盐水等缓冲液中搅拌而提取变应原，将该离心上清液调制为适当的变应原浓度而使用。

作为在本发明中使用的基板的材质，可以为例如，树脂、玻璃、金属、硅晶片中的任一者，从表面处理的容易性、大量生产性的观点考虑优选为树脂。

作为成为基板的材质的树脂，可举出例如，聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚酯等，优选为聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯。其中，作为聚甲基丙烯酸酯，可举出例如，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲基丙烯酸乙酯(PEMA)或聚甲基丙烯酸丙酯等聚甲基丙烯酸烷基酯(PAMA)，但优选为PMMA。

在本发明中，杉变应原特异性IgE抗体的检测只要使除去了非IgE抗体后的体液样本与上述基板上的反应槽接触，洗涤反应槽而除去了未结合物后，检测变应原与变应原特异性IgE抗体的复合体即可。

检测变应原与变应原特异性IgE抗体的复合体的方法本身是周知的，可举出例如，采用以由结合引起的折射率差作为检测原理的表面等离子共振法、以共振频率差作为检测原理的石英晶体微天平法等的检测法，使用被荧光物质(荧光色素)、生成发色/发光物质的酶、放射性同位素元素等标记了的抗IgE抗体的方法。它们之中，从操作的容易性和安全性考虑，优选为使用被荧光物质标记了的抗IgE抗体而检测的方法。该情况下，使被荧光物质标记了的抗IgE抗体与上述复合体反应，洗涤后，检测与复合体结合了的荧光色素。

本发明的其它方案是是用于检测体液样本中的杉变应原特异性IgE抗体的试剂盒，该试剂盒包含变应原微阵列和载体作为构成品，上述变应原微阵列具备设置了反应槽的基板，上述反应槽包含固定化了杉变应原的区域和固定化了除杉变应原以外的1种以上变应原的区域，上述载体固相化了能够与选自IgG抗体、IgM抗体、IgA抗体和IgD抗体中的至少1种抗体选择性地结合的配体(例如固相化了蛋白G作为能够与IgG抗体选择性地结合的配体的载体)。该基板与在上述本发明的杉变应原特异性IgE抗体的检测方法中使用的基板同样，在反应槽内包含固定化了杉变应原和除杉变应原以外的1种以上变应原的各区域。固相化了能够与这些抗体选择性地结合的配体(例如，蛋白G)的载体在上述本发明的杉变应原特异性IgE抗体的检测方法中的从体液样本除去该抗体(例如，IgG抗体)的除去工序中使用。

在本发明的体液样本中的杉变应原特异性IgE抗体的检测试剂盒中，作为上述以外的构成品，可以包含被荧光物质(荧光色素)、生成发色/发光物质的酶、放射性同位素元素等标记了的抗IgE抗体、标准试样、稀释液、洗涤液、反应停止液等。上述各构成试剂可以为悬浮液、溶液、或冷冻干燥品的形态。此外，可以包含该试剂盒的测定/分析所需要的装置和软件、导入了该软件的计算机、该试剂盒的使用方法、说明规程的说明书等。

实施例

以下显示实施例，但本发明不受这些实施例限定。

实施例1

使用了固定化了杉、虾、蟹、大豆、花生和荞麦变应原的微阵列的、除去了IgG抗体的人血清样本的杉变应原特异性IgE抗体的检测

(1)NHS酯化PMMA制基板的制作

将图3所示那样的、设置了反应槽(12.5mm×10mm×0.15mm)的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)制的基板(75mm×25mm×1.0mm)在10N的氢氧化钠水溶液中在70℃下浸渍了15小时。接着，按照纯水、0.1N HCl水溶液、纯水的顺序进行了洗涤。将基板表面的PMMA的侧链水解，生成了羧基。

接着，使N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)100mg、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)350mg溶解于2-吗啉代乙烷磺酸一水合物(MES)缓冲液(用0.1N氢氧化钠调整为pH5.0)400mL。在它们的混合溶液中浸渍上述水解后的PMMA制基板，用微搅拌器搅拌1小时，获得了被NHS酯化了的PMMA制基板。

(2)变应原溶液的调制

杉变应原作为0.2mg/mL的磷酸缓冲生理盐水溶液由林原社获得，直接用于以后的工序。虾、蟹、大豆、花生、荞麦的各变应原作为冷冻干燥粉末由GREER社获得，将各冷冻干燥粉末利用纯水以蛋白质浓度成为1.0mg/mL的方式溶解，在以后的工序中作为变应原溶液而使用。

(3)变应原固定化微阵列的制作

将在(2)中调制的杉、虾、蟹、大豆、花生、荞麦的各变应原溶液使用点样用机器人(日本レーザー電子(株)，GTMASStamp-2)分别点样在上述制作的NHS酯化PMMA树脂基板的1个反应槽内。接着，将该基板加入到密闭了的塑料容器中，在37℃、湿度100％的条件下孵育一晚，将各变应原固定化于反应槽表面。在孵育后，用磷酸缓冲生理盐水(0.05％Tween20(商品名))洗涤基板。如以上那样操作而获得了杉、虾、蟹、大豆、花生和荞麦的各变应原分别被固定化在同一反应槽内的微阵列。

(4)IgG抗体从人血清的除去(除去工序)

将蛋白G固定化载体的悬浮液(ProteinG Sepharose 4Fast Flow)(GEヘルスケアライフサイエンス社)在旋转柱(MoBiTec社制)中分注50μL后，通过离心分离(1500G，1分钟)将悬浮液的液体成分从载体分离除去，在柱上使载体干燥。

在如以上那样操作而调制出的蛋白G固定化载体柱中，作为体液样本使人血清20μL滴加、渗透，在室温下静置30分钟，使样本中的IgG抗体吸附于蛋白G。将该柱放置于1.5mLEppendorf管上，通过离心分离(1500G，1分钟)，将人血清从柱转移到1.5mL Eppendorf管中，与载体分离，获得了除去了IgG抗体的人血清样本。

(5)人血清对变应原固定化微阵列的接触(反应工序)

将在(4)中获得的除去了IgG抗体的人血清样本用磷酸缓冲生理盐水稀释为3倍，将该稀释液50μL滴加到在(3)中制作的基板的反应槽中，盖上间隙盖玻片(松波硝子工业株式会社制：24mm×25mm，间隙尺寸20μm)而进行了密封。在37℃下使其反应2小时后，取下间隙盖玻片，用磷酸缓冲生理盐水(0.05％Tween20(商品名))洗涤了基板。

(6)杉变应原特异性IgE抗体的检测(检测工序)

将Dylight-650色素标记抗人IgE山羊多克隆抗体(Novus biologicals社制)1.0mg/mL溶液用包含牛血清白蛋白1重量％的磷酸缓冲生理盐水(0.05％Tween20(商品名))进行了1000倍稀释，将所得的稀释液50μL滴加到在(5)中与人血清接触了的基板的反应槽中，盖上间隙盖玻片而在室温下使其反应1小时。然后，取下间隙盖玻片，用磷酸缓冲生理盐水(0.05％Tween20(商品名))洗涤了基板。

在“‘3D Gene’(注册商标)Scanner”(東レ株式会社)放置基板，在设定为激发光635nm、激光输出100％、PMT30的状态下，荧光检测了杉变应原固定化区域。将其荧光强度示于表1中。这里检测到的荧光来源于结合于杉变应原与杉变应原特异性IgE抗体的复合体的标记抗体所包含的荧光色素，杉变应原特异性IgE抗体对变应原固定化微阵列的结合量越多则显示越高的检测值。

比较例1

作为实施例1的对照实验，在实施例1的(4)中，不进行IgG抗体从血清样本的除去工序，除此以外，与实施例1同样地操作，实施了人血清样本的杉变应原特异性IgE抗体的检测。将荧光强度的测定结果示于表1中。

实施例2

使用了固定化了杉、核桃、牛奶、蛋清和小麦变应原的微阵列的、除去了IgG抗体的人血清样本的杉变应原特异性IgE抗体的检测

在实施例1的(2)、(3)中，作为除杉变应原以外的变应原，使用了核桃、牛奶、蛋清和小麦的变应原(GREER社)，除此以外，与实施例1同样地操作，实施了人血清样本的杉变应原特异性IgE抗体的检测。将荧光强度的测定结果示于表1中。

比较例2

作为实施例2的对照实验，在实施例2中，不进行IgG抗体从血清样本的除去工序，除此以外，与实施例2同样地操作，实施了人血清样本的杉变应原特异性IgE抗体的检测。将荧光强度的测定结果示于表1中。

实施例3

使用了固定化了杉、鸭茅、犬、猫和螨变应原的微阵列的、除去了IgG抗体的人血清样本的杉变应原特异性IgE抗体的检测

在实施例1的(2)、(3)中，作为除杉变应原以外的变应原，使用了鸭茅、犬、猫和螨的变应原(GREER社)，除此以外，与实施例1同样地操作，实施了人血清样本的杉变应原特异性IgE抗体的检测。将荧光强度的测定结果示于表1中。

比较例3

作为实施例3的对照实验，在实施例3中，不进行IgG抗体从血清样本的除去工序，除此以外，与实施例3同样地操作，实施了人血清样本的杉变应原特异性IgE抗体的检测。将荧光强度的测定结果示于表1中。

比较例4

使用了固定化了杉变应原的微阵列的、除去了IgG抗体的人血清样本的杉变应原特异性IgE抗体的检测

在实施例1的(2)、(3)中，不使用除杉变应原以外的变应原，除此以外，与实施例1同样地操作，实施了人血清样本的杉变应原特异性IgE抗体的检测。将荧光强度的测定结果示于表1中。

比较例5

作为实施例4的对照实验，在实施例4中，不进行IgG抗体从血清样本的除去工序，除此以外，与实施例4同样地操作，实施了人血清样本的杉变应原特异性IgE抗体的检测。将荧光强度的测定结果示于表1中。

表1

杉变应原固定化微阵列

在实施例1～3的使用了实施了IgG抗体的除去的人血清的情况下，其荧光强度检测值与对应的比较例1～3的使用了IgG未实施抗体的除去的人血清的情况相比，显示高值。推测是将作为抑制杉变应原与杉变应原特异性IgE抗体的复合体形成的抑制物质的IgG抗体从人血清除去了的结果、杉变应原特异性IgE抗体对被固定化于微阵列的杉变应原的结合的效率改善了的结果。

另一方面，使用仅固定化了杉变应原的基板，使用了实施了IgG抗体的除去的人血清的比较例4中，与使用了未实施IgG抗体的除去的人血清的比较例5相比不显示高值。表明了即使从人血清除去IgG抗体，杉变应原特异性IgE抗体对杉变应原的结合效率也不改善。

仅在使用了固定化了杉变应原和除杉变应原以外的1种以上变应原的基板的实施例1、2、3中，观察到由IgG抗体除去带来的杉变应原特异性IgE抗体的结合效率的改善，因此推测在使人血清与反应槽接触时，在反应槽中与杉变应原共存的除杉变应原以外的固定化变应原与IgG抗体除去协同而使杉变应原特异性IgE抗体对杉变应原的结合效率改善。

可知为了不受由特异性IgG抗体的竞争引起的妨碍而检测杉变应原特异性IgE抗体，需要使用共存地被固定化了杉变应原和除杉变应原以外的变应原的反应槽。

比较例6

使用了杉变应原固定化96孔微孔板的、除去了IgG抗体的人血清样本的杉变应原特异性IgE抗体的检测

(1)杉变应原溶液的调制

杉变应原作为0.2mg/mL的磷酸缓冲生理盐水溶液由林原社获得，利用磷酸缓冲生理盐水稀释为10倍，作为终浓度0.02mg/mL的杉变应原溶液而调制。

(2)杉变应原的固定化96孔微孔板的制作

对聚苯乙烯制96孔微孔板(WATSON社制)，每1孔添加在(1)中调制的杉变应原溶液50μL，在4℃下静置了16小时。丢弃孔内的溶液，在同一孔中添加包含1重量％牛血清白蛋白的磷酸缓冲生理盐水200μL，在室温下静置了2.5小时。将同一孔用磷酸缓冲生理盐水(0.05％Tween20(商品名))进行了洗涤。如以上那样操作，获得了杉变应原被固定化于各孔的微孔板。

(3)人血清对杉变应原固定化微孔板的接触

与实施例1的(4)同样地操作，调制出除去了IgG抗体的人血清样本。

将该人血清样本用包含牛血清白蛋白1重量％的磷酸缓冲生理盐水进行3倍稀释，将该稀释液以每1孔50μL添加在固定化了杉变应原的微孔板的孔中，在37℃下静置了2小时。将同一孔用磷酸缓冲生理盐水(0.05％Tween20(商品名))进行了洗涤。

(4)杉变应原特异性IgE抗体的检测

将辣根过氧化物酶标记抗人IgE山羊多克隆抗体(SouthernBiotech社制)1.0mg/mL溶液，用包含牛血清白蛋白1重量％的磷酸缓冲生理盐水(0.05％Tween20(商品名))进行5000倍稀释，将该稀释液50μL添加于固定化了杉变应原的孔中，在37℃下静置了1小时。将同一孔用磷酸缓冲生理盐水(0.05％Tween20(商品名))进行了洗涤。将TMB One ComponentHRP Microwell Substrate(コスモバイオ社)50μL添加到同一孔中，在室温下静置了15分钟。将1mol/mL硫酸水溶液50μL添加在同一孔中，利用酶标仪(モレキュラーデバイス社制)测定了450nm波长的吸光度。将其结果示于表2中。

比较例7

作为比较例6的对照实验，在比较例6的(3)中，不进行IgG抗体从血清样本的除去，除此以外，与比较例6同样地操作，使用杉变应原固定化96孔微孔板，实施了人血清的杉变应原特异性IgE抗体的检测。将其结果示于表2中。

表2

杉变应原固定化96孔微孔板

	IgG除去工序	吸光度测定值
			比较例6	有	3.23
比较例7	无	3.40

表2显示在比较例6、比较例7中实施了的、采用杉变应原固定化96孔微孔板的杉变应原特异性IgE抗体的检测结果。这里检测到的吸光来源于结合于杉变应原与杉变应原特异性IgE抗体的复合体的标记抗体所包含的、通过辣根过氧化物酶而被氧化了的TMB底物，杉变应原特异性IgE抗体对杉变应原固定化96孔微孔板的结合量越多则显示越高的检测值。

与使用了仅固定化了杉变应原的微阵列的比较例4、5同样地，在使用了仅固定化了杉变应原的96孔微孔板的比较例6、7中，使用了实施了IgG抗体的除去的人血清的比较例6也与使用了未实施IgG抗体的除去的人血清的比较例7相比不显示高值。表明了在使用了96孔微孔板的情况下，也即使从人血清除去IgG抗体，杉变应原特异性IgE抗体对杉变应原的结合效率也不改善。

符号的说明

1 基板

2 反应槽

3 杉变应原的固定化区域

4 除杉变应原以外的变应原的固定化区域

5 间隔壁。

Claims (9)

1.一种检测体液样本中的杉变应原特异性IgE抗体的方法，该方法包括下述工序：

除去工序，从体液样本除去选自IgG抗体、IgM抗体、IgA抗体和IgD抗体中的至少1种抗体；

反应工序，使在所述除去工序中获得的抗体除去后的体液样本、与设置有反应槽的基板的该反应槽接触，使变应原与变应原特异性IgE抗体的复合体形成，所述反应槽包含固定化了杉变应原的区域和固定化了除杉变应原以外的1种以上变应原的区域；以及

检测工序，检测在所述反应工序中获得的杉变应原与杉变应原特异性IgE抗体的复合体。

2.根据权利要求1所述的方法，被固定化在所述基板上的除杉变应原以外的变应原为选自由虾、蟹、大豆、花生、荞麦、核桃、牛奶、蛋清、小麦、鸭茅、犬、猫和螨构成的组的变应原中的至少1种变应原。

3.根据权利要求1或2所述的方法，在同一反应槽中固定化了杉变应原和除杉变应原以外的1种以上变应原的所述基板为微阵列。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，在所述除去工序中，将IgG抗体从体液样本除去。

5.根据权利要求4所述的方法，所述除去工序中的IgG抗体的除去，是通过使固定化了蛋白G的载体吸附IgG抗体而除去来进行的。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，所述检测工序中的变应原与变应原特异性IgE抗体的复合体的检测，是通过使被荧光色素标记的抗IgE抗体与所述复合体反应，检测与复合体结合了的荧光色素而进行的。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，所述体液样本为血液、血清或血浆。

8.一种用于检测体液样本中的杉变应原特异性IgE抗体的试剂盒，包含变应原微阵列和载体，

所述变应原微阵列具备设置了反应槽的基板，所述反应槽包含固定化了杉变应原的区域和固定化了除杉变应原以外的1种以上变应原的区域，

所述载体固相化了能够与选自IgG抗体、IgM抗体、IgA抗体和IgD抗体中的至少1种抗体选择性地结合的配体。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，固相化了能够与所述IgG抗体选择性地结合的配体的载体，是固相化了蛋白G的载体。

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