JPS6212857A - 逆受身赤血球凝集反応用ヒトフエリチン測定試薬 - Google Patents
逆受身赤血球凝集反応用ヒトフエリチン測定試薬Info
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- JPS6212857A JPS6212857A JP14998685A JP14998685A JPS6212857A JP S6212857 A JPS6212857 A JP S6212857A JP 14998685 A JP14998685 A JP 14998685A JP 14998685 A JP14998685 A JP 14998685A JP S6212857 A JPS6212857 A JP S6212857A
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- Japan
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- human ferritin
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- red cells
- blood cells
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は抗ヒトフェリチンモノクローナル抗体を用いた
、逆受身赤血球凝集反応用ヒトフェリチン測定試薬及び
当該試薬をキット化したものに関する。
、逆受身赤血球凝集反応用ヒトフェリチン測定試薬及び
当該試薬をキット化したものに関する。
フェリチンは、肝臓、肺臓、骨髄、小腸粘膜などに存在
する分子量約４６万の鉄を含んだ複答タンツク質で、生
体内の鉄の吸収と肝臓に関係している。
する分子量約４６万の鉄を含んだ複答タンツク質で、生
体内の鉄の吸収と肝臓に関係している。
血清７エリチンは、急性骨髄性白血病、肺癌、肺癌、肝
癌等で高値を示し、腫瘍マーカーとしての利用が考えら
れている。しかしながらその値が生体内の貯臓鉄を反映
し、輸血の有無や出血の伴う癌疾患等種々の要因で変動
するため、血清フェリチンを単独のマーカーとして腫瘍
の確定診断に用いるには難がある。そこで他の腫瘍マー
カーとの組合わせによる補助診断薬としてその利用が期
待される。
癌等で高値を示し、腫瘍マーカーとしての利用が考えら
れている。しかしながらその値が生体内の貯臓鉄を反映
し、輸血の有無や出血の伴う癌疾患等種々の要因で変動
するため、血清フェリチンを単独のマーカーとして腫瘍
の確定診断に用いるには難がある。そこで他の腫瘍マー
カーとの組合わせによる補助診断薬としてその利用が期
待される。
すでにフェリチンの定量法としてＲＩＡ法や酵素抗体法
が臨床的に用いられているが、これら方法は、取扱いが
煩雑であるという欠点がある。従って、本発明の第１の
目的は、取扱いが簡便なヒトフェリチン測定試薬を提供
することにある。本発明の第２の目的は、精度の高いヒ
トフェリチン測定試薬を提供することにある。
が臨床的に用いられているが、これら方法は、取扱いが
煩雑であるという欠点がある。従って、本発明の第１の
目的は、取扱いが簡便なヒトフェリチン測定試薬を提供
することにある。本発明の第２の目的は、精度の高いヒ
トフェリチン測定試薬を提供することにある。
本発明の目的は、抗ヒトフェリチンモノクローナル抗体
を動物赤血球に感作して得た抗ヒトフエリチンモノクロ
ーナル抗体感作赤血球を含むことを特徴とする、逆受身
赤血球凝集反応用ヒトフェリチン測定試薬によシ達成さ
れる。
を動物赤血球に感作して得た抗ヒトフエリチンモノクロ
ーナル抗体感作赤血球を含むことを特徴とする、逆受身
赤血球凝集反応用ヒトフェリチン測定試薬によシ達成さ
れる。
本発明に係る測定用試薬は、各試薬をキット化しておく
ことが便宜的であるので、以下キット化されたものを例
として本発明を説明する。
ことが便宜的であるので、以下キット化されたものを例
として本発明を説明する。
本発明をキット化した場合、次のごとき各試薬にて構成
される。即ち、（イ）抗ヒトフェリチンモノクローナル
抗体を動物赤血球に感作して得た抗ヒトフェリチンモノ
クローナル抗体感作赤血球（以下、感作赤血球という。
される。即ち、（イ）抗ヒトフェリチンモノクローナル
抗体を動物赤血球に感作して得た抗ヒトフェリチンモノ
クローナル抗体感作赤血球（以下、感作赤血球という。
）、（ロ）緩衝液、（・・）標準ヒトフェリチン陽性コ
ントロール（以下、陽性コントロールという。）及びに
）標準ヒトフェリチン陰性コントロール（以下、陰性コ
ントロールという。）の組み合わせにて当該キットは構
成される。陰性コントロールは緩衝液で代用することも
できる。
ントロール（以下、陽性コントロールという。）及びに
）標準ヒトフェリチン陰性コントロール（以下、陰性コ
ントロールという。）の組み合わせにて当該キットは構
成される。陰性コントロールは緩衝液で代用することも
できる。
モノクローナル抗体の製造には、細胞融合法、形質転換
法が採用される。
法が採用される。
細胞融合法は自体既知の手段にて行われ、その−例は増
殖性を持った細胞と、目的とする抗体を産生じているリ
ンパ球とをポリエチレングリコールの存在下で反応せし
めることによル、増殖性と抗体産生能とをかねそなえた
細胞を裂するもので、この細胞の産生ずる抗体は一個の
抗原決定基に対してのみ反応する単一の抗体である。
殖性を持った細胞と、目的とする抗体を産生じているリ
ンパ球とをポリエチレングリコールの存在下で反応せし
めることによル、増殖性と抗体産生能とをかねそなえた
細胞を裂するもので、この細胞の産生ずる抗体は一個の
抗原決定基に対してのみ反応する単一の抗体である。
増殖性を持った細胞として、例えばミエローマ細胞を抗
体産生リン、６球として、例えば、牌などの網内系細胞
を用いる。これらよシヒト７エリチンのモノクローナル
抗体が製造される。
体産生リン、６球として、例えば、牌などの網内系細胞
を用いる。これらよシヒト７エリチンのモノクローナル
抗体が製造される。
抗ヒト７工リチンモノクローナル抗体を感作させる赤血
球は、特に動物種を選ぶ必要はないが、安定でしかも感
度の高い試薬を作るためにはそルモット、ウサギ、ヒツ
ジ、ニワトリ、馬、ヤギ、ヒトの０型赤血球などが望ま
しい。赤血球は生理食塩水で充分洗浄した後、ゲルター
ル・アルデヒド、ホルマリン等の処理で安定化させる。
球は、特に動物種を選ぶ必要はないが、安定でしかも感
度の高い試薬を作るためにはそルモット、ウサギ、ヒツ
ジ、ニワトリ、馬、ヤギ、ヒトの０型赤血球などが望ま
しい。赤血球は生理食塩水で充分洗浄した後、ゲルター
ル・アルデヒド、ホルマリン等の処理で安定化させる。
このような赤血球は約２０μ以下、特に５〜１５μｍ程
度のものが良い。精裏抗体でこれらの赤血球を感作する
のは公知の方法（医学のあゆみ、７８、７５９ （１９
７０））で実施することが出来る。
度のものが良い。精裏抗体でこれらの赤血球を感作する
のは公知の方法（医学のあゆみ、７８、７５９ （１９
７０））で実施することが出来る。
それには、赤血球と抗体とを緩衝液中で感作させるのが
よく、一般には赤血球浮遊液と抗体含有液を混合するこ
とによシ行う。
よく、一般には赤血球浮遊液と抗体含有液を混合するこ
とによシ行う。
本操作は、ｐＨ３〜１０、温度θ℃〜６０℃で行うのが
よい。感作赤血球は凍結乾燥して、例えばバイアル中に
、好ましくはナトリウムアジド等のごとき保存剤を添加
して、封入しておくことが好ま°しい。
よい。感作赤血球は凍結乾燥して、例えばバイアル中に
、好ましくはナトリウムアジド等のごとき保存剤を添加
して、封入しておくことが好ま°しい。
本発明に関する陽性コントロールは、標準検量線を作成
するために用いられるものであシ、通常はヒトフエリチ
／を含有する溶液よシなるものである。
するために用いられるものであシ、通常はヒトフエリチ
／を含有する溶液よシなるものである。
陽性コントロールは、たとえばバイアル中に、好ましく
はナトリウムアジドなどの保存剤を添加して封入してお
く。
はナトリウムアジドなどの保存剤を添加して封入してお
く。
陰性コントロールは抗ヒト７工リチン抗体及びヒトフェ
リチンが共に陰性の液体（たとえば、生理食塩水など）
よりなり、’、／とえはバイアル中に、好ましくはナト
リウムアジドなどの保存剤を添加しておくととが好まし
い。
リチンが共に陰性の液体（たとえば、生理食塩水など）
よりなり、’、／とえはバイアル中に、好ましくはナト
リウムアジドなどの保存剤を添加しておくととが好まし
い。
緩衝液は、感作赤血球の懸濁および、陽性コントロール
、陰性コントロール、検体を希釈するために用いられる
もので６．Ｄ、たとえばリン酸緩衝液からなシ、非特異
的反応の生じるのを防止するために、たとえばストロー
マ、動物血清などを添加してもよい。また、たとえばナ
トリウムアジドなどの保存剤を添加しておくことが好ま
しい。
、陰性コントロール、検体を希釈するために用いられる
もので６．Ｄ、たとえばリン酸緩衝液からなシ、非特異
的反応の生じるのを防止するために、たとえばストロー
マ、動物血清などを添加してもよい。また、たとえばナ
トリウムアジドなどの保存剤を添加しておくことが好ま
しい。
本発明試薬のキットにおいては、さらに赤血球凝集反応
の特異性判定のための確認試薬（以下、確認試薬という
）を組合わせてもよい。確認試薬は任意の抗ヒトフェリ
チンポリクローナル抗体よりなるものである。
の特異性判定のための確認試薬（以下、確認試薬という
）を組合わせてもよい。確認試薬は任意の抗ヒトフェリ
チンポリクローナル抗体よりなるものである。
実施例 １
ヒトフェリチンをＢ Ａ Ｌ Ｃ／Ｃ系マウスに７週間
免疫し、血中抗体価の上昇したことを確認後、その牌細
胞（Ｂ細胞）を採取した。この細胞とマウスミエローマ
細胞であるＰ３−ｘ６３−Ａｇ８・６５３（アメリカ、
１’ＬＯＷ社よシ入手）とポリエチレングリコール＋４
０００存在下で混合し融合せしめた。
免疫し、血中抗体価の上昇したことを確認後、その牌細
胞（Ｂ細胞）を採取した。この細胞とマウスミエローマ
細胞であるＰ３−ｘ６３−Ａｇ８・６５３（アメリカ、
１’ＬＯＷ社よシ入手）とポリエチレングリコール＋４
０００存在下で混合し融合せしめた。
こノ融合細胞の内、ヒト７エリチンに対する抗体を産生
じている細胞を、赤血球凝集反応、酵素免疫反応等の方
法で検査しながら抗ヒトフェリチンモノクローナル抗体
産生株を得た。この細胞株をマウス腹腔内で培養し７〜
１０日目にマウス腹水を分離した。このマウス腹水よシ
精製された免疫グロブリン画分はヒトフェリチンと強く
反応することが上記の方法で確認された。このようにモ
ノクローナル抗体を得、感作用に使用した。
じている細胞を、赤血球凝集反応、酵素免疫反応等の方
法で検査しながら抗ヒトフェリチンモノクローナル抗体
産生株を得た。この細胞株をマウス腹腔内で培養し７〜
１０日目にマウス腹水を分離した。このマウス腹水よシ
精製された免疫グロブリン画分はヒトフェリチンと強く
反応することが上記の方法で確認された。このようにモ
ノクローナル抗体を得、感作用に使用した。
感作のだめの動物赤血球は、ヒツジ赤血球をリン酸緩衝
液で充分に洗浄後、ゲルタールアルデヒドを終濃度０，
５ ％ Ｗ／Ｖに添加して約１時間室温処理し、上記緩
衝液でダルタールアルデヒドヲ除いて固定化赤血球を得
た。
液で充分に洗浄後、ゲルタールアルデヒドを終濃度０，
５ ％ Ｗ／Ｖに添加して約１時間室温処理し、上記緩
衝液でダルタールアルデヒドヲ除いて固定化赤血球を得
た。
５４Ｖ八固定化赤血球の懸濁液と等量のタンニン酸液５
〜２０Ｔ’ｑ／ｄｌｌを添加・攪拌し３７℃で１５分間
放置後生理食塩液で洗浄し、タンニン酸処理血球を得た
。
〜２０Ｔ’ｑ／ｄｌｌを添加・攪拌し３７℃で１５分間
放置後生理食塩液で洗浄し、タンニン酸処理血球を得た
。
５チ■ハ１タンニン酸処理血球の懸濁液と等量の精製抗
ヒト７工リチンモノクローナル抗体溶液を混合し、ｐＨ
７，２，３７℃で１時間放置して感作し抗ヒトフェリチ
ンモノクローナル抗体感作ヒツジ赤血球（以下、感作ヒ
ツジ赤血球という。）を得た。
ヒト７工リチンモノクローナル抗体溶液を混合し、ｐＨ
７，２，３７℃で１時間放置して感作し抗ヒトフェリチ
ンモノクローナル抗体感作ヒツジ赤血球（以下、感作ヒ
ツジ赤血球という。）を得た。
そして、充分にリン酸緩衝液で洗浄した。この感作赤血
球を分注してから凍結乾燥して試薬を得た。
球を分注してから凍結乾燥して試薬を得た。
凍結乾燥後の感作ヒツジ赤血球を動物血清を含有する塩
化ナトリウム含有等張化リン酸緩衝液（ＰＨ７，２）に
２係以上のヒツジ赤血球ストローマを添加したリン酸緩
衝液で０．５係に調整懸濁し、ヒトフェリチンに対する
凝集反応をマイクロプレート法で測定した。検体中に含
有せるヒトフェリチン量の１゜９５μシー°までの測定
は可能であった。
化ナトリウム含有等張化リン酸緩衝液（ＰＨ７，２）に
２係以上のヒツジ赤血球ストローマを添加したリン酸緩
衝液で０．５係に調整懸濁し、ヒトフェリチンに対する
凝集反応をマイクロプレート法で測定した。検体中に含
有せるヒトフェリチン量の１゜９５μシー°までの測定
は可能であった。
実施例 ２ キットの構成
キットを構成している試薬類は、次の５種類である。
■ 感作ヒツジ赤血球：
１バイアルの内容物は、乾燥感作ヒツジ赤血球および保
存剤で■のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）の５４をこれに加え
て懸濁させるとき、０．５４ （Ｖ／Ｖ ）赤血球浮遊
液が得られる。保存剤としてナトリウムアジド１■が添
加されている。
存剤で■のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）の５４をこれに加え
て懸濁させるとき、０．５４ （Ｖ／Ｖ ）赤血球浮遊
液が得られる。保存剤としてナトリウムアジド１■が添
加されている。
■ 陽性コントロール：
１バイアル中、ヒトフェリチン濃度既知の溶液０．５ｄ
ｔ含有する。本溶液のＲＰＨＡ法によるフェリチン量は
１：３２以上である。保存剤としてナトリウムアジド’
（（１，１％ ）が添加されている。
ｔ含有する。本溶液のＲＰＨＡ法によるフェリチン量は
１：３２以上である。保存剤としてナトリウムアジド’
（（１，１％ ）が添加されている。
■ 陰性コントロール：
１バイアル中、抗ヒトフェリチン抗体ならびにヒトフェ
リチンが共に陰性の除菌濾過した生理食塩液１ｄを含有
する。保存剤としてナトリウムアジド＃１■（ｏ、ｉ
ｓ ）が添加されている。
リチンが共に陰性の除菌濾過した生理食塩液１ｄを含有
する。保存剤としてナトリウムアジド＃１■（ｏ、ｉ
ｓ ）が添加されている。
■ リン酸緩衝液：
１ノζイアル中、除菌濾過した塩化ナトリウム加等張リ
ン酸緩衝液、ｐＨ６，５（Ｐ Ｂ Ｓ ） ３０ ｔｘ
ｌを含有する。ＰＢＳには、試験に際して非特異反応の
生じるのを防止するため、可溶化ストローマおよび動物
血清を配合している。
ン酸緩衝液、ｐＨ６，５（Ｐ Ｂ Ｓ ） ３０ ｔｘ
ｌを含有する。ＰＢＳには、試験に際して非特異反応の
生じるのを防止するため、可溶化ストローマおよび動物
血清を配合している。
組成（３〇−中）
リン酸二ナトリウム（無水）２３７ｍ９リン酸−カリウ
ム ９３■塩化ナトリウム
１３５■ストローマ
３係動物血清 １チナト
リウムアンド ３０■、 ＰＨ６
，５ リン酸緩衝液の１０−は感作ヒツジ赤血球の懸濁用に用
いられ、残シは被験液の希釈に用いる。
ム ９３■塩化ナトリウム
１３５■ストローマ
３係動物血清 １チナト
リウムアンド ３０■、 ＰＨ６
，５ リン酸緩衝液の１０−は感作ヒツジ赤血球の懸濁用に用
いられ、残シは被験液の希釈に用いる。
保存剤として上記組成の如くナトリウムアジド０．１
％ （Ｗ／Ｖ）を加えておくことが好ましい。
％ （Ｗ／Ｖ）を加えておくことが好ましい。
■ 特異性判定のための確認試薬二
１バイアル中、除菌濾過した精製抗ヒトフェリチンポリ
クローナル抗体（ＰＨＡ価でに６４以上）を含む凍結乾
燥品である。これをリン酸緩衝液の５ｄで溶解する。
クローナル抗体（ＰＨＡ価でに６４以上）を含む凍結乾
燥品である。これをリン酸緩衝液の５ｄで溶解する。
実施例 ３
実施例２の示した試薬を用いて定量試験を次の通シ実施
した ■ 感作ヒツジ赤血球を、１バイアル当たシリン酸緩衝
液５ｄに懸濁する。
した ■ 感作ヒツジ赤血球を、１バイアル当たシリン酸緩衝
液５ｄに懸濁する。
μｌずつを入れる。Ａ列の混液を上に用いたりイ・リュ
ーθ−でＢ列へ移し、さらにＢ列よＦ）０列へ移し、次
々と順次移して５列までこれを行う。これによシ被験液
は、２倍段階希釈されておシ、５列の希釈倍数は１０２
４倍となっている。
ーθ−でＢ列へ移し、さらにＢ列よＦ）０列へ移し、次
々と順次移して５列までこれを行う。これによシ被験液
は、２倍段階希釈されておシ、５列の希釈倍数は１０２
４倍となっている。
■ 別に被験液の代わシに、陽性コントロールおよヒ陰
性コントロールについても、同様にして希釈系列をつく
る。
性コントロールについても、同様にして希釈系列をつく
る。
■ ドロー９＃ψ−を用い、すべての穴に感作ヒツジ赤
血球のリン酸緩衝液を２５μｌずつ加える。
血球のリン酸緩衝液を２５μｌずつ加える。
■ プレートは、マイクロミキサーで約１０秒間振盪後
、室温で２時間静置する。
、室温で２時間静置する。
■ コントロールの観察
陽性コントローヤについて、通常３２倍希釈以上で凝集
を認める。陰性コントロールはＡ−、ＴΩすべてにおい
て穴の底に赤血球の沈降物を認める（測定が良好な場合
、陰性像は小さく明瞭である）。
を認める。陰性コントロールはＡ−、ＴΩすべてにおい
て穴の底に赤血球の沈降物を認める（測定が良好な場合
、陰性像は小さく明瞭である）。
■ 試験結果
被験液につき、陰性コントロールと比較して凝集像を認
める最高希釈倍数をもってヒトフェリチン価とした。
める最高希釈倍数をもってヒトフェリチン価とした。
ヒトフェリチン含量を精密に定量するには、ヒトフェリ
チンの含量既知溶液、即ち陽性コントロールによシその
希釈倍数と対応する凝集像の直径（簡）を対数グラフに
プロットして標準検量線を作成する。この検量線をもと
に、未知被験液の希釈倍数と、凝集像の直径からヒトフ
ェリチン含量を求める。
チンの含量既知溶液、即ち陽性コントロールによシその
希釈倍数と対応する凝集像の直径（簡）を対数グラフに
プロットして標準検量線を作成する。この検量線をもと
に、未知被験液の希釈倍数と、凝集像の直径からヒトフ
ェリチン含量を求める。
手続補正書
昭和６０年１２月 Ｋ日
Claims (1)
- 抗ヒトフエリチンモノクローナル抗体を動物赤血球に感
作して得た抗ヒトフエリチンモノクローナル抗体感作赤
血球を含むことを特徴とする、逆受身赤血球凝集反応用
ヒトフエリチン測定試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14998685A JPS6212857A (ja) | 1985-07-10 | 1985-07-10 | 逆受身赤血球凝集反応用ヒトフエリチン測定試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14998685A JPS6212857A (ja) | 1985-07-10 | 1985-07-10 | 逆受身赤血球凝集反応用ヒトフエリチン測定試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6212857A true JPS6212857A (ja) | 1987-01-21 |
Family
ID=15486967
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14998685A Pending JPS6212857A (ja) | 1985-07-10 | 1985-07-10 | 逆受身赤血球凝集反応用ヒトフエリチン測定試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6212857A (ja) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54130093A (en) * | 1978-03-30 | 1979-10-09 | Daiichi Radioisotope Lab | Method of measuring ferritin |
| JPS54130094A (en) * | 1978-03-30 | 1979-10-09 | Daiichi Radioisotope Lab | Method of measuring ferritin |
| JPS57196154A (en) * | 1981-05-15 | 1982-12-02 | Morozu Chiyaya | Monochronal antibody |
| JPS59173762A (ja) * | 1983-03-22 | 1984-10-01 | Green Cross Corp:The | 逆受身抗体赤血球凝集反応用試薬 |
| JPS625999A (ja) * | 1985-07-02 | 1987-01-12 | Supeshiaru Refuarensu Lab:Kk | フエリチンに対する新規なモノクロ−ナル抗体 |
-
1985
- 1985-07-10 JP JP14998685A patent/JPS6212857A/ja active Pending
Patent Citations (5)
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| JPS54130093A (en) * | 1978-03-30 | 1979-10-09 | Daiichi Radioisotope Lab | Method of measuring ferritin |
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| JPS625999A (ja) * | 1985-07-02 | 1987-01-12 | Supeshiaru Refuarensu Lab:Kk | フエリチンに対する新規なモノクロ−ナル抗体 |
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