JPS6212860A - 逆受身赤血球凝集反応用測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は抗ヒトアルファフェトプロティン（ＡＦＰ　）
モノクローナル抗体を用いた、ＡＦＰ測定用逆受身赤血
球凝集反応用試薬および当該試薬をキット化したものに
関する。

（従来技術） ＡＦＰは胎児性血清蛋白であシ、このものは胎生期に胎
児肝細胞および卵黄のうで産生され、血中に分泌される
。生後、その産生は停止するが、肝細胞性肝癌およびあ
る種の悪性奇型腫では再びこれを産生ずる。このため血
液のＡＦＰの有無を検出することは、現に広く行われて
いる重要な臨床検査法である。従来、血清中のＡＦＦは
抗ＡＦＰを用いるオフテルロ＝　−（０ｕｃｈｔｅｒｌ
ｏｎｙ）法、マンシーニ（Ｍｏｎｃｌｎｉ）　法、ラジ
オイムノアッセイ法などで判定されて来た。しかしなが
ら、これら従来法は判定に長時間を要し、手技も煩雑で
あった。

そこで本発明者らは先に、ヒトＡＦＰに対す石抗体陽性
の免疫動物由来の血漿又は血清よシ得られる免疫プロブ
リ／から尚該動物に特有の免疫プロプリンを除去して得
たヒ）ＡＦＰに対する特異抗体によって感作され次赤血
球を含む逆受身抗体赤血球凝集反応用試薬を完成し、実
用化に供している（特開昭５９−１７３７６２号）。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は、先に完成した発明の改良であｐ、ポリクロー
ナル抗体を用いた場合には克服不可能であった高度の抗
原との反応特異性をモノクローナル法を用いることによ
シ、実現可能としたものである。

すなわち、本発明の目的は、よシ信頼性が高く、高感度
かつ高精度で容易にと）ＡＦＰの検出、定量が可能な逆
受身赤血球凝集反応用試薬を提供することにある。

（問題点を解決するための手段） 本発明の目的は、抗原認識部位の異なる、少なくとも二
種以上の抗ヒ）ＡＦＰモノクローナル抗体を動物赤血球
に感作して得た抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体感作赤
血球を含むことを特徴とする、逆受身赤血球凝集反応用
測定試薬により達成される。

本発明に係る測定用試薬は、各試薬をキット化しておく
ことが便宜的であるので、以下キット化されたものを例
として本発明を説明する。

本発明をキット化した場合、次のごとき各試薬にて構成
される。即ち、（イ）抗原認識部位の異なる、複数種の
抗ヒ）ＡＦＰモノクローナル抗体を動物赤血球に感作し
て得念抗ヒ）ＡＦＰモノクローナル抗体感作赤血球（以
下、感作赤血球という。）、（ロ）緩衝液、及び（ハ）
標準ヒトＡＦＰ陽性コントロール（以下、陽性コントロ
ールという。）及びに）標準ヒトＡＦＰ陰性コントロー
ル（以下、陰性コントロールという。）の組み合わせに
て当該キットは構成される。陰性コントロールは緩衝液
で代用することもできる。

（感作赤血球） 感作赤血球は、抗原認識部位の異なる、少なくとも二種
類以上の抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を動物赤血球
に感作させた感作赤血球からなる。

モノクローナル抗体の製造には、細胞融合法、形質転換
法が採用される。

細胞融合法は自体既知の手段にて行われ、その−例は増
殖性を持った細胞と、目的とする抗体を産生じているリ
ンパ球とをポリエチレングリコールの存在下で反応せし
めることにより、増殖性と抗体産生能とをかねそなえた
細胞を製するもので、この細胞の産生ずる抗体は一個の
抗原決定基に対してのみ反応する単一の抗体である。

増殖性を持った細胞として、例えばミエローマ細胞を、
抗体産生リンパ球として、例えば牌などの網内系細胞を
用いる。これらよシヒトＡＦＰのモノクローナル抗体が
製造される。これらモノクローナル抗体のサブクラスは
工ｇＧ１でアシ、後記実施例の方法にて抗原認識部位の
異なるモノクローナル抗体を選択した。

本願の複数種の抗ヒ）ＡＦ’Ｐモノクローナル抗体を感
作させる赤血球は、特に動物種を選ぶ必要は゛ないが、
安定でしかも感度の高い試薬を作るためにはモルモット
、ウサギ、ヒツジ、ニワトリ、馬、ヤギ又は、ヒトのＯ
型赤血球などが望ましい。

赤血球は生理食塩水で充分洗浄した後、ゲルタール・ア
ルデヒド、ホルマリン等の処理で安定化させる。

このような赤血球は約２０μ以下、特に５〜１５μｍ程
度のものが良い。精製抗体でこれらの赤血球を感作する
のは公知の方法（医学のあゆみ。

ｙ　ｓ、ｙ　ｓ　９（１９７０）　）テ実施ｉルコｔ：
ＡＥ出来る。

それには、赤血球と抗体とを緩衝液中で感作させるのが
よく、一般には赤血球浮遊液と抗体含有液を混合するこ
とによシ行う。

本操作は、ｐＨ４〜１０、温度０〜６０℃で行うのがよ
い。感作赤血球は凍結乾燥して、例えばバイアル中に、
好ましくはナトリウムアジド等のごとき保存剤を添加し
て、封入しておくことが好ましい。

本発明に関する陽性コントロールは、標準検量線を作成
するために用いられるものであシ、通常はヒ）ＡＦＰ含
有の凍結乾燥品よりなるものである。

陽性コントロールであるヒ）ＡＦＰは緩衝液に溶解して
使用され、小分けして標準検量線の作成に使用される。

陽性コントロールは、たとえばバイアル中に、好ましく
はナトリウムアジドなどの保存剤を添加して封入してお
く。

陰性コントロールは抗ヒ）ＡＦＰ抗体及びヒトＡＦＰが
共に陰性の液体（たとえば、生理食塩水など）よりなシ
、たとえばバイアル中に、好ましくはナトリウムアジド
などの保存剤を添加しておくことが好ましい。又、欠配
の緩衝液と同一組成でも良い。

緩衝液は、感作赤血球、陽性コントロール、陰性コント
ロールおよび被、］験液を希釈するために用いられるも
のであシ、たとえばリン酸緩衝液からなり、非特異的反
応の生じるのを防止するために、たとえばストローマ、
動物血清などを添加してもよい。また、たとえばナトリ
ウムアジドなどの保存剤を添加しておくことが好ましい
。

本発明試薬のキットにおいては、さらに赤血球凝集反応
の特異性判定のための確認試薬（以下、確認試薬という
。）を組合わせてもよい。確認試薬は任意の抗ヒトＡＦ
：ｐポリクローナル抗体あるいは、正常マウスエｇａ　
感作赤血球（対照血球）よりなるものである。

実施例１ ヒトＡＦＰをＢ　Ａ　Ｉ、　ａ　／　ｃ系マウスに８週
間免疫し、血中抗体価の上昇したことを確認後、その肺
細胞（Ｂ細胞）を採取した。この細胞とマウスミエロー
マｄ胞であるＰ３Ｕ−１（アメリカ、ＦＩＯＷ社より入
手）とポリエチレングリコール１１１４，０００存在下
で混合し融合せしめた。この融合細胞の内、ヒ）ＡＦＰ
に対する抗体を産生じている細胞を、赤血球凝集反応、
酵素免疫反応、及び中和抗体反応等の方法で検査しなか
ら抗ヒ）ＡＦＰ抗体産生株５株（Ａ８、Ａ４、Ｋ２、Ｋ
１０およびＣ６）を得た。これらの産生株より産生させ
るモノクローナル抗体を２者ずつ組み合わせて感作させ
た赤血球を用いてヒ）ＡＦＰとの反応性を調べた（第１
表）。

第１表 なお、表中、「＋」は強い凝集、「Δ」は弱い凝集が起
きたことを示し、「−」は非凝集であることを示す。

この結果、これら５ｓの細胞株は、Ａ８、Ａ４、Ｋ２と
いうグループとＥｌｏ、Ｃ３というグループの２種類に
分類される。

そこで、抗原認識部位の異なるモノクローナル抗体を産
生可能な細胞株として、Ａ８およびＫｉＯを選択した。

この２種の細胞株を各々別々にマウス腹腔内で培養し７
〜１０日目にマウス腹水を分離した。このマウス腹水は
ヒトＡＦＰの活性を強く阻害した。

このように２種のモノクローナル抗体を得、感作用に使
用した。

感作のための動物赤血球は、ヒツジ赤血球をリン酸緩衝
液で充分に洗浄後、ゲルタールアルデヒドを終濃度０．
５％Ｗ　／　Ｖに添加して約１時間室温処理し、上記緩
衝液でゲルタールアルデヒドを除いて固定化赤血球を得
た。

５％Ｗ　／　Ｖ羊固定化赤血球懸濁液にタンニン酸液（
１ａｒｇ／ｄｔ　ＰＢＳ、ｐＨｙ、２　）を等量混合し
、３７℃で１５分間反応させ次。その後タンニン酸処理
羊固定化赤血球（５％Ｗ／Ｖ）と八８、Ｅｉｌｏの細胞
株由来の抗ＡＦＰモノクローナル抗体液とを等量混合３
７℃で１時間反応させＡ８、Ｋ１０の細胞株由来の抗Ａ
ＦＰモノクローナル抗体感作赤血球を得た。

そして、充分に同上リン酸緩衝液で洗浄した。

この感作赤血球を分注してから凍結乾燥して試薬を得た
。

凍結乾燥後の前記本願における感作赤血球を動物血清を
含有する塩化ナトリウム含有等張化リン酸緩衝液（ｐＨ
７，２）に２％以上のヒツジ赤血球ストローマを含むり
／酸緩衝液で０．５チに調整溶解し、ヒ）ＡＦＰに対す
る凝集反応をマイクロプレート法で測定した。検体中に
含有せるヒトＡＦＰ量の０．８〜１．６　ｍ９　／　３
Ｌ／までの測定は可能であった。

実施例２　キットの構成 キットを構成している試薬類は、次の５種類である。

■　Ａ８．１！ｉ１０の細胞株由来の抗ヒ）ＡＦＰ抗体
を感作させたヒツジ赤血球： １バイアルの内容物は、乾燥感作ヒツジ赤血球および保
存剤で■のリン酸緩衝液の５ゴをこれに加えて懸濁させ
るとき、α５％（Ｗ／ｖ）赤血球浮遊液示得られる。保
存剤としてナトリウムアジド１　ｍｇが添加されている
。なお、抗ヒトＡＦＰ抗体は、実施例１と同様にして製
造したものである。

■　ヒトＡＦＰ陽性コントロール： １バイアル中、除菌濾過したヒ）ＡＦＰ濃度既知の溶液
／−を含有する。本溶液のＲＰＨＡ法によるヒ）ＡＦＰ
−Ｊｉは１：６４以上である。保存剤としてナトリウム
アジド１　ｍｇ　（０，１％　）が添加されている。

■　陰性コントロール： １バイアル中、除菌濾過した抗ヒ）ＡＰ’Ｐ抗体ならび
にヒ）ＡＦＰ抗原が共に陰性の人血清又は生理食塩液１
ｄを含有する。保存剤としてナトリウムアジド１９（０
，１％）が添加されている。この陰性コントロールの代
りとして欠配のリン酸緩衝液を用いることもできる。

■　リン酸緩衝液： １バイアル中、除菌濾過した塩化ナトリウム加等張リン
酸緩衝液、ｐＨ７，２（ＰＢＳ）５０ａ／ｉ含有する。

ＰＢＳには、試験に際して非特異反応の生じるのを防止
するため、可溶化ストローマおよび動物血清を配合して
いる。

組成（５０瓜ｌ中） リン酸二ナトリウム（無水）　　　　　５９５ｍｇリン
酸−カリウム　　　　　　　　１５５ＩＩｇ塩化ナトリ
ウム　　　　　　　２２５冨ｇス　　　ト　　　ロ　　
　−　　マ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　３　％動　物血清　　　　　１％ ナトリウムアジド　　　　　　　　５０叩ｐＨ７，２ リン酸緩衝液の１０ａｔｊは抗ヒトＡＦＰ抗体感作ヒツ
ジ赤血球の懸濁用に用いられ、残）は被験液の希釈に用
いる。上記組成の如く保存剤としてナトリウムアジドα
１　％　（Ｗ　／　Ｖ　）を加えておくことが好ましい
１、 ■　特異性判定のための確認試薬： １バイアル中、除菌濾過した精製抗ヒトＡＦＰポリクロ
ーナル抗体を含む凍結乾燥品である。これを生理食塩水
の５ｄで溶解する。

実施例３ 実施例２の示した試薬を用いてヒ）ＡＬＰの定量試験を
次の通シ実施し次。

■　Ａ８．１！＋１０の細胞株由来の抗ヒ）ＡＦ’Ｐモ
ノクローナル抗体を感作させたヒツジ赤血球を、μｔず
つを入れる。Ａ列の混液を上に用いたａｔｌｕｔｅｒで
Ｂ列へ移し、さらにＢ列よｐｃ列へ移し、次々と頭次移
してＨ列までこれを行う。これによル被験液は、２倍段
階希釈されておシ、Ｈ列の希釈倍数は２５６倍となって
いる。

■　別に被験液の代わりに、陽性コントロールおよび陰
性コントロール（添付のリン酸緩衝液を用Ｐ抗体感作ヒ
ツジ赤血球のリン酸緩衝液懸濁液を２５μｔずつ加える
。

■　プレートに÷；１ｘｅｒ）で約１０秒間振盪ｇ後、
室温で２時間静置する。

■　コントロールの観察 陽性コントロールについては、通常６４倍希釈以上まで
凝集を認める。陰性コントロールは、Ａ〜Ｈのすべてに
おいて穴の底に赤血球の沈降物を認める（測定が良好な
場合、陰性像は小さく明瞭である）。

■　試験結果 被験液につき、陰性コントロールと比較して凝集像を認
める最高希釈倍数をもってヒ）ＡＦＰ価とした。

ヒ）ＡＦＰ含量を精密に定量するには、ヒトＡＦＰの含
量既知溶液を用いてその希釈倍数と対応する凝集像の直
径（ｍｍ）を対数グラフにプロットして標準検量線を作
成する。この検量線をもとに、未知被験液の希釈倍数と
凝集像の直径からヒトＡＦＰ含量全求めた。

この結果検出感度の最低値は、本発明試薬は、０、８〜
１．６　ｎ　ｇ　／　ａｔであシ、約２時間で定量が行
えた。

実施例４ 又、被験液についての特異性を見るために行った試験で
は、被験液を該抗ヒ）ＡＦＰポリクローナル抗体であら
かじめ中和して再試験した結果、偽陽性と判定されるも
のは３％以下であり、本測定用試薬が非常に特異性の高
いものであることが判った。又、実施例５と同様な方法
で該抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体に代えて正常マウ
ス１ｇＧ感作赤血球を用いて、被験液を測定し、本測定
試薬の特異性の高さを確認できた。

手続補正書 昭和６０年１１月ｔｑ日

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １）抗原認識部位の異なる、少なくとも二種以上の抗ヒ
   トアルフアフエトプロテインモノクローナル抗体を動物
   赤血球に感作して得た抗ヒトアルフアフエトプロテイン
   モノクローナル抗体感作赤血球を含むことを特徴とする
   、逆受身赤血球凝集反応用測定試薬。