JPS62257063A - 癌関連糖蛋白質の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、癌関連糖蛋白質を含有する溶液、例えば癌患
者の血清あるいは腹水、胸水等の体液中の前記癌関連糖
蛋白質を測定する方法に関するものである。

（従来の技術） 従来癌の診断、治療効果判定、再発の予知等の目的でｉ
ｉ瘍ママ−カーして癌患者の血清中に出現するＣ　Ｅ　
Ａ　（ｃａｒｃｉｎｏ　　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　　ａｎ
ｔｉｇｅｎ　＞　。

Ａ　Ｆ　Ｐ　（ａｌｐｈａ　−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ
　）　、　　ＣＡ１９−　９等の癌関連物質の測定が広
く行われている。

（発明が解決しようとする問題点） しかし、これらの癌関連物質はすべての癌の診断を可能
にするものではなく、さらに新しい癌関連物質を発見し
、これを測定することによって診断の精度を向上させる
必要がある。

（問題点を解決するための手段） 本発明者は、癌患者の血清中あるいは腹水、胸水等の体
液中において小麦胚芽凝集素に結合づる糖蛋白質が増加
していることを見い出し、これを新たな癌関連糖蛋白質
として癌の診断に応用することについて検討した結果、
本発明を完成させるに至った。

すなわ１５、本発明は、癌関連糖蛋白質を含有する溶液
、例えば癌患者の血清あるいは腹水、胸水等の体液中の
前記癌関連糖蛋白質を測定するに当り、小麦胚芽凝集素
を固相化したプラスチック担体に、前記癌関連糖蛋白質
を含有する溶液を接触させて前記癌関連糖蛋白質を前記
担体上の前記凝集素に結合させ、次いでその結合Ｑを測
定することを特徴とする癌関連糖蛋白質の測定方法であ
る。

本発明で使用する小麦胚芽凝集素はレクチンの一種であ
り、比較的安価に市販されている。小麦胚芽は５吊のシ
アル酸残基あるいはＮ−アセチルグルコースアミン残基
を有する糖鎖と特異的に結合することが知られている。

本発明者は、癌患者の血清あるいは体液中には小麦胚芽
凝集素と結合する糖蛋白質が豊富に存在することを見い
出した。

本発明に使用するプラスチック担体は、サンドウィッチ
アッセイにおいて使用されているもののほか、凝集反応
を利用する各種測定法に用いられるラテックス粒子等の
プラスチック担体である。

かかる担体としては、グラスチックビーズ、例えば、直
径６．４ｍｍのポリスチレンビーズ、ＡＥ３Ｓ樹脂ビー
ズ、アミノ化ダイラークビース等、プラスチックプレー
ト、例えば、９６穴ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ　１ｉｎ
ｋｅｄ　　ｉ＋＋＋ｍｕｎｏｓｏｌｖｅｎｔ　　ａｓｓ
ａｙ　）用ポリスチレンプレート、プラスチックチュー
ブ、例えば、ポリスチレンチューブ、およびラテックス
粒子、例えば、ポリスチレンラテックス粒子等を使用す
ることができる。

小麦胚芽凝集素をプラスチック担体に同相化するに当っ
ては、先ず小麦胚芽凝集素を弱アルカリ性溶液に溶解す
る。プラスチック担体としてプラスチックビーズを使用
する場合には、上述の小麦胚芽凝集素溶液中にプラスチ
ックビーズを加え、またプラスチック担体として９６穴
ＥＬＩＳＡ用プラスブツクプレートを使用する場合には
、プラスチックプレートの各穴内に小麦胚芽凝集素溶液
を加える。次いで、蛋白質溶液、例えば１％ウシ血清ア
ルブミン／リン酸緩衝液中に保存する。プラスチック担
体としてラテックス粒子、例えば０．０７７μｍ径のポ
リスチレン粒子を使用する場合には、先ずラテックス粒
子を弱アルカリ性溶液中に溶解し、これに小麦胚芽凝集
素を加え、振とう混和後、例えば、１％ウシ血清アルブ
ミン／リン酸緩衝液等の蛋白溶液中に保存する。

小麦胚芽凝集素を固相化したビーズ、プレートまたはチ
ューブ等を使用する場合には、かかるビーズ、プレート
またはチューブ等に癌関連糖蛋白質を含有する溶液を加
え、固相化された小麦胚芽凝集素に前記癌関連糖蛋白質
を反応、結合させた後に、担体を洗）ｐし、残留する前
記溶液を除去し、次いで放射性ヨード１１２５あるいは
ペルオキシダーゼ等の酵素、あるいはＦ　Ｉ　Ｔ　Ｃ（
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ
　）等の螢光物質で標識した小麦胚芽凝集素を加え、固
相化された小麦胚芽凝集素に結合している前記糖蛋白質
に標識小麦胚芽凝集素を結合させ、その結合量を測定す
る。

１１２５標識小麦胚芽凝集素の場合にはガンマカウンタ
ーで放射活性を測定する。酵素で標識した小麦胚芽凝集
素の場合には発色試薬を加えて発色させた後吸光度を測
定する。ＦＴＴＣ等の螢光物質で標識した小麦胚芽凝集
素の場合には励起光を照射し、放射される螢光を測定す
る。小麦胚芽凝集素を同相化したラテックス粒子を使用
する場合には、かかるラテックス粒子に癌関連糖蛋白質
を含有づる溶液を加え、同相化された小麦胚芽凝集素に
前記癌関連糖蛋白質を反応、結合させた後に、同相化小
麦胚芽で集素と前記癌関連糖蛋白質との結合により生成
するラテックス粒子の凝集像を観察し、患者血清を１％
ウシ血清アルブミン／リン酸緩衝液等の希釈剤で系列希
釈し、何倍希釈まで凝集反応が認められるかを判定する
ことによって測定する。凝集像は血清等のなかに存在す
る癌関連糖蛋白質が高濃度である場合には高倍率の希釈
でもなお認められるが、前記癌関連糖蛋白質が低濃度で
ある場合には凝集像の認められる希釈倍率は低い値とな
る。

（作　用） 癌患者の血清あるいは体液中には小麦胚芽；貸集素と結
合する糖蛋白質が口冨に存在しており、担体上に固相化
された小麦胚芽凝集素に対する癌関連糖蛋白質の結合ω
は、担体がビーズ、プレートまたは゛ｆユーブ等の場合
には標識小麦胚芽凝集素の結合重を測定することにより
、あるいは担体がラテックス粒子の場合には何倍の希釈
倍率まで凝集反応が認められるかを判定することにより
定量が可能であり、この定量値から癌患者の血清あるい
は体液中の癌関連糖蛋白質ｉ１！度を決定することがで
きる。

（実施例） 次に本発明を実施例について説明する。

実施例１ １．１　　小麦胚芽凝集素を固化したプラスチックビー
ズの製造 小麦胚芽凝集素１＋ｇをＩ）　Ｈ８，４の５０ｍ　Ｍ重
炭酸ナトリウム溶液１００ｍβに溶解し、これに直径６
．４ｍｍのポリスチレンビーズ１０００ｇを加え、４℃
にて１週間放置した。次いでビーズを取出し、生理食塩
水で３回洗浄した侵に１％ウシ血清アルブミン／リン酸
緩衝液１００１１Ｊ２中に移し、４℃にて１週間以上放
置して保存した。かくして、小麦胚芽凝集素を同相化し
たポリスチレンビーズを得た。

１．２　　癌関連糖蛋白質の測定 アボット社’ｌナンドイッチプレ−１・に１％ウシ血清
アルブミン／リンＩ’１９緩衝液２００μ℃および癌患
者の血清２０μ℃を加えたｉな、前記１．１で得た小麦
胚芽凝集素結合ポリスチレンビーズ１ケを加え、２５℃
にて２開間放首し、血清中の小麦胚芽で集票結合性糖蛋
白質をビーズの表面に結合させた。

次にビーズを脱イオン水で洗浄し、非結合性の血清成分
を除去した後、１１２５で標識した小麦胚芽凝集素を１
％ウシ血清アルブミン／リン酸緩衝液に溶解して１５０
．ＯＯＯｃｐｍ／　２００μ℃となるように調整した溶
液を一再度サンドイツチプレートに加え、２５℃で２時
間放置し、ビーズ表面に結合した小麦胚芽凝集素結合性
糖蛋白質に標識小麦胚芽凝集素を結合させた。

再度ビーズを脱イＡン水で洗浄し、過剰の標識小麦胚芽
凝集素を除去した後、ビーズを試験管に移し、放射活性
をガンマカウンターで計測した。

この結果、健常成人での放射活性の（平均値）＋２×（
標ｔ￥偏差）を正常上限とすると、癌患者血清の約１５
％が陽性であった。また臓器別の比較では、胃癌におい
て最も陽性率が高く、胃癌患者血清の約４０％が陽性で
あった。

実施例２ ２．１　　小麦胚芽；疑集素を固相化した９６穴ＥＬＩ
ＳＡ用ポリスチレンプレートの製造 小麦胚芽凝集素索ｌｎ１ｇをｐ　Ｈ８，４の５０ｎ＋　
Ｍ重炭酸ナトリウム溶液５０ｍ℃に溶解し、これを９６
穴ＥＬＩＳＡ用プレートの各穴に対し１００μβずつ加
え、４℃にて２４時間放置した。次いでプレートを生理
食塩水で３回洗浄した侵に１％ウシ血清アルブミン、／
リン酸緩衝液２００μａを各穴に加え、４℃にて２４時
間以上ｔｌｊ装して保存した。かくして、小麦胚芽凝集
素を固相化したＥＬＩＳＡ用ポリスグレンプレートを得
た。

２．２　　癌関連糖蛋白質の測定 （１）前記２．１で得た小麦胚芽凝集固相化ＥＬＦＳＡ
用ポリスチレンプレートの各穴に対し癌患者血清５０μ
℃および緩衝液（１％ウシ血清アルブミン／リン酸緩衝
液）１００μｌを加え、２５℃にて２時間放置して血清
中の小麦胚芽凝集素結合性糖蛋白質を各穴の固相化小麦
胚芽凝集素に結合させた。

ＥＬＩＳＡ用プレー上プレート１％ウシ血清アルブミン
／リンｌＩ！緩衝液１００μ℃および癌患者の血清５０
μ℃を加え、室温で２時間放置し、血清中の小麦胚芽凝
集素結合性糖蛋白質をＥＬＩＳＡ用プレー１へに結合さ
せろ。

次にＥＬＩＳＡ用プレー上プレート塩水で洗浄し、非結
合性の血清成分を除去した後、ペルオキシダーゼで標識
した小麦胚芽凝集素を１％ウシ血清アルブミン／リン酸
緩衝液で１００倍に希釈した溶液を１００μβずつＥＬ
ＩＳＡ用プレー上プレート加え、２５℃で２時間放置し
、ＥＬＩＳＡ用プレー上プレート結合した小麦胚芽凝集
素結合性糖蛋白￥１に標識小麦胚芽凝集素を結合させた
。

再度ＥＬＩＳＡ用プレー上プレート塩水で洗浄し、過剰
の標識小麦胚芽凝集素を除去した後、蓼１１として過酸
化水素およびＯＰＤ　（オルソフェニルジアミン）試薬
を加えて発色させ、ＥＩＡリーダーで吸光度を計測した
。

この結果、隷常成人での吸光度のく平均（ａ）＋２Ｘ（
標準偏差）を正常上限とすると、癌患者血清の約１５％
が陽性であった。また臓器別の比較では、胃癌において
もっとも陽性率が高く、胃癌忠者向清の約４０％が陽性
であった。

（発明の効果） 癌患者の血清あるいは体液中に出現する小麦胚芽凝集木
枯合作癌関連糖蛋白質は従来知られていない新しいｌｌ
４ｉ瘍マーカーであり、各種の癌、特に胃癌において高
い陽性率を示す点において本発明方法は癌の診断上価値
が極めて高い。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、癌関連糖蛋白質を含有する溶液中の前記癌関連糖蛋
   白質を測定するに当り、 小麦胚芽凝集素を固相化したプラスチック 担体に、前記癌関連糖蛋白質を含有する溶液を接触させ
   て前記癌関連糖蛋白質を前記担体上の前記凝集素に結合
   させ、次いでその結合量を測定することを特徴とする癌
   関連糖蛋白質の測定方法。 ２、前記癌関連糖蛋白質を含有する溶液が、癌患者の血
   清あるいは腹水、胸水等の体液である特許請求の範囲第
   １項記載の方法。