JPH049665A - 肺疾患マーカー蛋白の測定法 - Google Patents
肺疾患マーカー蛋白の測定法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(伺産業上の利用分野
本発明は人血中の肺疾患マーカー蛋白の測定法に関する
。さらに詳しくは、本発明はヒト肺サーフアクタン1〜
アポ蛋白(SP−A)の異なるエピトープを認識する2
つの抗体を用い、反応系に特定の界面活性剤と蛋白を同
時に存在させることを特徴とする人血中の肺疾患マーカ
ー蛋白の測定法に関する。
。さらに詳しくは、本発明はヒト肺サーフアクタン1〜
アポ蛋白(SP−A)の異なるエピトープを認識する2
つの抗体を用い、反応系に特定の界面活性剤と蛋白を同
時に存在させることを特徴とする人血中の肺疾患マーカ
ー蛋白の測定法に関する。
(ロ)従来の技術及び発明か解決しようとする課題動物
の肺胞には、肺表面活性物質と称するリン脂質を主成分
とする生理活性物質が存在する。これは肺胞の内壁を覆
い、肺胞上皮保護作用を有すると共に、動物が呼吸機能
を維持する上に重要な生理的機能を有している。即ち、
肺表面活性物質は、呼吸時、呼気時における肺胞内面の
表面張力を変化させるといっな特異な表面活性を有して
おり、肺胞相互間の安定性に寄与して、抗無気肺作用を
示すと言われている。かかる肺表面活性′+17jJM
が不足すると肺胞は虚脱し1、安定し7だ換気能ブ〕を
維持できなくなり例えば、新生児呼吸緊迫症候群(IR
DS)や、成人呼吸緊迫症候群(A F(L) S )
のごとき症状が表われる。
の肺胞には、肺表面活性物質と称するリン脂質を主成分
とする生理活性物質が存在する。これは肺胞の内壁を覆
い、肺胞上皮保護作用を有すると共に、動物が呼吸機能
を維持する上に重要な生理的機能を有している。即ち、
肺表面活性物質は、呼吸時、呼気時における肺胞内面の
表面張力を変化させるといっな特異な表面活性を有して
おり、肺胞相互間の安定性に寄与して、抗無気肺作用を
示すと言われている。かかる肺表面活性′+17jJM
が不足すると肺胞は虚脱し1、安定し7だ換気能ブ〕を
維持できなくなり例えば、新生児呼吸緊迫症候群(IR
DS)や、成人呼吸緊迫症候群(A F(L) S )
のごとき症状が表われる。
従来、羊水中の肺表面活性物質の量を測定または推定す
る方法としては、いくつかの方法が提案されている。例
えば、肺表面活性物質のマーカ・−として、羊水中のし
・′S比くレシチンとスフィンゴミエリンの比)や羊水
中のジパルミトイルホスファチジル=1リン(i) P
P C)量が測定されているが、前者の方法は、肺表
面活性物質の主成分であるり〉′脂質を測定するもので
はなく、IRDSとの相関性が低いという欠点があり、
後者の方法は、感度が悪いとい・う問題点がある。と、
:ろで、肺表面活性物質の約90%はりン脂質や中性脂
質等の脂質であるが、約10%は蛋白であり、これらは
脂質と蛋白の捏合体、即ちリボ蛋白として存在し7てい
る。肺表面活性物質から脂質を除去゛すると水不溶性の
蛋白が得られ、これをアポ蛋白(spA)と呼んでいる
が、分子量的36.000 (36K )の糖蛋白が主
成分である。リン脂質に比べ、アポ蛋白は特異性に優れ
また高感度に検出し得るので、肺表面活性物質のマーカ
ーとしてアポ蛋白を用いることも検3ゴされ、いわゆる
ポリクローナル抗体による免疫学的定量も行なわれてき
た1、シかしながら、ポリクローナル抗体を用いる方法
は、測定に長時間を要しまた感度も十分ではないという
問題点があった。 そこで、本発明者らは、肺表面活性
物質を構成するアポ蛋白に対するモノクローナル抗体を
作成し、これを用いて測定する方法を既に提案〈特開昭
62−64956号および特願昭62−216355号
〜)しな。上記方法は、実用のなめに充分鋼えうる方法
であり、肺洗浄液、羊水および喀痰中のアポ蛋白の測定
に応用されている。
る方法としては、いくつかの方法が提案されている。例
えば、肺表面活性物質のマーカ・−として、羊水中のし
・′S比くレシチンとスフィンゴミエリンの比)や羊水
中のジパルミトイルホスファチジル=1リン(i) P
P C)量が測定されているが、前者の方法は、肺表
面活性物質の主成分であるり〉′脂質を測定するもので
はなく、IRDSとの相関性が低いという欠点があり、
後者の方法は、感度が悪いとい・う問題点がある。と、
:ろで、肺表面活性物質の約90%はりン脂質や中性脂
質等の脂質であるが、約10%は蛋白であり、これらは
脂質と蛋白の捏合体、即ちリボ蛋白として存在し7てい
る。肺表面活性物質から脂質を除去゛すると水不溶性の
蛋白が得られ、これをアポ蛋白(spA)と呼んでいる
が、分子量的36.000 (36K )の糖蛋白が主
成分である。リン脂質に比べ、アポ蛋白は特異性に優れ
また高感度に検出し得るので、肺表面活性物質のマーカ
ーとしてアポ蛋白を用いることも検3ゴされ、いわゆる
ポリクローナル抗体による免疫学的定量も行なわれてき
た1、シかしながら、ポリクローナル抗体を用いる方法
は、測定に長時間を要しまた感度も十分ではないという
問題点があった。 そこで、本発明者らは、肺表面活性
物質を構成するアポ蛋白に対するモノクローナル抗体を
作成し、これを用いて測定する方法を既に提案〈特開昭
62−64956号および特願昭62−216355号
〜)しな。上記方法は、実用のなめに充分鋼えうる方法
であり、肺洗浄液、羊水および喀痰中のアポ蛋白の測定
に応用されている。
しかしながら、検体とL7て肺洗浄液、羊水等を入手す
ることは患者に非常な負担を伴う。また従来の方法では
血中のアポ蛋白の測定については言及していない。
ることは患者に非常な負担を伴う。また従来の方法では
血中のアポ蛋白の測定については言及していない。
一方、肺疾患には間質性肺炎、サルコイド−シス、肺炎
、肺結核あるいは肺腺癌、肺扁平上皮癌等の種々の肺疾
患が知られているが、ヒトの血中に存在すると予想され
るこれらの肺疾患マ・−カー蛋白を測定してその診断、
治療に用いることは、従来知られていない。
、肺結核あるいは肺腺癌、肺扁平上皮癌等の種々の肺疾
患が知られているが、ヒトの血中に存在すると予想され
るこれらの肺疾患マ・−カー蛋白を測定してその診断、
治療に用いることは、従来知られていない。
(ハ)課題を解決するための手段
本発明者らは、特開昭62−64956号に述べている
アポ蛋白に特異的な2種のモノクローナル抗体(例えば
PE−10等)を用いて、ヒトの血中に存在する肺疾患
マーカー蛋白等免疫学的測定法の種々の条件を検討した
。
アポ蛋白に特異的な2種のモノクローナル抗体(例えば
PE−10等)を用いて、ヒトの血中に存在する肺疾患
マーカー蛋白等免疫学的測定法の種々の条件を検討した
。
本発明者らの研究によると、特願昭62−216355
号に述べたごとく、免疫反応に非イオン系と陰イオン系
の界面活性剤を共存させることにより、羊水中、肺胞洗
浄液中気道吸引液リボ蛋白中のアポ蛋白を正しくとらえ
ることを開示した。しかしながら、この方法を血液中の
肺疾患マーカー蛋白等の測定に応用する場合、その測定
系の感度および共存する血液成分による血清干渉が問題
であ・つな。
号に述べたごとく、免疫反応に非イオン系と陰イオン系
の界面活性剤を共存させることにより、羊水中、肺胞洗
浄液中気道吸引液リボ蛋白中のアポ蛋白を正しくとらえ
ることを開示した。しかしながら、この方法を血液中の
肺疾患マーカー蛋白等の測定に応用する場合、その測定
系の感度および共存する血液成分による血清干渉が問題
であ・つな。
そこで本発明者らは、開示した発明をさらに発展させる
べく、血液中の肺疾患マーカーを感度よく測定できる方
法、およびキットを提供すべく鋭意研究し7た結果本発
明に到達したものである3、即ち本発明は、ヒト肺サー
ファクタントアポ蛋白(S P−A )にえ1する異な
るエピト・−プを5忍識する2つの抗体を用いるヒト血
中の肺疾患マ・−カー蛋白の測定法、およびその測定用
キットである。
べく、血液中の肺疾患マーカーを感度よく測定できる方
法、およびキットを提供すべく鋭意研究し7た結果本発
明に到達したものである3、即ち本発明は、ヒト肺サー
ファクタントアポ蛋白(S P−A )にえ1する異な
るエピト・−プを5忍識する2つの抗体を用いるヒト血
中の肺疾患マ・−カー蛋白の測定法、およびその測定用
キットである。
本発明においてヒトの血中に存在する肺疾患マーカー蛋
白とは、血清、血漿等のヒト血中に存在し1、かつ抗し
)−S P〜A抗体に交叉反応性を存する1種類または
2種類以上の蛋白であ・−7)で、例えば間質性肺炎2
肺炎、肺線癌、肺扁甲上皮癌等の肺疾患時に血中に何故
遊離されるのか詳細は不明であるが、これら疾患と相関
関係を示すものをいつ。
白とは、血清、血漿等のヒト血中に存在し1、かつ抗し
)−S P〜A抗体に交叉反応性を存する1種類または
2種類以上の蛋白であ・−7)で、例えば間質性肺炎2
肺炎、肺線癌、肺扁甲上皮癌等の肺疾患時に血中に何故
遊離されるのか詳細は不明であるが、これら疾患と相関
関係を示すものをいつ。
本発明者らによれば、この蛋白はS P−Aに対する抗
体(PE−10)を用いてアフィニティ精製した結果、
分子量は20000〜80000に分布し2ていた。
体(PE−10)を用いてアフィニティ精製した結果、
分子量は20000〜80000に分布し2ていた。
またこの蛋白は抗ピトSP−A抗体と交叉反応性を示す
ことからSP−Aの分解物、複合体等も考えられる。
ことからSP−Aの分解物、複合体等も考えられる。
本発明においては、特に反応系に■非イオン・及び隘イ
オン界面活性剤、■分子量1.6・−15,0万でかつ
等電点が1.0・へ・5,0である蛋白を同時に存在さ
せることが好まし、い。
オン界面活性剤、■分子量1.6・−15,0万でかつ
等電点が1.0・へ・5,0である蛋白を同時に存在さ
せることが好まし、い。
かかる界面活性剤、蛋白を存在させることにより、血液
中の肺疾患マーカ・−蛋白を特に感度よく測定4ること
が=iT能になったが、その理由は、次のよ・うなこと
が挙げられる。該マーカー蛋白は、羊水中や喀癲中に存
在するS P−Aと同様にリン脂質と複合体を形成して
いるリボ蛋白と思われる。
中の肺疾患マーカ・−蛋白を特に感度よく測定4ること
が=iT能になったが、その理由は、次のよ・うなこと
が挙げられる。該マーカー蛋白は、羊水中や喀癲中に存
在するS P−Aと同様にリン脂質と複合体を形成して
いるリボ蛋白と思われる。
非イオン・陰イオン界面活性剤共存のみの場合、血中の
リボ蛋白は可溶化は十分となり該マーカー蛋白が免疫反
応に関与する抗体によって結合されることになる。しか
しながら、非特異吸着をおさえることができるような蛋
白成分が存在し5ないため、感度の低下が起こり、その
ため、血中で存在濃度が低い該マ・−カー蛋白を正し5
く測定できなくなる。
リボ蛋白は可溶化は十分となり該マーカー蛋白が免疫反
応に関与する抗体によって結合されることになる。しか
しながら、非特異吸着をおさえることができるような蛋
白成分が存在し5ないため、感度の低下が起こり、その
ため、血中で存在濃度が低い該マ・−カー蛋白を正し5
く測定できなくなる。
一方、そのような非特異吸着をおさえられる蛋白と非イ
オン界面活性剤のみの存在では、血中のリボ蛋白は可溶
化が不十分となり、該マーカー蛋白は、免疫反応に関与
する抗体に認識されず、従って、血中の該マーカー蛋白
を測定できない。しかしながら、非イオン・陰イオン界
面活性剤および特定の蛋白の共存により、それぞれの長
所が生かされ、即ち蛋白による非特異吸着の低Fおよび
リボ蛋白の可溶化によりそのアポ蛋白は抗体に効率よく
認識され、血中の非常に低い濃度で存在する該マーカー
蛋白を測定しうろことになる。
オン界面活性剤のみの存在では、血中のリボ蛋白は可溶
化が不十分となり、該マーカー蛋白は、免疫反応に関与
する抗体に認識されず、従って、血中の該マーカー蛋白
を測定できない。しかしながら、非イオン・陰イオン界
面活性剤および特定の蛋白の共存により、それぞれの長
所が生かされ、即ち蛋白による非特異吸着の低Fおよび
リボ蛋白の可溶化によりそのアポ蛋白は抗体に効率よく
認識され、血中の非常に低い濃度で存在する該マーカー
蛋白を測定しうろことになる。
本発明に用いられる、肺サーファクタントアポ蛋白に対
する異なるエピトープを認識する2つの抗体に関し、で
は、既に特開昭61−277699号に開小されたモ、
ツクローナル抗体PC−6,PE−10等が挙げられる
。また測定法に関しては、特開昭61275654号に
述べたが、異なるエピトープを認識する抗体はポリクロ
ーナル抗体でもかまわない4、本発明において反応系に
同時に存在させることのできる蛋白は分子量が1.6〜
5.0万で等電点が1.0〜5.0の範囲にあるものを
いう。
する異なるエピトープを認識する2つの抗体に関し、で
は、既に特開昭61−277699号に開小されたモ、
ツクローナル抗体PC−6,PE−10等が挙げられる
。また測定法に関しては、特開昭61275654号に
述べたが、異なるエピトープを認識する抗体はポリクロ
ーナル抗体でもかまわない4、本発明において反応系に
同時に存在させることのできる蛋白は分子量が1.6〜
5.0万で等電点が1.0〜5.0の範囲にあるものを
いう。
本発明におけるかかる蛋白とし2ては、ペプシン。
オボグリコブ11ティン、オロンムコイドやカゼインや
カゼインと無機質の混合物であるスキムミルク等が挙げ
られる。分7−■1□6万以下の蛋白を用いた場合には
、非特異吸着が上昇し、てし、よう結果を得ており、ま
た5、0万以上の分子2では免疫非特異的反応の低減が
不十分かつ特異的免疫反応の低下が見られることにより
、本発明に使用する分子量を1,6〜50万と決めた。
カゼインと無機質の混合物であるスキムミルク等が挙げ
られる。分7−■1□6万以下の蛋白を用いた場合には
、非特異吸着が上昇し、てし、よう結果を得ており、ま
た5、0万以上の分子2では免疫非特異的反応の低減が
不十分かつ特異的免疫反応の低下が見られることにより
、本発明に使用する分子量を1,6〜50万と決めた。
また等電点に関しても等電点5.0以上の蛋白を添加し
た場合、非特異吸着が上昇し7、また等電点140より
下では特異的反応がおさえられるために本発明に使用す
る蛋白の等電点の範囲を1.0−5.0と決めた。
た場合、非特異吸着が上昇し7、また等電点140より
下では特異的反応がおさえられるために本発明に使用す
る蛋白の等電点の範囲を1.0−5.0と決めた。
特に、上記蛋白の中でもスキムミルクが望ましい。
本発明におい°Cは、かかる蛋白は免疫反応溶液中にお
ける最終濃度を0.01−50.9重量%の範囲にする
のが好ましい。例えばスキムミルクのMFi液中の濃度
をかかる範囲に調製すると、免疫測定法が高感度である
ためのンつの必須条件くずなわぢ、。
ける最終濃度を0.01−50.9重量%の範囲にする
のが好ましい。例えばスキムミルクのMFi液中の濃度
をかかる範囲に調製すると、免疫測定法が高感度である
ためのンつの必須条件くずなわぢ、。
特異的反応を維持しながら、非特異反応を低減させる)
を満たずことが容易となる。スキムミルクは、0.9%
より濃い濃度では水に不溶であり、その懸濁液を用いて
ブ■7・ソキングするノごめ5ミクロ的にみれば、スA
・ムミルクの大きな不溶物が抗原を覆うため抗体が近づ
けなくなり、結果としζ、抗原抗体反応が大きく阻書さ
れやすくなる。3また0、01%以下では、十分な非特
異吸着の低減効果が得られにくくなる。
を満たずことが容易となる。スキムミルクは、0.9%
より濃い濃度では水に不溶であり、その懸濁液を用いて
ブ■7・ソキングするノごめ5ミクロ的にみれば、スA
・ムミルクの大きな不溶物が抗原を覆うため抗体が近づ
けなくなり、結果としζ、抗原抗体反応が大きく阻書さ
れやすくなる。3また0、01%以下では、十分な非特
異吸着の低減効果が得られにくくなる。
また、上記蛋白と免疫反応溶液中に同時に共存させる本
発明に使用する界面活性剤どしては、非イオン界面活性
剤どしては、ポリオキシエチレンアルギルエーテル類、
ポリオキシエチレンアルギルフェノールニーデル類、ポ
リオキシエチレン脂肪酸エステル(モノ)類、ポリオキ
シエチ1/ンアルキルチオエ・・−デル類があり、また
、陸・イオシ界面活性剤としては、高級アルコール硫酸
ニスデル類、アルギルスルポン酸塩類、アルキルベンゼ
ンスルホン酸塩類、ジナフチルメタンジスルホン酸塩類
、アルキルスルホコハク酸塩類、ポリオキシエチレンア
ルキルエーテル硫酸ニスデル類3ポリオキシエ11/ン
′アル−へ′・ルフエノ・−1し硫を変エステ・ル塩類
などが挙げられる、 非イオン界面活性剤としては2例えば、トす1〜ン(R
ohm &、 Haas Co、製の商品名)の、′と
きポリオギシエヂレンアルーS−ルフェノールエーテル
類が好まし、く、陰イオン界111活性剤とし7ては、
ソジウムドデシルサルフエー)、(SDS)のごときア
ルキルスルホン酸塩類が好ましい。濃度としでは、前者
は0.25・〜4重量1゛。、後者は0.2−3重量%
程度用いるのが特に好:t、 Lい。
発明に使用する界面活性剤どしては、非イオン界面活性
剤どしては、ポリオキシエチレンアルギルエーテル類、
ポリオキシエチレンアルギルフェノールニーデル類、ポ
リオキシエチレン脂肪酸エステル(モノ)類、ポリオキ
シエチ1/ンアルキルチオエ・・−デル類があり、また
、陸・イオシ界面活性剤としては、高級アルコール硫酸
ニスデル類、アルギルスルポン酸塩類、アルキルベンゼ
ンスルホン酸塩類、ジナフチルメタンジスルホン酸塩類
、アルキルスルホコハク酸塩類、ポリオキシエチレンア
ルキルエーテル硫酸ニスデル類3ポリオキシエ11/ン
′アル−へ′・ルフエノ・−1し硫を変エステ・ル塩類
などが挙げられる、 非イオン界面活性剤としては2例えば、トす1〜ン(R
ohm &、 Haas Co、製の商品名)の、′と
きポリオギシエヂレンアルーS−ルフェノールエーテル
類が好まし、く、陰イオン界111活性剤とし7ては、
ソジウムドデシルサルフエー)、(SDS)のごときア
ルキルスルホン酸塩類が好ましい。濃度としでは、前者
は0.25・〜4重量1゛。、後者は0.2−3重量%
程度用いるのが特に好:t、 Lい。
ト・リドンは0.2’4.1m%以北になると、免疫反
応の保護効果があられれ、4重量%を、−えると、免疫
反応を不安定にさせる傾向があられれる。また、SO3
は0,2重1%以上で界面活性効果があられれる。5r
)Sが3重1%をこえると、その界面活性効果があまり
にも強力であり、ト・リド・〉・の濃度を増しても、そ
の免疫反応保護効果が発揮されにくくなる。
応の保護効果があられれ、4重量%を、−えると、免疫
反応を不安定にさせる傾向があられれる。また、SO3
は0,2重1%以上で界面活性効果があられれる。5r
)Sが3重1%をこえると、その界面活性効果があまり
にも強力であり、ト・リド・〉・の濃度を増しても、そ
の免疫反応保護効果が発揮されにくくなる。
本発明においては非イオン及び陰イオン界面活性剤を併
用することが好ましいが、併用する場合の垂1比は陰イ
オン界面活性剤2./非イオン界面活性剤−=0.25
〜1.5が好ま[,7い。
用することが好ましいが、併用する場合の垂1比は陰イ
オン界面活性剤2./非イオン界面活性剤−=0.25
〜1.5が好ま[,7い。
本発明においては、ヒト肺ナーフ7−クタントアボ蛋白
にtJする異なるエピトープを認識する2−)の抗体を
、それぞれを111次抗、2次抗体として用いる。かか
る1次抗体は担体に固定化し7ておくのが好ましいが、
固定化の方法は公知の方法を採用でき、担体どしては固
相の、例えば、ポリスチレン・、ポリエチレン′、ボリ
ブY7ビレン、ポリエステル、ポリアクリルニトリル、
ポリアクリレート。
にtJする異なるエピトープを認識する2−)の抗体を
、それぞれを111次抗、2次抗体として用いる。かか
る1次抗体は担体に固定化し7ておくのが好ましいが、
固定化の方法は公知の方法を採用でき、担体どしては固
相の、例えば、ポリスチレン・、ポリエチレン′、ボリ
ブY7ビレン、ポリエステル、ポリアクリルニトリル、
ポリアクリレート。
デフ1′1ン等の弗素樹脂、ポリアセタール、架橋デキ
ストシン、ポリザラカライド等の高分子、その他紙、ガ
ラス、金属9アガロ・−スおよびこれらの組そ・ぜ等を
用いた、トレイ状1球状、繊維状、棒状、盤状7容器状
、セル、試験管などの種々の形状力くφげ′られ、ボー
/し1ビーズ′、ギヤ、゛ンイクロプj、・・−1・等
が好ましく使用される。
ストシン、ポリザラカライド等の高分子、その他紙、ガ
ラス、金属9アガロ・−スおよびこれらの組そ・ぜ等を
用いた、トレイ状1球状、繊維状、棒状、盤状7容器状
、セル、試験管などの種々の形状力くφげ′られ、ボー
/し1ビーズ′、ギヤ、゛ンイクロプj、・・−1・等
が好ましく使用される。
こしe、2次抗体は標識化さttでいることが好まし、
いが、かかる2次抗体の標識化の方法や手段、それの検
出方法や手段は何ら限定されるものではなく、公知の方
法や手段、例えば放射性物質または酵素もしくは蛍光物
質で標識された抗免疫グロブリン抗体またはブドウ球菌
蛋白Aとの2次反応により測定することもできる。標識
剤としては、酵素、蛍光物質2発光物質および放射性物
質が挙げられる。酵素を用いる方法<EIA)ではホー
スラディッシ、ス、パーオキシダーゼ、β−D〜ガラク
トシダーーーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素が
、放射性物質を用いる方法<RIA)では125J 、
131J 、 14(:、 3)(等が、蛍光物
質を用いる方法(FIA、)ではフル第1/センイソチ
オサイアネート、フィコビリ10デイン等、発光物質を
用いる方法ではイソルシノール、ルシゲニン等が通常使
用されるが、その標識剤の活性が測定可能であれば、そ
の他のものであ−ってもよい。
いが、かかる2次抗体の標識化の方法や手段、それの検
出方法や手段は何ら限定されるものではなく、公知の方
法や手段、例えば放射性物質または酵素もしくは蛍光物
質で標識された抗免疫グロブリン抗体またはブドウ球菌
蛋白Aとの2次反応により測定することもできる。標識
剤としては、酵素、蛍光物質2発光物質および放射性物
質が挙げられる。酵素を用いる方法<EIA)ではホー
スラディッシ、ス、パーオキシダーゼ、β−D〜ガラク
トシダーーーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素が
、放射性物質を用いる方法<RIA)では125J 、
131J 、 14(:、 3)(等が、蛍光物
質を用いる方法(FIA、)ではフル第1/センイソチ
オサイアネート、フィコビリ10デイン等、発光物質を
用いる方法ではイソルシノール、ルシゲニン等が通常使
用されるが、その標識剤の活性が測定可能であれば、そ
の他のものであ−ってもよい。
上記の方法の中で9.2次抗体に直接酵素が標識されて
いるものを用いることが望ましい。なぜなら、間接的な
方法では免疫反応が]、5tep多くなり実用的に不向
きであるからである、 標識剤が酵素である場合には、その活性を測定するなめ
に基質、必要により発色剤が用いら1する。
いるものを用いることが望ましい。なぜなら、間接的な
方法では免疫反応が]、5tep多くなり実用的に不向
きであるからである、 標識剤が酵素である場合には、その活性を測定するなめ
に基質、必要により発色剤が用いら1する。
基質とし5ては例えば、ホースラディ・ソシュバーオキ
シダーゼの基質と[、て、2.2’ 一つ′ジノン1−
3エヂルペンズチアソ″リシ′スルホシ′酸Jアシ・モ
Sニウム酸(−A B ”T” S )−112o2.
5− アミノサリチル酸H2O2,CL−−フエ、二
トンジアミン−H2(刀、4−アミノアンチピリン H
2G2、また、べ〉・ジジン(33’、5.5’ −
デトラメチルベンジジン等)−H2O2などが、β−丁
)−ガノクI・シダ・・−ゼの基質として、フル、オレ
セイン′−ジー(β−])〜ガラクトピラノシド)、O
L−二)−rrフェノール〜β−D−ガラクトピラノシ
ド、4−メチIレウン・ペリフェリlレーβD−−ガラ
クI・ピラノシドなど、アルカリフォスファターゼの基
質どし、てO−ニトロフェミニルフォ・スフニー・−ト
等を挙げることができる。測定のためには、これらの試
薬以外にも溶解剤、洗浄剤9反応停止側等の公知の試薬
が使用される。
シダーゼの基質と[、て、2.2’ 一つ′ジノン1−
3エヂルペンズチアソ″リシ′スルホシ′酸Jアシ・モ
Sニウム酸(−A B ”T” S )−112o2.
5− アミノサリチル酸H2O2,CL−−フエ、二
トンジアミン−H2(刀、4−アミノアンチピリン H
2G2、また、べ〉・ジジン(33’、5.5’ −
デトラメチルベンジジン等)−H2O2などが、β−丁
)−ガノクI・シダ・・−ゼの基質として、フル、オレ
セイン′−ジー(β−])〜ガラクトピラノシド)、O
L−二)−rrフェノール〜β−D−ガラクトピラノシ
ド、4−メチIレウン・ペリフェリlレーβD−−ガラ
クI・ピラノシドなど、アルカリフォスファターゼの基
質どし、てO−ニトロフェミニルフォ・スフニー・−ト
等を挙げることができる。測定のためには、これらの試
薬以外にも溶解剤、洗浄剤9反応停止側等の公知の試薬
が使用される。
本発明によるしI・・血中に存在する肺疾患マーカー蛋
白の免疫学的測定:方法 肺す−ファクタントアポ蛋自GJ対するモ、/りl」−
ナル抗体〈1次抗体、 PC−61を適当な不溶性担体
(例えばプラスザック容器)に固定化する(以1・°こ
れをパ固相抗体゛という)。次いで不溶性担体と測定し
、ようとする試薬または検体試料どの非特異的結合を避
けるために適当な物質(例えば牛血清アルブミン)で不
溶性担体の表面を被覆する。
白の免疫学的測定:方法 肺す−ファクタントアポ蛋自GJ対するモ、/りl」−
ナル抗体〈1次抗体、 PC−61を適当な不溶性担体
(例えばプラスザック容器)に固定化する(以1・°こ
れをパ固相抗体゛という)。次いで不溶性担体と測定し
、ようとする試薬または検体試料どの非特異的結合を避
けるために適当な物質(例えば牛血清アルブミン)で不
溶性担体の表面を被覆する。
このようにして得られた1次抗体が固定化された不溶性
担体を検体試料と、酵素で標識し、た抗腫サー・−・−
ファクタントア゛ボ蛋白抗体(2次抗体、 PE−10
)(標識抗体)を、非イオン・陰イオ〉・界面活性剤と
、分子−量1.6・〜・5.0でかつ等電点が1.0−
5□0なる蛋白を同時に、免疫反応液、例えば免疫反応
用緩衝液に共存させ、一定時間および一定温度で接触さ
せ反応させる。免疫反応温度は0・〜、50℃までよい
が、比較的高い温度で用いられる。ただし、低い温度の
免疫反応では、反応時間は長・く、比較的高い温度の免
疫反応では、免疫反応時間は短い。実用面から、常温(
20℃)から45℃が好んで用いらノ【る8:tlを適
当な洗浄液で洗い、次いで不溶性担体上に存在する2次
抗体にw識された標識物質の1を測定する。
担体を検体試料と、酵素で標識し、た抗腫サー・−・−
ファクタントア゛ボ蛋白抗体(2次抗体、 PE−10
)(標識抗体)を、非イオン・陰イオ〉・界面活性剤と
、分子−量1.6・〜・5.0でかつ等電点が1.0−
5□0なる蛋白を同時に、免疫反応液、例えば免疫反応
用緩衝液に共存させ、一定時間および一定温度で接触さ
せ反応させる。免疫反応温度は0・〜、50℃までよい
が、比較的高い温度で用いられる。ただし、低い温度の
免疫反応では、反応時間は長・く、比較的高い温度の免
疫反応では、免疫反応時間は短い。実用面から、常温(
20℃)から45℃が好んで用いらノ【る8:tlを適
当な洗浄液で洗い、次いで不溶性担体上に存在する2次
抗体にw識された標識物質の1を測定する。
かくしてその値から検体試料中の肺サーフアクタ〉・ト
アボ蛋白の1を算出することができる。
アボ蛋白の1を算出することができる。
本発明においては、検体試料どして血清、血漿等の血液
を用いる。
を用いる。
上記方法によ−って、ヒト血中の肺疾患マーカー蛋白の
測定が可能になるが、上記方法によ−って羊水中、肺洗
浄液中、喀痰中などの肺サーファクタント・アポ蛋白の
測定もiii工能であることは言うまでもない。なお、
血中の該マーカー蛋白の測定にあっては、例えば崩清は
52倍以上希釈することが望まし7い。
測定が可能になるが、上記方法によ−って羊水中、肺洗
浄液中、喀痰中などの肺サーファクタント・アポ蛋白の
測定もiii工能であることは言うまでもない。なお、
血中の該マーカー蛋白の測定にあっては、例えば崩清は
52倍以上希釈することが望まし7い。
測定試薬およびキットの構成
本発明のヒト血中の肺疾患マーカー蛋白の測定法に用い
る測定試薬は、ヒト肺サーファクタントアポ蛋白に対す
る異なるエピトープを認識する2つの抗体試薬、非イオ
ンおよび陰イオンパ界面活性剤と分子量1゜6−75,
0万でかり等電点1.0〜・5.0なる蛋白からなる。
る測定試薬は、ヒト肺サーファクタントアポ蛋白に対す
る異なるエピトープを認識する2つの抗体試薬、非イオ
ンおよび陰イオンパ界面活性剤と分子量1゜6−75,
0万でかり等電点1.0〜・5.0なる蛋白からなる。
なかでも、2つ・の抗体が上述1〜な不溶性担体に結合
し、な固相抗体試薬と、標識抗体試薬、および上述した
界面活性剤と蛋白を含有する免疫反応用M衝液とからな
る測定試薬が好ましい。
し、な固相抗体試薬と、標識抗体試薬、および上述した
界面活性剤と蛋白を含有する免疫反応用M衝液とからな
る測定試薬が好ましい。
また、本発明のしト血中の肺疾患マーカー蛋白測定用キ
ットは、」・記の測定試薬と、これら測定試薬を能率よ
くかつ簡便に利用するための補助剤とし、て、例えば固
体状の試薬または液状の検体を溶解させるための溶解剤
、不溶性担体に非特異的に結合し7た抗原1抗体を洗浄
するために使用される洗浄剤、および酵素で標識化した
抗体を用いる場合には、酵素活性を測定するための基質
およびその反応停止剤、その他の免疫学的測定用のキッ
トとして通常使用されるものが挙げられる。
ットは、」・記の測定試薬と、これら測定試薬を能率よ
くかつ簡便に利用するための補助剤とし、て、例えば固
体状の試薬または液状の検体を溶解させるための溶解剤
、不溶性担体に非特異的に結合し7た抗原1抗体を洗浄
するために使用される洗浄剤、および酵素で標識化した
抗体を用いる場合には、酵素活性を測定するための基質
およびその反応停止剤、その他の免疫学的測定用のキッ
トとして通常使用されるものが挙げられる。
かかるキットにおいて5本発明による非イオンおよび陰
イオン界面活性剤と分子量16−・5,0万でかつ等電
点1.0〜・5゜0なる蛋白は検体を溶解させるための
溶解剤に加えることが望まし6い。
イオン界面活性剤と分子量16−・5,0万でかつ等電
点1.0〜・5゜0なる蛋白は検体を溶解させるための
溶解剤に加えることが望まし6い。
(ホ)発明の効果
本発明により、ヒI・血中などに存在する肺疾患マーカ
ー蛋白を、極めて高感度に測定可能となり、従って小量
の検体と短い時間で容易に測定できる。
ー蛋白を、極めて高感度に測定可能となり、従って小量
の検体と短い時間で容易に測定できる。
以上により、肺線癌や他の肺疾患を、細巾の肺疾患マー
カー蛋白を測定することにより、その診断が可能となる
。
カー蛋白を測定することにより、その診断が可能となる
。
(へ)実施例
以下、実施例により、本発明を詳述する。
実施例1 血清中の肺疾患マーカー蛋白測定条件の検
討 (1)モノクローナル抗体不溶化ビーズをよく洗浄して
から、モノクl−7−ナル抗体PC−6の20μg/m
1の濃度を有するT″’BS (pH7,4)溶液中に
、4℃の温度で1昼夜放置しな。その後、ビーズをPB
S溶液で洗浄してから、0,5%牛血清アルブミ7(B
SA)水溶液中に、4°Cの温度で1昼夜放置してポス
トコーディング処理を実施して、モノクローナル抗体不
溶化ビーズを得た。
討 (1)モノクローナル抗体不溶化ビーズをよく洗浄して
から、モノクl−7−ナル抗体PC−6の20μg/m
1の濃度を有するT″’BS (pH7,4)溶液中に
、4℃の温度で1昼夜放置しな。その後、ビーズをPB
S溶液で洗浄してから、0,5%牛血清アルブミ7(B
SA)水溶液中に、4°Cの温度で1昼夜放置してポス
トコーディング処理を実施して、モノクローナル抗体不
溶化ビーズを得た。
(2)ホースラデイツシュ・ペルオキシダーゼ標識モノ
クローナル抗体の調製 モノクローナル抗体PE−10の1.0mg 7’ml
のPBS溶液に、N−(m−マレイミド安息香酸)N−
−−サクシンイミドエスデル(MBS)の10mg/n
ilの濃度のジメチルホルムアミド溶液50mを添加し
、25℃の温度で30分間反応さぜな。次いで、セファ
デックスG−25を充填し、たカラムを用い、0□1M
リン酸緩衝液(pH6,0)でゲル濾過を行ない、マレ
イミド化モノクロ・−ナル抗体と未反応MBSとを分M
した。
クローナル抗体の調製 モノクローナル抗体PE−10の1.0mg 7’ml
のPBS溶液に、N−(m−マレイミド安息香酸)N−
−−サクシンイミドエスデル(MBS)の10mg/n
ilの濃度のジメチルホルムアミド溶液50mを添加し
、25℃の温度で30分間反応さぜな。次いで、セファ
デックスG−25を充填し、たカラムを用い、0□1M
リン酸緩衝液(pH6,0)でゲル濾過を行ない、マレ
イミド化モノクロ・−ナル抗体と未反応MBSとを分M
した。
一方、ホースラデイツシュ・ペルオキシダーゼ(HRP
)の1.0mg/mlのPBS溶液に、Nザクシンイ
ミジル−3−(2−ピリジルチオ)プロピオネ−)13
POP)のIOB/mlの濃度のエタノール溶液を添加
し、25°0で30分間反応させた。次いで、セファデ
ックスG−25を充填し。
)の1.0mg/mlのPBS溶液に、Nザクシンイ
ミジル−3−(2−ピリジルチオ)プロピオネ−)13
POP)のIOB/mlの濃度のエタノール溶液を添加
し、25°0で30分間反応させた。次いで、セファデ
ックスG−25を充填し。
たカラムを用い、O,01M酢酸緩衝液(pH4,5+
でゲル濾過して精製し、ピリジルジスルフィド化HRP
を含有する両分を採集して、コロジオンバック中におい
て水冷下に約10倍に濃縮した。
でゲル濾過して精製し、ピリジルジスルフィド化HRP
を含有する両分を採集して、コロジオンバック中におい
て水冷下に約10倍に濃縮した。
次に、これに0.85%NaC1と0.1Mジチオスレ
イトールとを含有する0、1M酢酸緩衝液(pH4,5
11mlを添加し、25℃で30分間攪拌し5て、)(
RP分子中に導入したピリジルジスルフィド基を還元し
た。次いで、セファデックスG−25カラムにかけてゲ
ル濾過し、チオール化HRPを含有する画分を得た。
イトールとを含有する0、1M酢酸緩衝液(pH4,5
11mlを添加し、25℃で30分間攪拌し5て、)(
RP分子中に導入したピリジルジスルフィド基を還元し
た。次いで、セファデックスG−25カラムにかけてゲ
ル濾過し、チオール化HRPを含有する画分を得た。
上記の如くし2て得られたマレイミド化モノクローナル
抗体とチオール化HR,Pとを混合し7、コロジオンバ
ックを用いて水冷下に4mgの蛋白質濃度まで濃縮し、
4℃で1昼夜放置’t、fs後、ウルトロゲルAeA4
4を充填しなカラムでゲル濾過し7、HRP標識モノク
ローナル抗体を得た。
抗体とチオール化HR,Pとを混合し7、コロジオンバ
ックを用いて水冷下に4mgの蛋白質濃度まで濃縮し、
4℃で1昼夜放置’t、fs後、ウルトロゲルAeA4
4を充填しなカラムでゲル濾過し7、HRP標識モノク
ローナル抗体を得た。
(3)血清中の該マーカー蛋白(肺疾患マーカ・−蛋白
)の測定 血清検体希釈緩衝液と15で(a) 0.6%SDS。
)の測定 血清検体希釈緩衝液と15で(a) 0.6%SDS。
2.0%トリトンX−100、0,1%スキムミルク、
(b)0.6%SDS、2.0%トリトンX−100、
(c) 2.0%トリトンX−100、0,1%スキム
ミルクを含む混合液3種を用い、血清検体の希釈系列を
含むこの混合液とHRP標識モノクローナル抗体PE−
10希釈液とを、各々200μniずつ試験管中のモノ
クローナル抗体PC−6固定ボールに加え、免疫反応を
行なった(37℃、2時間)。
(b)0.6%SDS、2.0%トリトンX−100、
(c) 2.0%トリトンX−100、0,1%スキム
ミルクを含む混合液3種を用い、血清検体の希釈系列を
含むこの混合液とHRP標識モノクローナル抗体PE−
10希釈液とを、各々200μniずつ試験管中のモノ
クローナル抗体PC−6固定ボールに加え、免疫反応を
行なった(37℃、2時間)。
次に、試験管の溶液を吸引除去後、生理食塩水で洗浄し
てから、3.3’ 、 5.5’ −デトラメチルベ〉
′ジジン1%含有メタノール溶液/H2O20,015
%を含有する1Mリン酸−クエン酸緩衝液(pH4,5
)の3/7 (V/V)混合溶液を、各0.4mlず
つ各試験管内に加え、室温で15分間インキュベートし
た後、反応停止剤とじて1.5 NH2SO4水溶液を
2mlずつ加えて、酵素反応を停止さぜな。そして分光
光度計を用いてこの溶液の450nmの波長の吸収強度
を測定した。
てから、3.3’ 、 5.5’ −デトラメチルベ〉
′ジジン1%含有メタノール溶液/H2O20,015
%を含有する1Mリン酸−クエン酸緩衝液(pH4,5
)の3/7 (V/V)混合溶液を、各0.4mlず
つ各試験管内に加え、室温で15分間インキュベートし
た後、反応停止剤とじて1.5 NH2SO4水溶液を
2mlずつ加えて、酵素反応を停止さぜな。そして分光
光度計を用いてこの溶液の450nmの波長の吸収強度
を測定した。
−力、肺胞蛋白症から精製したアポ蛋白を標準物質とし
、前記と同じ混合液を希釈緩衝液とし、前記と同様にし
てSDSのそれぞれの濃度に対応し、た検量線を作成し
ておいた。そして、対応するSDS濃度の検量線を用い
て、前記のごとくして得られた450 +onの吸収強
度から、該マーカー蛋白(肺疾患マーカー蛋白)の濃度
を求めた。」−記により得られた値により、希釈直線を
得た5、そのうち緩衝液(a)を用いた結果を図]に、
桜橋液(b)を用いた結果を図2に示し図中X−−X
、 00.・−−〜−・、△〜−〜−〜〜△は各々4患
名検体について測定しまた結果を小−4゜ 図1かち、(a)を用いた場合には、血清4倍希釈かち
、その希釈直線は理論希釈直線と平行し正しい値を示し
2ていることがわかる。一方、図2からfb)を用いた
場合には、非特異吸着が大きくその希釈直線も、低濃度
領域において理論希釈直線と平行にならず、(b)の方
法は、血清系を測定するのに不適切であることがわかる
。
、前記と同じ混合液を希釈緩衝液とし、前記と同様にし
てSDSのそれぞれの濃度に対応し、た検量線を作成し
ておいた。そして、対応するSDS濃度の検量線を用い
て、前記のごとくして得られた450 +onの吸収強
度から、該マーカー蛋白(肺疾患マーカー蛋白)の濃度
を求めた。」−記により得られた値により、希釈直線を
得た5、そのうち緩衝液(a)を用いた結果を図]に、
桜橋液(b)を用いた結果を図2に示し図中X−−X
、 00.・−−〜−・、△〜−〜−〜〜△は各々4患
名検体について測定しまた結果を小−4゜ 図1かち、(a)を用いた場合には、血清4倍希釈かち
、その希釈直線は理論希釈直線と平行し正しい値を示し
2ていることがわかる。一方、図2からfb)を用いた
場合には、非特異吸着が大きくその希釈直線も、低濃度
領域において理論希釈直線と平行にならず、(b)の方
法は、血清系を測定するのに不適切であることがわかる
。
また(C)を用いた場合には、検体内の該マーカー蛋白
の可溶化が不十分のため、高濃度領域から希釈直線は理
論希釈直線と全く解離してしまった。以上により、本発
明の(a)の場合のみが、血清中の肺疾患マーカー蛋白
の測定に適することが判明し、また、血清を4〜16倍
まで希釈し。
の可溶化が不十分のため、高濃度領域から希釈直線は理
論希釈直線と全く解離してしまった。以上により、本発
明の(a)の場合のみが、血清中の肺疾患マーカー蛋白
の測定に適することが判明し、また、血清を4〜16倍
まで希釈し。
ても肺疾患マーカー蛋白が高感度に測定できることがわ
かった。
かった。
(4)免疫反応における血清検体希釈緩衝液中の陰イオ
ン2・′非イオン界面活性剤の比の検討血清検体希釈緩
衝液とし、て5トリトンX100 、1.2.3.4%
にそれぞれSDSが1,751、.5.1.25.1.
0.0.75%含有する混合液を用いて、血清検体の希
釈系列を含むこの混合液と、F(RP標識モノクローナ
ル抗体PE−10希釈とを、各々200 )llJずつ
試験管中のモノクローナル抗体P C,−6固定ボール
に加え、免疫反応を行ったり37°C290分)。以下
、実施例1(3)に従って、免疫反応終了後吸光度を測
定し、界面活性剤の陰イオ〉= /非イオシ・比に対し
てプロットしな。その結果を図3に示す5゜ 図中07−−−−○Trfton X−100,1%、
・−m=−・同2%、△−−−−へ同3%、ム一一〜−
一−−ム同4%を用いた時の測定値を示す。
ン2・′非イオン界面活性剤の比の検討血清検体希釈緩
衝液とし、て5トリトンX100 、1.2.3.4%
にそれぞれSDSが1,751、.5.1.25.1.
0.0.75%含有する混合液を用いて、血清検体の希
釈系列を含むこの混合液と、F(RP標識モノクローナ
ル抗体PE−10希釈とを、各々200 )llJずつ
試験管中のモノクローナル抗体P C,−6固定ボール
に加え、免疫反応を行ったり37°C290分)。以下
、実施例1(3)に従って、免疫反応終了後吸光度を測
定し、界面活性剤の陰イオ〉= /非イオシ・比に対し
てプロットしな。その結果を図3に示す5゜ 図中07−−−−○Trfton X−100,1%、
・−m=−・同2%、△−−−−へ同3%、ム一一〜−
一−−ム同4%を用いた時の測定値を示す。
図3から、 SDS/Triton X−100の至適
重量比は、0.25〜1.5であることがわかる。
重量比は、0.25〜1.5であることがわかる。
実施例2
実施例コ−の(a、)の条件、即ち、免疫反応緩衝液に
、0.6 %SDS、2.0%トリトン、Oo1%スキ
j\ミルクを加え、血清検体を用い免疫反応を行ない、
基本性能の1つである添加回収試験のチエツクを行なっ
た。すなわち、87.3mg、/ ml S P −A
含有血清に精製し7た肺疾患マーカー蛋白をそれぞれ、
0、1.54..8.3I2.3,464.3%g 、
、””mlを加えて本発明の方法にて測定した結果、表
1のごとく回収率は98.7−へ−106,4ジ;と良
好であった。
、0.6 %SDS、2.0%トリトン、Oo1%スキ
j\ミルクを加え、血清検体を用い免疫反応を行ない、
基本性能の1つである添加回収試験のチエツクを行なっ
た。すなわち、87.3mg、/ ml S P −A
含有血清に精製し7た肺疾患マーカー蛋白をそれぞれ、
0、1.54..8.3I2.3,464.3%g 、
、””mlを加えて本発明の方法にて測定した結果、表
1のごとく回収率は98.7−へ−106,4ジ;と良
好であった。
実施例3
検体の測定
実施例1によって、確立した測定系を用いて、間質性肺
炎(IPF)、サルコイド−シス(5arcoidos
is) 、肺炎(Pneumonia) 、肺結核(T
he)、およびステージ(stage) 工〜・■にあ
る肺線癌(Adreno carcinoma)、肺扁
平上皮癌(Squa、mouscell earcin
on+a)の患者について、その血清中の肺疾患マーカ
ー蛋白値を測定した。対照として健常人の血清中肺疾患
マーカー蛋白値を測定した。
炎(IPF)、サルコイド−シス(5arcoidos
is) 、肺炎(Pneumonia) 、肺結核(T
he)、およびステージ(stage) 工〜・■にあ
る肺線癌(Adreno carcinoma)、肺扁
平上皮癌(Squa、mouscell earcin
on+a)の患者について、その血清中の肺疾患マーカ
ー蛋白値を測定した。対照として健常人の血清中肺疾患
マーカー蛋白値を測定した。
結果を図3および図4に示した。
これらの結果から、明らかに間質性肺炎(I F)F)
、肺炎(Pneumonia)で高値を示し、earc
inomaでやや高値を示した。−・方、サルコイド
シス、肺結核(Tbc)では陽性を示さず、本発明のヒ
ト血中の肺疾患マーカー蛋白測定法は、上記種々の疾患
の鑑別診断やそれら疾患のモニタリングに有用である可
能性が示された。
、肺炎(Pneumonia)で高値を示し、earc
inomaでやや高値を示した。−・方、サルコイド
シス、肺結核(Tbc)では陽性を示さず、本発明のヒ
ト血中の肺疾患マーカー蛋白測定法は、上記種々の疾患
の鑑別診断やそれら疾患のモニタリングに有用である可
能性が示された。
図1は、実施例1の条件(a)にて免疫反応を行なった
ときの血清検体の希釈直線である。 図2は、実施例1の条件(1))にて免疫反応を行なっ
たときの血清検体の希釈直線である。 図3は、実施例1の(4)で界面活性剤の重1比を変え
て免疫反応を行なったときの測定値を示す。 図4は、患者検体くサルコイド−シス、間質性肺炎、肺
結核、肺炎)を、本発明の免疫測定法で測定した結果を
示す。 図5は、患者検体(肺線癌9肺扁平上皮癌)を、4本発
明の免疫測定法で測定した結果を示す。 図 ? 希釈f@率 希釈イ下之率 検体希釈液中の界面活性剤 (SDS/Tri士on x−100)重量比 505/Tr 士0n 100(重量比) 寸 凶 +□・
ときの血清検体の希釈直線である。 図2は、実施例1の条件(1))にて免疫反応を行なっ
たときの血清検体の希釈直線である。 図3は、実施例1の(4)で界面活性剤の重1比を変え
て免疫反応を行なったときの測定値を示す。 図4は、患者検体くサルコイド−シス、間質性肺炎、肺
結核、肺炎)を、本発明の免疫測定法で測定した結果を
示す。 図5は、患者検体(肺線癌9肺扁平上皮癌)を、4本発
明の免疫測定法で測定した結果を示す。 図 ? 希釈f@率 希釈イ下之率 検体希釈液中の界面活性剤 (SDS/Tri士on x−100)重量比 505/Tr 士0n 100(重量比) 寸 凶 +□・
Claims (10)
- (1)抗ヒト肺サーファクタントアポ蛋白(SP−A)
モノクローナル抗体を用いるヒト血中に存在する肺疾患
マーカーの測定方法。 - (2)該抗体が該SP−Aの異なるエピトープを認識す
る2つの抗体であって、反応系に[1]非イオンおよび
陰イオン界面活性剤、 [2]分子量1.6〜5.0万でかつ等電点が1.0〜
5.0である蛋白を同時に存在させることを特徴とする
請求項1記載の測定方法。 - (3)一方の抗体を担体に固定し、他方の担体を標識化
することを特徴とする請求項2記載の測定方法。 - (4)標識抗体が、西洋ワサビパーオキシダーゼで標識
化されることを特徴とする請求項2記載の測定方法。 - (5)該蛋白が、スキムミルクである請求項2記載の測
定方法。 - (6)陰イオン界面活性剤がアルキルスルホン酸塩類で
ある請求項2記載の測定方法。 - (7)非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンアル
キルフェノールエーテル類である請求項2記載の測定方
法。 - (8)陰イオン界面活性剤が、アルキルスルホン酸塩類
で、非イオン界面活性剤がポリオキシエチレンアルキル
フェノールエーテル類である請求項2記載の測定方法。 - (9)肺疾患が間質性肺炎、肺炎、肺線癌、又は肺扁平
上皮癌である請求項1記載の測定方法。 - (10)ヒト肺サーファクタントアポ蛋白の異なるエピ
トープを認識する2つの抗体試薬、非イオンおよび陰イ
オン界面活性剤、および分子量1.6〜5.0万で等電
点が1.0〜5.0である蛋白を含む免疫反応用緩衝液
からなることを特徴とする人血中に存在する肺疾患マー
カー蛋白の測定用キット。
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JP2110536A JP2517696B2 (ja) | 1990-04-27 | 1990-04-27 | 肺疾患マ―カ―蛋白の測定法 |
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