JPH049665A - 肺疾患マーカー蛋白の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （伺産業上の利用分野 本発明は人血中の肺疾患マーカー蛋白の測定法に関する
。さらに詳しくは、本発明はヒト肺サーフアクタン１〜
アポ蛋白（ＳＰ−Ａ）の異なるエピトープを認識する２
つの抗体を用い、反応系に特定の界面活性剤と蛋白を同
時に存在させることを特徴とする人血中の肺疾患マーカ
ー蛋白の測定法に関する。

（ロ）従来の技術及び発明か解決しようとする課題動物
の肺胞には、肺表面活性物質と称するリン脂質を主成分
とする生理活性物質が存在する。これは肺胞の内壁を覆
い、肺胞上皮保護作用を有すると共に、動物が呼吸機能
を維持する上に重要な生理的機能を有している。即ち、
肺表面活性物質は、呼吸時、呼気時における肺胞内面の
表面張力を変化させるといっな特異な表面活性を有して
おり、肺胞相互間の安定性に寄与して、抗無気肺作用を
示すと言われている。かかる肺表面活性′＋１７ｊＪＭ
が不足すると肺胞は虚脱し１、安定し７だ換気能ブ〕を
維持できなくなり例えば、新生児呼吸緊迫症候群（ＩＲ
ＤＳ）や、成人呼吸緊迫症候群（Ａ　Ｆ（Ｌ）　Ｓ　）
のごとき症状が表われる。

従来、羊水中の肺表面活性物質の量を測定または推定す
る方法としては、いくつかの方法が提案されている。例
えば、肺表面活性物質のマーカ・−として、羊水中のし
・′Ｓ比くレシチンとスフィンゴミエリンの比）や羊水
中のジパルミトイルホスファチジル＝１リン（ｉ）　Ｐ
　Ｐ　Ｃ）量が測定されているが、前者の方法は、肺表
面活性物質の主成分であるり〉′脂質を測定するもので
はなく、ＩＲＤＳとの相関性が低いという欠点があり、
後者の方法は、感度が悪いとい・う問題点がある。と、
：ろで、肺表面活性物質の約９０％はりン脂質や中性脂
質等の脂質であるが、約１０％は蛋白であり、これらは
脂質と蛋白の捏合体、即ちリボ蛋白として存在し７てい
る。肺表面活性物質から脂質を除去゛すると水不溶性の
蛋白が得られ、これをアポ蛋白（ｓｐＡ）と呼んでいる
が、分子量的３６．０００　（３６Ｋ　）の糖蛋白が主
成分である。リン脂質に比べ、アポ蛋白は特異性に優れ
また高感度に検出し得るので、肺表面活性物質のマーカ
ーとしてアポ蛋白を用いることも検３ゴされ、いわゆる
ポリクローナル抗体による免疫学的定量も行なわれてき
た１、シかしながら、ポリクローナル抗体を用いる方法
は、測定に長時間を要しまた感度も十分ではないという
問題点があった。　そこで、本発明者らは、肺表面活性
物質を構成するアポ蛋白に対するモノクローナル抗体を
作成し、これを用いて測定する方法を既に提案〈特開昭
６２−６４９５６号および特願昭６２−２１６３５５号
〜）しな。上記方法は、実用のなめに充分鋼えうる方法
であり、肺洗浄液、羊水および喀痰中のアポ蛋白の測定
に応用されている。

しかしながら、検体とＬ７て肺洗浄液、羊水等を入手す
ることは患者に非常な負担を伴う。また従来の方法では
血中のアポ蛋白の測定については言及していない。

一方、肺疾患には間質性肺炎、サルコイド−シス、肺炎
、肺結核あるいは肺腺癌、肺扁平上皮癌等の種々の肺疾
患が知られているが、ヒトの血中に存在すると予想され
るこれらの肺疾患マ・−カー蛋白を測定してその診断、
治療に用いることは、従来知られていない。

（ハ）課題を解決するための手段 本発明者らは、特開昭６２−６４９５６号に述べている
アポ蛋白に特異的な２種のモノクローナル抗体（例えば
ＰＥ−１０等）を用いて、ヒトの血中に存在する肺疾患
マーカー蛋白等免疫学的測定法の種々の条件を検討した
。

本発明者らの研究によると、特願昭６２−２１６３５５
号に述べたごとく、免疫反応に非イオン系と陰イオン系
の界面活性剤を共存させることにより、羊水中、肺胞洗
浄液中気道吸引液リボ蛋白中のアポ蛋白を正しくとらえ
ることを開示した。しかしながら、この方法を血液中の
肺疾患マーカー蛋白等の測定に応用する場合、その測定
系の感度および共存する血液成分による血清干渉が問題
であ・つな。

そこで本発明者らは、開示した発明をさらに発展させる
べく、血液中の肺疾患マーカーを感度よく測定できる方
法、およびキットを提供すべく鋭意研究し７た結果本発
明に到達したものである３、即ち本発明は、ヒト肺サー
ファクタントアポ蛋白（Ｓ　Ｐ−Ａ　）にえ１する異な
るエピト・−プを５忍識する２つの抗体を用いるヒト血
中の肺疾患マ・−カー蛋白の測定法、およびその測定用
キットである。

本発明においてヒトの血中に存在する肺疾患マーカー蛋
白とは、血清、血漿等のヒト血中に存在し１、かつ抗し
）−Ｓ　Ｐ〜Ａ抗体に交叉反応性を存する１種類または
２種類以上の蛋白であ・−７）で、例えば間質性肺炎２
肺炎、肺線癌、肺扁甲上皮癌等の肺疾患時に血中に何故
遊離されるのか詳細は不明であるが、これら疾患と相関
関係を示すものをいつ。

本発明者らによれば、この蛋白はＳ　Ｐ−Ａに対する抗
体（ＰＥ−１０）を用いてアフィニティ精製した結果、
分子量は２００００〜８００００に分布し２ていた。

またこの蛋白は抗ピトＳＰ−Ａ抗体と交叉反応性を示す
ことからＳＰ−Ａの分解物、複合体等も考えられる。

本発明においては、特に反応系に■非イオン・及び隘イ
オン界面活性剤、■分子量１．６・−１５，０万でかつ
等電点が１．０・へ・５，０である蛋白を同時に存在さ
せることが好まし、い。

かかる界面活性剤、蛋白を存在させることにより、血液
中の肺疾患マーカ・−蛋白を特に感度よく測定４ること
が＝ｉＴ能になったが、その理由は、次のよ・うなこと
が挙げられる。該マーカー蛋白は、羊水中や喀癲中に存
在するＳ　Ｐ−Ａと同様にリン脂質と複合体を形成して
いるリボ蛋白と思われる。

非イオン・陰イオン界面活性剤共存のみの場合、血中の
リボ蛋白は可溶化は十分となり該マーカー蛋白が免疫反
応に関与する抗体によって結合されることになる。しか
しながら、非特異吸着をおさえることができるような蛋
白成分が存在し５ないため、感度の低下が起こり、その
ため、血中で存在濃度が低い該マ・−カー蛋白を正し５
く測定できなくなる。

一方、そのような非特異吸着をおさえられる蛋白と非イ
オン界面活性剤のみの存在では、血中のリボ蛋白は可溶
化が不十分となり、該マーカー蛋白は、免疫反応に関与
する抗体に認識されず、従って、血中の該マーカー蛋白
を測定できない。しかしながら、非イオン・陰イオン界
面活性剤および特定の蛋白の共存により、それぞれの長
所が生かされ、即ち蛋白による非特異吸着の低Ｆおよび
リボ蛋白の可溶化によりそのアポ蛋白は抗体に効率よく
認識され、血中の非常に低い濃度で存在する該マーカー
蛋白を測定しうろことになる。

本発明に用いられる、肺サーファクタントアポ蛋白に対
する異なるエピトープを認識する２つの抗体に関し、で
は、既に特開昭６１−２７７６９９号に開小されたモ、
ツクローナル抗体ＰＣ−６，ＰＥ−１０等が挙げられる
。また測定法に関しては、特開昭６１２７５６５４号に
述べたが、異なるエピトープを認識する抗体はポリクロ
ーナル抗体でもかまわない４、本発明において反応系に
同時に存在させることのできる蛋白は分子量が１．６〜
５．０万で等電点が１．０〜５．０の範囲にあるものを
いう。

本発明におけるかかる蛋白とし２ては、ペプシン。

オボグリコブ１１ティン、オロンムコイドやカゼインや
カゼインと無機質の混合物であるスキムミルク等が挙げ
られる。分７−■１□６万以下の蛋白を用いた場合には
、非特異吸着が上昇し、てし、よう結果を得ており、ま
た５、０万以上の分子２では免疫非特異的反応の低減が
不十分かつ特異的免疫反応の低下が見られることにより
、本発明に使用する分子量を１，６〜５０万と決めた。

また等電点に関しても等電点５．０以上の蛋白を添加し
た場合、非特異吸着が上昇し７、また等電点１４０より
下では特異的反応がおさえられるために本発明に使用す
る蛋白の等電点の範囲を１．０−５．０と決めた。

特に、上記蛋白の中でもスキムミルクが望ましい。

本発明におい°Ｃは、かかる蛋白は免疫反応溶液中にお
ける最終濃度を０．０１−５０．９重量％の範囲にする
のが好ましい。例えばスキムミルクのＭＦｉ液中の濃度
をかかる範囲に調製すると、免疫測定法が高感度である
ためのンつの必須条件くずなわぢ、。

特異的反応を維持しながら、非特異反応を低減させる）
を満たずことが容易となる。スキムミルクは、０．９％
より濃い濃度では水に不溶であり、その懸濁液を用いて
ブ■７・ソキングするノごめ５ミクロ的にみれば、スＡ
・ムミルクの大きな不溶物が抗原を覆うため抗体が近づ
けなくなり、結果としζ、抗原抗体反応が大きく阻書さ
れやすくなる。３また０、０１％以下では、十分な非特
異吸着の低減効果が得られにくくなる。

また、上記蛋白と免疫反応溶液中に同時に共存させる本
発明に使用する界面活性剤どしては、非イオン界面活性
剤どしては、ポリオキシエチレンアルギルエーテル類、
ポリオキシエチレンアルギルフェノールニーデル類、ポ
リオキシエチレン脂肪酸エステル（モノ）類、ポリオキ
シエチ１／ンアルキルチオエ・・−デル類があり、また
、陸・イオシ界面活性剤としては、高級アルコール硫酸
ニスデル類、アルギルスルポン酸塩類、アルキルベンゼ
ンスルホン酸塩類、ジナフチルメタンジスルホン酸塩類
、アルキルスルホコハク酸塩類、ポリオキシエチレンア
ルキルエーテル硫酸ニスデル類３ポリオキシエ１１／ン
′アル−へ′・ルフエノ・−１し硫を変エステ・ル塩類
などが挙げられる、 非イオン界面活性剤としては２例えば、トす１〜ン（Ｒ
ｏｈｍ　＆、　Ｈａａｓ　Ｃｏ、製の商品名）の、′と
きポリオギシエヂレンアルーＳ−ルフェノールエーテル
類が好まし、く、陰イオン界１１１活性剤とし７ては、
ソジウムドデシルサルフエー）、（ＳＤＳ）のごときア
ルキルスルホン酸塩類が好ましい。濃度としでは、前者
は０．２５・〜４重量１゛。、後者は０．２−３重量％
程度用いるのが特に好：ｔ、　Ｌい。

ト・リドンは０．２’４．１ｍ％以北になると、免疫反
応の保護効果があられれ、４重量％を、−えると、免疫
反応を不安定にさせる傾向があられれる。また、ＳＯ３
は０，２重１％以上で界面活性効果があられれる。５ｒ
）Ｓが３重１％をこえると、その界面活性効果があまり
にも強力であり、ト・リド・〉・の濃度を増しても、そ
の免疫反応保護効果が発揮されにくくなる。

本発明においては非イオン及び陰イオン界面活性剤を併
用することが好ましいが、併用する場合の垂１比は陰イ
オン界面活性剤２．／非イオン界面活性剤−＝０．２５
〜１．５が好ま［，７い。

本発明においては、ヒト肺ナーフ７−クタントアボ蛋白
にｔＪする異なるエピトープを認識する２−）の抗体を
、それぞれを１１１次抗、２次抗体として用いる。かか
る１次抗体は担体に固定化し７ておくのが好ましいが、
固定化の方法は公知の方法を採用でき、担体どしては固
相の、例えば、ポリスチレン・、ポリエチレン′、ボリ
ブＹ７ビレン、ポリエステル、ポリアクリルニトリル、
ポリアクリレート。

デフ１′１ン等の弗素樹脂、ポリアセタール、架橋デキ
ストシン、ポリザラカライド等の高分子、その他紙、ガ
ラス、金属９アガロ・−スおよびこれらの組そ・ぜ等を
用いた、トレイ状１球状、繊維状、棒状、盤状７容器状
、セル、試験管などの種々の形状力くφげ′られ、ボー
／し１ビーズ′、ギヤ、゛ンイクロプｊ、・・−１・等
が好ましく使用される。

こしｅ、２次抗体は標識化さｔｔでいることが好まし、
いが、かかる２次抗体の標識化の方法や手段、それの検
出方法や手段は何ら限定されるものではなく、公知の方
法や手段、例えば放射性物質または酵素もしくは蛍光物
質で標識された抗免疫グロブリン抗体またはブドウ球菌
蛋白Ａとの２次反応により測定することもできる。標識
剤としては、酵素、蛍光物質２発光物質および放射性物
質が挙げられる。酵素を用いる方法＜ＥＩＡ）ではホー
スラディッシ、ス、パーオキシダーゼ、β−Ｄ〜ガラク
トシダーーーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素が
、放射性物質を用いる方法＜ＲＩＡ）では１２５Ｊ　、
　　１３１Ｊ　、　１４（：、　　３）（等が、蛍光物
質を用いる方法（ＦＩＡ、）ではフル第１／センイソチ
オサイアネート、フィコビリ１０デイン等、発光物質を
用いる方法ではイソルシノール、ルシゲニン等が通常使
用されるが、その標識剤の活性が測定可能であれば、そ
の他のものであ−ってもよい。

上記の方法の中で９．２次抗体に直接酵素が標識されて
いるものを用いることが望ましい。なぜなら、間接的な
方法では免疫反応が］、５ｔｅｐ多くなり実用的に不向
きであるからである、 標識剤が酵素である場合には、その活性を測定するなめ
に基質、必要により発色剤が用いら１する。

基質とし５ては例えば、ホースラディ・ソシュバーオキ
シダーゼの基質と［、て、２．２’　一つ′ジノン１−
３エヂルペンズチアソ″リシ′スルホシ′酸Ｊアシ・モ
Ｓニウム酸（−Ａ　Ｂ　”Ｔ”　Ｓ　）−１１２ｏ２．
　５−　アミノサリチル酸Ｈ２Ｏ２，ＣＬ−−フエ、二
トンジアミン−Ｈ２（刀、４−アミノアンチピリン　Ｈ
２Ｇ２、また、べ〉・ジジン（３３’、５．５’　　−
デトラメチルベンジジン等）−Ｈ２Ｏ２などが、β−丁
）−ガノクＩ・シダ・・−ゼの基質として、フル、オレ
セイン′−ジー（β−］）〜ガラクトピラノシド）、Ｏ
Ｌ−二）−ｒｒフェノール〜β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド、４−メチＩレウン・ペリフェリｌレーβＤ−−ガラ
クＩ・ピラノシドなど、アルカリフォスファターゼの基
質どし、てＯ−ニトロフェミニルフォ・スフニー・−ト
等を挙げることができる。測定のためには、これらの試
薬以外にも溶解剤、洗浄剤９反応停止側等の公知の試薬
が使用される。

本発明によるしＩ・・血中に存在する肺疾患マーカー蛋
白の免疫学的測定：方法 肺す−ファクタントアポ蛋自ＧＪ対するモ、／りｌ」−
ナル抗体〈１次抗体、　ＰＣ−６１を適当な不溶性担体
（例えばプラスザック容器）に固定化する（以１・°こ
れをパ固相抗体゛という）。次いで不溶性担体と測定し
、ようとする試薬または検体試料どの非特異的結合を避
けるために適当な物質（例えば牛血清アルブミン）で不
溶性担体の表面を被覆する。

このようにして得られた１次抗体が固定化された不溶性
担体を検体試料と、酵素で標識し、た抗腫サー・−・−
ファクタントア゛ボ蛋白抗体（２次抗体、　ＰＥ−１０
）（標識抗体）を、非イオン・陰イオ〉・界面活性剤と
、分子−量１．６・〜・５．０でかつ等電点が１．０−
５□０なる蛋白を同時に、免疫反応液、例えば免疫反応
用緩衝液に共存させ、一定時間および一定温度で接触さ
せ反応させる。免疫反応温度は０・〜、５０℃までよい
が、比較的高い温度で用いられる。ただし、低い温度の
免疫反応では、反応時間は長・く、比較的高い温度の免
疫反応では、免疫反応時間は短い。実用面から、常温（
２０℃）から４５℃が好んで用いらノ【る８：ｔｌを適
当な洗浄液で洗い、次いで不溶性担体上に存在する２次
抗体にｗ識された標識物質の１を測定する。

かくしてその値から検体試料中の肺サーフアクタ〉・ト
アボ蛋白の１を算出することができる。

本発明においては、検体試料どして血清、血漿等の血液
を用いる。

上記方法によ−って、ヒト血中の肺疾患マーカー蛋白の
測定が可能になるが、上記方法によ−って羊水中、肺洗
浄液中、喀痰中などの肺サーファクタント・アポ蛋白の
測定もｉｉｉ工能であることは言うまでもない。なお、
血中の該マーカー蛋白の測定にあっては、例えば崩清は
５２倍以上希釈することが望まし７い。

測定試薬およびキットの構成 本発明のヒト血中の肺疾患マーカー蛋白の測定法に用い
る測定試薬は、ヒト肺サーファクタントアポ蛋白に対す
る異なるエピトープを認識する２つの抗体試薬、非イオ
ンおよび陰イオンパ界面活性剤と分子量１゜６−７５，
０万でかり等電点１．０〜・５．０なる蛋白からなる。

なかでも、２つ・の抗体が上述１〜な不溶性担体に結合
し、な固相抗体試薬と、標識抗体試薬、および上述した
界面活性剤と蛋白を含有する免疫反応用Ｍ衝液とからな
る測定試薬が好ましい。

また、本発明のしト血中の肺疾患マーカー蛋白測定用キ
ットは、」・記の測定試薬と、これら測定試薬を能率よ
くかつ簡便に利用するための補助剤とし、て、例えば固
体状の試薬または液状の検体を溶解させるための溶解剤
、不溶性担体に非特異的に結合し７た抗原１抗体を洗浄
するために使用される洗浄剤、および酵素で標識化した
抗体を用いる場合には、酵素活性を測定するための基質
およびその反応停止剤、その他の免疫学的測定用のキッ
トとして通常使用されるものが挙げられる。

かかるキットにおいて５本発明による非イオンおよび陰
イオン界面活性剤と分子量１６−・５，０万でかつ等電
点１．０〜・５゜０なる蛋白は検体を溶解させるための
溶解剤に加えることが望まし６い。

（ホ）発明の効果 本発明により、ヒＩ・血中などに存在する肺疾患マーカ
ー蛋白を、極めて高感度に測定可能となり、従って小量
の検体と短い時間で容易に測定できる。

以上により、肺線癌や他の肺疾患を、細巾の肺疾患マー
カー蛋白を測定することにより、その診断が可能となる
。

（へ）実施例 以下、実施例により、本発明を詳述する。

実施例１　　血清中の肺疾患マーカー蛋白測定条件の検
討 （１）モノクローナル抗体不溶化ビーズをよく洗浄して
から、モノクｌ−７−ナル抗体ＰＣ−６の２０μｇ／ｍ
１の濃度を有するＴ″’ＢＳ　（ｐＨ７，４）溶液中に
、４℃の温度で１昼夜放置しな。その後、ビーズをＰＢ
Ｓ溶液で洗浄してから、０，５％牛血清アルブミ７（Ｂ
ＳＡ）水溶液中に、４°Ｃの温度で１昼夜放置してポス
トコーディング処理を実施して、モノクローナル抗体不
溶化ビーズを得た。

（２）ホースラデイツシュ・ペルオキシダーゼ標識モノ
クローナル抗体の調製 モノクローナル抗体ＰＥ−１０の１．０ｍｇ　７’ｍｌ
のＰＢＳ溶液に、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）Ｎ−
−−サクシンイミドエスデル（ＭＢＳ）の１０ｍｇ／ｎ
ｉｌの濃度のジメチルホルムアミド溶液５０ｍを添加し
、２５℃の温度で３０分間反応さぜな。次いで、セファ
デックスＧ−２５を充填し、たカラムを用い、０□１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６，０）でゲル濾過を行ない、マレ
イミド化モノクロ・−ナル抗体と未反応ＭＢＳとを分Ｍ
した。

一方、ホースラデイツシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ
　）の１．０ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液に、Ｎザクシンイ
ミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネ−）１３
ＰＯＰ）のＩＯＢ／ｍｌの濃度のエタノール溶液を添加
し、２５°０で３０分間反応させた。次いで、セファデ
ックスＧ−２５を充填し。

たカラムを用い、Ｏ，０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５＋
でゲル濾過して精製し、ピリジルジスルフィド化ＨＲＰ
を含有する両分を採集して、コロジオンバック中におい
て水冷下に約１０倍に濃縮した。

次に、これに０．８５％ＮａＣ１と０．１Ｍジチオスレ
イトールとを含有する０、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５
１１ｍｌを添加し、２５℃で３０分間攪拌し５て、）（
ＲＰ分子中に導入したピリジルジスルフィド基を還元し
た。次いで、セファデックスＧ−２５カラムにかけてゲ
ル濾過し、チオール化ＨＲＰを含有する画分を得た。

上記の如くし２て得られたマレイミド化モノクローナル
抗体とチオール化ＨＲ，Ｐとを混合し７、コロジオンバ
ックを用いて水冷下に４ｍｇの蛋白質濃度まで濃縮し、
４℃で１昼夜放置’ｔ、ｆｓ後、ウルトロゲルＡｅＡ４
４を充填しなカラムでゲル濾過し７、ＨＲＰ標識モノク
ローナル抗体を得た。

（３）血清中の該マーカー蛋白（肺疾患マーカ・−蛋白
）の測定 血清検体希釈緩衝液と１５で（ａ）　０．６％ＳＤＳ。

２．０％トリトンＸ−１００、０，１％スキムミルク、
（ｂ）０．６％ＳＤＳ、２．０％トリトンＸ−１００、
（ｃ）　２．０％トリトンＸ−１００、０，１％スキム
ミルクを含む混合液３種を用い、血清検体の希釈系列を
含むこの混合液とＨＲＰ標識モノクローナル抗体ＰＥ−
１０希釈液とを、各々２００μｎｉずつ試験管中のモノ
クローナル抗体ＰＣ−６固定ボールに加え、免疫反応を
行なった（３７℃、２時間）。

次に、試験管の溶液を吸引除去後、生理食塩水で洗浄し
てから、３．３’　、　５．５’　−デトラメチルベ〉
′ジジン１％含有メタノール溶液／Ｈ２Ｏ２０，０１５
％を含有する１Ｍリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ４，５
）の３／７　　（Ｖ／Ｖ）混合溶液を、各０．４ｍｌず
つ各試験管内に加え、室温で１５分間インキュベートし
た後、反応停止剤とじて１．５　ＮＨ２ＳＯ４水溶液を
２ｍｌずつ加えて、酵素反応を停止さぜな。そして分光
光度計を用いてこの溶液の４５０ｎｍの波長の吸収強度
を測定した。

−力、肺胞蛋白症から精製したアポ蛋白を標準物質とし
、前記と同じ混合液を希釈緩衝液とし、前記と同様にし
てＳＤＳのそれぞれの濃度に対応し、た検量線を作成し
ておいた。そして、対応するＳＤＳ濃度の検量線を用い
て、前記のごとくして得られた４５０　＋ｏｎの吸収強
度から、該マーカー蛋白（肺疾患マーカー蛋白）の濃度
を求めた。」−記により得られた値により、希釈直線を
得た５、そのうち緩衝液（ａ）を用いた結果を図］に、
桜橋液（ｂ）を用いた結果を図２に示し図中Ｘ−−Ｘ　
、　００．・−−〜−・、△〜−〜−〜〜△は各々４患
名検体について測定しまた結果を小−４゜ 図１かち、（ａ）を用いた場合には、血清４倍希釈かち
、その希釈直線は理論希釈直線と平行し正しい値を示し
２ていることがわかる。一方、図２からｆｂ）を用いた
場合には、非特異吸着が大きくその希釈直線も、低濃度
領域において理論希釈直線と平行にならず、（ｂ）の方
法は、血清系を測定するのに不適切であることがわかる
。

また（Ｃ）を用いた場合には、検体内の該マーカー蛋白
の可溶化が不十分のため、高濃度領域から希釈直線は理
論希釈直線と全く解離してしまった。以上により、本発
明の（ａ）の場合のみが、血清中の肺疾患マーカー蛋白
の測定に適することが判明し、また、血清を４〜１６倍
まで希釈し。

ても肺疾患マーカー蛋白が高感度に測定できることがわ
かった。

（４）免疫反応における血清検体希釈緩衝液中の陰イオ
ン２・′非イオン界面活性剤の比の検討血清検体希釈緩
衝液とし、て５トリトンＸ１００　、１．２．３．４％
にそれぞれＳＤＳが１，７５１、．５．１．２５．１．
０．０．７５％含有する混合液を用いて、血清検体の希
釈系列を含むこの混合液と、Ｆ（ＲＰ標識モノクローナ
ル抗体ＰＥ−１０希釈とを、各々２００　）ｌｌＪずつ
試験管中のモノクローナル抗体Ｐ　Ｃ，−６固定ボール
に加え、免疫反応を行ったり３７°Ｃ２９０分）。以下
、実施例１（３）に従って、免疫反応終了後吸光度を測
定し、界面活性剤の陰イオ〉＝　／非イオシ・比に対し
てプロットしな。その結果を図３に示す５゜ 図中０７−−−−○Ｔｒｆｔｏｎ　Ｘ−１００，１％、
・−ｍ＝−・同２％、△−−−−へ同３％、ム一一〜−
一−−ム同４％を用いた時の測定値を示す。

図３から、　ＳＤＳ／Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００の至適
重量比は、０．２５〜１．５であることがわかる。

実施例２ 実施例コ−の（ａ、）の条件、即ち、免疫反応緩衝液に
、０．６　％ＳＤＳ、２．０％トリトン、Ｏｏ１％スキ
ｊ＼ミルクを加え、血清検体を用い免疫反応を行ない、
基本性能の１つである添加回収試験のチエツクを行なっ
た。すなわち、８７．３ｍｇ、／　ｍｌ　Ｓ　Ｐ　−Ａ
含有血清に精製し７た肺疾患マーカー蛋白をそれぞれ、
０、１．５４．．８．３Ｉ２．３，４６４．３％ｇ　、
、””ｍｌを加えて本発明の方法にて測定した結果、表
１のごとく回収率は９８．７−へ−１０６，４ジ；と良
好であった。

実施例３ 検体の測定 実施例１によって、確立した測定系を用いて、間質性肺
炎（ＩＰＦ）、サルコイド−シス（５ａｒｃｏｉｄｏｓ
ｉｓ）　、肺炎（Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）　、肺結核（Ｔ
ｈｅ）、およびステージ（ｓｔａｇｅ）　工〜・■にあ
る肺線癌（Ａｄｒｅｎｏ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肺扁
平上皮癌（Ｓｑｕａ、ｍｏｕｓｃｅｌｌ　ｅａｒｃｉｎ
ｏｎ＋ａ）の患者について、その血清中の肺疾患マーカ
ー蛋白値を測定した。対照として健常人の血清中肺疾患
マーカー蛋白値を測定した。

結果を図３および図４に示した。

これらの結果から、明らかに間質性肺炎（Ｉ　Ｆ）Ｆ）
、肺炎（Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）で高値を示し、ｅａｒｃ
ｉｎｏｍａでやや高値を示した。−・方、サルコイド　
シス、肺結核（Ｔｂｃ）では陽性を示さず、本発明のヒ
ト血中の肺疾患マーカー蛋白測定法は、上記種々の疾患
の鑑別診断やそれら疾患のモニタリングに有用である可
能性が示された。

【図面の簡単な説明】

図１は、実施例１の条件（ａ）にて免疫反応を行なった
ときの血清検体の希釈直線である。 図２は、実施例１の条件（１））にて免疫反応を行なっ
たときの血清検体の希釈直線である。 図３は、実施例１の（４）で界面活性剤の重１比を変え
て免疫反応を行なったときの測定値を示す。 図４は、患者検体くサルコイド−シス、間質性肺炎、肺
結核、肺炎）を、本発明の免疫測定法で測定した結果を
示す。 図５は、患者検体（肺線癌９肺扁平上皮癌）を、４本発
明の免疫測定法で測定した結果を示す。 図 ？ 希釈ｆ＠率 希釈イ下之率 検体希釈液中の界面活性剤 （ＳＤＳ／Ｔｒｉ士ｏｎ　　ｘ−１００）重量比 ５０５／Ｔｒ 士０ｎ １００（重量比） 寸 凶 ＋□・

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗ヒト肺サーファクタントアポ蛋白（ＳＰ−Ａ）
   モノクローナル抗体を用いるヒト血中に存在する肺疾患
   マーカーの測定方法。
2. （２）該抗体が該ＳＰ−Ａの異なるエピトープを認識す
   る２つの抗体であって、反応系に［１］非イオンおよび
   陰イオン界面活性剤、 ［２］分子量１．６〜５．０万でかつ等電点が１．０〜
   ５．０である蛋白を同時に存在させることを特徴とする
   請求項１記載の測定方法。
3. （３）一方の抗体を担体に固定し、他方の担体を標識化
   することを特徴とする請求項２記載の測定方法。
4. （４）標識抗体が、西洋ワサビパーオキシダーゼで標識
   化されることを特徴とする請求項２記載の測定方法。
5. （５）該蛋白が、スキムミルクである請求項２記載の測
   定方法。
6. （６）陰イオン界面活性剤がアルキルスルホン酸塩類で
   ある請求項２記載の測定方法。
7. （７）非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンアル
   キルフェノールエーテル類である請求項２記載の測定方
   法。
8. （８）陰イオン界面活性剤が、アルキルスルホン酸塩類
   で、非イオン界面活性剤がポリオキシエチレンアルキル
   フェノールエーテル類である請求項２記載の測定方法。
9. （９）肺疾患が間質性肺炎、肺炎、肺線癌、又は肺扁平
   上皮癌である請求項１記載の測定方法。
10. （１０）ヒト肺サーファクタントアポ蛋白の異なるエピ
    トープを認識する２つの抗体試薬、非イオンおよび陰イ
    オン界面活性剤、および分子量１．６〜５．０万で等電
    点が１．０〜５．０である蛋白を含む免疫反応用緩衝液
    からなることを特徴とする人血中に存在する肺疾患マー
    カー蛋白の測定用キット。