JPS61275654A - ヒトの肺表面活性物質の測定方法及びそれに用いる試薬キツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 本発明は、ヒトの肺表面活性物質のアポ蛋白に対するモ
ノクローナル抗体を利用した、ヒトの肺表面活性物質の
測定方法、及びそのために用いられる試薬キットに関す
るものである。

（○）従来の技術 動物の肺胞には、肺表面活性物質と称するリン脂質を主
成分とする生理活性物質が存在する。これは肺胞の内壁
を覆い、肺胞上皮保護作用を有すると共に、動物が呼吸
機能を維持する上に積装な生理的機能を有している。即
ち、肺表面活性物質は、呼気時、吸気時における肺胞内
面の表面張力を変化させるといった特異な表面活性を有
しており、肺胞相互間の安定性に寄与して、抗無気肺作
用を示すと云われている。かかる肺表面活性物質が不足
すると肺胞は虚脱し、安定した換気能力を維持できなく
なり例えば、新生児呼吸窮迫症候群（ＩＲＤＳ）のごと
き症状が現われる。

かかる疾患を有する新生児の出生を予防するためには、
胎児肺の成熟度と関連のある羊水中の肺表面活性物質の
量を測定し、胎児が未熟肺のまま出生しようとしている
場合には、例えば、ステロイド投与による肺表面活性物
質の分泌促進といった、子宮内治療を行なうことが可能
である。

そして、従来、羊水中の肺表面活性物質の量を測定又は
推定する方法としては、いくつかの方法が提案されてい
る。例えば、肺表面活性物質のマーカーとして、羊水中
のＬ／Ｓ比（レシチンとスフィンゴミエリンの比）や羊
水中のジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ
）Ｉが測定されているが、前者の方法は、肺表面活性物
質の主成分であるリン脂質を測定するものではなく、Ｉ
ＲＤＳとの相関性が低いという欠点があり、後者の方法
は、感度が悪いという問題点がある。ところで、肺表面
活性物質の約９０％はリン脂質や中性脂質等の脂質であ
るが、約１０％は蛋白であり、これらは脂質と蛋白の複
合体、即ちリボ蛋白として存在している。肺表面活性物
質から脂質を除去すると水不溶性の蛋白が得られ、これ
をアポ蛋白と呼んでいるが、分子量約３６，０００　（
３６Ｋ　＞の蛋白が主成分である。リン脂質に比べ、蛋
白は特異性に優れまた高感度に検出し得るので、肺表面
活性物質のマーカーとして蛋白を用いることも検討され
、いわゆるポリクローナル抗体による免疫学的定量も行
なわれてぎた。しかしながら、ポリクローナル抗体を用
いる方法は、測定に長時間を要しまた感度も十分ではな
いという問題点があった。

（ハ）　発明が解決しようとする問題点以上の問題点を
解決し、羊水等の検体中に存在する微量の肺表面活性物
質を、短時間に感度よく測定するためには、肺表面活性
物質を構成するアポ蛋白に対するモノクローナル抗体を
得る必要があるが、現在までその様なモノクローナル抗
体は得られていない。

に）問題点を解決するための手段 本発明者らは、肺表面活性物質が大量蓄積する肺胞蛋白
症患者の気管支肺洗浄液から、肺表面活性物質のアポ蛋
白を分離精製し、そのアポ蛋白に特異的な２種類のモノ
クローナル抗体を作製し、これらを用いて免疫学的測定
法の検討を行った。

その結果、本発明に係る２つのモノクローナル抗体は、
肺表面活性物質の測定用試薬として極めて有用であるこ
とを知見し、本発明に到達した。

即ち、本発明は、免疫学的方法により検体中のヒトの肺
表面活性物質を測定する方法において、ヒトの肺表面活
性物質のアポ蛋白を認識する第一のモノクローナル抗体
と、該アポ蛋白を認識するが第一のモノクローナル抗体
とは異なる抗原部位と結合する第二のモノクローナル抗
体を用いることを特徴とする、検体中のヒトの肺表面活
性物質の測定方法である。本発明におけるモノクローナ
ル抗体の中で反応性や安定性の点で特に好ましいのは、
分子団が約６２，０００及び／又は約３４　、０００〜
３７．０００のアポ蛋白を認識する抗体であり、しかも
１（ＩＧ型のマウス抗体が好ましい。

本発明におけるモノクローナル抗体は、好ましくは、ヒ
トの肺表面活性物質のアポ蛋白で免疫された動物の抗体
産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合させることによっ
て、該アポ蛋白を認識するモノクローナル抗体を産生ず
るハイブリドーマを得、次いで、該ハイブリドーマ及び
／又はそれに由来する細胞株を培養し、培養物からヒト
の肺表面活性物質のアポ蛋白を認識するモノクローナル
抗体を採取することによって得られる。

本発明における肺表面活性物質は、ヒトの肺及び／又は
気管支の洗浄液から、好ましくは肺胞蛋白症患者の気管
支肺洗浄液から分離・採取される。

肺表面活性物質は、約９０％の脂質と約１０％の蛋白と
の複合体（リボ蛋白）であり、これから公知の方法、例
えばＦ　ｒＯ３Ｏ１ｏｎｏの方法（Ｊ、　ＬｉｐｉｄＲ
ｅｓ、　１１．　４３９−４５７（１９７０）参照）に
よって肺表面活性物質を得、次いで脂質を除去すると、
本発明におけるアポ蛋白が得られる。アポ蛋白は分子」
約６２．０００と約３６．０００の蛋白が主成分である
が、分子６約３６，０００の蛋白は、ソジウムドデシル
サルフエートーポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）では幅広いバンドとして分離し、この中
には分子６約３７，０００と約３４，０００の蛋白も含
んでいると考えられる。従って、本発明におけるアポ蛋
白とは、これらの蛋白及びその他のすべてのアポ蛋白又
はそれらのフラグメントを意味するものである。なお、
蛋白の分子量は５Ｏ８−ＰＡＧＥにより測定した。

アポ蛋白を認識するモノクローナル抗体を産生ずるハイ
ブリドーマは、手法それ自体は公知である１ｌｌ１１１
融合法によって製造することができる。まず、アポ蛋白
でサル、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ。

ウサギ、ラット、マウス等の動物を免疫し、次いでこれ
らの動物の牌臓やリンパ節等から抗体産生細胞（リンパ
球）を採取し、そして、この細胞をヒト又は動物のミエ
ローマ細胞と融合させる。ミニ［コーマ細胞としてはマ
ウスのミエローマ細胞を用いるのが便利であり、これら
の例としては、ＢＡＬＢ／ＣマウスのＰ　３−Ｘ　６３
−’Ａ　ｇ８．　Ｐ　３−Ｘ　６３−Ａｇ８−　Ｌｊ　
１　　、Ｐ３−Ｎ　Ｓ　１　／　１−Ａ＋７４−１．Ｐ
３−Ｘ６３−Ａ（１８６，５，３，５Ｐ２１０−Ａｏ１
４　　、　　ＦＯ，ＭＰＣ１１−４５，６ＴＧ　１．７
などがある。

細胞融合の条件は、例えば次の通りである。抗体産生細
胞とミエローマ細胞を１０：１〜１〜１０゜好ましくは
１：１〜１：３の比率で混合し、適当な細胞融合用溶液
、例えば約３５％ポリエチレングリコール（分子量１，
０００〜６，０００程度）および約７．５％ジメチルス
ルホキシドを含むＲＰＭ　Ｉ　１６４０を加えて、室温
〜３７℃で１〜数分間撹拌し、その後１０％ＦＣ３７Ｊ
ＯＲＰＭ　１１６４０Ｔ−徐々１．ｌ釈シ、洗浄の後Ｈ
ＡＴ　（ヒボキサンチン−アミノプテリン−チミジン）
選択培養液にて細胞濃度が１〜５Ｘ１０５個／ｍｅとな
るように調整する。これを０　、２　ｍｅずつ、例えば
９６穴プレートに分注し、５％ＣＯ２を含む空気中で３
５〜３８℃で２〜３３１ｉ４間＠養する。

ＳＡＴ培養液中ではハイブリドーマのみが存在し、８−
アザグアニン耐性のミエローマ細胞及びミエローマ同士
の融合細胞は生存し得ない（未融合の抗体産生細胞は数
日で死滅する）。次に、このハイブリドーマ集落から、
アポ蛋白に対し特異的なモノクローナル抗体を分泌する
ものだけ選別する。

この選別工程（スクリーニング）は、それぞれのバイプ
リドーマより産生されたモノクローナル抗体が、目的と
するアポ蛋白と抗原抗体反応をするか否かを酵素抗体法
で調べることによって行なう事ができる。目的とするモ
ノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマは、次にク
ローニングによりクローン化細胞にしなくてはならない
。この工程は、具体的には限界希釈法を用い行う事がで
きる。約２〜３遍間後、９６穴のプレート中で生育した
コロニーを拾い、再び酵素抗体法でアポ蛋白に対する抗
体活性を調べ選別したハイブリドーマを培養して、所望
のアポ蛋白に特異的なモノクローナル抗体を生成させる
。

モノクローナル抗体を得るためのもう一つの方法は、抗
体産生細胞にエプスタイン・バー・ウィルス（Ｅ　ｐｓ
ｔｅｉｎ　−Ｂ　ａｒｒ　Ｖ　１ｒｕｓ、以下Ｅ−Ｂウ
ィルスと略称する）を感染させて形質転換細胞を作成し
、該形質転換細胞及び／又はそれに由来する細胞株を培
養し、培養物からアポ蛋白に結合する性質を有するモノ
クローナル抗体を採取する方法である。

Ｅ−８ウイルスは、バーキットリンパ種や鼻咽頭ガンの
原因ウィルスとされている、ヘルペスウィルス群に属す
るウィルスである。抗体産生細胞をＥ−８ウイルスに感
染させ、約２〜３週間、５％ＣＯ２インキユベータで培
養し、多くの異質集落から成る形質転換細胞（トランス
７オームドセル）を形成させる。次に、この形質転換細
胞から、アポ蛋白に対し特異的なモノクローナル抗体を
分泌するものだけを、前記と同様な方法で選別する。

そして、前記と同様にして、クローン化された形質転換
細胞を得ることができる。

次に、本発明においては、選択したハイブリドーマ又は
形質転換細胞を培養して、所望の特異的モノクローナル
抗体を生成させる。クローニングによって選択された、
肺表面活性物質のアポ蛋白を認識する抗体を産生ずるハ
イブリドーマ又は形質転換は凍結して保存することがで
き、また、これを適当な方法で大量に培養することもで
きる。

そして、培養上清からアポ蛋白に特異的に結合するモノ
クローナル抗体を得ることができる。また、かかる細胞
を動物に移植して腫瘍化し、その腹水や血清から目的と
する抗体を得ることもできる。

本発明におけるモノクローナル抗体の精製は、プロティ
ンＡ等を用いるアフィニティクロマトグラフィー等の方
法によって行なわれる。

本発明においては、前述の如き方法によって、ヒトの肺
表面活性物質のアポ蛋白を認識する２種類のモノクロー
ナル抗体ＰＣ６とＰ　Ｅ　１０が得られた。これらは、
アポ蛋白のお互いに異なる抗原部位を認識するモノクロ
ーナル抗体であった。

従って、両抗体のサンドイッチによる固相酵素免疫測定
法（ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｈｏｓｏｒ
ｂｅｎｔ　ａＳＳ−ａｙ、ＥＬＩＳＡ）が可能となった
。

ＥＬＩＳＡ法の検討では、固相ＰＣ６とビオチン化Ｐ　
Ｅ　１０の組合せが、アポ蛋白を最も感度よく測定でき
た。このサンドイッチＥＬＩＳＩＡを用いて、各動物種
の肺アポ蛋白の測定を行った。この結果、ヒト肺、ヒト
羊水のみが測定可能で、他勅物種肺およびヒト血清では
、全く測定されなかった。即ち、両抗体はヒト肺、羊水
に特異的であり、本発明におけるアポ蛋白は血清由来で
はないことが明らかとなった。

また、２点同時免疫測定法（ｔＷｏ−８ｉｔ１３５ｉｌ
ｔｌｌｔａｎｅｏｕｓ　ｉｍｕｎｏａｓｓａｙ）　、即
ち、マイクロプレートに固定した第一のモノクローナル
抗体（１次抗体）。

抗原（アポ蛋白）、ビオチン化した第二のモノクローナ
ル抗体（２次抗体）を同時に反応せしめることで、測定
時間を短縮することもできた。また、ブロッキング剤に
スキムミルク（脱脂乳）を用いてバックグランドを著明
に低下できた。

本発明においては、１次抗体を担体に固定化しておくの
が好ましいが、固定化の方法は公知の方法を採用でき、
担体としては固相の、例えば、ポリスチレン、ポリエチ
レン、ポリアクリレート。

テフロン、ポリアセタール等を用いた、ボール。

ビーズ、ギヤ、マイクロプレートが好ましく使用される
。

また、標識化の方法や手段、それの検出方法や手段は何
ら限定されるものではなく、公知の方法や手段、例えば
、放射性物質又は酵素若、シクは螢光物質で標識された
抗免疫グロブリン抗体またはブドウ球菌蛋白Ａとの２次
反応により測定することができる。標識剤としては、酵
素を用いる方法（ＥＩＡ＞ではホースラデイシュパーオ
キシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォ
スファターゼ等の酵素が、放射性物質を用いる方法（Ｒ
ＩＡ＞では１３８■、　　ａＨ等が、螢光物質を用いる
方法（ＦＩＡ）ではフルオレセンインチオサイアネート
等が通常使用されるが、その標識剤の活性が測定可能で
あれば、その他のものであってもよい。

標識剤が酵素である場合には、その活性を測定するため
に基質が用いられる。基質としては例えば、ホースラデ
ィツシュパーオキシダーゼの基質として、２．２′　ア
ジノジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］ア
ンモニウム酸（ＡＢＴＳ）−Ｈｚ　０２．５−アミノサ
リチル酸−Ｈｚ　０２　。

Ｏ−フェニレンジアミン−Ｈ２０２，４−アミノアンチ
ピリン−Ｈｚ　Ｏｚなどが、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
の基質として、フルオレセイン−ジー（β−Ｄ−ガラク
トピラノシド）、ｏ−ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシドなどを挙げることが出来る。測定のため
には、これらの試薬以外にも溶解剤、洗浄剤９反応停止
剤等の公知の試薬が使用される。

本発明において、好ましく用いられるのは、ピオチン化
抗体と、酵素標識化アビジンの組み合せである。アビジ
ンとは卵白中に存在する谷子量約６８．０００の塩基性
糖蛋白質であり、ビタミンＨとして知られるビオチンと
極めて高い親和性（ＩＩ相性定数１０”　Ｍ　−１）を
有することが知られている。アとジンは、４個のサブユ
ニットから成ることが知られているが、本発明のアビジ
ンとはこれらのサブユニットも含む。

本発明は、また、前述した様な抗体及び試薬類のキット
化したものも、その範囲に含むものである。この好まし
い例は、（１）ヒトの肺表面活性物質のアポ蛋白をｌｉ
Ｈ！する、担体に固定された第一のモノクローナル抗体
（１次抗体）と、（２）該アポ蛋白をｉｌ識するが１次
抗体とは異なる抗原部位と結合する、標識化された第二
のモノクローナル抗体（２次抗体）と、（３）必要によ
り、該標識化抗体の検出試薬を主要構成成分とする、免
疫学的方法により、ヒト羊水やヒト肺又は気管支洗浄液
中に存在する肺表面活性物質を測定するための、試薬キ
ットである。

（菊　発明の効果 この方法で、肺表面活性物質中のアポ蛋白は１０−６４
０ｎｏ／ｉｆの範囲で測定可能で、変動係数（Ｖ　ａｒ
ｉａｔｉｏｎ　ｃｏｅｒｒｔｃｔｅｎｔ）は６％以下で
あった。

ヒト羊水は、水沫により０．２１で測定可能である。

そして、この方法によれば、後述の第１表に示す通り、
妊娠３０週前のアポ蛋白濃度は非常に低いが、３４週か
ら３６週の間ではこの値の６．５倍となり、３７週以降
は１５．５倍に増加した。即ち、羊水中の肺表面活性物
質のアポ蛋白濃度は、出産前に激増する。

そして、この妊娠運用における羊水アポ蛋白のパターン
は、羊水リン脂質（Ｌ／Ｓ比、ＤＰＰＣ）の胎生用増量
パターンによく一致した。

（へ）以下、実施例により本発明を詳述する。

実施例１ （１）肺胞蛋白症患者の肺及び気管支を、治療の目的で
、０．１５　Ｍ塩化ナトリウム溶液で洗浄し、気管支洗
浄液中 ＬＦを３００ｘ　ｇで１０分間遠心分離し、細胞及び細
胞破片を除去した。次いで、得られた上清を４８０００
ｘ　ｇで２０分間遠心分離し、沈渣画分を採取した。

この沈渣画分を、１４５１Ｍの塩化ナトリウム、１１Ｍ
のエチレンジアミン西遊酸二ナトリウムを含む１０１Ｍ
のトリス１衝液（ｐｈ７，４　）　８０ｍ１！に懸濁し
、０．２５　Ｍと０．６５　Ｍの不連続ショ糖密度勾配
による遠心分離を、４００００Ｘ　９で６０分間行なっ
た。

０．２５　Ｍと０．６５　Ｍのショ糖溶液のＩＢ画分を
採取し、上記緩衝液４００ｄに再懸濁した。そして、こ
の懸濁液を、４８０００Ｘ　９で３０分間遠心分離し、
沈澱物（肺表面活性物質）を得た。

アルブミン等の不純物を除くためにこの沈澱物を、１％
のトリトンＸ−１００（ポリオキシエチレンアルキルフ
ェニルエーテル）、３ｍＭのＥＤＴＡ、１ｇ＋Ｍのフェ
ニルメチルスルホニル７０リド。

０．５　ｍＭのジチオスレイトールを含む５　ｇｉＭの
トリス緩衝液（Ｅ）Ｈ７，８，以後トリトン緩衝液とい
う）　２７ＩＩＩに静かに分散させた。この分散液を１
５００００×９で６０分間遠心分離し、沈澱物（精製肺
表面活性物質）を得た。

この沈澱物を、上記トリトン緩衝液４Ｉ１１に再分散し
、この再分散液に４ｄのブタノール−エタノール混合液
（容８比６：１）を添加し、激しく振とうして、０℃で
１０分間放置し脂質を抽出除去した後、２０００ｒ、ｐ
）、で１５分間遠心分離し、沈澱物（アポ蛋白）を得た
。この操作をもう３回繰り返し、最終的なアポ蛋白の沈
澱を得た。

この沈澱物をトリトン緩衝液２０ｍに懸濁し、同じトリ
トン緩衝液に対してセロハン膜を用いて透析しくブタノ
ールエタノールの除去）、透析内液を得た。この透析内
液を、１５００００ｘ　ｇで６０分間遠心分離し上清を
得た。沈澱物には再びトリトン緩衝液２０ｍを添加し可
溶化した後、１５００００ｘ　ｇで６０分間遠心分離し
上清を得た。この操作をもう６回行ない上清を集めた。

得られた上清は合算して１５０１ｇであった。この上清
を、トリトン緩衝液で平衡化したブルーセファロース４
Ｂカラム（直径１．８ｃａ　Ｘ　３．５ＣＩＡ＞に注加
し、同緩衝液を用いて溶出し、素通り画分を採取するこ
とによって混在するアルブミンを完全に除去した。

この画分を、トリトン緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−ト
ーヨーバールカラム（直径１．４α×１９α）に注加し
、まず、同緩衝液２００ｄを用いて流速１５ｓｉ！　／
　ｈｒ、で溶出し、次に、同緩衝液に含まれる塩化ナト
リウムの濃度を０から０．５Ｍまで直線的に連続的に上
げながら溶出し、塩化ナトリウム濃度が０．３０　Ｍと
０．３５　Ｍの間の画分を得た。この画分に含まれる蛋
白の分子量は約６２０００と約３６０００であった。

（ａ　前記の塩化ナトリウム濃度が０．３０　Ｍと０．
３５　Ｍの間で溶出された両分に含まれるＬＳアポ蛋白
を、以下の実験に用いた。

ＬＳアポ蛋白を７０インド完全アジユバントに乳化し、
ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に投与した。

そして、３０日後にマウスに追加免疫を行った。一方、
１５％の牛胎児血清を添加したＲＰＭＩ　　１６４０（
ギブコ社製）で、ミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｏ８
−Ｌｌｌを維持培養しておいた。追加免疫３日後、マウ
スから得た牌臓細胞とＰ３−Ｘ６３−ＡＱ８−Ｕｌを、
Ｑｉ等の方法（Ｓ　ｅｌｅｃｔｉＶｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ　　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１
９８０．　ｐ３５１−３７２．参照）によりポリエチレ
ングリコール４０００を用い細胞融合させ、９６穴マイ
クロプレートにまいた。細胞融合後、培地を１００μＭ
ヒボキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μＭ
チミジンを添加したＲＰＭＩ培地（ＨＡＴ培地）に置き
換えた。ＨＡＴ培地で培養中２〜３週間で、牌臓細胞と
ミエローマ細胞のバイブリドーマのみが生育した。ハイ
ブリドーマの培養液中の抗体活性を、以下に述べるＥＬ
ＩＳＡ法で調べた。

［抗体のスクリーニング］ Ｌ’Ｓアポ蛋白をＥＬＩＳＡ用のプレートに付着させ、
１０１Ｍリン酸生理食塩液（１）８７．４）に３％（Ｗ
　／ｖ　）のＢＳＡを添加した液で、ブロッキングを行
った。ブロッキング後、ハイブリドーマ培養液５０μ磨
をＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で２時間又は４℃
で一夜培養した。その後、ビオチン化つマ抗マウス１ｇ
Ｇイムノグロブリン（２μ９／ａｌ）５０μ磨の２次抗
体を添加、室温で１時間反応させ。これに、５０μ文の
西洋ワサビパーオキシダーゼアビジンＤ溶液（１μ９／
ｄ）を加え、ＬＳアポ蛋白に結合した抗体を、１００μ
受の基質溶液（０，１％０−フェニレンジアミン。

０．０１５％Ｈ２０２、０，１Ｍクエン酸緩衝液、　　
ｐＨ４，６）を加える事により検出した。

（３）ＬＳアポ蛋白に対する抗体を産生ずるハイブリド
ーマを選別し、更に限界希釈法によるクローニングを行
ない、最終的に単一クローンのハイブリドーマ２種が得
られた。このハイブリドーマを、それぞれ、プリスタン
投与ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔で増殖させ、モノクロー
ナル抗体を含む腹水を得た。得られた腹水に５０％飽和
硫安を加え抗体を沈澱させ、この沈澱物を０．１Ｍリン
酸生理食塩液（１）８８．０）に溶解させた。そして透
析後、プロティンＡ−セファロースＣＬ４Ｂカラム（フ
ァルマシア社製）にかけ、抗体を０．２Ｍグリシン−塩
酸バッファー（１）８３．０）で溶出して精製した。

２種類のハイブリドーマから得られたモノクローナル抗
体を、それぞれＰＯ２，ＰＥ１０と命名した。

（４）モノクローナル抗体の性質 ウェスタン　ブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏ
ｔ−ｔｉｎｇ）法で、ＰＯ２とＰ　Ｅ　１０は、肺胞蛋
白症患者の気管支肺洗浄液の１８画分から得られた３６
にと６２にの両アポ蛋白を認識した。また、両抗体はヒ
ト羊水と正常ヒト気管支肺洗浄液中の、３７にと３４Ｋ
及び６２にアポ蛋白を認識した。３６に蛋白は５ＤＳ−
ＰＡＧＥで幅広いバンドとして分離し、この中に３７に
と３４に蛋白を含むので、３６に蛋白と３７Ｋ。

３４に蛋白は同一の蛋白である。ＰＯ２とＰＥｌ０は、
ドツト−免疫結合（ｄａｔ　−ｉｎ＋ｍｕｎｏｂｉｎｄ
ｉｎｇ　）法による交叉反応の結果から、近接する相互
に異なったエピトープ（抗原部位）を認識することが示
された。これらの抗体は、ヒトの肺表面活性物質のアポ
蛋白に特異的であり、ラット、ブタ、ウサギ等の動物の
肺表面活性物質のアポ蛋白とは反応せず、またヒトの血
清蛋白とも反応しなかった。

［ウェスタン　ブロッティング法］ モノクローナル抗体に特異的な抗原を、Ｔ　ｏｗｂ−ｉ
ｎ等の方法（Ｐｒｏ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、　７６　４３
５Ｇ−４３５４）によるウェスタン　ブロッティング法
を用いて同定した。最初に肺表面活性物質のアポ蛋白を
有する抗原を５Ｏ８−ＰＡＧＥにかけた。５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥ後電解液バッファーが２５１１Ｍトリス−塩酸ＤＨ
８，３，１９２１Ｍグリシン、２０％（Ｖ　／Ｖ　）メ
タノールであり、電圧傾斜が７Ｖ／α、２時間の条件で
スラブ（ｓｌａｂ）ゲルからニトロセルロースシートへ
蛋白を移した。ニトロセルロースシートの各レーンを切
り離した。片一方のシートを、アミドブラックで蛋白染
色を行い、他方は次の様な酵素免疫アッセイに処した。

３％（ｗ　／ｖ　）ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキング後、
１次抗体としてモノクローナル抗体（ＰＣＢ又はＰ　Ｅ
　１０）を加えた。２次抗体としてビオチン化ウマ抗マ
ウスＩ（ＪＧイムノグロブリンを加えた。

各シートは０．０５％（Ｖ　／Ｖ　）　）−ウィーン（
Ｔ　ｗｅｅｎ）　２０を含むＰＢＳで洗浄した。西洋ワ
サビパーオキシダーゼアビジンＤでインキュベート後、
基質溶液（０，０５％ジアミノベンジジン。

０．０３　％Ｈ２０２、０，０１Ｍ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　）　
ヲ加エルコとにより検出し同定した。

実施例２ （１）不溶化モノクローナル抗体の調製（モノクローナ
ル抗体の担体への固定）未処理マイクロタイタープレー
ト（Ｄ　ＶｎａｔｅＣｈＬ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　
Ｉ　Ｎ　Ｃ製）の各ウェルに、モノクローナル抗体ＰＣ
６の１０μｇ／Ｉｄの０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶
液２００ｍを加えて、２０℃で一昼夜インキユベートし
た。次に、各ウェルの溶液を吸引除去した後、２％のス
キムミルク及び１％のトリトンｘ−１００を含有するＰ
ＢＳ　（０，８５％ＮａＣ１含有０．０１　ＭリンｗＩ
緩衝液、　　ｐＨ７，４）溶液（以下、Ｔｘ／ＳＭ／Ｐ
ＢＳＪＩ液という）を加えて、室温で３０分間ポストコ
ーティング処理を行ない、処理終了後、マイクロタイタ
ープレートを上記溶液で洗浄後、使用まで一２０℃で保
存した。

（２）　　ビオチン標識モノクローナル抗体の調製モノ
クローナル抗体ｐ　［：　１０の１．０ＨＩ／Ｉ１１の
ＰＢＳ溶液を、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液で透
析した後、モノクローナル抗体１０容量に対して、Ｎ−
ヒドロキシサクシンイミドビオチン（Ｐ　１ｅｒｃｅ　
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）の１．０４／ｄジメチルスルホ
キシド溶液１容量を添加混合し、室温で４時間インキュ
ベートし、次いで５０ｍＭＰＢＳ溶液に対して透析する
ことにより、ビオチン標識モノクローナル抗体を得た。

（３）２点間時免疫測定法による肺表面活性物質のアポ
蛋白の定憬 モノクローナル抗体ＰＣ６を固定したマイクロタイター
プレートを室温に戻し、ＴＸ／ＳＭ／ＰＢＳ溶液で洗浄
した後、精製した肺表面活性物質のアポ蛋白１０ｎ（１
／ｄ　〜６４０ｎｌ；ｌ／ｄを含有するＴＸ／ＳＭ／Ｐ
ＢＳ溶液を、標準物質溶液として各ウェルに１００μ皇
ずつ加えた。また、これとは別に、測定試料としてヒト
羊水の２〜２５６倍希釈ＴＸ／ＳＭ／ＰＢＳ溶液を、１
００μ旦ずつ別なプレート各ウェルに加えた。そして、
次に、ビオチン標識モノクローナル杭体Ｐ　Ｅ　１０を
、２μ９／ｌｌ１１の濃度で含有するＴ　Ｘ　／　Ｓ　
Ｍ　／　Ｐ　Ｂ　Ｓ溶液を、前記標準物質溶液又は測定
試料溶液を充填したウェルに１００μ文ずつ加え、３７
℃の温度で９０分間インキュベートした後、溶液を吸引
除去してからＴＸ／ＳＭ／ＰＢＳ溶液で洗浄した。

次いで、各ウェルにホースラディツシュ・ペルオキシダ
ーゼ（＋−Ｉ　ＲＰ　）標識アビジンＤ（Ｖ　ｅｏｔｏ
ｒ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｔｅｓ、　Ｉ　Ｎ　Ｃ、製）
をＴＸ／ＳＭ／ＰＢＳ溶液で１２００倍に希釈した溶液
を２００μ文ずつ添加し、室温で２０分間インキュベー
トした後、溶液を吸引除去してから°１％トリトンＸ−
１００含有ＰＢＳ溶液で洗浄した。

更に、０．１％Ｏ−フェニレンジアミン、　　０．０１
５％Ｈ２Ｏ２を含有する０、１Ｍクエン酸緩衝液（＋）
８　４．６）からなる基質溶液を各ウェルに添加し、室
温で３０分間反応させた後、２Ｍ硫酸を１００μ文加え
て反応を停止させた。反応停止後、各ウェルについて波
長５００ｒｖ−６１０ｎ−の吸収強度を自動マイクロプ
レート・リーダーで測定し、標準物質の濃度及び吸収強
度をプロットして第１図の如き検量線を作製した。そし
て、この検量線を用いて、各測定試料の濃度を求めた。

このような方法を用いて、妊娠２３〜４１週の妊娠の羊
水サンプル５９検体中のアポ蛋白濃度を測定し、第１表
に示した如き、妊娠連数の増加と共にアポ蛋白濃度の増
加する結果を得た。

第１表 ≦３０　　　　　　０．８４　（１３）３１−３３　　
　　　１．５４　（１０）３４−３６　　　　　５．４
６　（１３）３７−４１　　　　　１３．１０　（２３
）へ 実施例３ （１）　　モノクローナル抗体不溶化ビーズのｇｌ製ポ
リスチレン製ビーズをよく洗浄してから、モノクローナ
ル抗体ＰＣ６の２０μｇ／Ｉ１１の濃度を有するＰＢＳ
　（１）Ｈ７，４）溶液中に、４℃の温度で１昼夜放置
した。その後、ビーズをＰＢＳ溶液で洗浄してから、０
．５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液中に、４℃の
温度で１昼夜放置してポストコーティング処理を実施し
て、モノクローナル抗体不溶化ビーズを得た。

（２）　　ホースラディツシュ・ペルオキシダーゼ標識
モノクローナル抗体の調製 モノクローナル抗体Ｐ　Ｅ　１０の１．０ｊＩｙ／−の
ＰＢＳ溶液に、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎサ
クシンイミドエステル（ＭＢＳ）の１０ｑ／ｄの濃度の
ジメチルホルムアミド溶液５０ａｅを添加し、２５℃の
温度で３０分間反応させた。次いで、セファデックスＧ
−２５を充填したカラムを用い、０，１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ６，０）でゲル濾過を行ない、マレイミド化モノ
クローナル抗体と未反応ＭＢＳとを分離した。

一方、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
（７）　１．Ｏ＃／ｍｅ（７）ＰＢＳ溶液に、Ｎ−サク
シンイミジルー３−（２−ピリジルチオ）プロビオネー
ト（ＳＰＤＰ）の１０ｍｇ／＋ｄ（１）ｌｌ１度ノエタ
ノール溶液を添加し、２５℃で３０分間反応させた。

次いで、セファデックスＧ−２５を充填したカラムを用
い、０．ＯＩ　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）でゲル濾過
して精製し、ピリジルジスルフィド化ＨＲＰを含有する
画分を採集して、コロジオンバック中において水冷下に
約１０倍に濃縮した。次に、これに０．８５％ＮａＣ１
と０．１Ｍジチオスレイトールとを含有する０、１Ｍ酢
酸ｍ衝液（ｐＨ４，５）　１　Ｉｄを添加し、２５℃で
３０分間撹拌して、ＨＲＰ分子中に導入したピリジルジ
スルフィド基を運９元した。

次いで、セファデックスＧ−２５カラムにかけてゲル濾
過し、チオール化ＨＲＰを含有する画分を得た。

上記の如くして得られたマレイミド化モノクローナル抗
体とチオール化ＨＲＰとを混合し、コロジオンバックを
用いて水冷下に４ｑの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃で１
昼夜放置した後、ウルトロゲルＡＣＡ４４を充填したカ
ラムでゲル濾過し、ＨＲＰ標識モノクローナル抗体を得
た。

（３）二点同時免疫測定法（同時ナンドインチ法）によ
るアポ蛋白の定量 モノクローナル抗体ＰＣ６を不溶化したピー２８１個と
、精製した肺表面活性物質のアポ蛋白１０ｎｇ／ａｆ　
〜６４ｏｎＯ／ｗｌｌ　（標準物質）を含有する０、５
％ＢＳＡ及び１％トリトンＸ−１００含有ＰＢＳ溶液（
ＤＨ７，４）　　２００μ磨と、ＨＲＰ４１識モノクロ
ーナル抗体Ｐ　Ｅ　１０を含有する０、５％ＢＳＡ及び
１％トリトンＸ−１００含有ＰＢＳ溶液（ＤＨ７，４）
２００μ隻とを各試験管に添加して、３７℃の温度で１
時間インキュベートした。次に、試験管内の溶液を吸引
除去した後、１％トリトンＸ−１００含有ＰＢＳで洗浄
してから、２．２′　−アジフジ−３−エチルベンズチ
アゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴ　Ｓ　）　　０．０
５％、　Ｈ２０２０，００３％を含有する０、１Ｍリン
酸−クエン酸緩衝液（［）Ｈ４，５）を０．５−ずつ各
試験管内に加え、３７℃の温度で３０分間インキュベー
トした後、反応停止剤として０．２Ｍシュウ酸水溶液を
１ｄずつ加えて酵素反応を停止させた。

次いで、この溶液を分光光度計を用いて４２０ｎｍの波
長の吸収強度を測定し、これを標準物質の濃度に対して
プロットすることにより、濃度依存性の良い検量線を得
た。結果を第２図に示した。

【図面の簡単な説明】

第１図と第２図は、本発明のモノクローナル抗体を用い
た、二点同時免疫測定法の検量線を示す。 第１図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、免疫学的方法により検体中のヒトの肺表面活性物質
   を測定する方法において、ヒトの肺表面活性物質のアポ
   蛋白を認識する第一のモノクローナル抗体と、該アポ蛋
   白を認識するが第一のモノクローナル抗体とは異なる抗
   原部位と結合する第二のモノクローナル抗体とを用いる
   ことを特徴とする、検体中のヒトの肺表面活性物質の測
   定方法。 ２、第一のモノクローナル抗体が担体に固定されており
   、第二のモノクローナル抗体が標識化されていることを
   特徴とする、特許請求の範囲第１項記載のヒトの肺表面
   活性物質の測定方法。 ３、第二のモノクローナル抗体がビオチン化抗体である
   、特許請求の範囲第１項又は第２項記載のヒトの肺表面
   活性物質の測定方法。 ４、ブロッキング剤としてスキムミルクを用いることを
   特徴とする、特許請求の範囲第２項又は第３項記載のヒ
   トの肺表面活性物質の測定方法。 ５、免疫学的方法により検体中のヒトの肺表面活性物質
   を測定する試薬キットであって、（１）ヒトの肺表面活
   性物質のアポ蛋白を認識する、担体に固定された第一の
   モノクローナル抗体と、（２）該アポ蛋白を認識するが
   第一のモノクローナル抗体とは異なる抗原部位と結合す
   る、標識化された第二のモノクローナル抗体と、（３）
   必要により、該標識化抗体の検出試薬を主要構成成分と
   する試薬キット。 ６、モノクローナル抗体が、分子量約６２，０００及び
   ／又は約３４，０００〜３７，０００のアポ蛋白を認識
   するものである特許請求の範囲第５項記載の試薬キット
   。 ７、モノクローナル抗体がＩｇＧ型のマウス抗体である
   、特許請求の範囲第５項又は第６項記載の試薬キット。 ８、標識化された第二のモノクローナル抗体がビオチン
   化抗体である、特許請求の範囲第５項記載の試薬キット
   。 ９、標識化抗体の検出試薬が酵素標識化アビジンである
   、特許請求の範囲第８項記載の試薬キット。