CN118393132A

CN118393132A - 一种单表位抗原标记方法、抗原标记物、试剂盒及应用

Info

Publication number: CN118393132A
Application number: CN202310067645.6A
Authority: CN
Inventors: 殷一珠; 吴晨; 李临
Original assignee: Chemclin Diagnostics Corp
Current assignee: Chemclin Diagnostics Corp
Priority date: 2023-01-16
Filing date: 2023-01-16
Publication date: 2024-07-26

Abstract

本发明公开了一种单表位抗原标记方法、抗原标记物、试剂盒及应用；所述制备方法，包含：将连接有交联剂的单表位抗原或其类似物与标记物同时与载体蛋白混合反应；所述单表位抗原为小分子抗原或半抗原；所述交联剂的间隔臂长度小于100埃；该标记方法，降低了标记复合物与抗体的亲和力，有效提高了检测灵敏度，实现了检测性能的提高。

Description

一种单表位抗原标记方法、抗原标记物、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及化学发光检测技术领域，具体涉及一种单表位抗原标记方法、抗原标记物、试剂盒及应用。

背景技术

小分子在调节生理过程中发挥着关键作用并作为生物标志物来揭示病理状况和治疗效果。但是，与大分子相比，检测小分子仍然是一个重大的挑战。

小分子抗原因分子质量小、抗原表位单一，不能够同时结合两个抗体，在免疫分析中，目前多采用竞争性免疫分析方法检测小分子抗原。放射免疫分析(RIA)是最早建立的竞争性免疫分析方法，并荣获1974年度诺贝尔生理医学奖。在放射性免疫分析中，含有放射性核素标记的竞争抗原(标记抗原)和限量的特异性抗体，标本中待检抗原和作为试剂的竞争抗原，分别竞争性与特异性抗体结合。分离结合标记物(B)和游离标记物(F)，并测定结合标记物的放射活性(或强度，单位每分钟计数，CPM)，放射活性与待检抗原呈反比例函数关系。采用系列已知浓度校准品，获得校准品的数学函数关系(校准函数，可简单理解为校准曲线)。

由于竞争性免疫分析中，特异性抗体的量是有限的。因此，用于小分子抗原检测的竞争性免疫分析方法往往难以实现低浓度的准确检测，从而阻碍了检测性能的进一步提高。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种单表位抗原标记方法、抗原标记物、试剂盒及应用，采用该标记方法，降低了标记复合物与抗体的亲和力，有效提高了检测灵敏度，实现了检测性能的提高。

本发明第一方面提供了一种单表位抗原的标记方法，其特征在于，包括：将连接有交联剂的单表位抗原或其类似物与标记物同时与载体蛋白混合反应；所述单表位抗原为小分子抗原或半抗原；所述交联剂的间隔臂长度小于100埃。

在本发明的一些实施方式中，所述交联剂的间隔臂长度为0～40埃；优选为7.7～40埃，更优选为7.7～35.8埃。

在本发明的一些实施方式中，还包括步骤：将单表位抗原或其类似物与交联剂相接触进行偶联反应，得到连接有交联剂的单表位抗原或其类似物。

在本发明的一些实施方式中，所述1mg/mL单表位抗原或其类似物与(2-7)mM所述交联剂相接触进行偶联反应。

在本发明的一些具体实施方式中，所述步骤还包括：将连接有交联剂的单表位抗原类似物与标记物同时与载体蛋白混合反应。

在本发明的一些实施方式中，1mol所述载体蛋白可以偶连N个所述单表位抗原或其类似物，10≤N≤100，优选为60≤N≤100。

在本发明的一些实施方式中，所述载体蛋白上偶联所述单表位抗原或其类似物和所述标记物的摩尔比为1:P:Q，其中N≤P+Q≤5N；优选为2N≤P+Q≤3N。

在本发明的一些实施方式中，所述被分析物或其类似物和所述偶联标记物的摩尔比为1:(1～399):(399～1)；优选为1:(1～199):(199～1)。

在本发明的一些实施方式中，所述标记物具有间隔臂；优选地，所述标记物的间隔臂长度大于所述交联剂的间隔臂长度。

在本发明的一些实施方式中，所述载体蛋白选自牛丙种球蛋白(BGG)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)中任意一种。

在本发明的一些具体实施方式中，所述载体蛋白为牛丙种球蛋白(BGG)。

在本发明的一些实施方式中，所述交联剂选自DSG、DSS和Bis(NHS)PEG9中任意一种。

在本发明的一些实施方式中，所述被单表位抗原为维生素D，优选为25-羟基维生素D，更优选为25-羟基维生素D2；和/或

所述单表位抗原类似物为维生素D类似物，优选为25-羟基维生素D类似物，更优选为25(OH)D2-氨基丙基醚。

在本发明的一些实施方式中，所述标记物为生物素或其衍生物，优选为生物素。

本发明第二方面提供了一种由第一方面所述的标记方法制备得到的标记复合物。

本发明第三方面提供了一种竞争性免疫分析检测试剂盒，包括：

组分1，上述第一方面所述制备方法制备得到的标记复合物；和

组分2，发光微球以及与之结合的抗体或其结合片段，所述第一抗体或其结合片段是特异性结合待测单表位抗原的抗体；所述发光微球能够与单线态氧作用产生化学发光。

在本发明中，所述标记复合物为竞争抗原。

本发明所述竞争性免疫分析检测为竞争性化学发光免疫分析检测。

本发明竞争性免疫分析检测的待测样本为血清或血浆。

在本发明一些实施例中，所述发光微球以及与之结合的抗体或其结合片段为抗体包被的发光微球。

在本发明一些具体实施例中，所述抗体包被的发光微球为FG-25-羟基维生素D抗体。

在本发明一些实施例中，所述标记复合物分散在缓存液或水中组装成组分1；所述组分1中所述标记复合物浓度优选为0.5～50ng/mL，更优选为20～30ng/mL。

在本发明一些实施例中，所述发光微球以及与之结合的抗体或其结合片段分散在缓存液或水中组装成组分2；所述组分2中所述发光微球以及与之结合的抗体或其结合片段浓度优选为0.5～50ng/mL，更优选为1～10ng/mL。

在本发明一些实施例中，所述试剂盒还包括：

组分3，感光微球，所述感光微球能够在光激发下产生单线态氧，且包被能够特异性识别并结合所述标记复合物中的标记物的配对物；优选地，所述配对物选自卵白亲和素、链霉亲和素、卵黄亲和素、中性亲和素和类亲和素中的一种或多种；更优选地，所述配对物为中性亲和素和/或链霉亲和素。

在本发明竞争性免疫分析检测中，所述组分1中所述标记复合物浓度取决于小分子抗原或半抗原的水平。

在本发明一些实施方式中，单表位抗原为25-羟基维生素D(25-OH-VD)，根据人体内25-羟基维生素D(25-OH-VD)的浓度水平及临床检测需要，所述试剂盒的检测的线性范围为4～140ng/mL，检出限不高于4.00ng/mL。

本发明第四方面提供了一种如第一方面所述标记方法制备得到的标记复合物或第三方面所述试剂盒在单表位抗原免疫检测中的应用。

在本发明一些实施方式中，所述免疫检测为所述竞争性免疫分析检测。

本发明的有益效果：

本发明单表位抗原的标记方法，将连接有交联剂的单表位抗原或其类似物与标记物同时与载体蛋白混合反应，得到标记复合物，该标记复合物为载体蛋白与单表位抗原或其类似物的偶联物(载体蛋白标记的小分子抗原或半抗原)。区别于现有技术，本发明通过调整交联剂的间隔壁臂长，削弱标记复合物的灵活性、增加空间位阻，降低标记复合物与特异性结合待测单表位抗原的抗体的亲和力，使标记复合物与抗体的亲和力略低于待测被分析物与抗体的亲和力，优化反应体系中抗体、待测单表位抗原、标记复合物(竞争抗原)三者之间的竞争关系，有效提高了检测灵敏度。

进一步地，通过调整偶联比例控制载体蛋白上小分子抗原或半抗原的量，结合竞争法抗体限量(抗体用量需要小于两种抗原所需抗体的累计用量，但必须大于竞争抗原或待测单表位抗原所需抗体累计用量)的特点，有效提升检测灵敏度。

此外，采用待测单表位抗原结构相似的单表位抗原类似物作为其中的一种竞争抗原标记标记物，确保在低浓度样本检测时待测单表位抗原能够优先结合抗体，进一步提高检测灵敏度。

附图说明

图1为本发明实施例标记复合物的制备方法示意图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。

在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。

除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。

术语

本发明所述用语“待检样本”是指可能含有被分析物的一种混合物，可以被用在本发明公开的方法中的典型待检样本包括体液，如血液、血浆、血清、尿、精液、唾液等。

本发明所述用语“抗体”以最广含义使用，包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白，保留对抗原的特异性结合的抗体片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv、和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、双特异性抗体、和包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。在任何需要的情况下，抗体可以进一步与其它部分，诸如特异性结合配对成员，例如生物素或链霉亲和素(生物素-链霉亲和素特异性结合配对成员中的一员)等缀合。

本发明所述用语“抗原”是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应的物质。抗原具有两个基本性质:免疫原性和免疫反应性。同时具有这两种性能的物质称为完全抗原,而只具有免疫反应性的物质称为半抗原。

本发明所述用语“表位(epitope)”又称抗原决定簇(antigenic determinant)，是抗原表位(英语：antigenic epitope)的简称，是指抗原表面上决定抗原特异性的化学官能基，其可被免疫系统(尤其是抗体、B细胞或者T细胞)识别。通常一个多肽表位由5～20个氨基酸残基组成，一个多糖表位由5～7个单糖组成，而一个核酸半抗原表位由6～8个核苷酸残基组成。针对蛋白质而言，抗原表位是一段特定氨基酸序列(线性表位)，也可以是几段特定氨基酸序列构成的空间构象(构象表位)。

本发明所述用语“半抗原(hapten)”又称不完全抗原，是指能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。一个半抗原相当于一个抗原表位，为单价抗原。

本发明所述单表位抗原为仅具有单个表位的抗原。

本发明所述用语“结合”指由于例如共价、静电、疏水、离子和/或氢键等相互作用，包括但不限于如盐桥和水桥等相互作用引起的两个分子间的直接联合。

本发明所述用语“特异性结合”，是指两种物质之间的相互辨别和选择性结合反应，从立体结构角度上说就是相应的反应物之间构象的对应性。

本发明所述用语“生物素”广泛存在于动植物组织中，其分子上有两个环状结构，分别为咪唑酮环和噻吩环，其中咪唑酮环是与链霉亲和素结合的主要部位。活化的生物素可以在蛋白质交联剂的介导下，与已知的几乎所有生物大分子偶联，包括蛋白质、核酸、多糖和脂类等。“亲和素”分子由4条相同的肽链组成，其中每条肽链都能结合一个生物素。因此每个抗原或抗体可同时偶联多个生物素分子，从而产生“触手效应”提高分析灵敏度。

本发明所述用语“检测范围”，是指剂量函数的有效范围，如将高浓度标本倍比稀释，所用稀释标本测定结果做线性回归分析，相关系数(R)大于0.990。

维生素D是人体内一种脂溶性小分子，它参与钙磷代谢，对骨骼健康至关重要，同时在高血压、心血管疾病、肿瘤及糖尿病等疾病中也扮演着重要角色。25-羟基维生素D是维生素D在人体内的主要存在形式，也是反映人体内维生素D状态的最佳指标。

室温指温度15～35℃。

实施例

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。

主要实验原料：

表1

表1中，

Bis(NHS)PEG₉为式I所述化合物，为二-琥珀酰亚胺酯活化的PEG化合物。

DSS为式II所述化合物，双琥珀酰亚胺辛二酸酯。

DSG为式III所述化合物，双琥珀酰亚胺戊二酸酯。

表2

交联剂	分子量	间隔臂长度
			Bis(NHS)PEG₉	708.71	35.8埃
DSG	326.26	7.7埃
			DSS	368.34	11.4埃

实施例1

通过下述步骤，使用交联剂Bis(NHS)PEG₉、DSG和DSS分别制备得到标记复合物(BIO-PEG₁₂-BGG-PEG₉-VD浓溶液)、(BIO-PEG₁₂-BGG-DSS-VD浓溶液)和标记复合物(BIO-PEG₁₂-BGG-DSG-VD浓溶液)。

步骤1 25(OH)D2-氨基丙基醚复溶

取0.5mL DMF(N,N-二甲基甲酰胺)加入含5mg 25(OH)D2-氨基丙基醚的容器中，室温溶解、平衡30min，终浓度10mg/mL；

步骤2交联剂溶液配制

取DMSO(二甲基亚砜)加入含交联剂的容器中，室温溶解、平衡30min，终浓度50mM；

步骤3小分子与交联剂偶联

将25(OH)D2-氨基丙基醚逐滴加入交联剂溶液中，室温旋转偶联1h，得到25(OH)D2-氨基丙基醚-交联剂溶液；

步骤4(小分子-交联剂)与Biotin不同比例混合

将步骤3获得的25(OH)D2-氨基丙基醚-交联剂溶液分为3份置于0.5mL规格的EP管中，加入不同比例Biotin-PEG₁₂-NHS，得到25(OH)D2-氨基丙基醚-交联剂和Biotin-PEG₁₂-NHS混合溶液；

步骤5 25(OH)D2-3-氨基丙基醚-交联剂、Biotin同时与BGG偶联

将第4步中得到的不同比例的25(OH)D2-氨基丙基醚-交联剂和Biotin-PEG₁₂-NHS混合溶液分别加入BGG溶液(0.1M NaHCO₃溶解)中，BGG反应浓度1mg/mL，4℃旋转过夜；

步骤6偶联后透析或过柱纯化，得到标记复合物浓溶液。

实施例2

1.实验步骤：

①将25-羟基维生素D抗体包被的发光微球(FG-25-羟基维生素D抗体)稀释到25ug/mL，不同交联剂偶联产物BIO-BGG-VD分别梯度稀释到50ng/mL、5ng/mL、0.5ng/mL。

25-羟基维生素D抗体包被的发光微球(FG-25-羟基维生素D抗体)的制备：

1)混合：将发光微粒与25-羟基维生素D抗体按质量比例为10∶(1-4)混合于缓冲液中；

2)反应：加入缓冲液配制的NaBH₃CN溶液混合并反应；

3)封闭：加入缓冲液配制的Gly及NaBH₃CN溶液，混匀反应后，再加入BSA溶液封闭；

4)清洗产物，获得25-羟基维生素D抗体包被的发光微球；

其中，缓冲液为pH8.0的成分为HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H₂O的HEPES缓冲液。

②用校准品稀释液将浓度为1mg/mL的25-羟基维生素D溶液稀释，配制校准品1～6(CAL1～6)并进行赋值，校准品浓度分别为0，5.1，10.06，29.93，70.2，139.8ng/mL。

③按照反应模式，加入样本溶液，再依次加入25-羟基维生素D抗体包被的发光微球和BIO-BGG-VD，各25uL。

④进行第一阶段温育：37℃温育17min。

⑤加入175uL通用液(市售)。

⑥进行第二阶段温育：37℃温育15min。

⑦读数。

2.实验结果：

见表3-4

表3

表4校准品区分度

3.数据分析：

①从校准品区分度上看，随着交联剂臂长的缩短，检测Cal1-Cal6的区分度明显改善。

②生物素试剂浓度5ng/mL时整体区分度最佳。

4.实验结论：

交联剂DSG的偶联产物其检测性能优于交联剂Bis(NHS)PEG₉和DSS的产物，通过调整交联剂的臂长，有效改善反应体系中抗体、待测物、生物素标记小分子三者之间的竞争关系，有效提高了试剂的检测区分度，进而有效提高了检测灵敏度。

实施例3

1.实验步骤：

①将25-羟基维生素D抗体包被的发光微球(FG-25-羟基维生素D抗体)稀释到25ug/mL，不同偶联比例的BIO-BGG-VD分别梯度稀释到50ng/mL、5ng/mL、0.5ng/mL。

②用校准品稀释液将浓度为1mg/mL的25-羟基维生素D溶液稀释，配制校准品1～6并进行赋值，校准品浓度分别为0，5.1，10.06，29.93，70.2，139.8ng/ml。

③按照反应模式，加入样本溶液，再依次加入抗体包被的发光微球和BIO-BGG-VD，各25uL。

④进行第一阶段温育：37℃温育17min。

⑤加入175ul通用液。

⑥进行第二阶段温育：37℃温育15min。

⑦读数。

2.实验结果：

见表5-6

表5

表6校准品区分度

3.数据分析：

①从校准品区分度上看，随着偶连比例的降低，检测Cal1-Cal6的区分度明显改善。

②生物素试剂浓度5ng/mL时整体区分度最佳。

4.实验结论：

偶联比例(1：4：196)的偶联产物其检测性能优于高偶联比例(1：100：100)和(1：20：180)的产物，通过对偶联比例的控制，有效提高了试剂的检测区分度，进而有效提高了检测灵敏度。

以上所述的仅是本发明的优选实例。应当指出对于本领域的普通技术人员来说，在本发明所提供的技术启示下，作为本领域的公知常识，还可以做出其它等同变型和改进，也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种单表位抗原的标记方法，其特征在于，包括：将连接有交联剂的单表位抗原或其类似物与标记物同时与载体蛋白混合反应；所述单表位抗原为小分子抗原或半抗原；所述交联剂的间隔臂长度小于100埃。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述交联剂的间隔臂长度为0～40埃；优选为7.7～40埃，更优选为7.7～35.8埃。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，还包括步骤：将单表位抗原或其类似物与交联剂相接触进行偶联反应，得到连接有交联剂的单表位抗原或其类似物；优选地，所述1mg/mL单表位抗原或其类似物与(2-7)mM所述交联剂相接触进行偶联反应。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，1mol所述载体蛋白可以偶连N个所述单表位抗原或其类似物，10≤N≤100，优选为60≤N≤100。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述载体蛋白上偶联所述单表位抗原或其类似物和所述标记物的摩尔比为1:P:Q，其中N≤P+Q≤5N；优选为2N≤P+Q≤3N。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的方法，其特征在于，所述标记物具有间隔臂；优选地，所述标记物的间隔臂长度大于所述交联剂的间隔臂长度。

7.根据权利要求1-6任意一项所述的方法，其特征在于，所述载体蛋白选自牛丙种球蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白及人工合成的多聚赖氨酸中任意一种；优选地，所述载体蛋白为牛丙种球蛋白。

8.根据权利要求1-7任意一项所述的方法，其特征在于，所述交联剂选自DSG、DSS和Bis(NHS)PEG₉中任意一种。

9.根据权利要求1-8任意一项所述的方法，其特征在于，所述被单表位抗原为维生素D，优选为25-羟基维生素D，更优选为25-羟基维生素D2；和/或

10.根据权利要求1-9任意一项所述的方法，其特征在于，所述标记物为生物素或其衍生物，优选为生物素。

11.一种由权利要求1-10任意一项所述的标记方法制备得到的标记复合物。

12.一种竞争性免疫分析检测试剂盒，其特征在于，包括：

组分1，权利要求1-10任意一项所述制备方法制备得到的标记复合物；和

13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述标记复合物分散在缓存液或水中组装成组分1；所述组分1中所述标记复合物浓度优选为0.5～50ng/mL，更优选为20～30ng/mL；和/或

所述发光微球以及与之结合的抗体或其结合片段分散在缓存液或水中组装成组分2；所述组分2中所述发光微球以及与之结合的抗体或其结合片段浓度优选为0.5～50ng/mL，更优选为1～10ng/mL。

14.根据权利要求12或13所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：

15.一种如权利要求1-10中任意一项所述标记方法制备得到的标记复合物或权利要求12-14任意一项所述试剂盒在单表位抗原免疫检测中的应用。