PT97482B

PT97482B - Anticorpos monoclonais anti-igm, metodo para a sua producao e aplicacao e hibridomas que os produzem

Info

Publication number: PT97482B
Application number: PT97482A
Authority: PT
Inventors: Michael G Rosenblum; Nicholas J Donato
Original assignee: Res Dev Foundation
Priority date: 1990-04-27
Filing date: 1991-04-26
Publication date: 1998-08-31
Also published as: CA2079901A1; NZ237784A; TW349995B; EP0538267A1; ZA912695B; PT97482A; IE911172A1; AU7866491A; IL97827A0; AU650659B2; CN1057072A; RU2105062C1; WO1991017257A1; JPH06504424A; EP0538267A4

Description

RESEARCH DEVELOPMENT FOUNDATION

ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-IgM, MÉTODO PARA A SUA

PRODUÇÃO E APLICAÇÃO E HIBRIDOMAS QUE OS PRODUZEM

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao campo da imunologia e à produção de anticorpos monoclonais. Mais particularmente , diz respeito a anticorpos monoclonais anti-IgM, hibridomas que produzem esses anticorpos, produtos imunoquímicos obtidos a partir desses anticorpos e à aplicação desses produtos imunoquímicos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Desde a publicação do relatório de Kohler e Milstein descrevendo a produção de anticorpos monoclonais, o desenvolvi mento de tecnologia para a produção de linfócitos imortalizados capazes de produzirem anticorpos de especificidade pré-determinada tem tido um grande impacto quer na investigação clínica quer na pesquisa científica de base, assim como nas modalidades terapêuticas disponíveis para diagnósticos e tratamento de uma grande variedade de situações patológicas.

Os anticorpos são proteínas endógenas produzidas pelo sistema imunológico como resposta a estímulos antigénicos. Estas proteínas ligam-se especificamente a moléculas de antigénios em sítios definidos (epitopes). Os anticorpos policlonais são obtidos a partir da imunização de animais com antigé i-2-

nios e ligam-se a esses antigénios em sítios múltiplos (epítopes). Por outro lado, os anticorpos monoclonais constituem um conjunto definido específico de anticorpos que são derivados de um único clone (monoclone) de células que produzem um anti corpo específico. Ao contrário dos anticorpos policlonais , os anticorpos monoclonais ligam-se apenas a um epítope específico da molécula do antigénio.

Embora a tecnologia para a geração de anticorpos monoclonais exista há algum tempo, a metodologia corrente é demora da, trabalhosa e frequentemente resulta na produção de anticor pos que, embora específicos para o antigénio alvo, têm uma afi. nidade relativamente baixa para o antigénio e, portanto, têm uma utilidade limitada numa grande variedade de aplicações.

Entre as dificuldades encontradas na produção de anticorpos monoclonais úteis e clinicamente importantes, é a abundância de anticorpos do subtipo IgM obtidos a partir de hibridomas produzidos por procedimentos de imunização convencionais in vivo e in vitro. Esses anticorpos do subtipo IgM são gera], mente de pequena afinidade, difíceis de purificação e frequentemente constituem o conjunto de anticorpos produzidos pelos hibridomas. Além disso, nas culturas mistas de IgM e IgG que segregam células hibridomas, as células que segregam IgM frequentemente desenvolvem excessivamente as células híbridas que segregam IgG.

Uma parte do trabalhoso procedimento para a produção de hibridomas é a eliminação de células de hibridoma que produzem IgM, produzidas após uma fusão celular. Isto é, de um modo geral, realizado por clonagem das células em diluição limitante, desenvolvimento de células individuais em colónias e verifica

ção de cada colónia individualmente para determinação das coió nias que produzem anticorpos do subtipo IgG. Geralmente, as células de hibridoma que produzem IgG são depois melhor analisadas para determinar a especificidade do antigénio dos antã. corpos produzidos.

Embora tenham sido referidos os anticorpos que são dirigidos contra epítopes no anticorpo IgM, todos os anticorpos testados reagiram também com anticorpos do subtipo IgG.

Os agentes citotóxicos que se ligam aos anticorpos para originarem iraunotoxinas foram descritos pela Requerente e por outros. Centrou-se recentemente o interesse nas imunotoxinas de anticorpos monoclonais conjugados com as porções que apresen tam actividade enzimática (cadeias A) de toxinas de origem bacteriana ou vegetal via agentes hetero-bifuncionais. Nevelle, D. M. e Voule, R. J., Immunol Rev., 62 (1982): 75-91; W. C. J., et al., European J. Biochem., (1980) 104; Vitteta, E. S., et al., Immuno1. Rev. 62 (1980), 158-183; Raso, V., et al., Câncer Res., 42 (1982) 457-464; Trowbridge, I. W. e Domingo, D. L., Nature (Lond), 294 (1981) 171-173.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um aspecto principal da presente invenção diz respeito a anticorpos monoclonais murinos que:

a) se ligam selectivamente a anticorpos do subtipo IgM;

b) são IgGs;

c) não se ligam ao subtipo IgG^ ou IgG2»

A variante preferida destes anticorpos é a designação por 2G10 e seus equivalentes funcionais. Hibridomas de rato-ra λ-

to que produzem os anticorpos anteriormente referidos e a progénie desses hibridomas são outros aspectos desta invenção.

A presente invenção também inclui um método para a pre paração de hibridomas tal como se definiu anteriormente, que consiste em efectuar a fusão de células tumorais murinas com esplenõcitos de rato obtidos de um rato imunizado com imunogé nio de subtipo IgM murino e seleccionar hibridomas que produzem anticorpos, como se definiu antes.

Um outro aspecto desta invenção é um método para a pro dução de anticorpos, tal como se definiu anteriormente, que consiste em efectuar a cultura de um hibridoma que tenha a capa cidade para produzir estes anticorpos ou, eventualmente, um hibridoma que tenha sido preparado por meio de um método acima reivindicado.

Um outro aspecto desta invenção refere-se a imunotoxinas e à sua preparação mediante conjugação de :

a) anticorpos monoclonais descritos antes e

b) um grupo citotõxico ou pérolas magnéticas.

Outro aspecto desta invenção diz respeito a derivados marcados dos anticorpos monoclonais descritos antes, que são marcados com uma marca detectável que permite a utilização dos derivados na localização, selecçâo especifica ou separação.

Outro aspecto desta invenção diz respeito a um método para aniquilar hibridomas ou células B que produzem IgM, median te o contacto das células com uma quantidade eficaz sob o ponto de vista citotõxico de uma ou mais das imunotoxinas descritas anteriormente.

Outros aspectos da .presente invenção são os imunoensaios directos ou indirectos para determinar se uma célula produz an-5-_r.

ticorpos IgM ou se um anticorpo é do isótipo IgM. Estes ensaios envolvem a incubação das células com os anticorpos monoclonais ou com os seus derivados marcados. Quando se utilizam derivados marcados, a presença de complexos imunológicos binários mar cados nas células é lida directamente. Quando se utiliza um antí. corpos não marcados as células são posteriormente incubadas com um anticorpo marcado contra o anticorpo monoclonal e é lida a presença de complexos imunológicos ternários marcados nas células .

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 representa a sondagem dos sobrenadantes de hibridona para anticorpo específico IgM.

A Figura 2 representa a ligação específica dependente da dose do anticorpo 2G10.

A Figura 3 representa o efeito do aumento do teor de imuno globulina murina absorvida na ligação de 2G10.

A Figura 4 representa o reconhecimento selectivo de IgM murino por 2G10 num ELISA indirecto.

A Figura 5 ilustra a pureza do anticorpo 2G10 por SDS-PAGE.

A Figura 6 caracteriza a subclasse de anticorpos 2G10 murino por imunodifusão de Ouchterlony.

A Figura 7 representa a utilização de 2G10 para a liga ção a células que exprimem anticorpos da subclasse IgM.

A Figura 8 apresenta a curva de eluição de imunotoxina (composta por 2G10 ligado a gelonina) numa matriz de filtração por gel.

A Figura 9 apresenta a pureza de imunotoxina de gelonina-2G10 por SDS-PAGE.

A Figura 10 representa a ligação específica de imunotoxina (2G10-gelonina) a IgM murino.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

A fim de que a invenção aqui descrita possa ser totalmente entendida, apresenta-se a seguinte descrição pormenoriza da.

Tal como se utiliza aqui a designação anticorpo monoclonal refere-se a uma composição de anticorpo contendo uma po pulação de anticorpos homogénea. Não se considera que a presen te invenção seja limitada pela origem do anticorpo ou pela forma como este é preparado.

Tal como se utiliza aqui no que se refere aos anticorpos IgM anti-murino monoclonais de rato, a designação equivalente funcional refere-se a um anticorpo monoclonal que: (a) bloqueia de forma cruzada um anticorpo monoclonal exemplificado; (b) liga-se selectivamente ao anticorpo IgM murino; (c) tem um isotipo G; e (d) não se liga aos isotipos IgG^ ou IgG2·

Tal como aqui se utiliza referindo-se a hibridomas que produzem anticorpos monoclonais da presente invenção o termo progénio, inclui todos os derivados, resultado e dependência do hibridoma inicial que produz o anticorpo IgM anti-murino mo noclonal produzido pelo hibridoma inicial, independentemente da geração ou identidade do cariotipo.

A presente invenção pode ser utilizada para produção de anticorpos que se ligam a anticorpos de IgM de qualquer espécie.

É apenas necessário utilizar e aplicar os ensinamentos âa presente invenção para se obter uma linha de células de hibridoma que é estável e contínua a produzir o anticorpo anti-IgM dirigido para a espécie imunizante. Preferencialmente, o anticorpo monocio nal anti-IgM da presente invenção é dirigido para um IgM huma no ou murino.

Produção de Anticorpos Monoclonais

Os parceiros da fusão que produz o anticorpo, que são utilizados para a obtenção dos hibridomas desta invenção são gerados pela imunização de ratos com anticorpo de IgM murino.

Os ratos são inoculados por via subcutânea e intraperitonial com uma quantidade imunogénica de anticorpo IgM murino em adju vante de Freund e, em seguida, desafiados com quantidades simi lares do imunogénio adjuvante. Recolhem-se os baços dos ratos imunizados alguns dias após o desafio final e prepara-se uma suspensão de células a partir daí para se utilizarem na fusão.

Os hibridomas são preparados a partir dos esplenõcitos e um parceiro de tumor murino utilizando-se a técnica de hibri. dação celular somática geral de Kohler, B. e Milstein, C., Nature, 256 (1975) 495-497 [modificado por Buck, D. W., et al., In Vitro, 18 (1982) 377-381)].

Podem ser utilizadas na hibridação linhas de mieloma de rato disponíveis, tais como YN2/0 e Y3-Ag 1.2.3.

Basicamente, a técnica envolve a fusão de células de tu mor e de esplenõcitos utilizando um fusogênio, tal como o polie tilenoglicol. Após a fusão, separam-se as células do meio de fusão e desenvolvem-se num meio de desenvolvimeto selectivo , tal como o meio HAT, para eliminar células iniciais que não hiί

bridaram. Desenvolveram-se os hibridomas, se apropriado, e ana lisaram-se os sobrenadantes para detecção de actividade anti-IgM murina, por meio de procedimentos de imunoensaio convencio nais (por exemplo, radioimunoensaio, imunoensaio ligado a enzima ou imunoensaio de fluorescência) utilizando como antigénio o agente de imunização IgG^, IgG₂ ou IgM (anticorpo IgM murino).

Os clones positivos são subsequentemente caracterizados para determinar se correspondem aos critérios dos anticorpos da presente invenção.

Os hibridomas que produzem estes anticorpos podem desen volver-se in vitro ou in vivo por meio de métodos convencionais. Os anticorpos monoclonais podem isolar-se do meio de cultura ou dos liquidos do corpo, conforme o caso, por procedimentos de pu rificação de imunoglobulina convencionais, tais como a precipj. tação com sulfato de amónio, electroforese em gel, diãlise, cro matogradia e ultrafiltração, se apropriado.

Selecção/caracterização de anticorpos monoclonais

As caratcerísticas importantes dos anticorpos monoclonais são (I) a sua classe de imunoglobulina; (2) a sua selecti^ vidade para o anticorpo IgM murino; e (3) a sua utilidade para a identificação e ligação com células de hibridoma que produzem IgM murina.

A selectividade e o intervalo de um dado anticorpo são de terminados por testes em painéis de células de hitaridcma que produzem (1) IgG₁, IgG₂ e IgM e (2) anticorpos IgH^, IgG₂ e IgM. Na selec ção dos anticorpos reivindicados, foram sondadas inicialmente cerca de 152 culturas de hibridoma em desenvolvimento. Nove cio *

-9nes reagiram com anticorpo murino IgM mas não com anticorpo IgG. Um destes clones foi escolhido para subsequente caracte rização.

Os anticorpos que exibiram selectividade e intervalo aceitáveis foram conjugados com gelonina utilizando 3-(2-piridilditio)-propionato de N-succinimidilo (SPDP) ou iminotiolano (IT) como agente de ligação. Os conjugados foram testados sobre placas revestidas com IgM e IgG (Figura 11) para determinar se a especificidade do anticorpo é mantida após a ligação ã toxina.

Nos exemplos que se seguem são apresentados outros por menores da caracterização deste anticorpo.

Produtos Imunoquímicos

Os derivados imunoquímicos dos anticorpos monoclonais da presente invenção mais importantes são as imunotoxinas (con jugados de anticorpo e grupos citotóxicos marcados, por exemplo, radiomarcados, marcados com enzima, marcados com magnetis: mo ou com fluorocromo) em que a marca proporciona um meio para identificação e/ou classificação dos complexos imunológicos que incluem o anticorpo marcado.

grupo citotóxico da imunotoxina pode ser um fármaco citotóxico ou uma toxina com actividade enzimãtica de origem bacteriana ou vegetal ou um fragmento com actividade enzimãtica (cadeia A) de uma destas toxinas. As toxinas com actividade enzimática e os seus fragmentos são preferidos e são exem plificados pela gelonina, cadeia A da difeteria, fragmentos ac tivos de não ligação de toxina diftérica, cadeia A de exotoxina de Pseudomonas aeruginosa, cadeia A de ricina, cadeia A de a?

-10abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites forddi, proteínas de diantina, proteína de Phytoiacca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de momordiea charan tia, curcina, crotina, inibidor de saponaria officinalis, mito gelina, restrictocina, fenomicina e neomicina. A mais preferi, da é a gelonina. Os conjugados de anticorpos monoclonais com estes grupos citotóxicos podem preparar-se utilizando uma variedade de agentes de ligação de proteína bifuncionais. São exemplos destes reagentes SPDP, IT, derivados bifuncionais de imidoésteres, tais como cloridrato de adipimidato de dimetilo-, ésteres activos como o suberato de dissuccinimidilo, aldeídos, tais como o glutaraldeído, compostos bis-azido tais co mo bis(p-azidopenzoil)-hexanodiamina, derivados de bis-diazónio, tais como bis(£-diamónio-benzoil)-etilenodiamina, diiso cianatos, tais como 2,6-diisocianato de tolileno, e compostos bifluorados activos, tais como 1,5-difluoro-dinitrobenzeno.

Quando se utilizam para aniquilar hibridomas in vitro que produzem anticorpos IgM, os conjugados serão habitualmente adicionados ao meio de cultura celular numa concentração mínima de cerca de 10 nM. A composição e a forma de administração para utilização in vitro não são críticas. Normalmente, utilizam-se composições aquosas que são compatíveis com o meio de cultura ou de perfusão . Pode ler-se a citotoxicidade por meio de técnicas convencionais para a determinação da presença ou do teor de células de hibridoma que produzem IgM.

Quando se utilizam para a supressão in vivo de células que produzm IgM, as imunotoxinas sãa administradas aos animais imunizados em quantidades eficazes sob o ponto de vita terapêutico (isto é, quantidades que eliminam ou reduzem os esplenóci-

tos que produzem IgM. São adiminstrados habitualmente por via parentêrica, de preferência por via endovenosa. A dose e a po sologia dependem da natureza das células que produzem IgM, que se pretendem suprimir, das caratcerísticas da imunotoxina particular, por exemplo, do seu índice terapêutico, e do início da acção. A quantidade de imunotoxina administrada está habitualmente compreendida entre 0,1 e cerca de 10 mg/Kg de peso do corpo.

Para a administração parentêrica, as imunotoxinas serão formuladas numa forma de dosagem unitária injectãvel (solu ção, suspensão, emulsão) em associação com um veículo parentérico aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Estes veícu los são inerentemente não tóxicos e desprovidos de acção terapêutica. Exemplos de veículos deste tipo são a água, a solução de cloreto de sódio, solução de Ringer, solução de dextrose e albumina sérica humana a 5%. Podem também utilizar-se veículos não aquosos, tais como os óleos fixos e o oleato de etilo. Podem utilizar-se como veículo lipossomas. O veículo pode conter pequenas quantidades de aditivos, tais como substâncias que aumen tam a isotonia e a estabilidade química, por exemplo, agentes tampão e conservantes. A imunotoxina é habitualmente formulada nestes veículos com concentrações compreendidas entre cerca de 1 mg/ml e 10 mg/ml.

Os medicamentos radioactivos citotóxicos para eliminação de células de hibridoma que produzem IgM podem preparar-se por conjugação de isõtipos que emitem transferência de energia linear elevada (LET) (por exemplo, Y, Pt) com os anticorpos. A designação grupo citotóxico é utilizada aqui para abranger es tes isótipos.

As marcas que são utilizadas para a obtenção de versões marcadas de anticorpos incluindo grupos que podem ser de tectados directamente, tais como fluorocromos e marcadores ra dioactivos, assim como grupos, tais como enzimas, que é necessário fazer reagir ou modificar para serem detectados. São exemplos desses marcadores ^²p_t fluoresceína e os seus derivados, rodamina e os seus derivados, dansilo, umbe liferona, luciferia, 2,3-di-hidroftalazinadionas, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, lisozima e glucose-6-fosfato-de sedrogenase. Os anticorpos podem ser assinalados com estes mar cadores aplicando métodos conhecidos. Por exemplo, agentes de acoplamento, tais como os aldeídos, carbodiimidas, dimaleimidas, imidatos, succinimidas, benzadina bis-diazotada e outros podem ser utilizados para assinalar os anticorpos com os marcadores fluorescentes, químio-luminescentes e enzimas, referidos anteriormente. Os anticorpos podem também ser marcados com pérolas magnéticas para utilização em regime de classificação magnética.

Os anticorpos e os anticorpos marcados podem ser utilizados em diversos procedimentos de separação de células para separar as células hibridoma que produzem IgG das células hibridoma que produzem IgM ou para eliminar as células hibridoma que produzem igM de culturas que contêm estas células.

As técnicas de ensaio correntes que se podem utilizar incluem ensaios directos e indirectos. Os ensaios directos com preendem a incubação de um hibridoma ou de um anticorpo de isotipo conhecido com um anticorpo marcado da presente invenção .

Se a amostra incluir células produtoras de IgM, o anticorpo marcado ligar-se-á a estas células. Após a lavagem das células para remover o anticorpo não marcado, observa-se a amostra rela tivamente à presença de complexos imunolõgicos marcados. Nos

ensaios indirectos, a amostra da célula é incubada com um anti_ corpo monoclonal não marcado. Em seguida, trata-se a amostra com o anticorpo marcado contra o anticorpo monoclonal (por exem pio, anticorpo anti-murino marcado), lava-se e observa-se para detectar a presença de complexos ternários marcados.

Para diagnóstico e ensaios para determinação da presen ça do isotipo IgM os anticorpos serão habitualmente distribuídos sob a forma de um conjunto (Kit). Estes conjuntos contêm tipicamente: um anticorpo sob uma forma marcada ou não marcada em contentores apropriados, reagentes para incubações e lavagens, anticorpo anti-murino marcado, se o conjunto for para um ensaio indirecto, e substratos ou agentes de derivação dependentes da natureza da marca. Pode ainda incluir-se controlos antigênio IgM e instruções.

Os exemplos seguintes proporcionam uma descrição pormenorizada da preparação, caracterização e aplicação de um anticorpo monoclonal representativo desta invenção. Estes exemplos não se destinam a limitar a presente invenção em qualquer senti do.

EXEMPLO 1

Origem e caracterização de anticorpos monoclonais IgM anti-murganho murinos

Um hibridoma murino designado por 58,6 foi obtido por intermédio da Dra. Joanne Trial, Department of Immunology ,

M. D. Anderson Câncer Center. Inicialmente, a linha de células 58,6 segregou um anticorpo murino. A linha de células não era estável e,após cerca de quatro subculturas, as células 58,6 *

-14- f cessaram a produção de qualquer anticorpo. Em seguida , efectuou-se a clonagem de uma reserva original de células por dilui ções limitantes para se obter uma linha de células que fosse es^ tável e continuasse a produzir anticorpos IgM.

A) Clonagem por diluição limitante

Cultivaram-se células 58,6 em meio de Iscove durante três dias à temperatura de 37°C numa atmosfera humidificada de dióxido de carbono a 5% em ar. Quando a cultura das células expandida, alcançou 50% da confluência, recolheram-se as células por centrifugação e contaram-se num hemacitómetro. Diluíram-se as células em 50% de meio recente e 50% de meio condicionado (meio em que se tinham desenvolvido células 58,6 duran te sete dias) e plaquearam-se a uma célula por cavidade, aproximadamente, em placas de 96 cavidades. Quando as cavidades que continham células individuais se desenvolveram em colónias pequenas (aproximadamente em 12 dias) retirou-se o meio e analisou-se para detecção de anticorpo anti-IgM do modo descrito no Exemplo 2. Expandiram-se as células positivas para produção de anticorpo em grande escala, congelação de reservas de células e caracterização subsequente do anticorpo. Quando as linhas de células estavam totalmente caracterizadas relativamente ao tipo e especificidade do anticorpo, reclonaram-se as linhas de cé lulas apropriadas e expandiram-se para congelação de reservas de células e injecções em murganhos nus tratados com pristano para a produção de liquido ascítico.

B) Congelação de células híbridas

Quando as células híbridas plaqueadas em frascos T75 alcançaram 70% da coxifluência, recolheram-se as células por cen trifugação e ressuspendeu-se o aglomerado em 0,9 ml de soro de

-15bovino fetal. Imediatamente antes da congelação, transferiram-se as células para frascos-ampolas de congelação e adicionou-se a cada frasco 0,1 ml de dimetilsulfóxido. Os frascos-ampo la foram armazenados em azoto líquido.

C) Produção de líquido ascítico

Lavaram-se aproximadamente 10 células hibridoma em meio isento de soro e injectaram-se por via intraperitonial em murganhos nus que tinham recebido uma injecção intraperitonial de 0,5 ml de /pristano/ 7 a 14 dias antes . 0 líquido ascítico formou-se normalmente dentro de 1 a 3 semanas e foi recolhido da cavidade peritonial utilizando-se uma agulha de calibre largo. 0 líquido foi recolhido para tubos contendo 5 ml de PBS com EDTA 20 mM. Após centrifugação a 2000 x g durante 10 minutos, recuperou-se o sobrenadante, tornou-se 0,1% em azeto de sódio e conservou-se â temperatura de 4°C ou congelou-se a -20°C em alíquotas pequenas. Este líquido proporcionou uma fonte rica de anticorpos monoclonais (aproximadamente 5 a 10 mg/ml) .

EXEMPLO 2

Selecção e Análise de Anticorpos IgM Anti-murganhos Murinos produzidos por células hibridoma

Colónias de hibridoma que se desenvolveram até uma den sidade de aproximadamente 500 a 1000 células em 2 semanas foram escolhidas para anãlise subsequente, com o objectivo de de terminar quais das células hibridoma produziam anticorpos que se ligam a anticorpo IgM murino. Analisou-se o meio de cultu ra de hibridoma destas colónias relativamente ã presença de IgM anti-murganho murino por um ensaio de imunoabsorção ligado a en zima (ELISA) realizado de acordo com o processo de Voller,et al. (ref.). Diluíram-se 100 mg de proteína IgG ou IgM de murga nho, purificada a 1 mg/ml (Sigma Chemical Company, St. Louis , MO), em tampão de revestimento (NaHCO^, 50 nM, pH 9,8) e absor veu-se durante a noite em placas microtituladoras de 96 cavidades por incubação à temperatura de 4°C numa câmara humidificada. Em seguida, lavaram-se as cavidades três vezes com solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato contendo 0,2% de Tween-20 (PBS-Tween). Após a lavagem e remoção de todos os traços de líquido das cavidades por pressão ligeira sobre toalhas de papel, adicionaram-se 100 Jig de sobrenandante de hibridoma às cavidades revestidas com IgM e incubaram-se ã temperatura ambien te durante 2 horas. Lavaram-se de novo as placas com PBS-Tween e incubaram-se durante 1 hora à temperatura ambiente com 100 jil de uma diluição a 1:1000 em PBS-Tween de IgG anti-murino desenvolvido na cabra e conjugado com peroxidase. Após nova lavagem das cavidades, como descrito anteriormente, fizeram-se reagir com 100 yl de ABTS 1 mM [ácido 2,2-azino-di(3-etilbenztiazolina-sulfónico)] em tampão de citrato de sódio 0,1 M de pH 4,2, contendo 0,03% de peróxido de hidrogénio, durante 20 a 60 minutos à temperatura de 37°C. Determinou-se a densidade óptica a 405 nm num leitor para micro-Elisa.

A fim úe se determinar se o epítope reconhecido pelos an ticorpos anti-IgM estava na cadeia pesada ou na cadeia leve do anticorpo, ensaiou-se a ligação de sobrenadantes de hibridoma a placas revestidas com proteína IgM-lambda e proteína IgM-Kapa. Os hibridomas IC2 e 2G10 ligaram-se ambos igualmente bem âs cavidades revestidas com IgM-Mapa e IgM-lambda, indicando que a especificidade de ligação dos anticorpos anti-IgM estava

na cadeia pesada (mu) do anticorpo IgM. Os resultados apresentados na Figura 1 indicam que os outros 7 anticorpos testados também se ligam a IgM murino. Como se pode observar nas Figuras IA e 1B, ensaiaram-se 9 hibridomas diferentes contra placas revestidas com IgM-Kapa ou IgM-lambda. Realizou-se um ensaio Elisa padrão para determinar a imunização de rato ligada a cada placa. Todos os anticorpos se ligaram ãs cavidades revesti das quer com IgM-kapa quer com IgM-lambda. Entre os anticorpos de ligação mais alta, escolheram 1C2 e 2G10 para estado mais de talhado. Devido ao seu desenvolvimento e às características de produção do anticorpo 2G10 foi finalmente escolhido o anti-corpo. Este forneceu uma densidade óptica de 0,3 + 0,03 (desvio-padrão). A base foi 0,06 unidades de densidade óptica (D.O.) utilizando o meio isento de anticorpo monoclonal de rato. As cavidades que apresentaram uma reacção com o anticorpo IgM anti-murino superior ou igual a D.O. 0,3 foram apresentadas.

A especificidade do anticorpo 2G10 monoclonal murino foi testada por ELISA sob uma diversidade de condições. Para determinar o reconhecimento selectivo de IgM versus IgG por 2G10, absorveram-se 100 ng de proteína IgM-lambda murina ou proteína IgGg-lambda em placas microtituladoras (100 jil) e incubou-se com concentrações crescentes do anticorpo 2G10. Como se mostra na Fig. 2, no intervalo de dose do anticorpo compreendido entre 2 e 1000 ng, a ligação de 2G10 ãs microplacas tituladoras revestidas com IgM foi maior do que a alcançada nas placas re vestidas com IgG. Para doses de 50 ng ou menores de anticorpo 2G10 não houve ligação mensurável nas placas revestidas com IgG, enquanto as cavidades revestidas com IgM foram reconhecidas por

2G10.

-18Foi examinado o efeito do aumento da concentração da imuglobulina que reveste as placas microtituladoras e observou-se também o reconhecimento pelo anticorpo 2G10. Como se representa na Figura 3, o anticorpo 2G10 (adicionado numa dose de 100 ng em 100 jtil) incubado em cavidades revestidas com IgG^ e IgM mostra uma ligação selectiva às placas revestidas com IgM para todas as concentrações de revestimento. Mediu-se por ELISA uma reactividade 10 vezes maior nas placas revestidas com IgM versus IgG numa dose de revestimento de 10000 ng de IgM ou IgG (comparar IgG^-kapa com IgM-kapa). O anticorpo 2G10 mais uma vez demonstrou ligação de IgM selectiva.

O anticorpo 2G10 foi também testado relatívamente ã sua capacidade para reconhecer selectivamente IgM num ensaio ELISA indirecto. Revestiram-se com os antigénios placas microtitula doras e incubaram-se com meio de cultura de hibridoma que continha o anticorpo que reconhece estes antigénios. Utilizaram-se neste ensaio os anticorpos das subclasses IgM e IgG^. Após a incubação de placas revestidas com antigénio, com o anticorpo que com ele interactua, adicionaram-se concentrações crescentes de anticorpo 2G10 murino às cavidades e avaliou-se por ELISA a ligação de 2G10. Tal como se representou na Figura 4, o anticorpo 2G10 reconheceu sensível e selectivamente o IgM ligado ao seu antigénio respectivo (círculos a cheio) mas foi incapaz de detectar IgG (círculos abertos) sob as mesmas condi ções, embora a presença de IgG^ pudesse ser detectada facilmen te com anticorpos que reagem com todos os subtipos de imunoglo bulina de murganho. Estes resultados demonstram o reconhecimento selectivo de imunoglobulinas de subclasse de IgM de mur ganho pelo anticorpo monoclonal murino 2G10. O anticorpo mono clonal murino também foi capaz de reconhecer o anticorpo de IçM

-19em doses da ordem . do picograma demonstrando a sua grande afinidade para o anticorpo IgM murino.

EXEMPLO 3

Caracterização de Anticorpos Murinos IgM Anti-murganho

Revestiram-se as placas microtituladoras com vários sub tipos de imunoglobulinas de murganho (IgM-kapa e lambda, IgG^, IgG2 e IgG^), do modo descrito no Exemplo 2 e caracterizou-se melhor a ligação dos anticorpos IgM murinos anti-murganho pro duzida pelas células hibridoma que foram positivas no Exemplo 2. Todas as placas foram lidas num leitor de placas ELISA Bio-Tek num comprimento de onda de 405 nm. A absorvância (compara da com os controlos) foi utilizada com uma indicação da presença de anticorpo anti-IgM de murganho.

EXEMPLO 4

Purificação e caracterização de anticorpo monoclonal murino 2G10

Para melhor caracterização foi escolhido um anticorpo monoclonal IgM murino anti-murganho, designado por 2G10. Como se mostrou no Exemplo 3, o anticorpo 2G10 foi positivo para IgM-kapa e IgM-lambda. Purificou-se o anticorpo por centrifugação e fraccionamento com sulfato de amónio.

A linha de células hibridoma representativa 2G10 foi de positada na American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md., U.S.A., a 23 de Abril de 1990, tendo-lhe sido atribuído o número de aceitação HB 10436. Os depósitos estão disponíveis de acordo com as leis e regulamentos de patente de invenção dos

Estados Unidos e dos países nos quais forem depositados os du plicados deste pedido de patente de invenção. A disponibilidade do material depositado não constitui uma autorização para pôr em prãtica a presente invenção em prorrogação de qualquer patente emitida sobre este assunto ou qualquer divisão ou continuação deste pedido de patente de invenção.

Levou-se o sobrenadante da cultura de 2G10 (ou líquido ascítico proveniente de murganhos nus) a 45% da saturação em sulfato de amónio (indução da precipitação; salting out) por adição lenta de um volume igual de sulfato de amónio a 90%. Agitou-se a amostra durante 30 minutos à temperatura de 4°C e, em seguida, centrifugou-se a 20000 x g durante 30 minutos. Re suspendeu-se o aglomerado numa suspensão de sulfato de amónio a 40%, agitou-se durante 30 minutos e voltou-se a aglomerar por centrifugação, como descrito anteriormente. Resuspendeu-se o aglomerado em água e dializou-se contra 100 volumes de PBS. Utilizaram-se alíquotas da solução para determinação do teor de proteína (pela densidade óptica a 280 nm), pureza (por SDS-PAGE) e especificidade de ligação por ELISA. A solução de anti corpo restante foi congelada ã temperatura de -20°C até ser necessária.

Purificaram-se os anticorpos de IgM por precipitação com sulfato de amónio e filtração por gel numa coluna de 2,6 x x 40 cm de resina cromatografica contendo agarose, dextrano e/ou acrilamida e eluindo com PBS/azeto de sódio 0,01% à temperatura ambiente com um caudal de 1 ml/minuto.

Determinou-se a subclasse do anticorpo monoclonal murino 2G10 pelo método de Ouchterlony (Ouchterlcny e Nilsson, no Handbook of Exp. Immun. Weir, ed., Londres, Blackwell Scientific, 1958, pp. 19.1-19.44) utilizando um conjunto de (kit) de imuno

difusão comercializado por ICN Immunobiologicals (Lisle, IL.).

A subclasse do anticorpo 2G10 é importante para a ava liação do modo de purificação desta molécula. Para realizar a análise da subclasse utilizou-se um conjunto (kit) para a técnica de imunodifusão de Ouchterlony. Resumidamente, vários anticorpos contra subtipos de imunoglobulina murina foram adicionados a cada uma das cavidades satélites. Ã cavidade central adicionou-se uma amostra padrão conhecida ou não conhe cida e deixou-se a difundir no meio semi-sólido. Uma banda de precipitação no sítio do anticorpo específico indica o subtipo. Tal como se vê na Figura 6, as amostras de controlo positivo contendo todos os anticorpos do subtipo murino apresentaram linhas de reacção com todas as cavidades com um subtipo. Por outro lado, o anticorpo 2G10 reagiu apenas com o anti-soro do sub tipo IgG₀ , o que indica que o anticorpo murino 2G10 é um antiZ 9l corpo IgG_2a·

A fim de avaliar a ligação de um anticorpo murino comercializado com IgM de murganho, avaliou-se a reactividade por ELISA de um anticorpo monoclonal murino LO-MM-9 (de Serotec,

Cat N°MCA 199) sobre IgM murino. Adicionaram-se 100 nanogramas de mu-k, gamma-k, ou gama-1 a cada cavidade de uma placa com 96 cavidades. Em seguida, adicionaram-se diversas quantidades do anticorpo murino LO-MM-9 e procedeu-se ao ensaio ELISA para o anticorpo murino, como descrito anteriormente. Tal como se indica no Quadro 1, não se observou ligação deste anticorpo mu rino às cavidades revestidas com IgM murino.

Quadro 1

Avaliação de anticorpos murinos, comercializados, contra IgM mu rino.

-22Quadro 1

Avaliação de anticorpos murinos, comercializados contra IgM murino

Reactividade ELISA com Ig murino

Concentração	MU-k	gama-K	gama-l
1000 ng	0,058	0,008	0,037
500 ng	0,034	0,004	0,031
100 ng	0,032	0,001	0,021
50 ng	0,030	0,001	0,020
10 ng	0,021	0,001	0,002
5 ng	0,018	0,001	0,024
1 ng	0,009	0,001	0,020
0,1 ng	0,020	0,001	0,023
Portanto	, este anticorpo não	foi considerado útil pa
ra estudo pormenorizado. Além disso	, como representado na Fi^
gura 7, faixa 3,	esta preparação de	anticorpo	continha pelo me
nos três bandas	de proteína principais e pelo	menos cinco ban-
das de proteína	menores, como se avaliou por í	SDS-PAGE.

EXEMPLO 5

Ligação de IgM murino anti-murganho a células produtoras de IgM

A fim de demonstrar gue o anticorpo murino 2G10 anti-mur ganho se liga não apenas ao anticorpo IgM purificado revestindo uma placa de 96 cavidades mas também as células que produzem um anticorpo IgM, realizou-se uma análise FACS com células 10 Cl e hibridoma ADR 238-57 murino que segregam IgG e IgM, respectivamente .

-236 ·*

Resumidamente, centrifugaram-se 1 x 10 células a 500 x g durante 3 minutos, lavaram-se 3 vezes com PBS e ressuspenderam-se em 3 ml de PBS.

Diluiu-se a 1:100 com PBS (lx) inunoglobulina IgM (Cappel) anti-murganho, desenvolvida na cabra, do fragmento F (ab^ purificado por afinidade e conjugado com fluorosceína e adicionou-se 20-40 jil de uma suspensão de células. Após a incubação durante 15 a 20 minutos na ausência de luz à temperatura ambien te, lavaram-se as células duas vezes com PBS, centrifugaram-se a 500 rpm durante 3 minutos.

Adicionou-se para a fixação das células uma alíquota de 300 jil de paraformaldeído (1% em PBS). Incubaram-se as células à temperatura de 4°C para classificação por citometria de fluxo.

Para a coloração indirecta, incubaram-se primeiro as células hibridoma com anticorpo de IgM murino anti-murganho 2G10, lavaram-se e em seguida coraram-se com imunoglobulina IgM anti-murganho, desenvolvida na cabra, do fragmento Fíab^ ligado a fluorosceína e classificaram-se por citometria de fluxo.

Como se apresentou no Quadro 2, Figura 7, o anticorpo 2G10 ligou-se especificamente à IgM presente na superfície de células hibridoma murino que segregam IgM e não ãs células que segregam IgG.

QUADRO 2

Análise de FACS de IgM e IgG expressos por células hibridoma e murino % de células marcadas com fluoresceína

IgG IgM

TRATAMENTO HlBRIDOS HlBRIDOS | 0 0,87 0,37

IgG murino irrelevante + anti-rato de caprino em FITC 0,23 0,96

IgM anti-murganho murino 2g10 Aby + Anti-murino de caprino em FITC 1,58 89,99

O Quadro 2 mostra que não havia fundo de células não tra ) tadas por fluoroscéína e que IgG murino irrelevante também não se liga com híbridos de IgG nem com híbridos de IgM. Não houve ligação do anticorpo 2G10 às células de hibridoma que produzem IgG (1,58% de células positivas. Figura 7A Quadro 2). Contudo, tal como se representa na Figura.7B e no Quadro 2, 90% das células gue produzem anticorpo IgM murino mostraram ligação estável ao anticorpo 2G10. Portanto, a ligação do anticorpo 2G10 às células ocorre devido ao reconhecimento do IgM murino na su perfície celular.

Deve considerar-se que as propriedades dos anticorpos examinados são efectivamente as únicas características importan tes dos hibridomas correspondentes pelo que, para os fins da pre ' τ sente invenção, os hibridomas são caracterizados pela sua capacidade para produzir anticorpos particulares apresentando as propriedades citadas antes.

Avaliação da citotoxicidade

Os anticorpos reivindicados foram conjugados com a cadeia A da toxina de ricina (RTA) tratada com SPDP como descrito por Carlsson, J., et al., Biochem. J., 173 (1978) 723-737 ou com imi notiolano (IT).

EXEMPLO 6

Ligação^ de 2G10_a gelonina

Preparou-se uma solução de reserva do reagente SPDP (3-(2-piridiltio)-propionato de N-succinimidilo) (6 mg/ml) em dimetilformamida anidra. Adicionou-se a 1 ml de uma solução de PBS contendo 1 mg de anticorpo de 2G10 em um tubo de ensaio de vidro, de 12 x 75 mm, lentamente, SPDP num excesso molar de cinco vezes (aproximadamente 10 jul da solução de reserva) . Agi. tou-se a mistura num vortex, de 5 em 5 minutos, durante 30 minutos à temperatura ambiente.

Removeu-se o excesso de SPDP que não reagiu na amostra por cromatografia de filtração por gel numa coluna Sephadex G-25 (1 x 24 cm) previamente equilibrada com tampão de fosfato de sódio 100 mM de pH 7,0, contendo EDTA 0,5 mM (tampão A). Re colheram-se fracções de 0,5 ml e analisaram-se paradeterminação do teor de proteína utilizando o ensaio de ligação com co rante de Bradford [Bradford, Anal. Biochem., 72 (1976) 248-254.

Determinou-se a absorvância a 600 nm numa placa de 95 cavidades

-26-χ ^>ιιι utilizando um leitor aromatizado Bio-TEX Microplate. 0 anticor po eluíu no volume vazio (fracções 14 a 20) , reuniram-se essas fracções e mantiveram-se ã temperatuta de 4°C.

Das sementes de geloníum multiflorum extraiu-se a toxi. na gelonina e purificou-se até à homogeneidade, aplicando o método de Stirpe, et al., [Stirpe et al., J. Biol. Chem., 255 (1980) 6947-6953]. Adicionou-se 1 mg de gelonina purificada (2 mg/ml em PBS) a tampão de cloridrato de trietanolamina (TEA-HC1) até uma concentração final de 60 mM de TEA-HC1 e ajustou-se o pH para 8,0. A solução foi ajustada para 1 mM de EDTA . Adicionou-se uma solução de reserva de 2-iminotiolano (0,5 M em TEA-HC1 = 0,5M, pH 8,0) até uma concentração final de 1 mM e incubou-se a amostra durante 90 minutos à temperatura de 4°C sob atmosfera de azoto.

Removeu-se o excesso do 2-iminotiolano por filtração em gel numa coluna de Sephadex G-25 (1 x 24 cm) equilibrada previa mente com tampão acetato de bis-tris 5 mM, pH 5,8, contendo NaCl 50 mM e EDTA 1 mM. Recolheram-se fracções de 0,5 ml e ana lisaram-se para a determinação do teor de proteína em placas microtituladoras de 96 cavidades utilizando o ensaio de ligação com corante de Bradford. A gelonina eluíu nas fracções 14 a 20 e reuniram-se estas fracções e conservaram-se à temperatura de 4°C. Misturou-se o anticorpo 2G10 modificado por SPDP com um excesso cinco vezes molar de gelona modificada por 2-iminotio lano. Ajustou-se o pH da mistura para 7,0 mediante a adição de tampão de TEA-HC1 e 0,05M , pH 8,0, e incubou-se a mistura durante 20 horas ã temperatura de 4°C sob atmosfera de azoto. Adicionou-se iodoacetamida (0,1 M em PBS) até uma concentração final de 2mM para bloquear quaisquer grupos sufridilo livres, restantes e continuou-se a incubação durante 1 hora à tempera-27tura de 25°C.

Purificação dos complexos de gelonina-2Gl0

Para remover os produtos de baixo peso molecular e a gelonina não conjugada, aplicou-se a mistura reaccional a uma coluna Sephadex S-300 (1,6 x 31 cm), equilibrada previamente com PBS. Recolheram-se fracções de 1,0 ml e analisaram-se alí. quotas de 30 r¹ para determinação do teor de proteína utilizan do o ensaio de coloração com o corante Bio-Rad. Para retirar 2G10 não conjugado, aplicou-se o pico molecular máximo, fracções 17 a 23, de uma coluna S-300, a uma coluna de cromatografia de afinidade Blue Sepharose CL-63 (1 x 24 cm) previamente equilibrada com tampão de fosfato lOmM de pH 7,2, contendo NaCl 0,1 M. Após a impregnação da amostra, lavou-se a coluna com 30 ml de tampão até eluir totalmente o anticorpo não conjugado. Eluíu-se a coluna com um gradiente linear de cloreto de sódio de C,1 a 2M em tampão de fosfato, 10 mM de pH 7,2. Determinou-se o teor de proteína das fracções eluídas pelo ensaio de liga ção com corantes descritos anteriormente.

A mistura de ligação contendo 2G10 livre, gelonina-2G10 e gelonina livre foi primeiro purificada por filtração por gel numa coluna S-300. Tal como se vê na Figura 8, detectou-se um pico de alto peso molecular (nas fracções 25 a 42) assim como um pico de menor peso molecular (fracções 55 a 67). Reuniram-se as fracções 26 a 42 para a análise da pureza e da reactivi dade do conjugado.

Realizou-se a análise PAGE do conjugado 2GlO-gelonina purificado. Como se pode ver na Figura 9, a mistura de ligação gelonina-2G10 (faixa 3) continha 2G10 livre, gelonina livre

-28(setas), assim como 2G10 ligado a uma molécula de gelonina (se ta monomérica) e 2G10 ligado a uma molécula de gelonia (seta dimêrica). Como se vê na faixa 1, o conjugado gelonina-2G10 purificado final contém principalmente 2G10 ligado a uma molé cuia de gelonina e quantidades menores de 2G10 ligado a duas moléculas de gelonina. A preparação não estava contaminada por gelonina livre nem por anticorpo livre.

Para se determinar se a reacção química e a ligação de£ te anticorpo 2G10 ã gelonina modificou o reconhecimento do anti. corpo 2G10 por IgM murino, revestiram-se placas de 96 cavidades com um anticorpo IgG murino ou IgM murino, tal como se represen ta na Figura 2. Em substituição do anticorpo 2G10, adicionou-se às cavidades o conjugado 2G10-gelonina em várias concentra ções. Em seguida, realizou-se um ensaio ELISA convencional pa ra detectar um anticorpo murino. Tal como se representa na Figura 10, o conjugado de gelonina 2G10 ligou-se facilmente às placas revestidas com IgM e apenas em pequena quantidade às pia cas revestidas com IgG. Apenas para a concentração mais alta testada (1000 ng/cavidade) o conjugado gelonina 2G10 se ligou significativamente às cavidades revestidas com IgG. Em contras^ te, para uma concentração similar o conjugado 2G10-gelonina li. gou-se em grande quantidade às cavidades revestidas com IgM. Portanto, foi preservada a imuno-reactividade do conjugado 2GlO-gelonina para IgM. Além disso, o conjugado 2GlO-gelonina não deu reacção cruzada de forma apreciável com IgG murino e portanto a selectividade do conjugado 2G10-gelonina também não foi alterada. Estes dados sugerem que o conjugado 2G10-geloni na deve ligar-se a células murinas cobertas com IgM, do mesmo modo que o próprio anticorpo 2G10.

EXEMPLO 7

Produção de anticorpos monoclonais de proteína ornitina descarboxilase (ODC)

A. Imunização in vitro e produção de anticorpos monoclonais

Os protocolos que são habitualmente utilizados para a produção de anticorpos monoclonais murinos originam a geração de hibridomas que segregam anticorpos da subclasse IgM. A fim de demonstrar o resultado típico dos protocolos de produção de anticorpos monoclonais murinos, utilizaram-se duas técnicas pa ra a geração de anticorpos monoclonais anti-proteína ornitina descarboxilase murina (ODC). A primeira técnica envolve a imu nização de células de base murinas in vitro, isto é, placas de cultura com proteína ornitina descarboxilase (ODC).

Esta técnica foi realizada pelo método de Luben [Luben e Mohler, Molec. Immunol., 17 (1980) 635-639] utilizando 25 |ig de proteína ornitina descarboxilase de fígado de rato purifica da.

Resumidamente, a proteína ODC foi incubada em células de murganho durante 72 horas ã temperatura de 37°C, na presença de meio condicionado com timócitos (uma fonte de imunoglobu lina que segrega factores de crescimento específicos do tipo de células). Em seguida fundiram-se as células de,baço com células de mieloma MPC utilizando como fusogénio polietilenoglicol. As células híbridas resultantes foram testadas em relação a secreção de anticorpo reactivo com a proteína ODC. Os resultados es tão resumidos no Quadro 3.

-30Quadro 3

Resumo da Imunização in vitro e da produção de hibridomas

RESUMO DA PRODUÇÃO

OBSERVAÇÕES

Total de cavidades 48 plaqueadas

Duas placas de 24 cavi_ dades.

x 10 células/cavidade

Total de cavidades com híbridos viáveis/ /Total de cavidades plaqueadas	48/48
Total de cavidades po sitivas pelo primeiro ELISA	48/48

Representa uma frequen cia de fusão mínima de l:10⁶ foram superiores a 4 vezes o meio de controlo anterior em ELISA

Cavidades positivas para 12/14 precipitação da activida de de ODC/cavidades testadas

Cavidades totais expandi 12/48 das para clonagem

Monoclones positivos por 70

ELISA individuais totais recuperados de 12 cavida des policlonais originais

Monoclones positivos to 50/70 tais para precipitação da actividade de ODC/Total analisado

Apenas se testaram os 14 mais positivos por ELISA

Limitado nos 12 clones mais promissores

Apenas 1 recuperado da cavidade policlonal num total de 18

No máximo 48% da activi dade ODC adicionada pre cipitada e no mínimo de 4%

Monoclones totais que se 70/70 gregam IgM/monoclones totais

Monoclones totais que se 0/70 gregam IgG/monoclones totais

-31Após a sondagem inicial com a proteína ODC, reclonaram-se os hibridomas e testaram-se novamente. Obtiveram-se 70 hibridomas que reagiram com a proteína ODC segundo diversos critérios . Contudo, tal como se mostra no Quadro 3, todos os clones foram segregados por anticorpos do isotipo IgM. Nenhuns foram segregados por anticorpos IgG. Verificou-se que estes anticorpos eram de uso limitado numa variedade de aplicações para anticorpos monoclonais.

B. Imunização in vivo e produção de anticorpos monoclonais

Uma segunda técnica utilizada para a produção de anti_ corpos monoclonais foi a imunização de um murganho por injecção com proteína ODC purificada. Isolaram-se as células do baço do murganho após a imunização, fundiram-se com 8.653 células de mie loma P3 x 63 Ag (utilizando PEG como descrito anteriormente) . Isolaram-se os clones, testou-se a reactividade com a proteína ODC e caracterizaram-se posteriormente para a utilização como reagente de reconhecimento de ODC específico. Os resultados destes testes estão apresentados no Quadro 4.

QUADRO 4

Resumo da Imunização in vivo da produção de hibridoma intra-espécies

Resumo da produção

Observações

Total de cavidades plaqueadas

Total de cavidades com híbridos viáveis

1200 Muitas das cavidades da placa de 96 cavidades pia 5 queadas com 2,5 x 10 células/cavidade

148 Aproximadamente 12% das cavidades plaqueadas (frequência de fusão de 7 cerca de 1:10 )

Total de cavidades posi. 30/148 tivas por primeiro ELISA

Cavidades clonadas por 30 diluição limitante

Monoclones positivos to- 27 tais individuais por ELI SA recuperados de 30 cavidades policlonais origi nais

Seis destas foram significativamente superiores ao controlo na ligação ODC por ELISA

Todos os policlones positivos expandidos e clonados

Três cavidades policlonais não forneceram monoclones positivos

Monoclones totais que se gregaram IgM/número testado

27/27 Sem comentários

Monoclones que segrega- 0/27 ram IgG/número testado

Monoclones totais que pre 1/5 cipitaram a actividade ODC/número testado

Apenas um precipitou uma quantidade significativa de quantidade ODC relati. vamente ã média de controlo

Desenvolveram-se 27 linhas de células monoclonais, 100% das quais segregaram o anticorpo da subclasse IgM. Mais uma vez, estes anticorpos mostraram subsequentemente serem inadequa dos para utilização como reagente específico de ODC.

Exemplo 8

Procedimento de classificação de fluxo de células activadas (FACS)

Células hibridoma 238-57 ADR segregando IgM foram centrifugadas a 500 x g durante 3 minutos, lavadas três vezes com PBS e suspensas em 3 ml de PBS.

Diluiu-se em PBS a imunoglobulina IgM anti-murganho, de senvolvida na cabra, do fragmento F(ab)₂ purificado por afinida de conjugada com fluorosceína (Cappel) e adicionou-se 20-40 jil a 20 jil de suspensão de células.

Após a incubação durante 15 a 20 minutos, na ausência de luz e ã temperatura ambiente, lavaram-se as células duas vezes com PBS, centrifugaram-se a 500 rpm durante 3 minutos.

Para fixar as células adicionou-se uma porção de 300 p.1 de paraformaldeído em PBS a 1%. Incubaram-se as células ã temperatura de 40°C até à sua separação por citometria de fluxo.

Para coloração indirecta, as células hibridoma foram primeiramente incubadas com anticorpo IgG murino anti-murganho 2G10, lavadas e depois coradas com imunoglobulina IgM anti-mur ganho, desenvolvida na cabra, do fragmento F(ab)₂ com fluoresceina e classificadas por citometria de fluxo.

-34EXEMPLO 9

Separação magnética das células

Células de hibridoma de murganho 238-57 ADR foram lavadas três vezes com meio de Iscove contendo 1% de soro bovino fetal e 0,1% de gentamicina. Centrifugaram-se as células a 500 x g durante 3 minutos ã temperatura ambiente e ressuspendeu-se o aglomerado em 0,5 ml de meio e incubou-se durante 60 minutos em gelo com anticorpo IgM anti-murganho murino purifi. cado (2G10) numa concentração aproximada de 0,425 mg/ml (cerca de 0,1 ml utilizado para cada 10 células/ml). Apõs lavagem duas vezes com meio de Iscove arrefecido, ressuspenderam-se as células em 0,2 ml de meio e contaram-se . Lavaram-se pérolas magnéticas três vezes em meio isento de soro utilizando uma pia ca magnética. Misturou-se o aglomerado celular com aglomerado das pérolas numa relação de 20 pérolas/célula. O volume total não excedeu 0,4 ml. A mistura célula/pérola foi incubada duran te 30 minutos sobre gelo com agitação de 10 em 10 minutos.

A mistura foi ressuspensa em, pelo menos 2 ml do meio e magneticamente separada segundo uma direcção perpendicular â gravidade . Quando a separação se completou, removeu-se o sobrenadante sem modificar o conjunto magnético. Ressuspenderam-se as pérolas em 1-2 ml de meio e observaram-se ao microscópio.

Após a descrição completa da presente invenção, deverá ser evidente para um especialista na matéria que se podem intro duzir modificações e alterações sem afastamento do espirito da presente invenção, tal como é definido pelas reivindicações seguintes .

Claims

REIVINDICAÇÕES

1.- Conjugados de anticorpos anti-IgM, caracterizados pelo facto de incluírem:

um anticorpo monoclonal que se liga selectivamente a um anticorpo IgM, que não se liga a anticorpos IgG^ ou IgG2 e que tem um isotipo G; e um grupo citotóxico -conjugado com o referido anticorpo monoclonal.
2.- Conjugados de anticorpos anti-IgM, caracterizados pelo facto de incluírem:

um anticorpo monoclonal que se liga selectivamente a um anticorpo IgM murino, que não se liga a anticorpos

IgG^ ou e que tem um isotipo G; e um grupo citotóxico conjugado com o referido anticorpo monoclonal.
3.- Conjugados de acordo com a reivindicação 1, ca-36 racterizados pelo facto de o referido anticorpo monoclonal se ligar a. células de hibridoma produtoras de anticorpos IgM.
4.- Conjugados de acordo com a reivindicação 1, ca racterizados pelo facto de o referido anticorpo monoclonal i se ligar a células de hibridoma produtoras de anticorpos IgM murinos.
5. - Conjugados de acordo com a reivindicação 1, ca racterizados pelo facto de o referido anticorpo monoclonal ser produzido por um dos hibridomas seguintes:

a) 2G10;

b) IC2; ou ser um anticorpo monoclonal que e funcionalmente equivalente a um qualquer dos anticorpos citados antes.
6. - Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo monoclonal ser produzido por um hibridoma de rato X rato ou pela progenia desse hibridoma.
7. - Imunotoxina, caracterizada pelo facto de ser um conjugado de um grupo citotóxico com um anticorpo monoclonal que se liga selectivamente com um anticorpo IgM, mas que não se liga com anticorpos IgG^ ou IgG£ e que tem um isotipo G.

-37ι
8. - Método para eliminar anticorpos IgM murinos pro dutores de células, caracterizado pelo facto de se fazer contactar as referidas células com uma quantidade citotóxica eficaz de uma imunotoxina tal como definida na reivindicação 7.
9. - Conjugados de acordo com a reivindicação 1, ca racterizados pelo facto de o referido anticorpo monoclonal ser marcado com um marcador detectável.
10. - Método para a recuperação de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais do isotipo IgG, caracterizado pelo facto:

de se tratar uma população de células híbridas com um anticorpo monoclonal que tem um isotipo g e que se liga selectivamente com um anticorpo IgM mas não se liga com anticorpos IgG^ ou >

de se separarem as referidas células resultantes imunocomplexadas ·, e de se recolherem as células que não foram complexadas com os referidos anticorpos.
11. - Método para a preparação de imunotoxinas, caracterizado pelo facto.· de se utilizar um anticorpo monoclonal que se liga selectivamente com um anticorpo IgM, mas que não se liga com anticorpos IgG^ ou IgG2 e que tem um isotipo g; e um grupo citotóxico conjugado com o referido anticorpo monoclonal.
12.- Conjugado de acordo com a reivindicação 2, ca racterizado pelo facto de o referido anticorpo monoclonal se ligar com células de hibridoma produtoras de anticorpos anti-IgM.
13. - Conjugado de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo monoclonal se ligar com células de hibridoma produtoras de anticorpos anti-IgM murinos.
14. - Conjugado de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo monoclonal ser marcado com um marcador detectável.
15. - Conjugado de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo monoclonal ser produzido por hibridomas 2G10 ou IC2 ou ser um equivalente funcional a um anticorpo monoclonal produzido por hibridomas 2G10 ou 1C2.

ζ*
16.- Conjugado de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo monoclonal ser produzido por hibridomas de rato X rato ou pela progenia desses hibridomas.
17.- Conjugado de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo monoclonal ser marcado com um marcador detectável.
18.- Conjugado de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo monoclonal ser produzido por hibridomas 2G10 ou IC2 ou ser um equivalente funcional a um anticorpo monoclonal produzido por hibridomas 2G10 ou 1C2.
19.- Conjugado de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo monoclonal ser produzido por hibridomas de rato X rato ou pela progenia desses hibridomas.
20.- Conjugado de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo monoclonal ser produzido por hibridomas de rato X rato ou pela progenia desses hibridomas.

-4ΰ-
21.- Conjugado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo monoclonal ser produzido por hibridomas de rato X rato ou pela progenia desses hibridomas.
22. - Imunotoxina, caracterizada pelo facto de ser um conjugado de um grupo citotóxico com um anticorpo monoclonal que se liga selectivamente com um anticorpo IgM murino, mas que não se liga com anticorpos IgG·^ ou IgG₂ e que tem um isotipo G.
23. - Imunotoxina, caracterizada pelo facto de ser um conjugado de um grupo citotóxico com um anticorpo monoclonal anti-IgM que se liga selectivamente- com anticorpo, mas que não se liga com anticorpos IgG^ ou IgG₂ e que tem um isotipo G.
24.- Método para a recuperação de hibridomas que produzem anticorpos monoclonais do isotipo IgG, caracterizado pelo facto:

de se tratar uma população de células híbridas com um anticorpo monoclonal que tem um isotipo G e que se liga selectivamente com um anticorpo IgM, mas que não se liga com anticorpos IgG^ ou IgG₂;

-*4Τ / ’χ

S ’ λ

de se separarem as referidas células resultantes imunocomplexadas; e de se recolherem as células que não foram complexadas com os referidos anticorpos.
25. - Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo facto de se separarem as referidas células imunocomplexadas por citometria de fluxo.
26. - Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo facto de se separarem as referidas células imunocomplexadas por separação magnética celular.
27. - Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de se separarem as referidas células imunocomplexadas por citometria de fluxo.
28. - Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de se separarem as referidas células imunocomplexadas por separação magnética celular.

.24

O.D. @ 405 nm

4BII 6BI 7BII IC2 IE4 2EI0 2G6 2GI0 SH8

FIG. IB

0. D. @ 405 nm

4BII 6BI 7BII IC2 IE4 2EI0 2G6 2GI0 5H8

FIG.

J_ι_L

Sf OJ

100 1000 (2610) @ 405nm

FIG.

O.D. @ 405nm