PT101652B - Anticorpos monoclonais anti-igm e metodos para a sua utilizacao - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-IgM E MÉTODOS PARA A SUA UTILIZAÇÃO

WEILER/FOUNDAT1ON RE.: D-5034

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Referência a um pedido de patente de invenção relacionada

Este pedido de patente de invenção é uma continuação em parte do pedido de patente de invenção norte-americana N° 08/139 613, depositado em 20 de Outubro de 1993 que é uma continuação do pedido de patente de invenção norte-americana N° 07/832 663, depositado em 4 de Fevereiro de 1992, presentemente abandonado, que é uma continuação do pedido de patente de invenção norte-americana N° 515 974 depositado em 27 de Abril de 1990, presentemente abandonado.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se na generalidade ao campo da imunologia e à produção de anticorpos monoclonais. Mais especialmente, a presente invenção diz respeito a anticorpos monoclonais anti-lgM e a métodos para a sua utilização.

Descrição da Técnica Relacionada

Desde a descrição inicial de anticorpos monoclonais, o desenvolvimento de tecnologia para a produção de linfócitos imortalizados capazes de produzirem anticorpos de especificidade pré-determinada tem tido um grande impacto quer na investigação clínica quer na pesquisa científica de base assim como nas modalidades terapêuticas disponíveis para o diagnóstico e o tratamento de uma grande variedade de situações patológicas.

Os anticorpos são proteínas endógenas produzidas pelo sistema imunológico como resposta a estímulos antigénicos. Estas proteínas ligam-se especificamente a moléculas de antigénios em sítios definidos (epitopes). Os anticorpos policlonais obtêm-se a partir da imunização de animais com antigénios e ligam-se a esses antigénios em epitopes múltiplos. Por outro lado, os anticorpos monoclonais constituem um conjunto definido e específico de anticorpos que são derivados de um único clone (monoclone) de células que produzem um anticorpo específico. Ao contrário dos anticorpos policlonais, os anticorpos monoclonais ligam-se apenas a um epitope específico na molécula do antigénio.

Embora a tecnologia para a geração de anticorpos monoclonais exista há algum tempo, a metodologia corrente é demorada, trabalhosa e resulta frequentemente na produção de anticorpos que, embora específicos para o antigénio alvo, têm uma afinidade relativamente baixa para o antigénio e, portanto, têm uma utilidade limitada em uma grande variedade de aplicações.

Entre as dificuldades encontradas na produção de anticorpos monoclonais úteis e clinicamente importantes encontra-se a abundância de anticorpos do subtipo IgM obtidos a partir de hibridomas produzidos por métodos de imunização convencionais in vivo e in vitro. Esses anticorpos do subtipo IgM são na generalidade de afinidade escassa, difíceis de purificar e frequentemente constituem a globalidade dos anticorpos produzidos pelos hibridomas. Adicionalmente, em culturas mistas de células de hibridomas secretoras de IgM e de IgG, as células que segregam IgM tomam-se frequentemente mais abundantes do que as células híbridas que segregam IgG.

Uma parte do método laborioso para a produção de hibridomas consiste na eliminação de células de hibridomas produtoras de IgM obtidas após uma fusão celular. Isto realiza-se na generalidade por clonagem de células mediante diluição limitadora, desenvolvimento de células individuais em colónias e verificação de cada colónia individualmente para determinar quais delas produzem anticorpos do subtipo IgG. Geralmente, as células de hibridomas produtoras de IgG são depois analisadas novamente para determinar a especificidade do antigénio dos anticorpos produzidos.

Embora tenham sido referidos anticorpos que são dirigidos contra epitopes no anticorpo IgM, todos os ensaiados até ao presente reagiram também com anticorpos do subtipo IgG.

A requerente e outros entendidos na matéria têm revelado agentes citotóxicos que se ligam aos anticorpos originando imunotoxinas. Um interesse recente incidiu sobre as imunotoxinas de anticorpos monoclonais conjugados com as porções que apresentam actividade enzimática (cadeias A) de toxinas de origem bacteriana ou vegetal via agentes hetero-bifuncionais. Nevelle, D.M. e Youle, R.J., Immunol Rev (1982) 62: 75-91; Ross, W.C.J. et al., European J. Biochem (1980) 104; Vitteta, E.S. et al., Immunol. Rev. (1982) 62: 158-183; Raso, V., et al., Câncer Res (1982) 42: 457-464; Trowbridge, I.W. e Domingo, D.L., Nature (Lond) (1981) 294: 171-173.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um aspecto principal da presente invenção diz respeito a anticorpos monoclonais murinos que: (a) se ligam sei ectivam ente a anticorpos do subtipo IgM; (b) são IgG; e (c) não se ligam ao subtipo IgGj ou IgG2- O tipo preferido destes anticorpos é o designado por 2G10 e os seus equivalentes funcionais.

Os hibridomas de rato x rato que produzem os anticorpos descritos antes e a progénie desses hibridomas são outros dos aspectos da presente invenção.

A presente invenção também inclui um método para a preparação de um hibridoma tal como definido antes que consiste em fundir células tumorais murinas com esplenócitos murinos obtidos a partir de um rato imunizado com imunogénio murino do subtipo IgM e em seleccionar hibridomas que produzem anticorpos tal como definidos antes.

Um outro aspecto desta invenção é um método para a produção de anticorpos tal como definidos antes que consiste em cultivar um hibridoma capaz de produzir um tal anticorpo ou, eventualmente, um hibridoma que tenha sido preparado por um método como o descrito antes.

Um outro aspecto desta invenção refere-se a imunotoxinas e à sua preparação mediante conjugação (a) dos anticorpos monoclonais descritos antes e (b) de um grupo citotóxico ou de pérolas magnéticas.

Um outro aspecto desta invenção diz respeito a derivados marcados dos anticorpos monoclonais descritos antes que são marcados com um marcador detectável que permite a utilização desses derivados na localização do alvo, selecção específica ou classificação.

Um outro aspecto desta invenção diz respeito a um método de assassínio de células B ou de um hibridoma produtor de IgM fazendo contactar as células

com uma quantidade eficaz sob o ponto de vista citocida de uma ou mais das imunotoxinas descritas antes.

Outros aspectos desta invenção são os imunoensaios directos ou indirectos para determinar se uma célula produz anticorpos IgM ou para determinar se um anticorpo pertence ao isotipo IgM. Estes ensaios envolvem a incubação de células com os anticorpos monoclonais ou os seus derivados marcados. Quando se utilizam derivados marcados, a presença nas células de complexos imunológicos binários marcados é lida directamente. Quando se utiliza um anticorpo não marcado, as células são incubadas posteriormente com um anticorpo marcado contra o anticorpo monoclonal e lê-se nas mesmas a presença de complexos imunológicos ternários marcados.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 demonstra a pesquisa em sobrenadantes de hibridomas de anticorpos específicos IgM.

A Figura 2 demonstra a ligação específica dose-dependente do anticorpo 2G10.

A Figura 3 demonstra o efeito do aumento do teor em imunoglobulina murina absorvida sobre a ligação do 2G10.

A Figura 4 mostra o reconhecimento selectivo da IgM murina pelo 2G10 em um ensaio ELISA indirecto.

A Figura 5 ilustra a pureza do anticorpo 2G10 por SDS-PAGE.

A Figura 6 caracteriza a subclasse do anticorpo 2G10 murino por imunodifusão de Ouchterlony.

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A Figura 7 demonstra a utilização do 2G10 na ligação a células que exprimem anticoipos da subclasse IgM.

A Figura 8 ilustra o perfil da eluição da imunotoxina (composta por

2G10 ligado a gelonina) em uma matriz de filtração por gele.

A Figura 9 demonstra a pureza da imunotoxina 2G10-gelonina por SDS-PAGE.

A Figura 10 mostra a ligação específica da imunotoxina (2G10-gelonina) à IgM murina.

A Figura 11 mostra o efeito do tratamento sobre a secreção de IgM proveniente de uma cultura primária de linfócitos - após 24 horas I.

A Figura 12 mostra o efeito do tratamento sobre a secreção de IgM proveniente de uma cultura primária de linfócitos - após 72 horas I.

A Figura 13 mostra o efeito do tratamento sobre a secreção de IgM proveniente de uma cultura primária de linfócitos - após 96 horas I.

A Figura 14 mostra o efeito do tratamento sobre a secreção de IgM proveniente de uma cultura primária de linfócitos - após 24 horas II.

A Figura 15 mostra o efeito do tratamento sobre a secreção de IgM proveniente de uma cultura primária de linfócitos - após 48 horas II.

A Figura 16 mostra o efeito do tratamento sobre a secreção de IgM proveniente de uma cultura primária de linfócitos - após 72 horas II.

A Figura 17 mostra o efeito de um tratamento de 2 horas sobre a secreção de IgM proveniente de uma cultura primária de linfócitos - após 24 horas 111.

A Figura 18 mostra o efeito de um tratamento de 2 horas sobre a secreção de IgM proveniente de uma cultura primária de linfócitos - após 48 horas III.

A Figura 19 mostra o efeito de um tratamento de 2 horas sobre a secreção de IgM proveniente de uma cultura primária de linfócitos - após 72 horas III.

A Figura 20 mostra o efeito de um tratamento de 2 horas sobre a secreção de IgM proveniente de uma cultura primária de linfócitos - após 96 horas III.

A Figura 21 mostra a comparação entre a secreção de IgG e de IgM no conjugado e nas fusões tratadas de AB/gel (anticorpo/gelonina).

A Figura 22 mostra a detecção de IgM no soro de murganhos pré-tratados e imunizados por KLH I.

A Figura 23 mostra a detecção de IgM no soro de murganhos pré-tratados e imunizados por KLH II.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Para que a invenção aqui descrita possa ser totalmente entendida, apresenta-se a seguinte descrição pormenorizada.

Quando utilizada na presente invenção a expressão anticorpo monoclonal significa uma composição de anticorpos com uma população de anticorpos homogénea. A presente invenção não é restrita quanto à fonte do anticorpo ou ao modo como o mesmo é preparado.

Quando utilizada na presente invenção relativamente aos anticorpos IgM anti-murinos monoclonais de rato exemplificados, a expressão equivalente funcional” significa um anticorpo monoclonal que: (a) bloqueia de forma cruzada um anticorpo monoclonal exemplificado; (b) se liga selectivamente ao anticorpo

IgM murino; (c) pertence ao isotipo G; e (d) não se liga ao isotipo IgGj ou IgG2Quando utilizado na presente invenção relativamente aos hibridomas produtores de anticorpos monoclonais descritos na presente invenção, o termo progénie inclui a totalidade de derivados, ascendência e descendência do hibridoma inicial que produz o anticorpo IgM anti-murino monoclonal produzido pela origem, independentemente da geração ou da identidade do cariotipo.

A presente invenção pode ser utilizada para produzir anticorpos capazes de se ligarem a anticorpos IgM de qualquer espécie. Para se obter uma linha de células de hibridoma estável e capaz de continuar a produzir um anticorpo anti-IgM dirigido para a espécie imunizante, é apenas necessário utilizar as indicações da presente invenção. Preferencialmente, o anticorpo monoclonal anti-IgM da presente invenção é dirigido para uma IgM humana ou murina.

Produção de Anticorpos Monoclonais

Os intervenientes na fusão produtora de anticorpos utilizados para a obtenção de hibridomas de acordo com a presente invenção são gerados mediante imunização de ratos com um anticorpo IgM murino. Os ratos são inoculados pelas vias subcutânea e intraperitoneal com uma quantidade imunogénica do anticorpo IgM murino em adjuvante de Freund e, seguidamente, é reforçada a imunização com quantidades similares do imunogénio em adjuvante. Alguns dias após o reforço final recolhem-se os baços dos ratos imunizados a partir dos quais se prepara uma suspensão de células para utilizar na fusão.

Utilizando a técnica geral de hibridação celular somática de Kohler, B. e Milstein, C., Nature (1975) 256: 495-497 |modificada por Buck, D.W. et al., In Vitro (1982) 18: 377-381], preparam-se hibridomas a partir de esplenócitos e de um tumor murino como interveniente. Na hibridação podem utilizar-se linhas de mieloma de rato disponíveis como, por exemplo, YB2/0 e Y3-Ag 1.2.3. Basicamente, a técnica envolve a fusão de células tumorais e de esplenócitos utilizando um fusogénio tal como o polietilenoglicol. Após a fusão, separam-se as células do meio de fusão e desenvolvem-se em um meio de crescimento selectivo, tal como o meio de HAT, para eliminar células iniciais que não hibridaram. Quando necessário, desenvolvem-se os hibridomas e analisam-se os sobrenadantes para determinar a actividade da IgM anti-murina por técnicas de imunoensaio convencionais (por exemplo, radioimunoensaio, imunoensaio enzimático ou imunoensaio por fluorescência) utilizando como antigénio um agente de imunização IgG], IgG2 e IgM (anticorpo IgM murino). Subsequentemente, caracterizaram-se os clones positivos para determinar se correspondem às especificações dos anticorpos de acordo com a presente invenção.

Os hibridomas que produzem estes anticorpos podem desenvolver-se in vitro ou in vivo utilizando técnicas convencionais. Quando necessário, os anticorpos monoclonais podem separar-se do meio de cultura ou dos líquidos do corpo, conforme o caso, por técnicas convencionais de purificação de imunoglobulinas como, por exemplo, precipitação com sulfato de amónio, electroforese em gel, diálise, cromatografia e ultrafiltração.

Selecção/Caracterização de Anticorpos Monoclonais

As características importantes dos anticorpos monoclonais são (1) a sua classe de imunoglobulina, (2) a sua selectividade para o anticorpo IgM murino; e (3) a sua utilidade na identificação e ligação com células murinas de hibridoma produtoras de IgM.

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A selectividade e a classificação de um dado anticorpo são determinadas por testes em painéis de (1) células de hibridoma produtoras de IgGj, IgG2 e IgM e (2) anticorpos IgG], IgG2 e IgM. Para seleccionar os anticorpos reivindicados investigaram-se inicialmente aproximadamente 162 culturas de hibridomas em desenvolvimento. Nove clones reagiram com o anticorpo IgM murino mas não com o anticorpo IgG. Um destes clones foi escolhido para subsequente caracterização.

Os anticorpos que exibiram selectividade e caracterização aceitáveis foram conjugados com gelonina utilizando o iminotiolano (IT) ou o propionato de N-succinimidil-3-(2-piridil-di-tio) (SPDP) como agente de ligação. Para determinar se a especificidade do anticorpo é mantida após a ligação química à toxina, ensaiaram-se os conjugados contra placas revestidas com IgM e IgG

Nos exemplos que se seguem são apresentados outros pormenores da caracterização deste anticorpo.

Produtos Imunoquímicos

Os derivados imunoquímicos dos anticorpos monoclonais de acordo com a presente invenção, que são de importância primordial, são imunotoxinas (conjugados de um anticorpo e de um grupo citotóxico) e derivados marcados (por exemplo, radiomarcados, marcados com uma enzima, marcados com magnetismo ou marcados com fluorocromo) em que a mareagem proporciona um meio de identificação e/ou classificação dos complexos imunológicos que incluem o anticorpo marcado.

O grupo citotóxico da imunotoxina pode ser um fármaco citotóxico ou uma toxina com actividade enzimática e de origem bacteriana ou vegetal ou um fragmento com actividade enzimática (cadeia A) de uma destas toxinas. Pre11

ferem-se as toxinas com actividade enzimática e os seus fragmentos de que são exemplos a gelonina, a cadeia A da difteria, os fragmentos activos sem capacidade de ligação da toxina diftérica, a cadeia A da exotoxina de Pseudomonas aeruginosa. a cadeia A da ricina, a cadeia A da abrina, a cadeia A da modecina, a alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii. proteínas de diantina, proteínas de Phytoiacca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), o inibidor de momordica charantia, a curcina, a crotina, o inibidor da Saponaria officinalis, a mitogelina, a restrictocina, a fenomicina e a enomicina. A preferida é a gelonina. Utilizando um grande número de agentes de ligação de proteínas bifuncionais podem preparar-se conjugados de um anticorpo monoclonal e dos grupos citotóxicos citados antes. São exemplos destes reagentes o SPDP, o IT, derivados bifuncionais de imidoésteres, por exemplo, o cloridrato do adipimidato de dimetilo, ésteres activos como, por exemplo, o suberato de disuccinimidilo, aldeídos como, por exemplo, o glutaraldeído, compostos bis-azido tais como a bis-(p-azidopenzoil)-hexanodiamina, derivados de bis-diazónio tais como a bis-(p-diamóniobenzoil)-etilenodiamina, di-isocianatos tais como o 2,6-di-isocianato de tolileno e compostos de flúor bi-activos como, por exemplo, o l,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno.

Quando utilizados para assassinar in vitro hibridomas produtores de anticorpos IgM murinos, os conjugados serão, na generalidade, adicionados ao meio de cultura celular em uma concentração de pelo menos cerca de 10 nM. A formulação e o modo de administração para utilização in vitro não são factores críticos. Normalmente, utilizam-se composições aquosas que são compatíveis com o meio de cultura ou de perfusão. Para determinar a presença ou o teor de células de hibridoma produtoras de IgM pode avaliar-se a citotoxicidade por técnicas convencionais.

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Quando utilizadas in vivo para a supressão de células produtoras de IgM, as imunotoxinas são administradas aos animais imunizados em quantidades eficazes sob o ponto de vista terapêutico (isto é, quantidades que eliminam ou reduzem os esplenócitos produtores de IgM). Estes são na generalidade administrados por via parentérica, de preferência por via endovenosa. A dose e a posologia dependerão da natureza da célula produtora de IgM que se pretende suprimir, das características da imunotoxina escolhida como, por exemplo, do seu índice terapêutico e início de acção. A quantidade de imunotoxina administrada está habitualmente compreendida entre aproximadamente 0,1 e aproximadamente 10 mg/kg de peso do corpo.

Para a administração parentérica as imunotoxinas serão apresentadas sob uma forma injectável unitária (solução, suspensão, emulsão) em associação com um veículo parentérico aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Estes veículos são inerentemente atóxicos e desprovidos de acção terapêutica. Exemplos de veículos deste tipo são a água, o soro fisiológico, a solução de Ringer, uma solução de dextrose e a albumina sérica humana a 5%. Podem também utilizar-se veículos não aquosos tais como óleos fixos e o oleato de etilo. Como veículos podem utilizar-se lipossomas. O veículo pode conter quantidades mínimas de aditivos como, por exemplo, substâncias que reforçam a isotonia e a estabilidade química tal como tampões e conservantes. Na generalidade, adiciona-se a imunotoxina a estes veículos em concentrações compreendidas entre aproximadamente 1 mg/ml e 10 mg/ml.

Os medicamentos radioactivos citotóxicos para eliminação de células de hibridoma produtoras de IgM podem preparar-se conjugando isótopos que emitem transferência de energia linear elevada (LET) (por exemplo, 98γ, 95pt) com os anticorpos. Quando utilizada na presente invenção a expressão grupo citotóxico inclui estes isótopos.

Os marcadores utilizados para a obtenção das versões marcadas dos anticorpos incluem grupos que se podem detectar directamente tais como fluorocromos e radiomarcadores, bem como grupos tais como enzimas que se devem fazer reagir ou transformar em derivados detectáveis. Exemplos destes marcadores são 32p_? 125i, 14(2, fluoresceína e os seus derivados, rodamina e os seus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferia, 2,3-di-hidroftalazinadionas, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, lisozima e glicose-6-fosfato-desidrogenase. Utilizando métodos conhecidos podem detectar-se estes anticorpos com tais marcadores. Por exemplo, para detectar anticorpos com marcadores fluorescentes, quimio-luminescentes e enzimas como os citados antes, podem utilizar-se agentes de ligação tais como aldeídos, carbodi-imidas, a dimaleimida, imidatos, succinimidas, a benzadina bis-diazotada e outros. Para utilizar em regimes de classificação magnética os anticorpos podem também marcar-se com pérolas magnéticas.

Os anticorpos e os anticorpos marcados podem utilizar-se em um grande número de técnicas de classificação celular para separar células de hibridoma produtoras de IgM de células de hibridoma produtoras de IgG ou para eliminar células de hibridoma produtoras de IgM de culturas que as contêm.

As técnicas de ensaio correntes que se podem utilizar incluem ensaios directos e indirectos. Os ensaios directos compreendem a incubação de um hibridoma ou de um anticorpo de isotipo desconhecido com um anticorpo marcado de acordo com a presente invenção. Quando a amostra inclui células produtoras de IgM, o anticorpo marcado ligar-se-á àquelas células. Após a lavagem das células para remover o anticorpo marcado não ligado, determina-se na amostra a presença de complexos imunológicos marcados. Nos ensaios indirectos incuba-se a amostra celular com um anticorpo monoclonal não marcado. Seguidamente, trata-se a amostra com um anticorpo marcado contra o anticorpo monoclonal (por exemplo, um anticorpo anti-murino marcado), lava-se e determina-se a presença de complexos ternários marcados.

Para utilizar como diagnóstico ou em ensaios destinados a determinar a presença do isotipo das IgM os anticorpos são na generalidade distribuídos em um estojo (Kit). Na generalidade estes estojos incluem o anticorpo marcado ou não marcado acondicionado em recipientes apropriados, reagentes para as incubações e lavagens, um anticorpo anti-murino marcado quando o estojo se destina a um ensaio indirecto e substratos ou agentes de derivação conforme a natureza do marcador. Podem incluir também controlos antigénio IgM e instruções.

Os exemplos seguintes proporcionam uma descrição detalhada da preparação, caracterização e utilização de um anticorpo monoclonal representativo de acordo com a presente invenção. Estes exemplos não pretendem de modo algum limitar a mesma invenção.

EXEMPLO 1

Caracterização de Anticorpos Monoclonais IgM anti-murganho murinos

Por intermédio da Dr^a Joanne Trial, Departamento de Imunologia do

M.D. Anderson Câncer Center, obteve-se um hibridoma murino designado por 58.6. Inicialmente, a linha de células 58.6 segregou um anticorpo murino. A linha de células não era estável e, após cerca de quatro subculturas, as células

58.6 cessaram a produção de qualquer anticorpo. Para se obter uma linha de células que fosse estável e continuasse a produzir anticorpos anti-lgM, clonou-se depois uma provisão original de células por diluições limitadoras.

A) Clonagem por diluição limitadora

Em meio de Iscove cultivaram-se células 58.6 durante 3 dias à temperatura de 37°C em uma atmosfera humidificada de dióxido de carbono a 5% em ar. Quando a cultura de células expandida alcançou uma confluência de 50%, recolheram-se as células por centrifugação e contaram-se utilizando um hemacitómetro. Diluíram-se as células em 50% do meio recente e 50% do meio condicionado (o meio em que se tinham desenvolvido as células 56.8 durante 7 dias) e semearam-se em placas, aproximadamente uma célula por cavidade em placas de 96 cavidades. Quando as cavidades que continham células individuais se desenvolveram até formarem colónias pequenas (aproximadamente 12 dias), removeu-se o meio e analisou-se para pesquisar o anticorpo anti-lgM do modo descrito no Exemplo 2. Para produzir o anticorpo em larga escala desenvolveram-se as células positivas, congelando as reservas celulares e caracterizando de novo o anticorpo. Concluída a caracterização das linhas de células relativamente ao tipo e especificidade do anticorpo produzido, reclonaram-se as linhas de células apropriadas e desenvolveram-se para congelar reservas de células e para injectar em murganhos nus tratados com pristano para se obter líquido ascítico.

B) Congelação de células híbridas

Quando células híbridas plaqueadas em frascos T75 alcançaram uma confluência de 70%, recolheram-se as células por centrifugação e ressuspendeu-se o aglomerado (pellet) em 0,9 ml de soro fetal de bovino. Imediatamente antes da congelação, transferiram-se as células para frascos-ampolas de congelação e

I I adicionou-se a cada frasco-ampola 0,1 ml de dimetilsulfóxido. Armazenaram-se os frascos-ampolas em atmosfera de azoto líquido.

C) Produção de líquido ascítico

Em um meio isento de soro lavaram-se aproximadamente 10^ células de hibridoma e injectaram-se por via intraperitoneal em murganhos nus aos quais tinha sido administrada 7 a 14 dias antes uma injecção intraperitoneal de 0,5 ml de pristano. O líquido ascítico formou-se como habitualmente entre 1 a 3 semanas e foi recolhido da cavidade peritoneal utilizando uma agulha de calibre grande. Recolheu-se o líquido em tubos contendo 5 ml de PBS com 20 mM de EDTA. Após centrifugação a 2000 x g durante 10 minutos, recuperou-se o sobrenadante, levou-se à concentração de 0,1 % em azida de sódio e armazenou-se a 4°C ou congelou-se a -20°C em alíquotas pequenas. Este líquido proporcionou uma fonte rica de um anticorpo monoclonal (aproximadamente 5-10 mg/ml).

EXEMPLO 2

Hibridomas Produtores de Anticorpos IgM anti-murganho

Para análise posterior destinada a determinar quais as células de hibridoma que produziram anticorpos que se ligaram ao anticorpo IgM murino, escolheram-se colónias de hibridoma que se desenvolveram até uma densidade aproximada de 500-1000 células durante 2 semanas. Analisou-se o meio de cultura de hibridoma proveniente destas colónias para se verificar a presença de IgM anti-murganho murinas realizando um ensaio (ELISA) com um imunoabsorvente ligado a uma enzima. Basicamente diluiram-se 100 ng de uma proteína IgG ou IgM de murganho purificada (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.) em um tampão de revestimento (NaHC03 50 mM, pH 9,8) que foram absorvidos durante a noite por placas de microtitulação com 96 cavidades por incubação a 4°C em uma câmara humidificada. Lavaram-se depois as cavidades três vezes com soro fisiológico tamponado com fosfato e contendo 0,2% de Tween 20 (PBS-Tween). Após lavagem e remoção de todos os vestígios de líquido das cavidade por pressão ligeira sobre toalhas de papel, adicionaram-se 100 μΐ de sobrenadante de hibridoma às cavidades revestidas com IgM e incubaram-se à temperatura ambiente durante 2 horas. Lavaram-se as placas novamente com PBS-Tween e incubaram-se durante uma hora à temperatura ambiente com 100 μΐ de uma diluição a 1:1000 de IgG anti-murinas desenvolvidas em cabra conjugadas com uma peroxidase em PBS-Tween. Após as cavidades terem sido lavadas novamente como se descreveu antes, fizeram-se reagir com 100 μΐ de ABTS 1 mM |2,2-azino-di-(ácido 3-etil-benz-tiazolina-sulfónico) em tampão de citrato de sódio 0,1 M pH 4,2 contendo 0,03% de peróxido de hidrogénio] durante 20-60 minutos à temperatura de 37°C. Determinou-se a densidade óptica a 405 nm com um Leitor para MicroELISA.

Para determinar se o epitope reconhecido pelos anticorpos anti-IgM se encontrava na cadeia pesada ou na cadeia leve do anticorpo, analisou-se a ligação de 9 sobrenadantes de hibridoma a placas revestidas com proteínas IgM-Kapa e IgM-lambda. Os hibridomas IC2 e 2G10 ligaram-se ambos igualmente bem às cavidades revestidas com IgM-Kapa e IgM-lambda, indicando que especificidade de ligação dos anticorpos anti-IgM se encontrava na cadeia pesada (mu) do anticorpo IgM. Que os outros 7 anticorpos analisados se ligavam também à IgM murina indica-o os resultados apresentados na Figura 1. Como se pode observar nas Figuras IA e 1B, ensaiaram-se nove hibridomas diferentes contra placas revestidas com IgM-Kapa ou IgM-lambda. Para medir a ligação da imunoglobulina murina a cada uma das placas realizou-se um ensaio ELISA padrão. Observou-se que todos os anticorpos se ligavam às cavidades revestidas quer com IgM-Kapa quer com IgM-lambda. Entre os anticorpos com maior capacidade de ligação, escolheram-se os 1C2 e os 2G10 para estudo posterior. Devido ao seu desenvolvimento e características produtoras de anticorpos, escolheu-se por fim o anticorpo 2G10. Este exibiu uma densidade óptica de 0,3 ± 0,03 (desvio padrão). Utilizando um meio isento de anticorpo monoclonal murino a base foi 0,06 de unidades de densidade óptica (D.O.). Guardaram-se as colónias produtoras de anticorpos que exibiram uma reacção sobre o anticorpo IgM anti-murino superior ou igual a uma D.O. 0,3.

Em condições diversas, analisou-se por ELISA a especificidade do anticorpo monoclonal murino 2G10. Para determinar o reconhecimento selectivo pelo 2G10 da IgM versus a IgG, 100 ng de proteína IgM-lambda ou proteína IgG3-lambda murina foram absorvidos pela superfície de placas de microtitulação (100 μΐ) e incubados com concentrações crescentes de anticorpo 2G10. Como se mostra na Figura 2, em doses de anticorpo compreendidas entre 2 e 1000 ng, a ligação de 2G10 às placas de microtitulação revestidas com IgM é superior à observada em placas revestidas com IgG. Em doses de 50 ng e inferiores de anticorpo 2G10 a ligação não foi mensurável em placas revestidas com IgG enquanto cavidades revestidas com IgM foram reconhecidas pelo 2G10. Observou-se também o efeito do aumento da concentração do revestimento pela imunoglobulina das placas de microtitulação e o reconhecimento pelo anticorpo 2G10. Como se mostra na Figura 3, o anticorpo 2G10 (adicionado na dose de 100 ng em 100 μΐ) incubado em cavidades revestidas com lgG3 e IgM mostra uma ligação selectiva às placas revestidas com IgM em todas as concentrações de revestimento. Por ELISA mediu-se uma reactividade dez vezes superior em placas

revestidas com IgG versus IgM numa dose de revestimento de 10000 ng de IgM ou de IgG (comparar IgG3-Kapa com IgM-Kapa). O anticorpo 2G10 demonstrou mais uma vez capacidade de ligação selectiva à IgM.

Verificou-se também a capacidade do anticorpo 2G10 reconhecer selectivamente a IgM num ensaio ELISA indirecto. Cobriram-se placas de microtitulação com antigénios e incubaram-se com um meio de cultura de hibridoma que continha um anticorpo que reconhece estes antigénios. Neste ensaio utilizaram-se anticorpos da subclasse IgM e IgGl. Após incubação com o seu anticorpo interactuante das placas revestidas com o antigénio, adicionaram-se às cavidades concentrações crescentes do anticorpo 2G10 murino e avaliou-se a ligação do 2G10 por ELISA. Como se mostra na Figura 4, o 2G10 reconheceu sensível e selectivamente a ligação da IgM ao seu antigénio respectivo (círculos a cheio), mas nas mesmas condições foi incapaz de detectar a IgG (círculos abertos), embora a presença da IgGl pudesse ser facilmente detectada com anticorpos que reagem com todos os subtipos de imunoglobulinas murinas. A figura 4 demonstra o reconhecimento selectivo de imunoglobulinas de murganho da subclasse IgM pelo anticorpo monoclonal murino 2G10. O anticorpo monoclonal murino foi também capaz de reconhecer o anticorpo da IgM em doses da ordem do picograma, demonstrando a sua elevada afinidade para o anticorpo IgM murino.

EXEMPLO 3

Caracterização de Anticorpos murinos IgM anti-murganho

Como descrito no Exemplo 2, cobriram-se placas de microtitulação com uma imunoglobulina de murganho de diferentes subtipos (IgM-Kapa e lambda, IgG], IgG2 e lgG3) e adicionalmente caracterizou-se a ligação dos anticorpos murinos IgM anti-murganho produzidos pelas células de hidromas positivas no Exemplo 2. Todas as placas foram lidas num leitor de placas ELISA Bio-Tek num comprimento de onda de 405 nm. A absorvância (comparada com os controlos) foi utilizada como uma indicação da presença de um anticorpo contra IgM de murganhos.

EXEMPLO 4

Purificação e Caracterização do Anticorpo Monoclonal Murino 2G10

Para caracterização adicional, escolheu-se um anticorpo murino monoclonal IgM anti-murganho representativo, designado por 2G10. Como se mostrou no Exemplo 3, o anticorpo 2G10 foi positivo relativamente à ligação à IgM-Kapa e lambda. Purificou-se o anticorpo por centrifugação e fraccionamento com sulfato de amónio.

A linha de células de hibridoma representativa designada por 2G10 foi depositada na American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md., U.S.A., em 23 de Abril de 1990, tendo-lhe sido atribuído o número de aceitação HB 10436. Os depósitos estão disponíveis de acordo com a lei de patentes e regulamentos dos Estados Unidos e dos países nos quais foram depositados pedidos correspondentes a este pedido de patente de invenção. A disponibilidade deste depósito não constitui uma autorização para aplicar na prática a invenção descrita neste pedido em detrimento de qualquer patente publicada sobre o assunto ou sobre qualquer divisão ou continuação deste pedido de patente de invenção.

Levou-se o sobrenadante da cultura de 2G10 (ou o líquido ascítico proveniente de murganhos nus) a uma saturação de 45% em sulfato de amónio (indu ção da precipitação) mediante a adição lenta de um volume igual de uma solução saturada de sulfato de amónio a 90%. Agitou-se a amostra durante 30 minutos à temperatura de 4°C e centrifugou-se depois a 20000 x g durante 30 minutos. Resuspendeu-se o aglomerado (pellet) em uma solução saturada de sulfato de amónio a 40%, agitou-se durante 30 minutos e granulou-se de novo por centrifugação como se descreveu antes. Resuspendeu-se o aglomerado (pellet) em água e dializou-se contra 100 volumes de PBS. Para determinar o teor em proteínas (por densidade óptica a 280 nm), a pureza (por SDS-PAGE) e a especificidade da ligação (por ELISA) utilizaram-se alíquotas da solução. A restante solução de anticorpos congelou-se a -20°C até ser necessária.

Purificaram-se os anticorpos anti-IgM murinos por precipitação com sulfato de amónio e filtração sobre gel em uma coluna de 2,6 x 40 cm de resina cromatográfica contendo agarose, dextrano e/ou acrilamida utilizando como eluente PBS/azida de sódio a 0,01%, à temperatura ambiente com um caudal de 1 ml/minuto.

Determinou-se a subclasse do anticorpo monoclonal murino 2G10 pelo método de Ouchterlony (Ouchterlony e Nilsson (1958) em Handbook of Exp. Immun. Weir, ed., Blackwell Scientific, London, pp. 19.1-19.44) utilizando um conjunto (kit) de imunodifusão comercializado por ICN Immunobiologicals, Lisle, IL.

A subclasse do anticorpo 2G10 é importante para avaliar como purificar esta molécula. Para determinar a subclasse utilizou-se um conjunto (kit) para a técnica de imunodifusão de Ouchterlony. Em resumo, a cada uma das cavidades satélites adicionou-se antisoro contra diferentes subtipos de imunoglobulina murina. Na cavidade central adicionou-se uma amostra desconhecida ou uma amostra padrão conhecida e deixou-se difundir em um meio semi-sólido. Uma banda de precipitação no sítio do antisoro específico indica o subtipo. Como se observa na Figura 6 as amostras de controlo positivas contendo todos os anticorpos dos subtipos murinos mostram linhas de reacção em todas as cavidades com um subtipo. Por outro lado, o anticorpo 2G10 reagiu apenas com o antisoro do subtipo IgG2_a o que indica que o anticorpo murino 2G10 é um anticorpo IgG2a·

Para avaliar a ligação de um anticorpo murino comercializado a uma IgM de murganho, avaliou-se a reactividade por ELISA do anticorpo monoclonal murino LO-MM-9 (proveniente de Serotec, cat#MCA 199) contra uma IgM murina. A cada uma das 96 cavidades de uma placa adicionaram-se 100 nanogramas de mu-k, gama-k ou gama-1. Adicionaram-se depois diferentes quantidades do anticorpo murino Lo-MM-9 e realizou-se um ensaio ELISA para determinar o anticorpo murino como descrito anteriormente. Como se mostra no Quadro 1, não se observou ligação deste anticorpo murino às IgM murinas que revestiam as cavidades.

QUADRO I

Avaliação de anticorpos murinos contra IgM murinas

Reactividade por ELISA

Concentração	Mu-k	contra Ie murinas
gama-k	gama-'
1000 ng	0,058	0,008	0,037
500 ng	0,034	0,004	0,031
100 ng	0,032	0,001	0,021
50 ng	0,030	0,001	0,020
10 ng	0,021	0,001	0,002
5 ng	0,018	0,001	0,024
1 ng	0,009	0,001	0,020
0,1 ng	0,020	0,001	0,023

Assim, este anticorpo não foi considerado útil para estudos posteriores.

Adicionalmente, como se pode observar na Figura 5, faixa 3, esta preparação de anticorpos continha pelo menos três bandas principais de proteínas e pelo menos cinco bandas secundárias de proteínas como se avaliou por SDS-PAGE.

' / / ι ι

EXEMPLO 5

Ligação de IgM Anti-murganho Murinas a Células Produtoras de IgM

Para demonstrar que o anticorpo IgM anti-murganho murino 2G10 se liga não só ao anticorpo IgM purificado quando este último reveste uma placa de 96 cavidades mas também a células produtoras do anticorpo IgM, realizaram-se análises FACS com células 10C1 e células de hibridomas ADR 238-57 murinas que segregam IgG e IgM, respectivamente. Resumidamente, centrifugaram-se 1 x 10⁶ células a 500 x g durante 3 minutos, lavaram-se três vezes com PBS e ressuspenderam-se em 3 ml de PBS.

Diluiu-se a 1:100 com PBS (lx) uma imunoglobulina IgM anti-murganho desenvolvida na cabra a partir do fragmento F(ab)2 purificado por afinidade com um conjugado de fluoresceína (Cappel) e adicionaram-se 20-40 μΐ a 20 μΐ de uma suspensão celular. Após incubação durante 15-20 minutos no escuro à temperatura ambiente, lavaram-se as células duas vezes com PBS centrifugando a 500 rpm durante 3 minutos.

Para fixar as células adicionou-se uma alíquota de 300 μϊ de paraformaldeído (1% em PBS). Incubaram-se as células a 4°C até serem classificadas por citometria de fluxo.

Para fixação indirecta, incubaram-se primeiro as células de hibridoma com anticorpos IgM anti-murganho murinos designados por 2G10, lavaram-se e fixaram-se depois com imunoglobulina IgM anti-murganho desenvolvida na cabra a partir do fragmento F(ab)2-fluoresceína e classificaram-se por citometria de fluxo.

Como se pode observar no Quadro 2 e na Figura 7, o anticorpo 2G10 ligou-se especificamente à IgM presente na superfície de células de hibridomas murinas secretoras de IgM e não às células secretoras de IgG.

QUADRO Π

Análise FACS das Células de Hibridoma Murinas que Exprimem IgM e IgG % de células marcadas com fluoresceína

Tratamento Híbridos de IgG Híbridos de IgM

0,870,37

IgG murinas irrelevantes + FITC cabra anti-rato 0,230,96

IgM AbY murina anti-murganho 2G10 + FITC cabra anti-rato 1,5889,99

Como se pode observar no Quadro 2, não existia fluorescência de fundo das células não tratadas. As IgG murinas irrelevantes também não se ligaram quer aos híbridos de IgG quer aos híbridos de IgM. Não se observou ligação do anticorpo 2G10 às células de hibridomas produtoras de IgG (1,58% de células positivas. Figura 7A e Quadro 2). Contudo, como se pode observar na Figura 7B e no Quadro 2, 90% das células produtoras do anticorpo IgM murino mostraram capacidade de se ligarem fortemente ao anticorpo 2G10. Consequente26 h/ mente, a ligação do anticorpo 2G10 às células ocorre devido ao reconhecimento das IgM murinas à superfície celular.

Seria interessante que as propriedades dos anticorpos examinados fossem efectivamente as únicas características relevantes dos hibridomas correspondentes pelo que, para os fins da presente invenção, os hibridomas são caracterizados pela sua capacidade de produzirem anticorpos especiais com as citadas propriedades.

EXEMPLO 6

Ligação do 2G10 à Gelonina

Preparou-se uma solução de reserva do reagente SPDP [3-(2-piridil-di-tio)-propionato de N-succininidilo] (6 mg/ml) em DMF anidra. A 1 ml de uma solução de PBS contendo 1 mg do anticorpo 2G10 em um tubo de ensaio de vidro de 12 x 75 mm, adicionou-se lentamente o SPDP ao quíntuplo da concentração molar (aproximadamente 10 μΐ da solução de reserva). Agitou-se a mistura num vórtex, de 5 em 5 minutos, durante 30 minutos à temperatura ambiente.

Por cromatografia de filtração por gel utilizando uma coluna de Sephadex G-25 (1 x 24 cm) previamente equilibrada com um tampão de fosfato de sódio 100 mM pH 7,0 contendo EDTA 0,5 mM (tampão A), removeu-se da amostra o SPDP em excesso que não reagiu. Utilizando o ensaio de Bradford de ligação a um corante (Bradford, (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254), recolheram-se fracções de 0,5 ml e analisaram-se para determinar o teor em proteína. Controlou-se a absorvância a 600 nm em uma placa de 96 cavidades utilizando um leitor automático de microplacas BioTEK. Reuniram-se estas fracções e o

anticorpo eluido no volume de exclusão (fracções 14-20) e conservaram-se a 4°C.

A toxina gelonina foi extraída das sementes de gelonium multiflorum e purificada até à homogeneidade utilizando o método de Stirpe et al., [Stirpe, et al., J, Biol. Chem. 255: 6947-6953 (1980)]. Ao tampão de cloridrato de trietanolamina (TEA/HC1) adicionou-se um miligrama de gelonina purificada (2 mg/ml em PBS) até à concentração final de 60 mM de TEA/HC1 e ajustou-se o pH até 8,0. A solução apresentava uma concentração de 1 mM em EDTA. A esta concentração final de lmM adicionou-se uma solução de reserva de 2-iminotiolano (0,5M em TEA/HC1 0,5M pH 8,0) e incubou-se a amostra durante 90 minutos à temperatura de 4°C sob atmosfera de azoto.

Por filtração em gel utilizando uma coluna de Shephadex G-25 (1 x 24 cm) pré-equilibrada com um tampão de acetato de bis-Tris 5 mM pH 5,8 contendo 5 mM de NaCl e 1 mM de EDTA, removeu-se o reagente 2-iminotiolano em excesso. Reuniram-se as fracções (0,5 ml) e analisaram-se para determinar o teor em proteína em placas microtituladoras de 96 cavidades utilizando o ensaio de Bradford de ligação a um corante. A gelonina foi eluida nas fracções 14-20 que se reuniram e armazenaram a 4°C. Misturou-se o anticorpo 2G10 modificado por SPDP com um excesso molar cinco vezes maior de gelonina modificada pelo 2-iminotiolano. Ajustou-se o pH da mistura até 7,0 adicionando um tampão de TEA/HC1 0,05M pH 8,0 e incubou-se a mistura durante 20 horas à temperatura de 4°C sob atmosfera de azoto. Para bloquear quaisquer grupos sulfidrilo livres remanescentes, adicionou-se iodoacetamida (0,lM em PBS) até à concentração final de 2 mM e a incubação prosseguiu durante mais uma hora à temperatura de 25°C.

Purificação dos Complexos 2G10-Gelonina

Para remover os produtores de peso molecular baixo e a gelonina não conjugada, colocou-se a mistura reaccional em uma coluna Sephadex S-300 (1,6 x 31 cm) previamente equilibrada com PBS. Recolheram-se as fracções (1,0 ml) e analisaram-se alíquotas de 50 μΐ para determinar o teor em proteínas utilizando um ensaio de Bio-Rad de ligação a um corante. Para remover o 2G10 não conjugado, aplicou-se o pico molecular máximo (fracções 17-23) proveniente da coluna S-300 a uma outra coluna de cromatografia de afinidade de Sepharose Azul > CL-6B (1 x 24 cm) pré-equilibrada com um tampão de fosfato 10 mM (pH 7,2) contendo NaCl O,1M. Após o enchimento da coluna com a amostra lavou-se a coluna com 30 ml do tampão para eluir completamente o anticorpo não conjugado. Eluiu-se a coluna com um gradiente salino linear de NaCl 0,1 a 2 M em um tampão de fosfato 10 mM pH 7,2. Determinou-se o teor em proteína das fracções eluidas realizando um ensaio de ligação a um corante como se descreveu antes.

Inicialmente purificou-se a mistura de ligação contendo o anticorpo 2G10 livre, o conjugado 2G10-gelonina e a gelonina livre por filtração por gel em - '* uma coluna S-300. Como se mostra na Figura 8 detectou-se um pico de peso molecular máximo (fracções 25-42) bem como um pico de peso molecular mínimo (fracções 55-67). Para determinar a pureza e a capacidade de reacção do conjugado reuniram-se e analisaram-se as fracções 26-42.

Por SDS-PAGE realizou-se a análise do conjugado 2G10-gelonina purificado. Como se pode observar na Figura 9, a mistura de ligação 2G10-gelonina (faixa 3) continha 2G10 livre, gelonina livre (setas) bem como 2G10 ligado a uma molécula de gelonina (monómero, seta) e 2G10 ligado a duas moléculas de gelonina (dímero, seta). Como se pode observar na faixa 1, o conjugado final purificado 2G10-gelonina contém principalmente 2G10 ligado a uma molécula de gelonina e uma quantidade menor de 2G10 ligado a duas moléculas de gelonina. A preparação não estava contaminada com gelonina livre ou anticorpo livre.

Para determinar se a reacção química e a ligação deste anticorpo 2G10 à gelonina modificou o reconhecimento do anticorpo 2G10 pela IgM murina, revestiram-se placas com 96 cavidades com o anticorpo IgG murino ou o anticorpo IgM murino como na Figura 2. Em vez do anticorpo 2G10, adicionou-se às cavidades o conjugado 2G10-gelonina em diferentes concentrações. Para detectar a anticorpo murino realizou-se depois um ensaio ELISA convencional. Como se mostra na Figura 10 o conjugado 2G10-gelonina ligou-se facilmente às placas revestidas com IgM e apenas um pouco às placas revestidas com IgG. Apenas nas concentrações mais elevadas analisadas (1000 ng/cavidade) o conjugado 2G10-gelonina se ligou signifícativamente às cavidades revestidas com IgG. Ao contrário, em uma concentração similar o conjugado 2G10-gelonina ligou-se amplamente às cavidades revestidas com IgM. Assim, a imunorreactividade do conjugado 2G10-gelonina relativamente à IgM foi preservada. Adicionalmente, o conjugado 2G10-gelonina falhou apreciavelmente na reacção cruzada com IgG murina e consequentemente a selectividade do conjugado 2G10-gelonina também não foi alterada. Assim, o conjugado 2G10-gelonina deve ligar-se à IgM expressa nas células murinas do mesmo modo que o anticorpo o próprio 2G10.

EXEMPLO 7

Produção de Anticorpos Monoclonais ODC

A. Imunização In Vitro e Produção de Anticorpos Monoclonais

Os protocolos utilizados habitualmente para a produção de anticorpos monoclonais murinos resultam na produção de hibridomas que segregam anticorpos da subclasse IgM. Para demonstrar o resultado característico dos protocolos de produção de anticorpos monoclonais murinos, utilizaram-se duas técnicas para a produção de anticorpos monoclonais contra uma proteína de rato, a omitina-descarboxilase (ODC). A primeira técnica envolve a imunização, in vitro, de células de baço murinas isto é, em placas de culturas com proteína ODC.

Esta técnica realizou-se pelo método de Luben [Luben e Mohler, (1980) Molec. Immunol. 17: 635-639] utilizando 25 pg de ODC de fígado murino purificada. Em resumo, incubou-se a proteína ODC com células de murganho durante 72 horas à temperatura de 37°C na presença de um meio condicionado com timócitos (a fonte de factores de desenvolvimento específico de um tipo de células secretoras da imunoglobulina). Em seguida fundiram-se as células de baço com células de mieloma MPC utilizando polietilenoglicol como fusogénio. Analisaram-se as células híbridas resultantes relativamente à secreção do anticorpo capaz de reagir com a proteína ODC. Os resultados estão apresentados no Quadro III.

QUADRO III

Sumário da Produção de Hibridomas e da Imunização In Vitro

	Sumário da Produção	Observações
Total de cavidades plaqueadas	48	Duas placas de 24 cavidades.
Total de cavidades com híbridos	48/48	1x10^ células/cavidade Representa a frequência da
viáveis/Total de cavidades plaqueadas		fusão mínima de 1:10^
Total de cavidades positivas pelo primeiro	48/48	Catorze destas eram 4 vezes
ELISA		maiores sobre um meio de
Cavidades positivas relativamente à	12/14	controlo por ELISA Apenas as 14 mais positivas
precipitação da actividade da		se analisaram por ELISA
ODC/cavidades ensaiadas Cavidades totais expandidas para clonagem	12/48	Limitado aos 12 clones mais
Total de monoclones ELISA-positivos	70	promissores Apenas um recuperado das
individuais recuperados de 12 cavidades		cavidades monoclonais num
policlonais originais		total de 18
Monoclones totais positivos relativamente	50/70	Tanto como 48% da
à precipitação da actividade da ODC/Total		actividade da OD adicionada
ensaiada		precipitou e no mínimo 4%
Total de monoclones secretores de	70/70
IgM/monoclones totais Total de monoclones secretores de	0/70

IgG/monoclones totais

Após a sondagem inicial com a proteína ODC, reclonaram-se os hibridomas e ensaiaram-se de novo. Obtiveram-se 70 hibridomas que reagiram com a proteína ODC segundo diversos critérios. Contudo, como se mostra no Quadro III, todos os clones segregam anticorpos do isotipo IgM. Nenhum segregava IgG. Em um grande número de aplicações para anticorpos monoclonais, verificou-se que estes anticorpos eram de utilização limitada.

B. Produção de Anticorpos Monoclonais e Imunização In Vivo

Uma segunda técnica utilizada para a produção de anticorpos monoclonais foi a imunização de um murganho por injecção de proteína ODC purifica

da. Após a imunização isolaram-se células de baço de murganho, fundiram-se com células de mieloma P3 x 63 Ag 8.653 (utilizando PEG como se descreveu antes). Isolaram-se os clones, ensaiaram-se relativamente à capacidade de reacção com a proteína ODC e caracterizaram-se depois para se utilizarem como um reagente específico de reconhecimento da ODC.

QUADRO IV

Imunização in vivo e Hibridomas Intra-espécies

Total de cavidades plaqueadas

Sumário da Produção

1200

Total de cavidades com colónias

148 viáveis

Total de cavidades positivas pelo primeiro ELISA

30/148

Cavidades clonadas por diluição30 limitante

Total de monoclones ELIS A-positivos27 individuais recuperados de 30 cavidades policlonais originais

Total de monoclones secretores de27/27

IgM/número ensaiado

Total de monoclones secretores de0/27

IgG/número ensaiado

Total de monoclones que precipitaram1/5

Observações

Numerosas cavidades das placas com 96 cavidades plaqueadas com 2,5 x 10^ células/cavidade Aproximadamente 12% de híbridos viáveis

Seis foram significativamente superiores ao controlo na ligação à ODC no ELISA Todos os policlones positivos expandidos e clonados Três cavidades policlonais não produziram monoclones positivos

Sem comentários a actividade da ODC/número ensaiado

Apenas um precipitou uma quantidade significativa de actividade de ODC relativamente ao meio de controlo

O Quadro IV mostra que se desenvolveram as vinte e sete linhas de células monoclonais, 100% das quais segregavam um anticorpo da subclasse IgM. Mais uma vez se observou mais tarde que estes anticorpos são inadequados para utilização como reagentes específicos da ODC.

EXEMPLO 8

Métodos de FAÇS (Classificação do Fluxo de Células Activadas)

Durante 3 minutos centrifugaram-se a 500 x g células de hibridomas secretoras de IgM 238-57 ADR, lavaram-se três vezes com PBS e suspenderam-se de novo em 3 ml de PBS. Em PBS (lx) diluiu-se a 1:100 a imunoglobulina IgM anti-murganho purificada desenvolvida na cabra a partir de um fragmento F(ab)2 com afinidade para o conjugado com fluorescência (Cappel) e adicionaram-se 20-40 μΐ a 20 μΐ da suspensão celular. Após incubação durante 15-20 minutos no escuro e à temperatura ambiente, lavaram-se as células duas vezes com PBS centrifugando a 500 x g durante 3 minutos. Para fixar as células adicionou-se uma alíquota de 300 μ\ de paraformaldeído (1% em PBS). Incubaram-se as células a 4°C até serem classificadas por citometria de fluxo. Para fixação indirecta incubaram-se primeiro as células de hibridomas com o anticorpo IgM anti-murganho murino 2G10, lavaram-se, fixaram-se seguidamente com uma imunoglobulina IgM anti-murganho desenvolvida na cabra a partir de um fragmento F(ab)2 conjugado com fluorescência e classificaram-se por citometria de fluxo.

EXEMPLO 9

Separação Magnética das Células

Em um meio de Iscove contendo 1 % de soro fetal de bovino e 0,1 % de gentamicina lavaram-se três vezes células de hibridomas de murganho 238-57 ADR. Durante três minutos centrifugaram-se as células a 500 x g e à temperatura ambiente e contaram-se seguidamente. Ressuspendeu-se o aglomerado (pellet) em 0,5 ml do meio e incubou-se durante 60 minutos sobre gelo com / / anticorpo IgM anti-murganho murino purificado (2G10) a uma concentração aproximada de 0,425 mg/ml (por 10^ células/ml utilizou-se aproximadamente 0,1 ml). Após serem lavadas duas vezes em um meio de Iscove frio, suspenderam-se novamente as células em 0,2 ml do meio e contaram-se. Utilizando uma placa magnética lavaram-se as pérolas magnéticas três vezes em um meio isento de soro. Misturou-se o aglomerado (pellet) de células com o aglomerado de pérolas (pellet) em uma proporção de 20 pérolas/célula. O volume total não deve exceder 0,4 ml. Durante meia hora incubou-se a mistura de células/pérolas sobre gelo, agitando de 10 em 10 minutos.

Suspendeu-se de novo a mistura de células/pérolas em pelo menos 2 ml de meio e separou-se magneticamente segundo uma direcção perpendicular à gravidade. Uma vez concluída a separação removeu-se o sobrenadante sem desarranjar o aglomerado (pellet) magnético. Suspenderam-se de novo as pérolas em 1-2 ml de meio e observaram-se ao microscópico.

EXEMPLO 10

Estudo dos Linfócitos com o Conjugado 2G10-Gelonina

Para demonstrar a citotoxicidade do conjugado 2G10-gelonina, sacrificaram-se dois murganhos fêmeas Balb/c (Harlan Sprague Dawley) e extirparam-se os baços. Em uma câmara de fluxo laminar lavou-se a pele por cima do baço com álcool isopropílico a 70% e expôs-se uma incisão praticada com tesouras autoclavadas ou assépticas. Utilizando um par de fórcipes estéreis e tesouras, praticou-se um incisão no peritoneu expondo o baço. Colocou-se o baço em uma caixa de Petri de 100 mm estéril e contendo 10-15 ml de meio de crescimento (Iscoves;Gibco) com 10% de soro fetal de bovino (Hyclone) e 50 Mg/ml de gen35

tamicina (Tri-Bio-Laboratories). Fez-se redemoinhar o baço no meio, transferiu-se depois para uma caixa de Petri limpa contendo meio de crescimento recente e tapou-se.

Preparação dos Linfócitos

Em uma câmara de fluxo laminar e utilizando instrumentos esterilizados, separaram-se dos baços a gordura em excesso e o tecido conjuntivo (material branco). Utilizando fórcipes transferiram-se os baços para uma nova caixa de Petri com aproximadamente 20 ml do meio de crescimento. Repetiu-se o método de lavagem duas vezes. Dispersaram-se os baços utilizando duas seringas de 10 ml com agulhas de calibre 18 até deixar de observar quaisquer grandes secções do baço restante. No meio de crescimento as células do baço (esplenócitos) apareciam como misturas turvas e continham quer glóbulos vermelhos quer glóbulos brancos. Pipetaram-se as células e o meio para um tubo de centrífuga de 50 ml (Coming) e excluíram-se quaisquer grandes secções não dispersas. Ao fundo da caixa de Petri adicionou-se meio de crescimento que se removeu após agitação com um turbilhão em 10 ml de meio de crescimento. No tubo fechado colocaram-se as células sobre gelo durante 10 minutos.

Com uma pipteta retirou-se a porção superior (rejeitando as secções maiores dos tecidos não dispersos). Após centrifugação durante 10 minutos a 1800 rotações por minuto (rpm) em uma centrífuga 2LC-2B DuPont Sorvall, eliminou-se o sobrenadante. Ressuspendeu-se o aglomerado (pellet) em 10 ml do meio de crescimento e contaram-se as células utilizando 5 μΐ da suspensão celular e 95 μΐ de uma diluição a 1:2 de uma solução de azul de tripano utilizando um hemocitómetro e um microscópio Nikon de contraste de fase com uma ampliação de 100 x. A contagem total de células foi de 6,24 x 10$ células. Au36

mentou-se o volume da solução para 20 ml obtendo-se 3,12 x 10⁷ células/ml do meio de crescimento. A cada um dos tubos da centrífuga de 15 ml adicionou-se 1 ml desta suspensão celular.

Os grupos constavam de grupo 1: Meio de controlo apenas adicionado a células; grupo 2: Meio de controlo apenas adicionado a células; grupo 3: Meio de controlo apenas adicionado a células; grupo 4: Anticorpo 2G10 (Ab) a 1 ;xg/ /ml; grupo 5: Anticorpo 2G10 a 0,1 /xg/ml; grupo 6: Anticorpo a 2G10 a 0,01 /xg/ml; grupo 7: gelonina a 1 /xg/ml equivalente = 0,2 /xg/ml; grupo 8: gelonina a 0,1 /xg/ml equivalente = 0,02 /xg/ml; grupo 9: gelonina a 0,01 /xg/ml equivalente = 0,002 /xg/ml; grupo 10: Ab + gelonina a 0,5 /xg/ml Ab + 0,1 /xg/ml gelonina; grupo 11: Ab + gelonina a 0,05 /xg/ml Ab + 0,02 /xg/ml gelonina; grupo 12: Ab + gelonina a 0,005 /xg/ml Ab + 0,002 /xg/ml gelonina; grupo 13: 2G10 + conjugado de gelonina a 1 /xg/ml; grupo 14: 2G10 + conjugado de gelonina a 0,1 /xg/ml; e grupo 15: 2G10 + conjugado de gelonina a 0,01 /xg/ml.

Adicionou-se a proteína aos tubos numerados respectivamente e levou-se o volume total de cada um até 5 ml com meio de crescimento de Iscoves. Afrouxaram-se as tampas dos tubos que se incubaram durante 24 horas à temperatura de 37°C em uma incubadora Queue sob atmosfera de anidrido carbónico (5% de CC>2 - 95% de ar). Centrifugaram-se depois os tubos a 1500 rpm durante 10 minutos em uma centrífuga IEC Centra-7R à temperatura de 4°C. Removeu-se o sobrenadante que se guardou. Suspenderam-se novamente os aglomerados (pellets) celulares em 10 ml de meio de crescimento e centrifugaram-se. Rejeitou-se o sobrenadante e lavaram-se as células duas vezes por centrifugação com 4-5 ml de meio de crescimento. Transferiram-se as células tratadas em 5 ml do meio de crescimento para uma placa com 6 cavidades (Falcon) e incubaram-se à temperatura de 37°C em uma incubadora sob atmosfera de anidrido carbó37 nico. Depois disso, nos dias especificados recolheram-se 300 μΐ do meio de crescimento para um tubo numerado da microcentrífuga. A cada tubo adicionou-se 1 μ} de azida de sódio a 10% e armazenou-se à temperatura de 4°C. Recolheram-se amostras do meio de crescimento decorridas 24 horas, 72 horas e 96 horas. Para determinar o efeito do tratamento sobre a secreção das IgM proveniente da cultura linfócita primária utilizou-se o ensaio do imunoabsorvente ligado a uma enzima.

Em 12 ml de água bi-destilada (ddFQO) dissolveram-se 50 μΐ de uma concentração de 2 mg/ml de IgM anti-murganho desenvolvidas em cabra (anticorpo completo) (sigma). Utilizando uma pipeta tituladora de canais múltiplos (Titer-Tek) colocaram-se 50 μΐ desta solução em cada uma das 96 cavidades da placa microtituladora (Falcon) recebendo cada uma das cavidades 500 mg do anticorpo imunoglobulina G anti-murganho produzida pela cabra e secaram-se durante a noite mediante incubação destapada em estufa à temperatura de 37°C. A cada uma das cavidades de uma placa com 96 cavidades adicionaram-se 100 μΐ de BSA a 5% em 1 x soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e incubaram-se durante 1,5 horas à temperatura ambiente. Removeu-se o líquido invertendo a placa sobre tolhas de papel. Lavou-se cada uma das 96 cavidades de uma placa uma vez com PBS contendo 0,05% de Tween 20 (Biorad) e removeu-se o líquido invertendo a placa e secando batendo ao de leve sobre a toalha de papel. A cada uma das cavidades da placa de 96 cavidades adicionaram-se 100 μΐ de cada um dos sobrenadantes e incubaram-se durante 1,5 horas à temperatura ambiente. Lavaram-se as cavidades três vezes com PBS-Tween 20 e adicionaram-se 100 μΐ de uma cadeia de imunoglobulina murina contra um anticorpo produzido por cabra quimicamente conjugada à enzima peroxidase de rábano (Sigma) diluída a 1:1000 em 1 mg/ml de BSA em PBS e incubaram-se durante

1,5 horas à temperatura ambiente. Adicionaram-se 100 μ\ de ABTS [2,2^-azino-bis(ácido 3-etil-benz-tiazolina-6-sulfónico) (Sigma)J em tampão de citrato de sódio a 0,1% (pH 4,2) com peróxido de hidrogénio a 0,03% (11 μΐ de H2O2 a 30% em 11 ml de ABTS) e decorridos 20 minutos à temperatura ambiente, colocou-se a placa em um Leitor automático de microplacas de Bio-Tek Laboratories e determinaram-se os valores de absorvância. O conjugado de acordo com a presente invenção inibiu significativamente a secreção de IgM libertada pelos linfócitos primários às 24 horas (Figura 11), 48 horas (Figura 12) e 72 horas (Figura 13). Os resultados apresentados nas figuras 11-13 ilustram que o tratamento com 0 conjugado reduziu dependentemente da dose 0 nível de IgM nas culturas de linfócitos primários. Os outros tratamentos foram incapazes de alterar os níveis de IgM em um qualquer dos níveis de doses ensaiados. Consequentemente, através da associação covalente do anticorpo monoclonal IgM antimurganho (2G10) com gelonina, a concentração de IgM produzida pelos linfócitos foi suprimida.

EXEMPLO 11

Estudo N° 2 dos Linfócitos com o conjugado 2G10-Gelonina

Utilizou-se o mesmo processo descrito no Exemplo 10, excepto que as concentrações finais de proteínas foram de 5 μg, 0,5 μg e 0,05 μg ou a concentração molar equivalente para a gelonina.

As figuras 14-16 mostram que o conjugado de acordo com a presente in venção inibiu fortemente a secreção da IgM libertada pelos linfócitos primários às 24, 48 e 72 horas, respectivamente.

EXEMPLO 12

Estudo N° 3 dos Linfócitos com o conjugado 2G10-Gelonina

Prepararam-se as células como nos Exemplos 10 e 11, excepto que as mesmas foram expostas a um tratamento (com o controlo, o anticorpo, a gelonina, Ab + gelonina e o conjugado) durante 2 horas sobre gelo. Centrifugaram-se depois as células e lavaram-se duas vezes com o meio e transferiram-se para placas com seis cavidades e incubaram-se. Recolheram-se as amostras do sobrenadante nos intervalos de 24, 48, 72 e 96 horas. A concentração final da proteína foi de 5 /zg/ml (ou equivalente para a gelonina). Preparou-se um novo conjugado 2G10-gelonina e analisou-se juntamente com o conjugado inicial.

As Figuras 17-20 mostram que os conjugados de acordo com a presente invenção inibem completamente a secreção do anticoipo IgM libertada pelos linfócitos às 24, 48, 72 e 96 horas, respectivamente. Evidentemente, a incubação de curta duração com o imunoconjugado foi suficiente para provocar alterações na secreção das IgM libertadas pelas células plasmáticas.

EXEMPLO 13

Fusão de células de Baço Murino (Balb/c) com células de Mieloma Murino (P3 x AG63 x 8)

Para o desenvolvimento das células de mieloma P3 x AG63 x 8 utilizaram-se 500 ml do meio de Iscoves (Gibco) contendo 10% de soro fetal de bovino (Hyclone) e 0,5% de gentamicina (Tri-BioLaboratories). Aproximadamente uma semana antes do momento da fusão substituiu-se o meio de crescimento regular do mieloma (P3 x AG63 x 8) por uma solução de 8-azo-guanina (20 gg/ /ml). A solução HAT continha 0,5 ml de gentamicina, 5 ml de 100 x HT, 5 ml de 100 x A e 20% de FBS (soro fetal de bovino). A solução 100 x HT continha 136 mg de hipoxantina (10 mM) e 39 mg de timidina (1,6 mM) em 100 ml de água bi-destilada ddH2O (aquecida até 70-80°C). A solução 100 x A era constituída por 1,8 mg de aminopterina/100 ml de água, pH 7,8.

A fusão realizou-se com células de baço lavadas quatro vezes em um meio isento de gentamicina e soro por centrifugação durante 5 minutos a 200 x g (1000 rpm em uma centrífuga Sorvall GLC-2B table-top). Após a ressuspensão em 10 ml de um meio isento de soro, diluiram-se as células a 1:20 (5 μ\ em 100 μΐ do meio) e contaram-se num hemocitómetro.

Utilizaram-se, em frascos, aproximadamente 50-60% de confluente com células de mieloma P3, reuniram-se as células por centrifugação, lavaram-se 4 vezes em um meio isento de soro (5 minutos a 500 x g) e contaram-se as células. Reuniram-se o baço e as células P3 na proporção de 4:1 (8 x 10? células de baço e 2 x 10? células de mieloma) e granularam-se por centrifugação durante 5 minutos a 1200 rpm. Adicionou-se 1 ml de uma solução fria de PEG 4000-DMSO e incubaram-se as células nesta mistura durante 15 segundos, depois do que se diluiram lentamente com PEG-DMSO contendo 20 ml de um meio isento de soro que se adicionaram gota a gota durante 3 minutos. Centrifugou-se a mistura de células a 400 x g (166 rpm) durante 6 minutos e aspirou-se completamente o diluente PEG. Suspenderam-se de novo as células em 50 ml de 1 x HAT e com uma pipeta tituladora de canais múltiplos distribuiram-se em cinco placas com 96 cavidades (Falcon) 100 μΐ/cavidade e incubaram-se. Após o plaqueamento das células, colocaram-se em uma incubadora durante 3-4 dias antes da adição de 100 μΐ do meio HAT recente e aguardou-se a formação de colónias.

EXEMPLO 14

Pesquisa de IgM e de IgG

Quando os sobrenadantes das células de fusão amareleceram, separaram-se as secreções de IgM e IgG utilizando um ensaio ELISA. Resumidamente, revestiram-se 10 placas microtituladoras rígidas com 96 cavidades (Falcon) com 500 ng/cavidade do anticorpo 2 mg/ml IgG (global) anti-murganho desenvolvido em cabra diluindo 120 μΐ em 96 ml de água bidestilada (ddH2O), plaquearam-se 50 μΐ/cavidade utilizando uma pipeta tituladora de canais múltiplos e secaram-se durante a noite à temperatura de 37°C em estufa aberta. Bloqueou-se a solução com albumina de soro bovino a 5% em PBS adicionando 100 μΐ a cada uma das cavidades e incubando durante 1,5 horas à temperatura ambiente. Após três lavagens com PBS contendo 0,05% de Tween 20 (Bio-Rad), pipetaram-se 50 μΐ para cada uma das cavidades de duas placas separadas (uma para analisar as IgG e a outra para analisar as IgM). A placa de fusão adicionou-se meio de desenvolvimento para reposição e incubou-se durante 1,5 horas à temperatura ambiente antes de três lavagens com PBS-Tween 20. O anticorpo secundário examinado relativamente à presença da IgM foi a peroxidase específica da IgM murganho x cabra (Sigma) diluída a 1:1000 em 1 mg/ml de BSA em 1 x PBS. O anticorpo secundário examinado relativamente à presença da IgG foi a peroxidase específica de IgG murganho x cabra (Sigma) diluída a 1:1000 em 1 mg/ml de BSA em 1 x PBS. Adicionou-se o Ab secundário às placas respectivas, incubaram-se durante 1,5 horas à temperatura ambiente e lavaram-se depois três vezes com PBS-Tween 20. Procedeu-se à detecção mediante a adição de 100 μϊ de ABTS [2,2^-azino-bis-(ácido 3-etil-benz-tiazolina-6-sulfónico)J contendo 0,03% de peróxido !

i l de hidrogénio e leram-se as placas a 405 nm utilizando um leitor automático de microplacas Bio-Tek Instruments.

EXEMPLO 15

Fusão de Células de Mieloma Murino (P3 x AG63 x 8) com Baços de Murganhos Fêmeas Balb/c tratados

Os grupos de tratamento eram N° 1: controlo PBS-murganhos; N° 2: anticorpo 2G10 e gelonina; e N° 3: conjugado. Administrou-se o conjugado por via intraperitoneal em uma concentração de 500 /zg/500 μΐ de PBS no dia 1 e no dia 4. Administrou-se a mistura de anticorpo 2G10 e gelonina ao murganho na concentração de 250 μ° de anticorpo + 50 μσ de gelonina em 500 μ\ de PBS no dia 1 e no dia 4. Administrou-se o controlo por via intraperitoneal em 500 μ[ no dia 1 e no dia 4. No dia 9 excisaram-se os baços e prepararam-se as células como se descreveu antes. Seguidamente fundiu-se cada uma das amostras do baço com um número igual de células de mieloma utilizando para cada fusão 8x10^ células de baço + 2x10^ células de mieloma. Uma semana mais tarde separaram-se os sobrenadantes tendo em vista os anticorpos secretores de IgG e IgM em cada grupo e analisaram-se. Na Figura 21 pode observar-se a percentagem de colónias viáveis secretoras de IgM e de IgG, e as cavidades que contêm quer anticorpos secretores de IgM e de IgG. A Figura 21 mostra que a IgM foi a forma principal de imunoglobulina segregada pelas células viáveis provenientes de animais tratados com soro fisiológico ou a mistura de 2G10 e gelonina. O tratamento com o imunoconjugado aumentou significativamente (de 3 para 30%) o número de colónias secretoras de IgG e colónias secretoras de IgG e IgM (como evidenciado pela detecção específica das IgG e IgM nas cavidades com o sobre nadante das culturas consumido e contendo colónias). Assim, o imunoconjugado reforça o número de colónias viáveis e a secreção das IgG pelas colónias viáveis após a fusão das células. Possivelmente, todas as células segregaram alguma forma de imunoglobulina. Estes resultados mostram os efeitos in vivo do imunoconjugado sobre a expressão da imunoglobulina em um animal intacto após a imortalizaçâo dos seus linfócitos pela fusão das células. O tratamento dos animais com o imunoconjugado poderia ser útil na indução da produção de IgG in vitro após os protocolos normais de imortalizaçâo por fusão de células nos esquemas de produção de anticorpos monoclonais.

EXEMPLO 16

Detecção de IgM no Soro de Murganhos Pré-Tratados e Imunizados por KLH

Trataram-se murganhos fêmeas Balb/c e imunizaram-se de acordo com o esquema seguinte. No dia 0 recolheram-se da extremidade da cauda de cada um dos murganhos 150 μΐ de sangue para um tubo de microcentrífuga 0,5, microcentrifugaram-se durante 10 minutos e pipetou-se o soro cuidadosamente para um tubo de centrífuga limpo e rotulado. Armazenaram-se estes tubos à temperatura de -20°C até à sua utilização em ensaios. Após a recolha do sangue, administrou-se o primeiro tratamento. Dividiram-se os murganhos em 4 grupos - 2 murganhos/grupo. O primeiro grupo era o dos murganhos controlo que foram tratados por via intraperitoneal com 500 μΐ de soro fisiológico tamponado com fosfato; ao segundo grupo foram injectados por via intraperitoneal 500 μ% de anticoçpo 2G10 em 500 μΐ de PBS. O terceiro grupo foi tratado com 100 μg de gelonina (uma dose molar equivalente a 500 μg) em 500 μΐ de PBS e ao quarto i

l X ί ί

grupo foi injectado por via intraperitoneal o conjugado 2G10-gelonina. Foi administrada por via intraperitoneal uma dose de 500 ^g em 500 μ\ de PBS.

No dia 2, administrou-se a cada um dos murganhos um segundo tratamento em uma quantidade exactamente igual a metade da quantidade do primeiro tratamento. Isto é, 250 μ° (ou equivalente) em 250 μ\ de PBS. Os murganhos controlo foram tratados apenas com 250 μ\ de PBS. Todas as injecções foram administradas por via intraperitoneal. No dia 4, o terceiro tratamento foi igual ao segundo. No dia 5, colheu-se novamente uma amostra de sangue de cada um dos murganhos e procedeu-se à primeira imunização com KLH (Keynole-limpet-hemocianina)-DNP (dinitrofenol) (Calbiochem). Em cada um dos murganhos injectou-se por via intraperitoneal uma dose de 250 gg DNP-KLH em 200 μϊ de PBS. No dia 6, administrou-se o quarto tratamento por via intraperitoneal: controlo - 125 μϊ de PBS; Anticorpo - 125 μΐ em 125 μΐ de PBS; gelonina 50 μΐ em 125 μΐ de PBS; e Conjugado - 125 μΐ em 125 μΐ de PBS.

No dia 8, administrou-se o quinto tratamento. A dose era igual à do quarto tratamento. No dia 10, recolheram-se amostras de sangue. Administrou-se o sexto tratamento que era igual ao quinto tratamento. No dia 12, administrou-se o sétimo tratamento. A dose era de 250 μβ/250 μΐ e administraram-se aos murganhos controlo 250 μΐ PBS. No dia 13, administrou-se um reforço de KLH. O reforço era igual à primeira imunização. No dia 20, recolheram-se amostras de sangue.

No dia 20, analisaram-se amostras de soro. Para analisar a IgM no soro de murganhos pré-tratados imunizados com KLH: revestiram-se quatro placas com 96 cavidades com 150 mg de DNP-KLH por cavidade em 50 μϊ. Em 48 ml de água bidestilada (ddH2O) mediram-se 57,6 μΐ de KLH - DNP a 2,5 mg/ml. Utilizando uma pipeta tituladora com canais múltiplos, adicionaram-se 50 μΐ a

cada uma das cavidades em quatro placas, que se deixaram destapadas e se secaram durante a noite à temperatura de 37°C em estufa. Bloquearam-se as placas com 100 μΐ/cavidade de BSA a 5% em PBS e incubaram-se durante 1,5 horas à temperatura ambiente. Após três lavagens com PBS-Tween 20, diluiu-se cada uma das amostras de soro a 1:500 em 1 mg/ml de BSA em PBS (2 μΐ/ΐ ml). Em cada uma das cavidades colocaram-se 100 μΐ e incubaram-se durante 1,5 horas à temperatura ambiente. Após três lavagens com PBS-Tween 20, adicionaram-se 100 μΐ do anticorpo secundário - IgM - peroxidase murganho x cabra (Sigma). Diluiu-se a amostra a 1:2000 em 1 mg/ml de BSA-PBS e incubou-se durante 1,5 horas à temperatura ambiente. Após três lavagens com PBS-Tween 20, adicionaram-se 100 μΐ de ABTS com H2O2 a 0,03% e leu-se a 405 nm utilizando um leitor automático de microplacas Bio-Tek. A figura 22 mostra que o conjugado de acordo com a presente invenção suprime a resposta in vivo das IgM ao KLH demostrando a eficácia do imunoconjugado nos animais.

EXEMPLO 17

Detecção de IgM no Soro de Murganhos Pré-Tratados e Imunizados por KLH mi

Trataram-se murganhos fêmeas Balb/c e imunizaram-se de acordo com o esquema seguinte. No dia 0, recolheram-se amostras de sangue de cada um dos murganhos e armazenaram-se. No dia 1, dividiram-se os murganhos em quatro grupos: o grupo 1 era 0 dos murganhos controlo aos quais se administraram por via intraperitoneal 500 μΐ de soro fisiológico tamponado com fosfato. Ao grupo 2 injectaram-se por via intraperitoneal 100 (dose equivalente a 500 μΐ) de gelonina em 500 μΐ de PBS. Ao grupo 3 injectou-se por via intraperitoneal uma

mistura de anticorpo-gelonina constituída por 250/*g de anticoipo 2G10 + 50 Mg de gelonina em 250 μ\ de PBS. Ao grupo 4 injectaram-se por via intraperitoneal 500 Mg do conjugado 2G10-gelonina em 500 μ1 de PBS. No dia 4, administrou-se um segundo tratamento. No dia 5, uma imunização com KLH que consistia em 250 Mg de KLH-DNP em 200 μΐ de PBS. Nos dias 12 e 18, recolheu-se sangue. No dia 19, administrou-se o terceiro tratamento (igual ao primeiro e segundo tratamentos). No dia 20, administrou-se o reforço com KLH (igual à primeira imunização). No dia 29 recolheu-se sangue. No dia 36, analisou-se o soro relativamente à presença de IgM no soro dos murganhos pré-tratados e imunizados com KLH. A Figura 23 mostra resultados similares aos da Figura 22.

Todas as patentes e publicações mencionadas nesta memória descritiva são um indicativo do conhecimento dos entendidos na matéria no campo científico a que a presente invenção pertence. Todas as patentes e publicações foram incorporadas na presente invenção a título de referência na medida em que fosse aconselhável que cada uma delas fosse especifica e individual mente incorporada a título de referência.

Qualquer entendido na matéria perceberá facilmente que a presente invenção está bem adaptada para atingir os objectivos e obter os resultados e vantagens mencionadas, bem como tudo o que estiver relacionado com a mesma invenção. Os exemplos apresentados juntamente com os métodos., técnicas, tratamentos, moléculas e compostos específicos descritos na presente invenção constituem presentemente aspectos preferidos característicos a título exemplificativo e não limitativo do âmbito da presente invenção. Ao entendido na matéria ocorrerão alterações ao conteúdo da presente invenção e outras utilizações as quais

estão englobadas no espirito da invenção de acordo com o âmbito das reivindicações.

Lisboa, 6 de Fevereiro de 1995

Claims (20)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Conjugados de anticorpos anti-IgM, caracterizados pelo facto de compreenderem: um anticorpo monoclonal que se liga selectivamente a um anticorpo IgM, não se liga a um anticorpo IgGj ou IgG2 e pertence ao isotipo G; e um grupo citotóxico conjugado com o anticorpo monoclonal citado.
2. 2. Conjugados de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo facto de o anticorpo monoclonal citado se ligar a células de hibridomas produtoras de anticorpos IgM.
3. 3. Conjugados de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo facto de o anticorpo monoclonal citado ser produzido por um dos hibridomas seguintes: (a) 2G10; (b) 1C2; ou ser um anticorpo monoclonal equivalente sob o ponto de vista funcional quer ao hibridoma 2G10 quer ao hibridoma 1C2.
4. 4. Conjugados de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo facto de o anticorpo monoclonal citado ser produzido por rato x rato ou rato x hibridoma de murganho ou a progenie do hibridoma citado.
5. 5. Conjugados de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo facto de se marcar o anticorpo monoclonal citado com um marcador detectável.
6. 6. Conjugados de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo facto de o grupo citotóxico ser a gelonina.
7. 7. Método para assassinar células produtoras de anticorpos IgM, caracterizado pelo facto de se fazer contactar as células citadas com uma quantidade do conjugado de acordo com a reivindicação 6 eficaz sob o ponto de vista citocida.
8. 8. Método para recolher hibridomas produtores de anticorpos monoclonais pertencentes ao isotipo IgG, caracterizado pelo facto de se tratar uma população de células híbridas com um anticorpo monoclonal pertencente ao isotipo G e que se liga selectivamente ao anticorpo IgM mas não se liga ao anticorpo IgGj ou IgG2; se seleccionar as células que formaram os imunocomplexos resultantes citados; e se recolher as células que não formaram complexos com os anticorpos citados.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se seleccionar por citometria de fluxo as células citadas que formaram imunocomplexos.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se seleccionar por separação celular magnética as células citadas que formaram imunocomplexos.
11. 11. Conjugados de anticorpos anti-IgM, caracterizados pelo facto de compreenderem: um anticorpo monoclonal que se liga selectivamente ao anticorpo IgM murino, não se liga ao anticorpo IgG] ou IgG2 e pertence ao isotipo G; e um grupo citotóxico conjugado com o anticorpo monoclonal citado.
12. 12. Conjugados de acordo com a reivindicação 11, caracterizados pelo facto do anticorpo monoclonal citado se ligar a células de hibridomas produtoras do anticoipo IgM anti-murganho.
13. 13. Conjugados de acordo com a reivindicação 11, caracterizados pelo facto de se marcar o anticorpo monoclonal citado com uma marca detectável.
14. 14. Conjugados de acordo com a reivindicação 11, caracterizados pelo facto de o anticorpo monoclonal citado ser produzido por hibridomas 2G10 ou 1C2 ou ser um equivalente funcional do anticorpo monoclonal produzido por hibridomas 2G10ou 1C2.
15. 15. Conjugados de acordo com a reivindicação 2, caracterizados pelo facto de o anticorpo monoclonal citado ser produzido por rato x rato ou rato x hibridomas de murganho ou progenie dos hibridomas citados.
16. 16. Conjugados de acordo com a reivindicação 2, caracterizados pelo facto de o grupo citotóxico ser a gelonina.
17. 17. Método para assassinar células murinas produtoras de anticorpos IgM, caracterizado pelo facto de se fazer contactar as células citadas com uma quantidade eficaz sob o ponto de vista citocida do conjugado de acordo com a reivindicação 11.
18. 18. Método para seleccionar hibridomas produtores de anticorpos monoclonais pertencentes ao isotipo IgG, caracterizado pelo facto de se tratar uma popu lação de células híbridas com um anticorpo monoclonal pertencente ao isotipo G e que se liga selectivamente ao anticorpo IgM murino mas não se liga ao anticorpo IgG] ou IgG2; se seleccionar as células resultantes citadas que formaram um imunocomplexo; e se recolher as células que não formaram um complexo com os anticorpos citados.
19. 19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de se seleccionar por citometria de fluxo as células citadas que formaram um imunocomplexo.
20. 20. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de se seleccionar por separação celular magnética as células citadas que formaram um imunocomplexo.