DE69026453T2

DE69026453T2 - Antirhodopsiner monoklonaler Antikörper and seine Verwendung

Info

Publication number: DE69026453T2
Application number: DE69026453T
Authority: DE
Inventors: Shuji Imazeki; Tadashi Ishibashi; Hiroaki Kezuka; Norio Shimizu; Motoyuki Tsuda; Saeko Yoshino
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd Tokio/tokyo Jp New Energy And Indu
Priority date: 1989-09-27
Filing date: 1990-09-25
Publication date: 1996-09-26
Anticipated expiration: 2010-09-26
Also published as: EP0420151A1; US5414072A; DE69026453D1; EP0420151B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper, der sich zum Einsatz von Rhodopsin als Photosensor oder als optisches Informationserkennungselement eignet, sowie die Verwendung dieses Antikörpers.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen monoklonalen anti-Octopus-Rhodopsin-Antikörper, der mit Rhodopsin ohne Hemmung der photochemischen Reaktion von Octopus- Rhodopsin reagiert, einen monoklonalen anti-Rhodopsin-Antikörper, der unterschiedliche Affinitäten gegenüber Rhodopsin und Metarhodopsin besitzt, einen Hybrid-Antikörper, der gleichzeitig Rhodopsin und ein Dünnschichtbestandteil-Molekül erkennen kann, ein Verfahren zum Fixieren oder Immobilisieren von Rhodopsin unter Verwendung dieser Antikörper, ein Verfahren zur Herstellung einer Rhodopsin-Dünnschicht, ein Verfahren zum photochemischen Nachweis der Rhodopsin-Dünnschicht und die Rhodopsin-Dünnschicht.
Als Substanzen, die in vivo an der Informationsverarbeitung teilnehmen, gibt es bekannte funktionelle Proteine, wie der Acetylcholin-Rezeptor oder Rhodopsin. Falls deren Funktionen künstlich unter Verwendung dieser funktionellen Proteine ausgeübt werden könnten, wäre es möglich, äußerst wirksame Sensoren oder Informationsverarbeitungselemente bereitzustellen. Um derartige Sensoren oder Elemente zu erhalten, ist es erforderlich, diese Proteine an einem Träger oder einem Substrat ohne Schädigung der Funktion der Proteine zu fixieren.
Rhodopsin ist ein Sehpigment, das einen Sensor zur Erkennung von optischen Informationen und ein in Wirbeltier- und Nichtwirbeltier-Spezies weit verbreitetes Membranprotein, das Beachtung als Material für Photosensoren oder optische Informationserkennungselemente findet. Rhodopsin besteht aus Opsinprotein und 11-cis-Retinal. Bei Belichtung mit Licht geht cis-Retinal in trans-Retinal unter Bildung von Metarhodopsin über. Farbpigmente mit Farbempfindlichkeit unterliegen einer ähnlichen Veränderung. Beispielsweise verwandelt sich Octopus-Rhodopsin bei Belichtung mit blauem Licht in ein Gemisch aus Photoprodukten, Metarhodopsin und Rhodopsin. In diesem Fall verschiebt sich die wellenlänge der maximalen Absorption von 475 nm auf 500 nm. Bei Belichtung mit rotem Licht von 580 nm oder länger läßt sich Rhodopsin aus Metarhodopsin regenerieren, wobei die Wellenlänge der maximalen Absorption auf 475 nm zurückkehrt (Tsuda, Motoyuki; Biochemica et Biophysica Acta, Bd. 578 (1979), 5. 372-380). Somit kommt es in Betracht, daß im Fall von Octopus-Rhodopsin die beiden Zustände durch Auswahl von rotem oder blauem Licht gesteuert werden können und sich Octopus-Rhodopsin somit als Photosensor oder optischer Speicher eignet. Farbpigmente, die an der Farbwahrnehmung beteiligt sind, unterliegen einer ähnlichen photochemischen Reaktion wie Rhodopsin. Somit wurde die Aufmerksamkeit auf Rhodopsin-ähnliche Substanzen, die am Sehvorgang teilnehmen, konzentriert.
Um Rhodopsin als Photosensor oder als optischen Speicher einzusetzen, ist es erforderlich, es zu immobilisieren. Das Langmuir-Burget-Verfahren (nachstehend als LB-Verfahren abgekürzt) ist als Verfahren zur Fixierung von Proteinen unter Herstellung einer Dünnschicht bekannt. Es wird beispielsweise berichtet, daß Rinder-Rhodopsin nach dem LB-Verfahren schichtförmig auf eine Glasplatte aufgebracht wird und dessen photochemische Reaktion spektrophotometrisch bestimmt wird (Korenbrat et al., J. Membrane Biol., Bd. 37 (1977), S. 235-263). Dabei wird Rhodopsin einer Phosphatidyl-cholin-Membran einverleibt und auf der Oberfläche von Wasser verteilt. Die ausgebreitete Schicht wird zur Herstellung einer Rhodopsin- Dünnschicht auf eine Glasplatte gebracht.
Jedoch treten bei der vorstehend beschriebenen bekannten Technik Probleme insofern auf, als Rhodopsin nicht in einer speziellen Richtung angeordnet und fixiert werden kann, so daß es schwierig ist, Rhodopsin ohne Schädigung seiner Funktion zu immobilisieren. Dadurch daß Rhodopsin nicht regelmäßig angeordnet werden kann, läßt sich eine photochemische Reaktion der Rhodopsin-Dünnschicht nicht direkt nachweisen.
Auf der anderen Seite wurde für Antikörper oder monoklonale Antikörper nicht nur eine ausgeprägte Eignung als Sonden für die Gewebeverteilung oder für die funktionelle Analyse von Proteinen festgestellt, sondern auch eine Eignung als Materialien zur Fixierung von funktionellen Proteinen. Zur Immobilisierung von Rhodopsin unter Verwendung von Antikörpern wird in JP-A-63-111428 ein Verfahren angegeben, bei dem Rhodopsin Liposomen, die aus einem haptengebundenen Phospholipid bestehen, einverleibt wird und die Liposomen zweidimensional auf einem Substrat unter Verwendung eines für das Phospholipid spezifischen Antikörpers angeordnet werden, um das Rhodopsin zu immobilisieren und dadurch ein biologisches Element aufzubauen, das zur Umwandlung einer externen optischen Information zu verschiedenen Ionen und chemischen Substanzen befähigt ist.
Was monoklonale Antikörper gegen Rhodopsin betrifft, werden Antikörper gegen Rinder-, Ratten- und Bakterien-Rhodopsine auf die nachstehend angegebene Weise gebildet. C. J. Bamstable et al. erzeugten monoklonale Antikörper, die zur Erkennung von Photorezeptor-Gewebe befähigt waren, wobei sie aus Ratten-Netzhäuten erhaltene rohe Membrankomponenten als Antigen verwendeten und die Struktur des Photorezeptor-Gewebes unter kombinierter Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen anti-Rinder-Rhodopsin analysierten (J. of Neurocytology, Bd. 12 (1983), S. 785-803). D. Mackenzie et al. hat ebenfalls monoklonale Antikörper erzeugt, die zur Erkennung des C-Terminus von Rinder-Rhodopsin befähigt waren. Sie analysierten die Verteilung und die Veränderung von Rhodopsin in der Sehzell-Scheibenmembran (Biochemistry, Bd. 23 (1984), S. 6544-6549). Jedoch wurde bisher kein monoklonaler anti-Rhodopsin-Antikörper entwickelt, der sich als Photosensor oder als optisches Informationserkennungselement eignet.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen monoklonalen anti-Rhodopsin-Antikörper bereitzustellen, der sich für die Verwendung von Rhodopsin als Photosensor oder als optisches Informationserkennungselement eignet. Ferner soll ein hybrider Antikörper bereitgestellt werden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Immobilisierung von Rhodopsin unter Verwendung eines monoklonalen anti-Rhodopsin-Antikörpers oder eines hybriden Antikörpers bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung einer Rhodopsin-Dünnschicht unter Verwendung eines hybriden Antikörpers sowie die nach diesem Verfahren erhaltene Dünnschicht bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum photochemischen Nachweis unter Verwendung eines monoklonalen anti-Rhodopsin-Antikörpers bereitzustellen.
Diese und weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden ein monoklonaler anti-Octopus-Rhodopsin-Antikörper, der zur Erkennung einer stabilen Stelle des Octopus-Rhodopsin-Moleküls, die durch Proteasen nicht entfernt wird, ohne Hemmung der photochemischen Reaktion befähigt ist, und ein Hybridom, das zur Bildung des monoklonalen Antikörpers befähigt ist, bereitgestellt.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Immobilisierung von Rhodopsin an einem Träger unter Verwendung des monoklonalen anti-Octopus-Rhodopsin- Antikörpers bereitgestellt.
Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden ein monoklonaler anti-Rhodopsin-Antikörper mit unterschiedlichen Affinitäten gegenüber Rhodopsin und Metarhodopsin sowie ein Hybridom, das zur Bildung des monoklonalen Antikörpers befähigt ist, bereitgestellt.
Gemäß einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum photochemischen Nachweis einer Rhodopsin- Dünnschicht bereitgestellt, das die Umsetzung des monoklonalen anti-Rhodopsin-Antikörpers mit der Rhodopsin-Dünnschicht, die vorher mit Licht belichtet worden ist, und den Nachweis der photochemischen Reaktion des Rhodopsins umfaßt.
Gemäß einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung werden ein Hybrid-Antikörper, der gleichzeitig Rhodopsin und das Dünnschicht-Bestandteilsmolekül erkennen kann, und ein Hybrid-Hybridom, das zur Bildung des Hybrid-Antikörpers befähigt ist, bereitgestellt.
Gemäß einem sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden ein Verfahren zur Herstellung einer Rhodopsin-Dünnschicht, das die Immobilisierung von Rhodopsin an einer Dünnschicht umfaßt, die das Dünnschicht-Bestandteilsmolekül, das durch den Hybrid-Antikörper erkannt wird, enthält, sowie eine gemäß diesem Verfahren erhaltene Rhodopsin-Dünnschicht bereitgestellt.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 zeigt Diagramme zur Erläuterung der Antikörper-Produktivität von B6-, C1-, C6-, C11-, C15-, D9-, D11- und D24- Zellinien in serumfreier Kultur.
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse einer Abstich-Kultur des D11- Stammes.
Fig. 3 zeigt die Ergebnisse des Immunoblotting von Antikörpern, die von den B6-, C1-, C11-, C15-, D9- und D11- Stämmen gebildet worden sind.
Fig. 4 zeigt Diagramme zur Erläuterung des Vorliegens oder des Fehlens einer Affinität von anti-Octopus-Rhodopsin-Antikörper gegen Rhodopsin und Metarhodopsin.
Fig. 5 erläutert, daß Rhodopsin erfindungsgemäß an einer Phospholipid-Membran durch den Hybrid-Antikörper angeordnet und immobilisiert werden kann.
Fig. 6 erläutert die Eignung des erfindungsgemäßen Hybrid- Antikörpers.
Nachstehend wird die Erfindung näher erläutert.
Der monoklonale anti-Rhodopsin-Antikörper kann durch Züchten eines durch sog. Zellfusion konstruierten Hybridoms gebildet werden. Das den monoklonalen anti-Rhodopsin-Antikörper bildende Hybridom kann durch Hybridombildung aus Antikörper erzeugenden Zellen und Myelomzellen und durch Klonieren eines zur Bildung des anti-Rhodopsin-Antikörpers befähigten Hybridoms erzeugt werden. Das monoklonalen anti-Rhodopsin-Antikörper bildende Hybridom wird in Mäuse-Abdomen oder in einer Zellkultur-Einrichtung vermehrt, um den Antikörper zu erhalten.
Als Antikörper bildende Zellen werden Mäuse-Miizzellen verwendet, die aus einem Tier, das unter Verwendung von Rhodopsin oder Metarhodopsin oder einem Gemisch von Rhodopsin und Metarhodopsin als Antigen immunisiert worden ist, präpariert werden. Als immunisierendes Antigen kann rohes oder gereinigtes Standard-Antigen eingesetzt werden. Beim rohen Standard-Antigen handelt es sich um einen Proteinextrakt, der durch Extrahieren der mikrovillaren Membran der Augapfel-Retina mit einem nicht-ionogenen oberflächenaktiven Mittel, wie Digitonin, Octylglucosid, Heptylglucosid oder Zuckerester, das als Membranprotein-Extraktionsmittel verwendet wird, erhalten worden ist. Das gereinigte Standard-Antigen läßt sich erhalten, indem man den Proteinextrakt einer Ionenaustauschchromatographie und Affinitätschromatographie unterwirft. Rhodopsin, Metarhodpsin oder ein Gemisch aus Rhodopsin und Metarhodopsin läßt sich nach einem Verfahren herstellen, das sich für die Tierspezies eignet. Beispielsweise läßt sich im Fall von Octopus-Rhodopsin das Gemisch aus Rhodopsin und Metarhodopsin herstellen, indem man eine Lösung des rohen oder gereinigten Standard-Antigens mit blauem Licht belichtet. Wird die rohe oder gereinigte Standard-Antigenlösung rotem Licht von 580 nm oder längerwelliger ausgesetzt, kann Rhodopsin hergestellt werden. Metarhodopsin läßt sich durch Belichten einer Lösung des rohen oder gereinigten Standard-Antigens mit einem pH-Wert von mindestens 10 mit orangefarbenem Licht und anschließende Verringerung des pH-Werts auf 7 oder darunter herstellen. Diese Antigene werden mit Adjuvans vermischt, und das Gemisch wird Mäusen unter sicherem Rotlicht injiziert, um die Tiere zu immunisieren. Die Immunisierung wird durch Injektion des Antigens in einer Einzeldosis von 40 bis 100 µg, berechnet als Proteingewicht, auf subkutanem, intravenösem oder intraperitonealem Wege 2- bis 4-mal alle 2 bis 3 Wochen durchgeführt. Da einige der Membranprotein-Extraktionsmittel, wie Digitonin oder Zuckerester, toxisch sind, ist es erforderlich, sie vorher zu testen und festzustellen, ob eine Dosis für den Körper zulässig ist. Ferner kann dann, wenn ein für Mäuse stark toxisches Extraktionsmittel im Antigen enthalten ist, eine in vitro-Immunisierung angewandt werden.
Die Zellfusion kann auf ähnliche Weise wie beim Verfahren von Köhler und Milstein durchgeführt werden. Als Fusionspartner lassen sich Myelomzellen verwenden, z. B. von BALB/c-Mäusen abgeleitete X63-Zellen, P3U1-Zellen, NS-1-Zellen und SP2- Zellen und dergl. Aus Mäusemilz gewonnene B-Zellen werden im 2- bis 10-fachen Überschuß mit den Myelomzellen vermischt. Nach Zentrifugation wird der Überstand vollständig durch Absaugen entfernt, wodurch man ein gemischtes Pellet aus Myelomzellen und B-Zellen erhält. Nach gründlichem Lockern der Pellets wird 30 bis 50% Polyethylenglykol (Molekulargewicht 1000 bis 4000), das vorher auf 37ºC erwärmt worden ist, zu den Pellets gegeben, wonach sich eine Umsetzung bei 30 bis 37ºC anschließt. Anschließend wird serumfreies Medium zugetropft und mit dem System vermischt, um die Reaktion zu beenden. Nach weiterer Zugabe von serumfreiem Medium in großen Mengen werden die Zellen durch Zentrifugation gewonnen. Die Zellen werden in HAT-Medium (mit einem Gehalt an Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) suspendiert. Die Suspension wird auf einer Platte mit 96 Vertiefungen verteilt, wonach eine Inkubation bei 37ºC durchgeführt wird. Die Hälfte des Mediums wird durch Absaugen alle 2 Tage an 3 oder 4 Tagen nach der Inkubation entfernt und durch frisches HAT-Medium ergänzt, um das Hybridom allein zu vermehren. Nach ausreichender Vermehrung des Hybridoms wird ein Hybridom, das zur Bildung eines gewünschten anti-Octopus-Rhodopsin-Antikörpers befähigt ist, durch einen ELISA-Test ausgewählt. Das ausgewählte Hybridom wird durch Grenzverdünnung geklont, wodurch man einen anti- Octopus-Rhodopsin-Antikörper bildenden Klon erhält.
Der Klon wird in das Abdomen von BALB/c-Mäusen, denen vorher Pristan verabreicht worden ist, transplantiert. 10 bis 14 Tage später wird der Aszites zur Gewinnung des Antikörpers entnommen. Der Antikörper kann auch durch Züchten des Klons in einer Tierzell-Züchtungseinrichtung gebildet werden. Der Antikörper wird aus dem Aszites oder dem Medium über Stufen, die die Fraktionierung mit Ammoniumsulfat, die Ionenaustauschchromatographie und dergl. einschließen, gereinigt.
Zur Gewinnung des erfindungsgemäßen monoklonalen anti- Octopus-Rhodopsin-Antikörpers, der zur Erkennung einer stabilen Stelle des Rhodopsin-Moleküls ohne Hemmung der photochemischen Reaktion von Rhodopsin befähigt ist, kann der gewünschte Antikörper auffolgende Weise ausgewählt werden.
Das vorstehend beschriebene gereinigte Octopus-Rhodopsin wird mit dem erhaltenen Antikörper in Gegenwart eines nichtionogenen oberflächenaktiven Mittels, wie Digitonin, Zuckerester und dergl., vermischt und anschließend 1 bis 4 Stunden bei 37ºC inkubiert. Durch Umsetzung von Octopus-Rhodopsin mit dem Antikörper in Gegenwart eines nicht-ionogenen oberflächenaktiven Mittels und durch anschließende Ultrafiltration in Gegenwart des oberflächenaktiven Mittels läßt sich das an den Antikörper gebundene Octopus-Rhodopsin vom ungebundenen Octopus-Rhodopsin isolieren. Die Konzentration des oberflächenaktiven Mittels kann 2% oder weniger und vorzugsweise 0,05 bis 0,2% betragen. Nach der Inkubation wird das nicht-umgesetzte Octopus-Rhodopsin durch eine Ultrafiltrationsmembran, die Moleküle mit einem Molekulargewicht von 100 000 oder mehr nicht durchläßt, isoliert. Die Ultrafiltrationsmembran ist nicht auf eine derartige Membran begrenzt, die den Durchgang von Molekülen mit einem Molekulargewicht von 100 000 oder mehr nicht gestattet, vielmehr können beliebige Membranen verwendet werden, sofern Octopus-Rhodopsin und der Antikörper voneinander durch die Membran fraktioniert werden. Nach Zugabe des Puffers zur fraktionierten Lösung, die Moleküle mit einem Molekulargewicht von 100 000 oder mehr enthält, kann das Gemisch mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einem Gehalt an dem oberflächenaktiven Mittel ergänzt werden, um das ursprüngliche Volumen wiederherzustellen. Sodann erfolgt erneut eine Ultrafiltration. Um das an den Antikörper gebundene Octopus-Rhodopsin und das ungebundene Rhodopsin voneinander zu trennen, kann eine trägerfreie Elektrophorese und dergl. zusätzlich zur Ultrafiltration angewandt werden. Es können auch beliebige andere Techniken eingesetzt werden, sofern sie die Bindung zwischen dem Antikörper und dem Octopus-Rhodopsin nicht beeinträchtigen. Unmittelbar nach der Ultrafiltration wird die fraktionierte Lösung rotem Licht von 560 nm oder mehr und blauem Licht von 350 bis 460 nm für etwa 10 bis etwa 60 Sekunden ausgesetzt. Das gesamte Spektrum zwischen 200 und 650 nm wird mit einem Spektrophotometer aufgenommen. Die maximale Absorption bei abwechselnder Bestrahlung mit rotem/blauem Licht wird bestimmt. Durch eine Auswahl des Antikörpers, bei dem das Absorptionsmaximum abwechselnd bei Belichtung mit rotem Licht etwa 475 nm und bei Belichtung mit blauem Licht etwa 500 nm beträgt, können Antikörper ausgewählt werden, die die Photoreaktion von Octopus-Rhodopsin nicht hemmen.
Der C-Terminus von Octopus-Rhodopsin, dessen Molekulargewicht etwa 10 000 betragt, ist gegenüber Protease-Verdau leichter zugänglich. Der die Stelle des C-Terminus erkennende Antikörper eignet sich nicht zur Immobilisierung von Octopus- Rhodopsin. So werden die ausgewählten Antikörper aufihre Fähigkeit zur Erkennung von begrenzten tryptischen Fragmenten geprüft. Gereinigtes Octopus-Rhodopsin wird mit Trypsin in einem Verhältnis von 50 bis 200:1 vermischt, wonach sich eine 5- bis 40-minütige Inkubation bei 37ºC anschließt. Das Mischverhältnis von Trypsin ist nicht besonders beschränkt, jedoch werden bei jedem Ansatz optimale Bedingungen gewählt. Die Reaktionslösung wird mit SDS-behandelter Lösung mit einem Gehalt an Mercaptoethanol vermischt. Das erhaltene Gemisch wird 1 bis 5 Minuten auf 100ºC erwärmt. Nach Elektrophorese an SDS-Polyacrylamidgel wird das System auf eine Nitrocellulose- Membran übertragen. Die ausgewählten Antikörper werden mit ELISA-Technik behandelt, um die Fähigkeit zur Erkennung der tryptischen Fragmente zu prüfen. Von diesen Antikörpern werden solche ausgewählt, die das Verdauungsprodukt mit einem Molekulargewicht von etwa 16 000 oder etwa 28 000 erkennen, die aber die C-terminale Stelle mit einem Molekulargewicht von etwa 10 000 nicht erkennen können.
Durch die vorstehenden Stufen werden die Antikörper, die die photochemische Reaktion nicht hemmen, sondern zur Erkennung einer stabilen Stelle des Rhodopsin-Moleküls befähigt sind, als monoklonale anti-Rhodopsin-Antikörper zur Immobilisierung von Rhodopsin bereitgestellt.
Unter Verwendung des erfindungsgemäßen monoklonalen anti- Octopus-Rhodopsin-Antikörpers, der die stabile Stelle des Rhodopsin-Moleküls ohne Hemmung der photochemischen Reaktion von Rhodopsin erkennen kann, läßt sich Rhodopsin an einem Trager immobilisieren. Dies bedeutet, daß Rhodopsin beispielsweise an aktivierten Mikrokügeichen durch kovalente Bindung des monoklonalen anti-Rhodopsin-Antikörpers an die Mikrokügelchen beispielsweise über eine Bismaleinimidgruppe immobilisiert werden kann, wonach die Antikörper-gebundenen Mikrokügelchen in einer Rhodopsin-Lösung suspendiert werden und anschließend eine Inkubation durchgeführt wird. Somit lassen sich Elemente, wie Photosensoren oder optische Speicher unter Verwendung von Rhodopsin bereitstellen, indem man sich des erfindungsgemäßen monoklonalen anti-Octopus-Rhodopsin-Antikörpers bedient.
Um den erfindungsgemäßen monoklonalen anti-Rhodopsin-Antikörper mit unterschiedlicher Affinität gegenüber Rhodopsin und Metarhodopsin zu erhalten, kann der gewünschte Antikörper auffolgende Weise ausgewählt werden.
Der erfindungsgemäße monoklonale anti-Rhodopsin-Antikörper mit unterschiedlicher Affinität gegenüber Rhodopsin und Metarhodopsin läßt sich durch kompetitive Umsetzung von Rhodopsin- und Metarhodopsin-Antigenen mit den von Hybridomen gebildeten Antikörpern, durch Nachweis des Vorliegens oder Fehlens der Affinitäten durch ELISA-Technik und durch Auswahl des Antikörpers mit unterschiedlichen Affinitäten bereitstellen.
Unter Verwendung des erfindungsgemäßen monoklonalen anti- Rhodopsin-Antikörpers mit unterschiedlichen Affinitäten gegenüber Rhodopsin und Metarhodopsin läßt sich die photochemische Reaktion nachweisen.
Die photochemische Reaktion von Rhodopsin in einer Dünnschicht läßt sich unter Verwendung des monoklonalen anti-Rhodopsin-Antikörpers in Kombination mit einem Verfahren zum Nachweis der Antigen-Antikörper-Reaktion nachweisen. Beispielsweise läßt sich für Octopus-Rhodopsin die photochemische Reaktion auffolgende Weise nachweisen. Nach Belichtung der Rhodopsin-Dünnschicht mit rotem oder blauem Licht, wird die Antigen-Antikörper-Reaktion unter Verwendung des monoklonalen anti-Rhodopsin-Antikörpers mit unterschiedlichen Affinitäten gegenüber Rhodopsin und Metarhodopsin durchgeführt. Anschließend wird eine Menge des an die Dünnschicht gebundenen Antikörpers durch ELISA-Technik, Fluoreszenz-Antikörper-Technik oder dergl. bestimmt. Durch Vergleich der Menge des Antikörpers, der an die Rhodopsin-Dünnschicht, die vorher mit rotem oder blauem Licht belichtet worden ist, nämlich durch Bestimmung der Differenz der Bindungsmengen, läßt sich die photochemische Reaktion der Rhodopsin-Dünnschicht erfassen.
Damit wird es möglich, die photochemische Reaktion von Rhodopsin auf einer Dünnschicht durch Antigen-Antikörper-Reaktion des Rhodopsins in der Dünnschicht, die mit Licht unterschiedlicher Wellenlängen belichtet worden ist, und dem monoklonalen anti-Rhodopsin-Antikörper mit unterschiedlicher Affinität gegenüber Rhodopsin und Metarhodopsin in Kombination mit einem Verfahren, bei dem die Antigen-Antikörper-Reaktion verstärkt wird, bestimmen.
Der erfindungsgemäße Hybrid-Antikörper, der gleichzeitig Rhodopsin und die Dünnschichtkomponenten erkennt, läßt sich erhalten, indem man das auf die vorstehende Weise erhaltene Hybridom, das zur Bildung des anti-Octopus-Rhodopsin-Antikörpers befähigt ist, mit einem Hybridom fusioniert, das zur Bildung des anti-Dünnschichtbestandteil-Molekül-Antikörpers befähigt ist, wodurch man die fusionierte Zelle mit Antikörper-Genen der beiden Zellen, nämlich das Hybrid-Hybridom, erhält.
Das zur Bildung des anti-Dünnschichtbestandteil-Molekül- Antikörpers befähigte Hybridom läßt sich herstellen, indem man Mäuse-Milzzellen eines Tiers, das mit dem Dünnschichtbestandteil-Molekül als Antigen immunisiert worden ist, mit Myelomzellen auf die vorstehend beschriebene Weise fusioniert.
Als Dünnschichtbestandteil-Molekül können beliebige Moleküle verwendet werden, sofern sie eine immunogene Beschaffenheit besitzen und die Bildung von Antikörpern gegen das Dünnschichtbestandteil-Molekül hervorrufen können. Für den Fall, daß eine immunogene Beschaffenheit fehlt, wie bei Phospholipiden, wird ein Hapten an die Phospholipide gebunden, um einen anti-Hapten-Antikörper zu bilden. Erfindungsgemäß können Dinitrophenyl (DNP), Trinitrophenyl (TNP) oder p-Azobenzoat als Hapten verwendet werden, wobei im Hinblick auf die hohe Stabilität vorteilhafterweise DNP eingesetzt wird. Andererseits können beliebige organische Dünnschichten, die ein Substrat zum Aufbringen und Immobilisieren von Rhodopsin darstellen, verwendet werden, sofern das Hapten an der Dünnschicht gebunden wird. Die Verwendung von Phospholipiden ist jedoch besonders bevorzugt, da sie leicht eine Monolayer- Schicht bilden. Zur Herstellung als Phospholipide können beispielsweise Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) oder Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) verwendet werden. Insbesondere eine unter Verwendung von DPPC hergestellte Schicht eignet sich für die erfindungsgemäßen Zwecke, da sie eine regelmäßige Struktur aufweist und eine stabile Schicht über eine große Fläche hinweg bildet. Zur Bildung von Antikörpern gegen DNP muß ein Antigen zur Stimulierung von Lymphozyten ein Molekulargewicht von etwa 10 000 oder mehr aufweisen. Demgemäß wird BSA-DNP, das durch Bindung von DNP an BSA (Protein mit einem Molekulargewicht von 69 000) erhalten worden ist, als Antigen eingesetzt. Mit diesem Antigen können nicht nur Antikörper gegen DNP oder BSA gebildet werden, sondern auch Antikörper gegen Teile von DNP und BSA. Es ist somit notwendig, solche Antikörper auszuwählen, die nur an DNP binden.
Die Fusionszellen des Hybridoms, das zur Bildung von anti- Octopus-Rhodopsin-Antikörper befähigt ist, mit dem Hybridom, das zur Bildung des anti-Dünnschichtbestandteil-Molekül-Antikörpers befähigt ist, nämlich das Hybrid-Hybridom kann unter Verwendung von HAT-Medium ausgewählt werden.
Für die HAT-Selektion ist es erforderlich, aus den entsprechenden Hybridomen Zellen mit Enzymmangel herzustellen. Wenn das Hybridom mit einer bestimmten Chemikahe behandelt wird, um es gegen diese Chemikahe resistent zu machen, zeigt das Hybridom einen Mangel an HGPRT (Hypoxanthin-guanin-phosphoribosyl-transferase) oder TK (Thymidin-kinase). Wenn ein Hybridom einen Mangel an HGPRT und das andere einen Mangel an TK aufweist, kann nur ein durch Fusion von verschiedenen Zellen hergestelltes Hybrid-Hybridom beide Enzyme bilden und in einem HAT-Medium gezüchtet werden, wodurch eine HAT-Selektion durchgeführt wird. Sämtliche durch die HAT-Selektion erhaltenen Zellen erwerben nicht die Antikörper-Gene der jeweiligen Hybridome. Somit werden diese Zellen einer primären Selektion durch ELISA-Technik, Klonieren und zusätzliche sekundäre Selektion durch ELISA unterworfen, wodurch das gewünschte Hybrid-Hybridom erhalten werden kann. Da dieses Hybrid-Hybridom die Antikörper-Gene aus beiden Hybridomen erwirbt, werden Antikörper in 10 Kombinationen gebildet. Um den Hybrid-Antikörper zu erhalten, der zur Erkennung von Rhodopsin und dem Dünnschichtbestandteil-Molekül befähigt ist, ist es erforderlich, den Hybrid-Antikörper unter diesen Antikörpern durch Affinitätschromatographie und dergl. zu isolieren und zu reinigen.
Der Hybrid-Antikörper kann auch auf chemischem Wege gebildet werden. Die im Gelenkbereich des Antikörpers vorhandene S-S-Bindung kann mit einem Reduktionsmittel gespalten werden. Daher werden der anti-Octopus-Rhodopsin-Antikörper und der anti-Dünnschichtbestandteil-Molekül-Antikörper mit einem Reduktionsmittel, wie Dithiothreit (DTT) oder Mercaptoethanol, behandelt. Anschließend werden die Hälften der jeweiligen Antikörper vereinigt, wodurch man den Hybrid-Antikörper erhält, der zur gleichzeitigen Erkennung des Rhodopsins und des Dünnschichtbestandteil-Moleküls befähigt ist. Zur Herstellung des Hybrid-Antikörpers können entweder dieses chemische Verfahren oder das vorerwähnte biologische Verfahren eingesetzt werden.
Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Hybrid-Antikörpers, der gleichzeitig Rhodopsin und das Dünnschichtbestandteil-Molekül erkennen kann, läßt sich Rhodopsin an der Dünnschicht immobilisieren. Der Hybrid-Antikörper kann direkt auf der Dünnschicht angeordnet und dort immobilisiert werden. Alternativ kann der Fc-Teil des Hybrid-Antikörpers durch Behandlung mit Pepsin abgetrennt und das restliche F(ab'')&sub2; allein für die Anordnung und Immobilisierung eingesetzt werden.
Erfindungsgemäß kann Rhodopsin regelmäßig auf der Dünnschicht angeordnet und dort immobilisiert werden, und zwar im gleichen Umfang wie die Anordnung des Dünnschichtbestandteils erfolgt, wobei man den Hybrid-Antikörper verwendet, der gleichzeitig Rhodopsin und das Dünnschichtbestandteil-Molekül erkennt. Somit ist es möglich, einen genauen Photosensor oder einen Photospeicher von besonders hoher Dichte und dergl. zu erhalten.
Nachstehend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die nicht-beschränkenden Beispiele genauer erläutert.

Beispiel 1

1) Reinigung von Antigen

Rhodopsin ist ein Membran-Protein, das in den Stäbchen der Sehzellen, die die Netzhaut bilden, vorliegt.
Zunächst werden die Stäbchen fraktioniert. Die nachstehenden Maßnahmen werden in einem Dunkelraum durchgeführt.
Von 100 Augäpfeln von Paroctopus defleini wurden die Netzhäute entnommen und gewonnen. Sie wurden in 1,2 Liter A-Puffer (10 mM MOPS-NAOH, pH-Wert 7,4, 20 µM p-Aminophenylmetasulfonylfluorid-hydrochlorid (PAPASF)) suspendiert. Anschließend wurden großteilige Feststoffe durch Gaze entfernt. Sodann wurde die Suspension 30 Minuten bei 4ºC und 40 000 g zentrifugiert, um das äußere Segment der die Netzhaut bildenden Sehzellen zu gewinnen. Das äußere Segment wurde in 300 ml 34% Saccharose enthaltendem A-Puffer suspendiert. Die Saccharose-Suspension wurde 1 Stunde bei 40 000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde gewonnen. Man erhielt Mikrovillarmembranen. Nach Zugabe von A-Puffer zum Überstand unter Auffüllung auf ein Volumen von 600 ml wurde 20 Minuten bei 4ºC und 40 000 g zentrifugiert. Man erhielt Mikrovillarmembran-Pellets. Sodann wurden die Pellets in A-Puffer resuspendiert, und die Suspension wurde unter den gleichen Bedingungen zentrifugiert. Dieses Verfahren wurde zur Durchführung eines Spülvorgangs 3 mal wiederholt. Die Mikrovillarmembranen wurden in Digitonin- Lösung (2% Digitonin, 100 mM Na&sub2;HPO&sub4;-KH&sub2;HPO&sub4;, pH-Wert 6,8) suspendiert. Diese Suspension wurde zur Extraktion von Rhodopsin 1 Stunde geschüttelt. Anschließend wurde der Rückstand durch Zentrifugation (25 000 g, 1 Stunde) unter Bildung eines Extrakts entfernt. Der Rückstand wurde erneut mit Digitonin extrahiert, um das Rhodopsin zu gewinnen.
Um das Ommochrom aus dem Digitonin-Extrakt zu entfernen, wurde eine Ionenaustauschchromatographie an DEAE-Cellulose-Ionenaustauscher (DEAE-Sephacel , Produkt der Fa. Pharmacia) durchgeführt. Eine Säule wurde mit 5 ml DEAE-Sephacel gepackt und mit B-Puffer (0,1% Digitonin, 50 mM Na&sub2;HPO&sub4;- KH&sub2;HPO&sub4;, pH-Wert 6,8) äquilibriert Anschließend wurde der Extrakt aufgesetzt, und der B-Puffer wurde über die Säule geleitet. Man erhielt eine Fraktion mit einer Absorption bei 280 nm und 480 nm. Sodann wurde Rhodopsin durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Con A-Sepharose (Produkt der Fa. Pharmacia) isoliert. Eine Säule wurde mit 10 ml Con A Sepharoser gepackt und mit C-Puffer (0,2% Digitonin, 50 mM Tris-HCL, pH-Wert 7,0) äquilibriert Sodann wurde die Fraktion aufgesetzt, und C-Puffer wurde mehrfach über die Säule gegeben. Sodann wurde Rhodopsin mit einem Puffer mit einem Gehalt an 1 M α-Methylglucosid eluiert.

2) Immunisierung einer Maus

Nach vorheriger Einstellung der Digitonin-Konzentration auf 0,1% oder weniger mit CENTRICON 30K (Produkt der Fa. Amicon Co., Ltd.) wurde das gereinigte Octopus-Rhodopsin mit PBS verdünnt. Man erhielt eine Octopus-Rhodopsin-Lösung mit einer Proteinkonzentration von 200 µg/ml. Die Octopus-Rhodopsin-Lösung wurde verdünnt. Die Verdünnung wurde intrapentoneal gemäß folgendem Verfahren einer weiblichen BALB/c-Maus zur Sensibilisierung mit Octopus-Rhodopsin injiziert. Tabelle 1 Verfahren zur Sensibilisierung Proteinmenge Menge des Adjuvans injizierte Dosis Erste Immunisierung Zweite - Dritte Immunisierung Letzte Immunisierung Abstände: Erste Immunisierung [-- 2 Wochen --] Zweite Immunisierung [-- 2 Wochen --1 Dritte Immunisierung [-- 2 Wochen --] Letzte Immunisierung

Adjuvans:

N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (Produkt der Fa. Sigma Co., Ltd.)

3) Zellfusion

3 Tage nach der letzten Immunisierung wurde der Maus die Milz entnommen und für die Zellfusion bereitgestellt. Nach Zerkleinern der Milz in einem 1:1-Mischmedium aus HAM-Medium (Produkt der Fa. Nisshui Pharmaceutical Co., Ltd.) und IMDM- Medium (Produkt der Fa. Sigma Co., Ltd.) (nachstehend als HI- Medium bezeichnet) wurde zur Gewinnung der Milzzellen eine Zentrifugation (16 000 U/min, 5 Minuten) durchgeführt. Die Zellpellets wurden in HI-Medium resuspendiert. Die Milzzellsuspension und Myelom-Zellen (P3U1-Stamm) die durch Züchten in HI-Medium mit einem Gehalt an 10% fötalem Kälberserum und durch Zentrifugieren (5 Minuten 1000 U/min) gewonnen worden waren, wurden in serumfreiem HI-Medium resuspendiert und anschließend zentrifugiert. Das Verfahren wurde 2 mal wiederholt, um eine von Serumkomponenten freie Myelom-Zellsuspension zu erhalten.
Die beiden Zeilsuspensionen wurden unter Bereitstellung von 2 x 10&sup8; Milzzellen und 4 x 10&sup7; Myelomzellen vermischt. Das Gemisch wurde zentrifugiert (1800 U/min, 5 Minuten). Man erhielt ein Mischpellet. Nach vollständiger Entfernung des Überstands wurden die Pellets vermischt. Das Gemisch wurde tropfenweise mit 1 ml 50% Polyethylenglykol 1500 (Produkt der Fa. Boehringer Mannheim Co., Ltd.), das vorher 1 Minute auf 37ºC erwärmt worden war, versetzt. Nach 1-minütigem Rühren wurde 1 ml HI-Medium innerhalb von 1 Minute tropfenweise zugesetzt. Sodann wurden 8 ml weiteres HI-Medium innerhalb von 3 Minuten zugetropft, und die Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen (1000 U/min, 5 Minuten).
Die Zellpellets wurden in 40 ml HAT-Medium (HI-Medium, suppiementiert mit HAT-Lösung (Produkt der Fa. Flow Laboratories)) mit einem Gehalt an 20% fötalem Kälberserum suspendiert. Die Suspension wurde getrennt in die einzelnen Vertiefungen einer Mikroplatte mit 96 Vertiefungen (Produkt der Fa. Corning Co., Ltd.) aufgesetzt. 4 Tage später wurden 100 µm HAT-Medium zugesetzt. Anschließend wurden alle 2 Tage 50% Medium durch frisches HAT-Medium ausgetauscht. 10 Tage später wurden 50% des Mediums alle 2 Tage mit HT-Medium (HI-Medium, supplementiert mit HT-Lösung (Produkt der Fa. Flow Laboratories)) mit einem Gehalt an 20% fötalem Kälberserum ausgetauscht.

4) Hybridom-Selektion

Aus Vertiefungen von Kolonien mit einem großen Hybridom wurde der Überstand zur Probennahme entfernt. Ein zur Bildung von anti-Octopus-Rhodopsin-Antikörper befähigtes Hybridom wurde durch ELISA-Technik ausgewählt.
Nachdem die einzelnen Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, die vorher mit Poly-L-lysin beschichtet war, getrennt mit jeweils 50 µl gereinigtem Octopus-Rhodopsin (0,01 mg/ml) versetzt worden waren, ließ man das System etwa 18 Stunden bei 4ºC absetzen. 1 Minute später wurden jeweils 50 µl 1% Glutaraldehyd zugesetzt. Sodann wurde 3 mal jeweils mit 200 µl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült. Ferner wurden 200 µl Blockierlösung (BLOCK ACE , milchige Proteinlösung der Fa. Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) mit PBS auf 1/4 verdünnt) zugesetzt. Man ließ das erhaltene Gemisch 1 Stunde bei 37ºC absetzen, um den nicht adsorbierten Teil in den einzelnen Vertiefungen zu blockieren. Nach 3-maligem Spülen mit PBS wurden 100 µl Überstand zugegeben. Man ließ das Gemisch 1 Stunde bei 37ºC absetzen. Nach 3-maligem Spülen mit PBS mit einem Gehalt an 0,1% Tween 20 wurden 100 µl einer biotinierten anti-Maus IgG-Antikörper (ABC Kit, Produkt der Fa. Bector-Stein Co., Ltd.)-Lösung zugegeben. Man ließ das Gemisch 1 Stunde bei 37ºC absetzen. Nach 3-maligem Spülen mit PBS wurden 100 µl eines Gemisches aus biotinierter Peroxidase- und Avidin-Lösung zugesetzt. Man ließ das Gemisch 30 Minuten bei 37ºC absetzen. Nach 3-maligem Spülen mit PBS wurde 0,1 M Citratpuffer (pH-Wert 5,4)-Orthophenylendiamin mit einem Gehalt an 0,001% Wasserstoffperoxid zugegeben. Die Absorption wurde bei einer Wellenlänge von 412 nm gemessen. Gleichzeitig wurde der ELISA-Test mit 0,1% Digitonin-Lösung durchgeführt.
Man erhielt 35 Proben, die Octopus-Rhodopsin erkannten, wovon 6 Digitonin erkannten.
Als Hybridome, die nur Octopus-Rhodopsin allein erkannten, wurden die Hybridom-Zellinien B6, C1, C6, C11, C15, D9, D11 und D24 durch die Grenzverdünnungsmethode erhalten.

5) Herstellung von monoklonalem Antikörper

Um die Reinigung des Antikörpers zu erleichtern, wurden die Hybridome in serumfreiem Medium (E-RDF-Medium, Produkt der Fa. Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.) alle 3 Tage einer Subkultur unterzogen. Stämme mit stabiler Antikörperbildung wurden auf diese Weise durch serumfreie Inkubation ausgewählt.
Sämtliche Stämme vermehrten sich im serumfreien Medium. Wie in Fig. 1 dargestellt ist, veränderte sich nach 24-facher Subkultur die Antikörper-Produktivität der Stämme B6, C1, C11, C15, D9, und D11 jedoch nicht im Vergleich zum Anfangsstadium der Subkultur, während die Stämme C6 und D24 eine Verringerung der Antikörper-Produktivität zeigten. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurden die Stämme B6, C1, C11, C15, D9 und D11 als Kandidaten zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern ausgewählt.
Mit den einzelnen Stämmen wurde eine Suspensionskultur unter Verwendung eines Züchtungskolbens mit Ablauföffnung (Produkt der Fa. Ikemoto Rika Co., Ltd.) durchgeführt.
Das Kolbenvolumen betrug 200 ml und das zugesetzte Volumen 70 ml. Die Temperatur wurde auf 37ºC und die Schüttelfrequenz des Rührers auf 350 U/min eingestellt. Die Gasphase des Kolbens wurde durch 5% CO&sub2;-Luft ersetzt. Jeden 2. Tag wurde das Medium gegen frisches Medium ausgetauscht.
Als Inkubationsbeispiei ist das Verfahren zur Züchtung des Stammes Dli in Fig. 2 dargestellt.
Anschließend wurden die einzelnen Kulturlösungen auf etwa 1/5 mittels einer Uitrafiltrationsmembran (Trenn-Molekuiargewicht 200 000; Produkt der Fa. Toyo Advantech Co., Ltd.) eingeengt. Sodann wurde mit Ammoniumsulfat ausgesalzt und gegen PBS dialysiert. Man erhielt eine rohe Antikörper-Lösung. Die rohe Lösung wurde sodann unter Verwendung eines Reinigungssysterns für monoklonale Antikörper (Produkt der Fa. Bio-Rad Co., Ltd.) gereinigt.

6) Eigenschaften des monoklonalen Antikörpers

(1) Klasse und Unterklasse

Die Klasse und Unterklasse der einzelnen monokionalen Antikörper wurden unter Verwendung eines Isotyp-Kits für monoklonale Mäuse-Antikörper (Produkt der Fa. Amersham Co., Ltd.) bestimmt.
Dabei wurde festgestellt, daß die Stämme B6, C1, C15 und D11 Antikörper der Klasse IgG bildeten. Die Antikörper des Stammes B6 gehörten der Unterklasse IgG2a und die übrigen der Unterklasse IgG1 an. Die Stämme C11 und D9 bildeten Antikörper der Klasse IgM.

(2) Einfluß von Antikörpern auf die photochemische Reaktion von Octopus-Rhodopsin

Nach Bindung der vorstehend beschriebenen Antikörper an gereinigtes Octopus-Rhodopsin wurde abwechselnd eine Bestrahlung mit rotem/blauem Licht durchgeführt, um die Veränderung des Absorptionsmaximums zu prüfen.
Nach Vermischen von gereinigtem Octopus-Rhodopsin und den Antikörpern (Antikörper von B6, C1, C15, C11, D9 und D11) in einem Molverhältnis von 3:2 unter Verwendung von 0,1% Digitonin enthaitendem PBS wurde eine 2-stündige Inkubation bei 37ºC durchgeführt. Anschließend wurde das nicht-umgesetzte Rhodopsin durch eine Ultrafiltrationsmembran (Trenn-Molekulargewicht 200 000; Produkt der Fa. Toyo Advantech Co., Ltd.) entfernt. Unmittelbar danach wurde der Überstand mit 0,1% Digitonin enthaitendem PBS wieder auf das ursprüngliche Volumen gebracht. Der Überstand wurde aus einem Abstand von 1 cm mittels Filtern für rotes/blaues Licht (Glasfilter 0-58, V-44, Produkt der Fa. Toshiba), die auf einem Gleitträger montiert waren, in einer Dunkelkammer 10 Sekunden belichtet. Sämtliche Spektren wurden mittels eines Spektrophotometers (Produkt der Fa. Hitachi Ltd.) aufgenommen, um die Absorptionsmaxima nach Belichtung mit rotem/blauem Licht festzustellen.
Tabelle 2 zeigt die Veränderung der Absorptionsmaxima nach Belichtung mit rotem/blauem Licht. Zur Kontrolle wurden das System Octopus-Rhodopsin (OR) allein und das System nach Vermischen mit Rinderserumalbumin (BSA) untersucht. Tabelle 2 Einfluß von Antikörper auf die photochemische Reaktion von Octopus -Rhodopsin Absorptionsmaximum (nm) Probe Belichtung mit rotem Licht Belichtung mit blauem Licht rotem Licht blauem Licht OR + Antikörper von
Bei sämtlichen Antikörpern wurden die Absorptionsmaxima nach Belichtung mit rotem/blauem Licht abwechselnd verschoben, wie es bei Octopus-Rhodopsin allein der Fall ist. Somit läßt sich feststellen, daß diese Antikörper die photochemische Reaktion von Octopus-Rhodopsin nicht hemmen.

(3) Fähigkeit von Octopus-Rhodopsin zur Erkennung von begrenzten tryptischen Fragmenten

Bei spezifischer Verdauung oder Spaltung von gereinigtem Octopus-Rhodopsin mit Trypsin weist das Verdauungs- oder Spaltungsprodukt ein Molekulargewicht von etwa 40 000 auf, wobei der C-endständige Bereich mit einem Molekulargewicht von etwa 10 000 vom Octopus-Rhodopsin (Molekulargewicht etwa 50 000) entfernt worden ist. Ferner werden Verdauungsprodukte mit Molekulargewichten von etwa 16 000 und 28 000 gebildet. Die Fähigkeit der einzelnen Antikörper zur Erkennung dieser spezifischen Verdauungsprodukte wurde durch Immunoblotting- Technik geprüft.
Gereinigtes Octopus-Rhodopsin wurde mit Trypsin (Produkt der Fa. Worthington Biochemical Co., Ltd.) im Verhältnis von 100:1 gemischt, wonach sich eine 30-minütige Inkubation bei 37ºC anschloß. Unmittelbar nach der Inkubation wurde das System mit einer SDS-Behandlungslösung vermischt. Das Gemisch wurde 5 Minuten auf 100ºC erwärmt. Das mit SDS behandelte Systern wurde der Elektrophorese an SDS-"phast"-Geir (Produkt der Fa. Pharmacia) unter Verwendung einer PHAST SYSTEM ELECTROPHORESIS EQUIPMENT (Produkt der Fa. Pharmacia) unterzogen. Anschließend wurde eine feuchte Nitrocellulose-Membran auf das Gel gelegt. Das Gei wurde 20 Minuten von unten auf 70ºC erwärmt, um Rhodopsin und dessen tryptische Fragmente zu übertragen. Die Nitrocellulose-Membran wurde mit einem Blockierungsmittel (Produkt der Fa. Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) blockiert. Nach Spülen mit PBS mit einem Gehalt an 0,1% Tween-20 wurde der Antikörper darauf umgesetzt. Anschließend wurde das ELISA-Verfahren durchgeführt. Schließlich wurde die Nitroceiiuiose-Membran mit 4-Chlornaphthol entwickelt.
Die Ergebnisse des Immunoblottings sind in Fig. 3 dargestellt. Die Antikörper der Stämme B6 und C1 erkannten das tryptische Fragment mit einem Molekulargewicht von etwa 40 000, während die Antikörper der Stämme C11, C15, D9 und D11 das tryptische Fragment nicht erkannten. Die Antikörper der Stämme B6, C1, C15, D9 und D11 erkannten das Verdauungsprodukt mit einem Molekulargewicht von etwa 28 000. Der Antikörper des Stammes D11 erkannte das Verdauungsprodukt mit einem Molekulargewicht von 16 000.
Diese Ergebnisse lassen erkennen, daß die Antikörper der Stämme C15, D9 und D11 das mit SDS behandelte tryptische Fragment mit einem Molekulargewicht von etwa 40 000 nicht erkennen können, während die Antikörper der Stämme B6 und C1 das mit SDS behandelte tryptische Fragment erkennen können, da die tryptischen Fragmente mit Molekulargewichten von etwa 16 000 und etwa 28 000 tryptische Fragmente des Produkts mit einem Molekulargewicht von etwa 40 000 sind.
Durch die vorstehenden Stufen ließen sich die Antikörper, die zur Erkennung der stabilen Steile der Struktur ohne Hemmung von deren photochemischer Reaktion befähigt waren, als monoklonale Antikörper für die Immobilisierung von Octopus- Rhodopsin bereitstellen.

Beispiel 2

Der in Beispiel 1 erhaltene Antikörper wurde kovalent an einen Träger gebunden. Octopus-Rhodopsin wurde sodann an dem Trager immobilisiert und mit rotem/blauem Licht belichtet, um das Vorliegen oder Fehlen einer photochemischen Reaktion zu prüfen.
Anschließend wurde der D11-Antikörper kovalent an 30 mg aktivierte Mikrokügeichen (Durchmesser etwa 3 µm; Produkt der Fa. Funakoshi Chemical Co., Ltd.) gebunden. Der Träger wurde durch Zentrifugation (3000 U/min, 10 Minuten) gewonnen. Anschließend wurde der Träger in PBS suspendiert, und die Suspension wurde zentrifugiert. Dieses Verfahren wurde 2 mal unter anschließendem Spülen wiederholt. Der an den Antikörper gebundene Träger wurde in 0,1% Digitonin enthaltender Octopus-Rhodopsin-Lösung (1,1 mg/ml) suspendiert. Unter mäßigem Rühren wurde die Suspension 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Nach Gewinnen des Trägers durch Zentrifugation wurde er in 0,1% Digitonin enthaltender PBS suspendiert. Die Suspension wurde zur Spülung zentrifugiert. Der gespülte Träger wies eine hell-orangefarbene Färbung auf, was zeigt, daß Rhodopsin daran immobilisiert war. Der Träger wurde in 0,1% Digitonin enthaltender PBS suspendiert. Die Suspension wurde auf eine Platte aus Quarzglas getropft. Nach einer Bestrahlungszeit von 20 Sekunden mit rotem/blauem Licht durch eine optische Faser in einer Dunkelkammer wurde die Absorptionsänderung mit einem Spectro Multichannel Photodetector (Produkt der Fa. OTSUKA ELECTRONICS Co., Ltd.) bestimmt.
Bei Bestrahlung mit rotem Licht betrug das Absorptionsmaximum 475 nm und bei Bestrahlung mit blauem Licht 502 nm. Durch abwechselnde Bestrahlung mit rotem/blauem Licht verschoben sich die Absorptionsmaxima abwechselnd hin und her. Wurde der an den Antikörper gebundene Träger allein auf ähnliche Weise mit dem roten/blauen Licht belichtet, wurde eine derartige Veränderung des Absorptionsmaximums nicht festgestellt. Somit wird die vorstehende Veränderung der photochemischen Reaktion des durch den Antikörper immobilisierten Octopus-Rhodopsins zugeschrieben.

Beispiel 3

Der erfindungsgemäße monoklonale anti-Rhodopsin-Antikörper mit unterschiedlicher Affinität gegenüber Rhodopsin und Metarhodopsin wurde auf folgende Weise ausgewählt.

(1) Unterschied der Affinititen gegenüber Rhodopsin und Metarhodopsin

Der in Beispiel 1 erhaltene Antikörper wurde zur Prüfung seiner Affinität kompetitiv mit Rhodopsin und Metarhodopsin umgesetzt. In jede Vertiefung einer Immunoplatte mit 96 Vertiefungen, die vorher mit Poly-L-lysin beschichtet worden war, wurden getrennt jeweils 50 µl Rhodopsin-Lösung (mit einem Gehalt an 0,1% Digitonin) gegeben. Man ließ das System 1 Stunde bei 37ºC stehen. 1 Minute später wurde das Gemisch mit 50 µl 1% Glutaraldehyd-Lösung versetzt, wonach 3 mal mit PBS gespült wurde. Ferner wurden 200 µl Blockierungslösung (BLOCK ACE , milchige Proteinlösung, Produkt der Fa. Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), die mit PBS auf 1/4 verdünnt war) zugesetzt. Man ließ das Gemisch 1 Stunde bei 37ºC stehen, um den nicht-adsorbierten Teil in den einzelnen Vertiefungen zu blockieren. Nach 3-maligem Spülen mit PBS wurden jeweils 25 µl Antikörper-Lösung und 25 µl Rhodopsin-Lösung oder Metarhodopsin-Lösung in geeigneter Verdünnung zugegeben. Man ließ das Gemisch 1 Stunde bei 37ºC stehen. Nach 3-maligem Spülen mit PBS mit einem Gehalt an 0,1% Tween 20 wurden 100 µl einer biotinierten anti-Maus IGG-Antikörper-Lösung (ABC Kit, Produkt der Fa. Bector-Stein Co., Ltd.) zugegeben. Man ließ das Gemisch 1 Stunde bei 37ºC stehen. Nach 3-maligem Spülen mit PBS wurden 100 µl eines Gemisches aus biotinierter Peroxidase- und Avidin-Lösung zugesetzt. Man ließ das Gemisch 30 Minuten bei 37ºC stehen. Nach 3-maligem Spülen mit PBS wurde 0,1 M Citratpuffer (pH-Wert 5,4)-Orthophenylendiamin mit einem Gehalt an 0,001% Wasserstoffperoxid zugesetzt. Die Absorption wurde bei einer Wellenlänge von 412 nm gemessen.
Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt. Die Ordinate bezeichnet das Verhältnis der Bindungshemmung durch freies Rhodopsin und Metarhodopsin. Die Abszisse gibt die Menge an freiem Antigen an. Die C1-, B6-, C6-, C15-, D11- und D24-Antikörper zeigten unabhängig davon, ob Rhodopsin und Metarhodopsin als freies Antigen verwendet wurden, keine Unterschiede, während die C11- und D9-Antikörper durch das freie Antigen Metarhodopsin gehemmt wurden. Dies zeigt, daß diese beiden Antikörper eine hohe Affinität für Metarhodopsin aufwiesen.

(2) Erkennungsutelle

Die Erkennungsstellen der beiden vorstehend beschriebenen Antikörper wurden geprüft.
Die Primärstruktur von Octopus-Rhodopsin ist von Y. A. Ovchinnikov et al., aufgeklärt worden. Bezüglich der Sekundärstruktur wird angenommen, daß 7 Helices durch die Membran gehen (FEBS Letters, Bd. 232, Nr. 1 (1988), S. 69-72). Das Fragment mit einem Molekulargewicht von 28 000, das von Cli- Antikörpern (dessen Erkennung durch Prüfung der Kreuzreaktivität mit einem Peptid gemäß den nachstehenden Angaben bestätigt wurde) und D9-Antikörpern erkannt wurde, stellt einen Bereich mit einem Gehalt an der ersten bis fünften Helix des N-Terminus dar. Demgemäß wurde ein Peptid, dessen Aminosäuresequenz einem Teil der cytoplasmatischen Steile in diesem Bereich entsprach, synthetisiert und über Carbodiimid an Rinderserumaibumin (BSA) gebunden, wonach das Vorliegen oder Fehlen einer Kreuzreaktivität mit den Antikörpern durch ELISA-Technik untersucht wurde. Die Peptidsynthese wurde nach dern Fmoc-Verfahren unter Verwendung eines Peptid-Synthesegeräts (Produkt der Fa. Pharmacia) durchgeführt.
Die Meßergebnisse, die eine Kreuzreaktivität mit dem an Rinderserumaibumin (BSA) gebundenen Peptid zeigen, sind in Tabelle 3 dargestellt. In diesem Fall entspricht die Aminosäuresequenz des Peptids den nachstehenden Angaben. Die Ergebnisse mit anderen Antikörpern sind ebenfalls in Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle 3 Absorption A&sub4;&sub1;&sub2; Antigen Monoklonaler Antikörper Octopus-Rhodopsin Peptid-BSA
Die Ergebnisse zeigen, daß die C11- und D9-Antikörper mit dern Peptid eine Kreuzreaktion ergaben. Da das Peptid sich im hydrophilen Bereich, der die dritte und die vierte Heiix verbindet, befand, wurde angenommen, daß die beiden Antikörper diesen Bereich erkennen. Aminosäuresequenz des synthetischen Peptids:
N-Terminus-Val-Ile-Gly-Arg-Pro-Met-Ala-Ala-Ser-Lys-Lys- Met-Ser-C-Terminus

Beispiel 4

Unter Verwendung des C11-Antikörpers wurde das Vorliegen oder Fehlen der photochemischen Reaktion bei der Octopus-Rhodopsin-Dünnschicht geprüft.
Die Octopus-Rhodopsin-Dünnschicht wurde auffolgende Weise hergestellt. Reines Wasser wurde in einen "Langmuir Trough" (Produkt der Fa. Joyce Level Co., Ltd.) gegeben. 100 µl Octopus-Rhodopsin-Lösung mit einem Gehalt an 0,2% Digitonin wurden auf dem Wasser verteilt, wonach eine Kompression auf 50 mN/m erfolgte. Im Vergleich zu Digitonin zeigte eine π-A- Kurve der Octopus-Rhodopsin-Lösung eine größere Zunahmegeschwindigkeit des Oberflächendrucks, was bestätigte, daß das Octopus-Rhodopsin-Molekül an der Gas-Flüssigkeits-Grenzfläche gepackt war. Daher wurde ein Quarzsubstrat 4 mal mit einer Eintauchgeschwindigkeit von 5 ml/min eingetaucht und herausgezogen, um den Film auf der Flüssigkeitsoberfläche auf das Substrat zu übertragen. Die Octopus-Rhodopsin-Dünnschicht wurde unter sicherem Rotlicht mit rotem oder blauem Licht belichtet. Das Vorliegen oder Fehlen der photochemischen Reaktion wurde durch ELISA-Technik geprüft.
Der Analysenvorgang wurde unter sicherem Rotlicht durchgeführt. Zunächst wurde das Quarzsubstrat mit der Octopus-Rhodopsin-Dünnschicht in eine Blockierungslösung getaucht und 1 Stunde auf 37ºC erwärmt. Anschließend wurde das Substrat mit PBS gespült und sodann in eine Lösung eines mit Peroxidase markierten C11-Antikörpers getaucht und 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Daran schloß sich eine ähnliche Vorgehensweise wie in Beispiel 1 an. Schließlich wurde das Quarzsubstrat in Orthophenylendiamin-Lösung (pH-Wert 5,4) mit einem Gehalt an 0,001% Wasserstoffperoxid getaucht. Die Absorption der Lösung wurde bei einer Wellenlänge von 412 nm gemessen. Zur Kontrolle wurden ähnliche Vorgehensweisen an mit Peroxidase markiertem Du-Antikörper und mit anti-Dinitrophenyi-Antikörper durchgeführt.
Die Ergebnisse des Tests der photochemischen Reaktion von Octopus-Rhodopsin in dieser Schicht sind in Tabelle 4 aufgeführt. Beim Du-Antikörper ergab sich keine Veränderung der Absorption in der Octopus-Rhodopsin-Dünnschicht bei Belichtung mit rotem oder blauem Licht. Dagegen war beim C11-Antikörper die Absorption bei Belichtung mit blauem Licht höher. Dadurch wurde gezeigt, daß ein Unterschied in der Absorption der Octopus-Rhodopsin-Dünnschicht bei Belichtung mit rotem Licht und blauem Licht bestand, was auf eine Veränderung der photochemischen Reaktion zurückzuführen war. Tabelle 4 Absorption A&sub4;&sub1;&sub2; Probe D11-anti-Dinitrophenyl-Antikörper Octopus-Rhodopsin-Dünnschicht bei Belichtung mit rotem Licht
Wie vorstehend ausgeführt, konnte die photochemische Reaktion von Octopus-Rhodopsin in dieser Schicht mit dem Antikörper mit unterschiedlichen Affinitäten gegenüber Rhodopsin und Metarhodopsin in Kombination mit dem ELISA-Verfahren und dergi., wobei die Antigen-Antikörper-Reaktion verstärkt werden konnte, nachgewiesen werden.

Beispiel 5 [I] Herstellung von anti-DNP-Antikörper

anti-DNP-Antikörper wurde auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt. In diesem Fall wurde DNP an BSA gebunden. 4 Mäuse wurden mit BSA-DNP als Antigen immunisiert. Es besteht die Möglichkeit, daß dieses Antigen nicht nur die Bildung von Antikörpern gegen DNP oder BSA veranlaßt, sondern auch gegen die Stellen, die einen Teil von DNP oder BSA enthalten. Die Durchführung erfolgte so, daß nur an DNP bindende Antikörper ausgewählt wurden. Dabei wurde die Umsetzung mit Poly-L-lysin (PLL)-DNP, erhalten durch Bindung von DNP an PLL, ebenfalls durch ELISA-Technik getestet, zusätzlich zur Umsetzung mit BSA und BSA-DNP. Antikörper die nur eine Bindung mit DNP eingingen, wurden ausgewählt. Dabei wurde für 13 von 768 Proben festgestellt, daß sie nur mit DNP bindende Antikörper bildeten. Darunter wurden zwei willkürlich ausgewählte Antikörper gekiont. Man erhielt fünf monoklonale Hybridome, die zur stabilen Bildung des anti-DNP-Antikörpers befähigt waren. Ein unter den fünf Hybridomen willkürlich ausgewähltes Hybridom wurde gezüchtet. Der in das Medium sezernierte Antikörper wurde durch Ultrafiltration, Aussalzen und Dialyse gereinigt.
Es wurde geprüft, ob der auf diese Weise erhaltene Antikörper eine Bindung mit DNP-gebundener Phospholipid-LB-Membran (DNP-Phospholipid-LB-Membran) eingehen konnte. Auf einer Platte aus Quarzglas wurde die DNP-Phospholipid-LB-Membran gebildet. Der anti-DNP-Antikörper wurde zur Durchführung des ELISA-Tests umgesetzt. Um zu zeigen, daß die Reaktion über die Bindung durch die Antigen-Antikörper-Reaktion erfolgt, wurde anti-Rhodopsin-Antikörper zu Kontrolizwecken umgesetzt und einem ELISA-Test unterworfen. Um ferner zu bestätigen, daß die Farbentwicklung nicht durch eine nicht mit dem Antikörper in Zusammenhang stehende Reaktion erfolgte, wurde der ELISA-Test auch mit einer Probe, die nicht mit Antikörper versetzt war, durchgeführt. Es ergab sich, daß nur die Proben, denen anti-DNP-Antikörper zugesetzt worden war, eine Farbentwicklung zeigten, während die Proben, denen entweder der anti-Rhodopsin-Antikörper oder kein Antikörper zugesetzt worden war, keinerlei Färbung entwickelten. Somit ergab sich aus der Tatsache, daß der gebildete anti-DNP-Antikörper an die DNP-Phospholipid-LB-Membran gebunden war, daß es sich beim erhaltenen Antikörper zweifelsfrei um anti-DNP-Antikörper handelte.

[II] Konstruktion von Hybrid-Antikörper 1) Herstellung einer chemisch resistenten Zellinie

Um ein Hybrid-Hybridom durch HAT-Selektion herzustellen, wurde ein Hybridom zunächst mit einer Chemikahe behandelt, um einen chemisch resistenten Stamm zu erhalten. Als anti- Rhodopsin-Antikörper bildendes Hybridom wurde der in Beispiel 1 verwendete C1-Stamm eingesetzt. Der C1-Stamm wurde mit 8- Azaguanin (8-AG) behandelt, um dem Stamm C1 einen HGPRT-Mangel zu verleihen. Das anti-DNP-Antikörper bildende Hybridom wurde mit 5-Bromdesoxyuridin (5-BDU) behandelt, um dem Stamm einen TK-Mangel zu verleihen. Zunächst wurden die Behandlungskonzentrationen stufenweise eingestellt, um die Grenzkonzentration für die Vermehrungshemmung zu ermitteln. Bei der gleichen Konzentration wurde die Inkubation fortgesetzt, bis der chemisch resistente Stamm auftrat.

a) Herstellung von gegen 8-AG resistentem Hybridom

Das anti-Rhodopsin-Antikörper bildende Hybridom (C1) wurde in einem Medium mit einem Gehalt an 8-AG in 6 abgestuften Konzentrationen von 0,94 bis 30 µg/ml gezüchtet. 4 Tage später ergab sich eine erhebliche Hemmwirkung auf die Vermehrung bei einer Konzentration von 30 µg/ml. Daher wurde die Inkubation fortgesetzt. 18 Tage später wurde das Auftreten von Zeilen mit chemischer Resistenz beobachtet. Ein Teil der im HAT- Medium gezüchteten Zellen war abgestorben und der HGPRT-Mangel wurde bestätigt. Sodann wurden die Zellen unter Bildung von 16 Hybridomen mit anti-Rhodopsin-Antikörper-Produktivität und mit erworbener 8-AG-Resistenz geklont.

b) Herstellung von gegen 5-BDU resistentem Hybridom

Das anti-DNP-Antikörper bildende Hybridom wurde in einem Medium mit einem Gehalt an 5-BDU in 6 abgestuften Konzentrationen von 3 bis 60 µg/ml gezüchtet. 3 Tage später wurde bei jeder Konzentration die Hemmwirkung auf die Proliferation festgestellt, wobei aber Zellen in einer Konzentration von 7,5 bis 60 µg/ml abgestorben waren. 5-BDU zeigte im Vergleich zu 8-AG bei geringeren Konzentrationen eine wachstumshemmende Wirkung. Somit wurden die Zellen, bei denen in Konzentrationen von 3 und 6 µg/ml eine Vermehrung festgestellt wurde, stufenweise innerhalb von 1 bis 2 Tagen an eine höhere Konzentration angepaßt. Dabei traten 11 Tage später Zellen auf, die sich bei einer Konzentration von 60 µg/ml vermehren konnten. Durch weitere Fortsetzung der Inkubation bei dieser Konzentration wurde der TK-Mangei in HAT-Medium bestätigt, und die Antikörper-Produktivität wurde durch ELISA-Technik bestimmt. Man erhielt 2 Hybridome.

2) Zellfusion

Das anti-Rhodopsin-Antikörper bildende Hybridom (HGPRT- Mangel) wurde mit dem anti-DNP-Antikörper bildenden Hybridom (TK-Mangel) fusioniert. Eine HAT-Selektion wurde zur Bildung eines Hybrid-Hybridoms durchgeführt. Das Hybrid-Hybridom wurde durch ELISA-Technik getestet. Dabei wurden 126 Zeilen ausgewählt, die zur Bildung von Antikörper, der sowohl eine Bindung mit Rhodopsin als auch mit DNP einging, befähigt waren. 3 willkürlich ausgewählte Hybrid-Hybridome wurden geklont. Man erhielt 27 Stämme in Form von Zellen mit stabiler Antikörper-Produktivität. Daraus wurde ein Stamm mit hoher Antikörper-Produktivität zur Herstellung von Hybrid-Antikörper ausgewählt.

3) Herstellung von Hybrid-Antikörper

Das Hybrid-Hybridom wurde gezüchtet. Die in das Medium sekretierten Antikörper wurden durch Ultrafiltration, Aussalzen und Dialyse gereinigt. Aus 10 Arten von Antikörpern, die in den vorstehend gereinigten Antikörpern enthalten waren, wurden Hybrid-Antikörper durch zweistufige Affinitätschromatographie gereinigt. Zunächst wurde die gereinigte Probe mit Lysin-Sepharose 4B-DNP (Lysin-Agarose 48-DNP) gereinigt. Nach dem Spülen wurde ein Eluat unter Verwendung von 0,1 N Salzsäure erhalten. Der ELISA-Test ergab, daß die Menge des anti-DNP-Antikörpers in der Spülflüssigkeit im Vergleich zu der gereinigten Probe verringert war. Es wird somit angenommen, daß der anti-DNP-Antikörper eine Bindung mit dem Träger eingegangen war. Sodann konnte durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Rhodopsin als Träger der Hybrid-Antikörper gewonnen werden. Jedoch war für die Affinitätschromatographie Rhodopsin in großen Mengen erforderlich. Daher wurde das folgende Verfahren angewandt. Die L-Kette des anti- Rhodopsin-Antikörpers ist vom K-Typ und der anti-DNP-Antikörper vom λ-Typ. Unter Ausnutzung dieses Unterschieds wird der Hybrid-Antikörper an einen Träger von anti-k-Ketten-Antikörper (Agarose-Avidin-D-biotinierter anti-k-Ketten-Antikörper) gebunden, und die Elution wird mit 0,1 N Salzsäure durchgeführt. Durch diese Vorgehensweise konnte das Antikörpergemisch des Antikörpers, der zur Erkennung von DNP befähigt, aber nicht zur Erkennung von Rhodopsin befähigt war und dem Hybrid-Antikörper erhalten werden. Somit konnte der Hybrid- Antikörper durch die vorstehend beschriebene zweistufige Affinitätschromatographietechnik erhalten werden.

[III] Herstellung einer Rhodopsin-Dünnschicht

Unter Verwendung des Hybrid-Antikörpers, der zur gleichzeitigen Erkennung von Rhodopsin und DNP befähigt war, wurde Rhodopsin auf folgende Weise immobilisiert. Das Verfahren wird unter Bezugnahme auf Fig. 5 erläutert.
Wie in Fig. 5(a) dargestellt, wurde die DNP-Phosphoiipid- Membran 2 auf einem Quarzglas-Substrat 1 gemäß dem LB-Verfahren gebildet. Nach Umsetzung des Antikörpers 3 wurde Rhodopsin 4 zur Reaktion zugesetzt. Um die Bildung der gewünschten Dünnschicht zu bestätigen, wurde mit Peroxidase markierter anti-Rhodopsin-Antikörper 5 (D11) nach Spülen umgesetzt, wie in Fig. 5(b) erläutert ist. Nach Spülen wurde eine Orthophenylendiamin-Lösung zugesetzt, um das Vorliegen oder Fehlen einer Farbentwickiung zu prüfen. Wie in Fig. 5(b) dargestellt, wurde Rhodopsin an der Phospholipid-Membran durch den Hybrid-Antikörper immobilisiert, so daß die Lösung durch das Enzym, das am vorstehend beschriebenen markierten Antikörper gebunden war, gefärbt wurde. Somit wurde bestätigt, daß in diesem Beispiel der beabsichtigte Zweck erreicht wurde. Das Ergebnis ist in der Aufnahme von Fig. 5(c) dargestellt. Fig. 6 zeigt das Ergebnis eines Vergleichsbeispiels zur Bestätigung der Brauchbarkeit der vorliegenden Erfindung. In dem in Fig. 6 dargestellten Beispiel wurde ein anti-DNP-Antikörper 6 anstelle von Hybrid-Antikörper 3 verwendet und der anti-DNP- Antikörper wurde auf ähnliche Weise wie in Fig. 5 behandelt. In diesem Fall war der anti-DNP-Antikörper an die DNP- Phospholipid-Membran gebunden und Rhodopsin war aufgrund des Fehlens der Fähigkeit zur Erkennung von Rhodopsin nicht immobilisiert, wie in Fig. 6(a) gezeigt ist. Daher floß das Rhodopsin beim Spülen aus, so daß der mit Peroxidase markierte anti-Rhodopsin-Antikörper nicht daran gebunden wurde. Somit ergab sich keine Farbentwicklung, wie in Fig. 6(b) gezeigt ist.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß unter Verwendung eines Hybrid-Antikörpers, der zur gleichzeitigen Erkennung von Rhodopsin und DNP befähigt war, Rhodopsin auf der Phospholipid-Membran angeordnet und immobilisiert werden konnte und eine Rhodopsin-Dünnschicht mit einer ebenso regelmäßigen Anordnung wie die der Phospholipid-Membran erhalten werden konnte.

Claims

1. Monoklonaler anti-Octopus-Rhodopsin-Antikörper, der zur Erkennung einer stabilen, durch Proteasen nicht entfernten Steile des Octopus-Rhodopsin-Moieküls befähigt ist, ohne die photochemische Reaktion von Octopus-Rhodopsin zu hemmen.

2. Monokionaler Antikörper nach Anspruch 1, wobei der monoklonale anti-Octopus-Rhodopsin-Antikörper zur Erkennung des begrenzten tryptischen Fragments von Octopus-Rhodopsin mit einem Molekulargewicht von etwa 16 000 oder etwa 28 000 befähigt ist.

3. Monoklonaler anti-Rhodopsin-Antikörper mit unterschiedlichen Affinitäten gegenüber Rhodopsin und Metarhodopsin zum Nachweis von photochemischen Reaktionen von Rhodopsin-Moiekülen, wobei durch blaues/rotes Licht Rhodopsin in Metarhodopsin und andererseits Metarhodopsin in Rhodopsin übergeführt wird.

4. Monoklonaler anti-Rhodopsin-Antikörper nach Anspruch 3, wobei es sich beim Rhodopsin und beim Metarhodopsin um von Cephaiopoda abgeleitetes Rhodopsin und Metarhodopsin handelt.

5. Monokionaler anti-Rhodopsin-Antikörper nach Anspruch 3, wobei es sich beim Rhodopsin und Metarhodopsin um Octopus- Rhodopsin handelt.

6. Monoklonaler anti-Rhodopsin-Antiktrper nach Anspruch 3, der eine höhere Affinität gegenüber Metarhodopsin aufweist.

7. Monokionaler anti-Rhodopsin-Antikörper nach Anspruch 3, der die folgende Aminosäuresequenz erkennt:

Val-Ile-Gly-Arg-Pro-Met-Ala-Ala-Ser-Lys-Lys-Met-Ser.

8. Hybrid-Antikörper, enthaltend eine Komponente des monoklonalen anti-Octopus-Rhodopsin-Antikörpers nach Anspruch 1 oder 2 und eine Komponente eines anti-Dünnschichtbestandteil- Molekül-Antikörpers.

9. Hybrid-Antikörper nach Anspruch 8, wobei es sich beim Hybrid-Antikörper um einen Antikörper handelt, der aus einer H-Kette und einer L-Kette, die zur Erkennung von Rhodopsin befähigt sind, und einer H-Kette und einer L-Kette, die zur Erkennung des Dünnschichtbestandteil-Moleküls befähigt sind, aufgebaut ist.

10. Hybrid-Antikörper nach Anspruch 8, wobei es sich beim Dünnschichtbestandteii-Molekül um Phosphoiipid handelt, an das Dinitrophenyl (DNP) gebunden ist.

11. Hybridom, befähigt zur Bildung eines monokionalen anti- Octopus-Rhodopsin-Antikörpers nach Anspruch 1.

12. Hybridom, befähigt zur Bildung eines monoklonalen anti- Rhodopsin-Antikörpers nach Anspruch 3.

13. Hybrid-Hybridom, befähigt zur Bildung eines monoklonalen anti-Rhodopsin-Antikörpers nach Anspruch 8.

14. Verfahren zum Immobilisieren von Rhodopsin, umfassend das Immobilisieren von Rhodopsin an einem Träger unter Verwendung eines monokionalen anti-Octopus-Rhodopsin-Antikörpers nach Anspruch 1.

15. Verfahren zur Herstellung einer Rhodopsin-Dünnschicht, umfassend das Immobilisieren von Rhodopsin an einer Dünnschicht mit einem Gehalt an einem Dünnschichtbestandteii-Molekül, das durch den Hybrid-Antikörper nach Anspruch 8 erkannt wird, unter Verwendung dieses Hybrid-Antikörpers.

16. Verfahren zum Nachweis einer photochemischen Reaktion einer Rhodopsin-Dünnschicht, umfassend die Umsetzung einer mit einem Enzym markierten Form des monoklonalen anti-Rhodopsin-Antikörpers nach Anspruch 3 mit einer Rhodopsin-Dünnschicht und Vergleichen der Enzymaktivitäten vor und nach Bestrahlen der Rhodopsin-Dünnschicht.

17. Rhodopsin-Dünnschicht, erhalten durch Immobilisieren von Rhodopsin an einer Dünnschicht, die ein durch einen Hybrid- Antikörper nach Anspruch 8 erkannten Dünnschichtbestandteil- Molekül enthält, unter Verwendung des Hybrid-Antikörpers.