FR2667945A1 - Moyens et methodes pour le diagnostic in vitro de la sclerose en plaques et autres neuropathies demyelinisantes. - Google Patents
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Abstract
Méthode de diagnostic de la sclérose en plaques ou d'autres affections démyélinisantes, caractérisée en ce qu'elle met en jeu un déterminant antigénique comprenant le groupe inositol.
Description
"MOYENS ET METHODES POUR LE DIAGNOSTIC IN VITRO DE LA
SCLEROSE EN PLAOUES ET AUTRES AFFECTIONS DEMYELINISANTES"
L'invention a pour objet une méthode pour le diagnostic in vitre de la sclérose en plaques et autres affections démyélinisantes.
SCLEROSE EN PLAOUES ET AUTRES AFFECTIONS DEMYELINISANTES"
L'invention a pour objet une méthode pour le diagnostic in vitre de la sclérose en plaques et autres affections démyélinisantes.
En France, on estime qu'environ 50000 personnes sont atteintes de sclérose en plaques (SEP) et 2000 nouveaux cas sont enregistrés chaque année. Elle débute chez l'adulte jeune, habituellement entre 20 et 40 ans. Son incidence est plus forte chez les femmes que chez les hommes. Les symptômes sont variables : ils peuvent se présenter sous forme notamment de troubles visuels, d'une faiblesse musculaire, d'une perte de coordination des mouvements ou de contractures. Ils reflètent tous une altération de la conduction nerveuse centrale. Ils peuvent disparaitre ou s'atténuer, pour réapparaître ensuite sous une forme plus grave.L'évolution habituelle de la maladie est cyclique, entraînant une invalidité progressive, mais les formes cliniques sont très polymorphes. I1 n'existe pas à l'heure actuelle de test de diagnostic ni de thérapeutique efficace, étant donné que ltétiologie de la SEP demeure inconnue.
L'étiologie multifactorielle de la SEP où, génétique, environnement et immunologie semblent tenir une place importante, prévaut actuellement. De plus, de nombreux arguments sont en faveur du rôle pathologique des désordres immunitaires observés dans cette affection.
La recherche de marqueurs immunologiques dans la
SEP a porté principalement ces dernières années sur les constituants antigéniques de la myéline : la PBM, la MAG, le protéolipide et les glycolipides. Si des anticorps anti-PBM ont bien été retrouvés dans le liquide cêphalorachidien (LCR) de malades atteints de SEP, ils ne semblent pas être toujours spécifiques de l'affection.
SEP a porté principalement ces dernières années sur les constituants antigéniques de la myéline : la PBM, la MAG, le protéolipide et les glycolipides. Si des anticorps anti-PBM ont bien été retrouvés dans le liquide cêphalorachidien (LCR) de malades atteints de SEP, ils ne semblent pas être toujours spécifiques de l'affection.
Des anticorps anti-oligodendrocytes ont été mis en évidence par immunofluorescence indirecte chez des patients atteints de SEP mais n'ont pas été retrouvés par dosage radioimmunologique. Leur présence ne serait donc pas non plus spécifique de la SEP.
I1 en est de même avec les anticorps lymphotoxiques, anti-galactocérébrosides sériques, antiglycolipides décrits.
Les inventeurs ont alors abordé le problème par une approche immunochimique nouvelle ne portant pas sur les protéines de la myéline, mais sur les lipides placés à leur interface.
Les études effectuees ont permis de mettre en évidence des taux élevés d'anticorps dirigés spécifiquement contre un certain type de lipides dans les prélèvements de fluides biologiques de patients atteints d'affections démyélinisantes.
La poursuite de ces travaux a conduit à l'élaboration d'outils de diagnostic utilisables également comme agents thérapeutiques.
L'invention a donc pour but de fournir une méthode de diagnostic de SEP ou d'autres affections démyélinisantes permettant un diagnostic précoce de la maladie.
Elle a également pour but de fournir des moyens permettant de diagnostiquer avec précision le type de forme évolutif de la maladie.
L'invention vise également à fournir des complexes immuns et des anticorps utiles comme réactifs de diagnostic, et, selon un aspect de grand intérêt, notamment comme médicaments.
La méthode, selon l'invention, de diagnostic in vitro de la sclérose en plaques ou d'autres neuropathies démyélinisantes est caractérisée en ce qu'elle met en jeu un déterminant antigénique comportant le groupe inositol.
Selon une disposition particulière de l'invention le déterminant antigénique comporte un enchaînement phosphate-inositol.
Selon une autre disposition, le déterminant antigénique comporte un enchaînement glycéryl-phosphateinositol.
Ces déterminants sont reconnus de manière inattendue avec une grande spécificité et sensibilité par des auto anti-corps circulants formés contre eux, qui s'avèrent présents selon des taux élevés dans les prélèvements de fluides de patients atteints des maladies en question.
Les travaux effectués par les inventeurs ont montré la présence de taux élevés d'anticorps spécifiques vis-à-vis de ces déterminants dans les prélèvements de fluides biologiques de ces patients, alors que les patients en rémission ou les témoins sains ne présentent que des taux très faibles d'anticorps polyspécifiques.
Le déterminant antigénique mis en jeu dans la méthode de l'invention est constitué plus particulièrement par le phosphatidylinositol.
Selon un mode de réalisation avantageux, on met en contact un prélèvement de fluide biologique d'un patient avec un déterminant antigénique tel que défini ci-dessus dans des conditions permettant d'établir une liaison immunologique entre ce déterminant et, lorsqu'ils sont présents, les anticorps de l'échantillon dirigés contre ce déterminant, la mise en évidence de la réaction immunologique étant effectuée selon les techniques classiques.
L'étape de mise en contact est réalisée avantageusement par incubation, en milieu tampon, d'un déterminant tel que défini ci-dessus avec le prélèvement à étudier.
On opère de préférence à une température supérieure à l'ambiante, notamment de 20 à 40 C, en particulier aux environs de la température physiologique de 37c C
Le milieu tampon présente un pH voisin de la neutralité notamment de 7 à 8 environ, avantageusement voisin de 7,5, en particulier de 7,4. On a recours plus spécialement à un tampon phosphate.
Le milieu tampon présente un pH voisin de la neutralité notamment de 7 à 8 environ, avantageusement voisin de 7,5, en particulier de 7,4. On a recours plus spécialement à un tampon phosphate.
Le déterminant antigénique utilisé est fixé sur un support inerte vis-à-vis de la réaction immunologique recherchée et des réactifs mis en oeuvre.
Pour la fixation, on utilise le déterminant antigénique sous forme prédiluée dans un tampon contenant un stabilisateur d'acide gras tel que le chlorure de calcium et un solvant organique capable d'éviter la formation de micelles comme l'hexane ou autre solvant de ce type.
I1 est avantageux d'utiliser des supports capables d'absorber l'antigène par interactions, par exemple électrostatiques, force de Van der Waals ou hydrophobes.
Parmi les supports convenant à cet effet, on citera ceux en matériau polymère, comme le polystyrène ou encore des membranes en matériau synthétique ou naturel par exemple formées de cellulose telle que la nitrocellulose.
Le fluide biologique prélevé sur le patient est plus spécialement constitué par du sang ou un constituant du sang comme le sérum, ce qui permet de réaliser de manière particulièrement simple le test de diagnostic.
En variante, le fluide biologique correspond à un prélèvement de liquide céphalo-rachidien.
On effectue le plus généralement une dilution du prélèvement dans un milieu tampon dans des conditions permettant d'obtenir la liaison immunologique recherchée.
Des dilutions de l'ordre de 1/5 000 à 1/50 000, notamment de l'ordre de 1 à 1/30 000, en particulier de 1/20 000
10 000 environ s'avèrent particulièrement appropriées avec des sérums.
10 000 environ s'avèrent particulièrement appropriées avec des sérums.
Les dilutions sont moins fortes avec du liquide céphalo-rachidien, notamment de tordre de 1/50 à 1 , plus
200 spécialement d'environ 1
100
Le milieu de dilution est un milieu tampon ayant en particulier un pH de l'ordre de 7.
200 spécialement d'environ 1
100
Le milieu de dilution est un milieu tampon ayant en particulier un pH de l'ordre de 7.
La révélation du complexe immunologique formé est réalisée selon les méthodes classiques.
Il est aisé de réaliser la méthode de diagnostic de l'invention en mettant en oeuvre la technique ELISA, plus spécialement la technique en deux temps type sandwich.
On réalise alors deux incubations successives, l'une avec le prélèvement à tester et le déterminant antigénique défini ci-dessus, l'autre avec un deuxième anticorps (anti-Ig humaine) marqué. Le deuxième anticorps est dilué de manière appropriée. Le marquage est plus généralement réalisé à l'aide d'une enzyme, plus spécialement la peroxydase ou encore la phosphatase alcaline ou le p-galactosidase qui sont les plus couramment utilisées.
D'autres formes de marquage classiques sont utilisables et pourront être choisies par l'homme de l'art, comme le marquage fluorescent, chimique ou radioactif.
Le groupe marqueur est révélé de manière habituelle.
La technique décrite ci-dessus permet avec avantage de mettre en évidence la présence de taux élevés d'anticorps circulants dirigés contre les déterminants antigéniques en question plus spécialement dans les formes évoluant en poussée et rémission.
Selon un aspect de grand intérêt, l'invention permet également dans un autre mode de réalisation, de diagnostiquer de manière spécifique les formes de SEP ou d'autres affections démyélinisantes évoluant progressivement en soumettant les complexes immuns déterminants antigéniques tels que définis ci-dessus - anticorps dirigés contre ces déterminants à un traitement approprié pour éliminer le déterminant.
Avantageusement, le complexe immun formé in vive lors de 1 t évolution progressive de la maladie est isolé du prélèvement de fluide biologique à étudier et soumis à un traitement de délipidation.
Les prélèvements sont de préférence pré-dilués dans un tampon de pH basique de l'ordre de 7,5 à 8,5 notamment d'environ 8 et mélangés avec un ou plusieurs solvants organiques appropriés.
Le mélange est ensuite traité pour séparer les lipides et les déterminants, en particulier par centrifugation.
Les anticorps récupérés sont mis en contact avec un déterminant antigénique et la réaction immunologique est conduite selon la technique indiquée plus haut.
On mesurera l'intérêt de ce mode de réalisation qui permet de distinguer dans ces affections démyélinisantes, en particulier dans la SEP, la forme évolutive, faire une distinction entre les SEP en rémission (forme évoluant par poussée et rémission) des SEP progressives. I1 est ainsi possible d'agir de manière appropriée à un mode précoce.
L'invention vise egalement une trousse pour le diagnostic in vitre de la sclérose en plaques ou d'autres affections démyélinisantes.
Cette trousse comprend
- un ' déterminant antigénique tel que défini cidessus, en particulier du phosphatidylinositol,
- les solvants, tampons et agents nécessaires pour réaliser les étapes d'incubation et /ou de révélation du complexe immunologique.
- un ' déterminant antigénique tel que défini cidessus, en particulier du phosphatidylinositol,
- les solvants, tampons et agents nécessaires pour réaliser les étapes d'incubation et /ou de révélation du complexe immunologique.
Le déterminant antigénique est de préférence fixé sur un support polymère tel que le polystyrène et se présente avantageusement absorbé dans les puits de plaque de microtitration. En variante, le déterminant antigénique est fixé sur une membrane en un matériau synthétique ou naturel, notamment en cellulose, comme la nitrocellulose ou encore un polyamide tel que le nylon.
D'autres formes de support comprennent des billes.
L'invention vise en outre en tant que produits nouveaux les complexes immuns formés d'un déterminant antigénique tel que défini ci-dessus et d' anticorps dirigés contre ce déterminant.
Ces complexes sont notamment utilisables pour l'élaboration selon les techniques classiques d'anticorps dirigés contre eux. De tels anticorps bloquants présentent l'intérêt de ralentir par injection le processus de la maladie.
Les anticorps dirigés contre les déterminants antigéniques évoqués plus haut, notamment les anticorps anti-phosphatidylinositol sont des produits nouveaux et en tant que tels entrent également dans le cadre de l'invention.
Ces anticorps qui reconnaissent spécifiquement ces déterminants sont caractérisés en outre en ce outils appartiennent à la phase des Ig G.
L'invention vise encore en tant que produits nouveaux, les anticorps anti-idiotypes formés contre les anticorps définis ci-dessus.
L'invention sera illustrée ci-après par des exemples de mise en oeuvre de modes de réalisation de la méthode du diagnostic de la sclérose en plaques, définie cidessus.
Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 4 qui représentent
- la figure 1, les valeurs de l'absorbance de sérums de patients MS, mesurées avec différents lipides,
- la figure 2, l'absorbance de sérums selon l'évolution de la sclérose en plaques des patients,
- la figure 3, l'absorbance des sérums de différents groupes de patients avant et après délipidation,
- la figure 4, les valeurs de l'absorbance avec ou sans inhibiteur hapténique.
- la figure 1, les valeurs de l'absorbance de sérums de patients MS, mesurées avec différents lipides,
- la figure 2, l'absorbance de sérums selon l'évolution de la sclérose en plaques des patients,
- la figure 3, l'absorbance des sérums de différents groupes de patients avant et après délipidation,
- la figure 4, les valeurs de l'absorbance avec ou sans inhibiteur hapténique.
Patients :
On distingue plusieurs types de patients selon le cours de ltévolution de la maladie
forme évoluant par poussée et rémission (RRMS) rechute aiguë ou poussée (RRMS-AR), ou forme rémittante, c'est-à-dire asymptomatique entre deux rechutes (RRMS-R)
forme progressive avec des symptômes progressant lentement, se développant après une période de symptômes rechute-rémission (RPMS)
forme primaire progressive chronique (CPMS) les patients du groupe CPMS ont une incapacité neurologique s'aggravant progressivement pendant au moins 6 mois avant d'etre retenus pour l'étude.Deux groupes sont distingués, à savoir le groupe CPMS-A (forme rapide), lorsque les patients ont souffert d'une aggravation durant les trois mois passés, et le sous-groupe CPMS-S (forme lente), s'ils se sont trouvés dans une phase stationnaire d'incapacité pendant au moins trois mois.
On distingue plusieurs types de patients selon le cours de ltévolution de la maladie
forme évoluant par poussée et rémission (RRMS) rechute aiguë ou poussée (RRMS-AR), ou forme rémittante, c'est-à-dire asymptomatique entre deux rechutes (RRMS-R)
forme progressive avec des symptômes progressant lentement, se développant après une période de symptômes rechute-rémission (RPMS)
forme primaire progressive chronique (CPMS) les patients du groupe CPMS ont une incapacité neurologique s'aggravant progressivement pendant au moins 6 mois avant d'etre retenus pour l'étude.Deux groupes sont distingués, à savoir le groupe CPMS-A (forme rapide), lorsque les patients ont souffert d'une aggravation durant les trois mois passés, et le sous-groupe CPMS-S (forme lente), s'ils se sont trouvés dans une phase stationnaire d'incapacité pendant au moins trois mois.
Tous les patients du groupe RPMS étaient également dans une période d'incapacité augmentant lentement, progressivement, pendant au moins 6 mois.
Les sujets témoins sont des donneurs de sang sains (HD), des patients atteints d'autres maladies neurologiques (OND), qui ne sont pas connues pour être associées avec des situations immunologiques anormales (accidents vasculaires cérébraux, lésions traumatiques de la moelle épinière, épilepsie idiopathique, démence sénile du type Alzheimer et maladie de Parkinson), des patients avec des maladies neurologiques auto-immunes (AIND) : syndrome de Guillain
Barré ou myasthénie.
Barré ou myasthénie.
Les groupes OND et AIND, ne montrant pas de différence en ce qui concerne les titres en anticorps sont groupés pour l'analyse statistique.
méthode de diagnostic basée sur la technique ELISA
Cette méthode comprend
1/ la titration des auto anti-PI dans les liquides biologiques des malades
2/ une étape de séparation des complexes immuns par délipidation.
Cette méthode comprend
1/ la titration des auto anti-PI dans les liquides biologiques des malades
2/ une étape de séparation des complexes immuns par délipidation.
On réalise ces étapes comme suit
1/ titration des auto anti-PI dans les liquides biologiques des malades
Les auto anti-PI présents dans les sérums humains sont identifiés par leur liaison avec l'antigène (PI) recouvrant des plaques de microtitration (Nunc)R en polystyrène.
1/ titration des auto anti-PI dans les liquides biologiques des malades
Les auto anti-PI présents dans les sérums humains sont identifiés par leur liaison avec l'antigène (PI) recouvrant des plaques de microtitration (Nunc)R en polystyrène.
a/ Revêtement des plaques de microtitration
A partir d'une solution mère de PI à 10 mg/ml dans le chloroforme, on prépare la solution qui servira au revêtement des puits sur les plaques.
A partir d'une solution mère de PI à 10 mg/ml dans le chloroforme, on prépare la solution qui servira au revêtement des puits sur les plaques.
80 p1 de la solution mère de PI sont dilués dans 40 ml de tampon phosphate 10-2 M contenant du Ca Cl2 à 10-3 M et 100 pl d'hexane. Le mélange est parfaitement homogénéisé.
Les puits reçoivent ensuite soit 200 p1 du mélange (solution PI à 20 ,ug/ml) dans le tampon phosphate avec 1Q-3 M Ca C12 pH : 7,4 soit 200 pl d'une solution contrôle de protéine (thyroglobuline à 20/ pg/ml dilué dans du tampon phosphate 10-2 M contenant 10-3 M, de Ca C12 pH : 7,4 et 100 pl d'hexane pour 40 ml).
Cette étape de revêtement est effectuée sur deux heures à 37 C.
Les plaques de microtitration sont ensuite vidées, rincées trois fois avec du phosphate salé (PS).
b/ Application des dilutions sarigues ou de LCR
Les sérums sont dilués au 20.000ème dans du phosphate salé, pH : 7,4 et déposés sur les plaques pendant 2 heures à 37 C. Les LCR sont dilués 100 fois dans le même tampon et appliqués dans les mêmes conditions pendant deux heures également. Les puits sont ensuite rincés trois fois avec le phosphate salé.
Les sérums sont dilués au 20.000ème dans du phosphate salé, pH : 7,4 et déposés sur les plaques pendant 2 heures à 37 C. Les LCR sont dilués 100 fois dans le même tampon et appliqués dans les mêmes conditions pendant deux heures également. Les puits sont ensuite rincés trois fois avec le phosphate salé.
c/ La liaison PI-auto anti-PI humains est révélee par l'addition successive : de 200 p1
- dans chaque puits
a) de sérum de chèvre contenant des antiimmunoglobulines marquées à la peroxydase (Institut Pasteur
Production) dilué au 20.000ème, dans du tampon PS, pH 7,4 contenant 2 * de sérum de porc pendant une heure à 37C C ;
et
b) après trois rinçages par du tampon PS, d'une solution de citrate (0,1 M) phosphate (0,2 M) pH 5, contenant 0,025 t d'H202 (substrat de la peroxydase) et 1 * d'orthophénylèndiamine (0PD, Chromogène, Sigma) pendant 10 minutes à l'obscurité.
- dans chaque puits
a) de sérum de chèvre contenant des antiimmunoglobulines marquées à la peroxydase (Institut Pasteur
Production) dilué au 20.000ème, dans du tampon PS, pH 7,4 contenant 2 * de sérum de porc pendant une heure à 37C C ;
et
b) après trois rinçages par du tampon PS, d'une solution de citrate (0,1 M) phosphate (0,2 M) pH 5, contenant 0,025 t d'H202 (substrat de la peroxydase) et 1 * d'orthophénylèndiamine (0PD, Chromogène, Sigma) pendant 10 minutes à l'obscurité.
La réaction colorimétrique est arrêtée par addition dans chaque puits de 50 pl d'une solution d'H2S04 4N.
La lecture de la densité optique sur chaque puits de la plaque est effectuée par un spectrophomètre multiscan (MR 610 Dynatech) informatisé.
2/ Séparation des complexes immuns par délipidation
La délipidation des sérums et LCR a pour but de dissocier les anti-PI complexés avec leur antigène.
La délipidation des sérums et LCR a pour but de dissocier les anti-PI complexés avec leur antigène.
Une prédilution au 1/20 du sérum est faite dans du tampon phosphate, pH : 8 (le LCR n'est prédilué qu'au 5ème).
Puis on met en présence un volume égal de chaque prédilution et d'un mélange de dimethylsulfoxide/chloroforme (vol/vol).
Le mélange est fortement agité 10 minutes, puis centrifugé à 10.000 g pendant 10 minutes.
La phase aqueuse est récupérée et finalement diluée 20.000 fois pour les sérums et 100 fois pour les LCR.
Elle est ensuite appliquée sur des plaques de microtitration recouvertes de l'antigène PI et de la protéine contrôle.
L'efficacité de la délipidation a été évaluée par addition d'un composé radioactif dans des liquides biologiques humains contrôles. Elle est de plus de 90 %. La préservation de la reconnaissance antigène-anticorps (non dénaturation des Ig anti-PI humaines) a été testée également : l'affinité des anti-PI sériques n'est pas modifiée après délipidation.
EXPERIENCES DE COMPETITION
Pour évaluer la spécificité de la réponse immunologique, plusieurs expériences ont été effectuées, en utilisant la méthode ELISA, entre des puits de plaques de microtitration revêtues de PI et différents compétiteurs hapténiques à des concentrations de 10-4 à 10-5 M, préincubés 16h à 4"C avec des sérums dilués de patients ou des sérums dilués et délipidés de SEP en phase progressive.
Pour évaluer la spécificité de la réponse immunologique, plusieurs expériences ont été effectuées, en utilisant la méthode ELISA, entre des puits de plaques de microtitration revêtues de PI et différents compétiteurs hapténiques à des concentrations de 10-4 à 10-5 M, préincubés 16h à 4"C avec des sérums dilués de patients ou des sérums dilués et délipidés de SEP en phase progressive.
Les composés suivants ont été utilisés : PI, le myoinositol (mIns), le PI -4 monophosphate, le PI -4, le 5 biphosphate et des gangliosides.
Chromatographie des immunoglobulines (Ig
Pour identifier la classe des Ig induites contre
PI, on a soumis des sérums de patients MS à une chromatographie.
Pour identifier la classe des Ig induites contre
PI, on a soumis des sérums de patients MS à une chromatographie.
On rapporte les résultats obtenus sur 10 sérums MS chromatographiés sur G-200.
Chaque fraction Ig est testée sur des puits de plaques recouvertes de PI.
La liaison PI-Ig est révélée par des immunoglobulines anti-humaines de type A, G ou M, marquées à la peroxydase de raifort (Institut Pasteur Production). Les autres étapes sont réalisées comme décrit ci-dessus.
Résultats
Détection d'anticorps anti-phospholipides
Une série d'expériences concerne la recherche de la présence d'anticorps dirigés contre quatre phospholipides dans les sérums de deux groupes de patients.
Détection d'anticorps anti-phospholipides
Une série d'expériences concerne la recherche de la présence d'anticorps dirigés contre quatre phospholipides dans les sérums de deux groupes de patients.
Les quatre phospholipides sont
le phosphatidylinositol (PI)
la phosphatidyléthanolamine (PE)
la phosphatidylsérine (PS)
la phosphatidylchloline (PC)
Les deux groupes de patients correspondent respectivement à 8 cas consécutifs en poussée aiguë de SEP (RRMS-AR) et 8 cas consécutifs en phase progressive de SEP (CPMS).
le phosphatidylinositol (PI)
la phosphatidyléthanolamine (PE)
la phosphatidylsérine (PS)
la phosphatidylchloline (PC)
Les deux groupes de patients correspondent respectivement à 8 cas consécutifs en poussée aiguë de SEP (RRMS-AR) et 8 cas consécutifs en phase progressive de SEP (CPMS).
Les tests sont effectués en aveugle par comparaison à des sérums de 6 patients présentant d'autres maladies neurologiques OND et de 7 donneurs de sang sains (HD).
On rapporte sur la figure 1 les valeurs d'absorbance (ELISA) obtenues.
On constate que des niveaux élevés d'anticorps ne sont trouvés que vis-à-vis du PI et seulement dans les sérums de patients avec en poussée aiguë de SEP, à une dilution de 1 (p < 0,001).
20 000
Recherche d'anticorps anti PI dans différentes formes de SEP
On rapporte sur la figure 2 les résultats obtenus sur 99 patients atteints de SEP, les expériences ayant été effectuées selon deux séries séparées = 22 avec une poussée de SEP, 25 avec une rémission, 29 avec une forme progressive ayant une poussée et 23 avec une forme progressive comprenant 14 cas d'évolution rapide et 9 d'évolution lente.
Recherche d'anticorps anti PI dans différentes formes de SEP
On rapporte sur la figure 2 les résultats obtenus sur 99 patients atteints de SEP, les expériences ayant été effectuées selon deux séries séparées = 22 avec une poussée de SEP, 25 avec une rémission, 29 avec une forme progressive ayant une poussée et 23 avec une forme progressive comprenant 14 cas d'évolution rapide et 9 d'évolution lente.
L'examen de ces résultats montre que les plus hauts taux d'anticorps anti-PI sont trouvés dans les sérums de patients en cours de poussée, ceux-ci étant significativement différents de ceux obtenus chez 30 donneurs de sang sains (HD) et chez 20 patients présentant d'autres maladies neurologiques (OND) ou d'autres maladies auto-immunes neurologiques (AIND).
On n'observe aucune différence dans les titres en anticorps pour les différents sous-groupes de témoins qui présentent tous une faible liaison immunologique sur les puits des plaques recouvertes de PI.
Aucune différence n'est observée entre les patients avec une SEP en progression rapide ou lente.
Recherche d'anticorps anti-PI dans les sérums délipidés de patients en phase progressive : étape importante pour discriminer les patients en rémission des patients en progression.
On étudie la liaison immunologique après délipidation dans les sérums de patients (5 SEP en poussée, 5 SEP en rémission, 5 SEP progressives et 5 SEP progressives en poussée) et des sérums témoins (4 HD).
Les résultats obtenus sont rapportés sur la figure 3. On observe des niveaux significatifs d'anticorps anti-PI après délipidation seulement dans les sérums de patients ayant une SEP progressive comparés aux niveaux obtenus avant la délipidation.
Au contraire, dans les témoins HD et OND, aucune modification statistiquement significative n'est observée (ces résultats ne sont pas représentés).
Identificatlon immuno-chimique de ltépitope le mieux reconnu
Une première série d'expériences qui sont des tests directs a porté sur l'étude de la spécificité de la réponse immune observée à l'égard du PI dans la SEP selon la composition en acide gras du PI et selon son degré de phosphorylation.
Une première série d'expériences qui sont des tests directs a porté sur l'étude de la spécificité de la réponse immune observée à l'égard du PI dans la SEP selon la composition en acide gras du PI et selon son degré de phosphorylation.
On rapporte sur la figure 4 les résultats d'études sur des sérums de 5 patients avec une SEP en poussée, 4 avec une SEP en rémission, 5 avec une SEP progressive, 4 avec une SEP progressive en poussée et 8 sujets sains.
Une deuxième série d'expériences (tests de compétition) a permis d'établir les courbes de déplacement (figure 4). Celles-ci sont établies après des expériences dtinhibition haptenique entre les puits des plaques recouvertes du PI et un compétiteur pré-incubé avec sérum de 9 SEP en poussée (courbe 1), 9 SEP progressives sans délipidation (courbe 2), 9 sérums de SEP progressives délipidés (courbe 3) et 9 témoins sains (courbe 4).
Chaque point représente les valeurs moyennes de l'absorbance des 9 sérums testés deux fois. B indique l'absorbance avec l'inhibiteur hapténique et BO sans inhibiteur.
Par - les tests directs, aucune différence n'apparat dans la liaison PI entre les sous-groupes, que PI (recouvrant les puits de la plaque) contienne des acides arachidoniques et stéariques ou des acides linoléiques et palmitiques, ce qui suggère que la réponse immune n'est pas dirigée vers la partie hydrophobe de la molécule.
Ces résultats sont donnés dans le tableau 1 suivant.
Tableau 1
Liaison immunologique sur les molécules suivantes absorbées sur les plaques de microtitration.
Liaison immunologique sur les molécules suivantes absorbées sur les plaques de microtitration.
<tb>
<SEP> Molécule <SEP> RRMS-AR <SEP> RPMS <SEP> CPMS <SEP> RRMS-R
<tb> <SEP> r* <SEP> r* <SEP> r* <SEP> r*
<tb> PI <SEP> avec <SEP> acides <SEP> arachidoni- <SEP> 2,03 <SEP> 2,08 <SEP> -0,09 <SEP> -0,12
<tb> que <SEP> et <SEP> stéarique <SEP> (PI <SEP> 2) <SEP> (n=5) <SEP> (n=4) <SEP> (N=5) <SEP> (n=4)
<tb> PI <SEP> avec <SEP> acides <SEP> linoléique <SEP> 2,01 <SEP> 2,02 <SEP> -0,10 <SEP> 0,09
<tb> et <SEP> palmitique <SEP> (PI <SEP> 1) <SEP> (n=5) <SEP> (n=5) <SEP> (n=5) <SEP> (n=4)
<tb> PI2 <SEP> 2,30 <SEP> 2,55 <SEP> -0,06 <SEP> -0,09
<tb> <SEP> (n=7) <SEP> (n=5) <SEP> (n=3) <SEP> (n=6)
<tb> PI4 <SEP> Monophosphate <SEP> (PI-P) <SEP> 2,42 <SEP> 2,33 <SEP> -0,12 <SEP> -0,06
<tb> <SEP> (n=7) <SEP> (n=5) <SEP> (n=3) <SEP> (n=6)
<tb> PI <SEP> 4-5 <SEP> Biphosphate <SEP> (PI-PP) <SEP> 2,29 <SEP> 2,60 <SEP> 0,11 <SEP> -0,05
<tb> <SEP> (n=7) <SEP> (n=5) <SEP> (n=3) <SEP> (n=6)
<tb> * Les résultats sont exprimés en utilisant le rapport ODMS
ODC dans lequel ODMS = densité optique moyenne de sérums de patients MS et ODC = densité optique moyenne de sérums HD.
<tb> <SEP> r* <SEP> r* <SEP> r* <SEP> r*
<tb> PI <SEP> avec <SEP> acides <SEP> arachidoni- <SEP> 2,03 <SEP> 2,08 <SEP> -0,09 <SEP> -0,12
<tb> que <SEP> et <SEP> stéarique <SEP> (PI <SEP> 2) <SEP> (n=5) <SEP> (n=4) <SEP> (N=5) <SEP> (n=4)
<tb> PI <SEP> avec <SEP> acides <SEP> linoléique <SEP> 2,01 <SEP> 2,02 <SEP> -0,10 <SEP> 0,09
<tb> et <SEP> palmitique <SEP> (PI <SEP> 1) <SEP> (n=5) <SEP> (n=5) <SEP> (n=5) <SEP> (n=4)
<tb> PI2 <SEP> 2,30 <SEP> 2,55 <SEP> -0,06 <SEP> -0,09
<tb> <SEP> (n=7) <SEP> (n=5) <SEP> (n=3) <SEP> (n=6)
<tb> PI4 <SEP> Monophosphate <SEP> (PI-P) <SEP> 2,42 <SEP> 2,33 <SEP> -0,12 <SEP> -0,06
<tb> <SEP> (n=7) <SEP> (n=5) <SEP> (n=3) <SEP> (n=6)
<tb> PI <SEP> 4-5 <SEP> Biphosphate <SEP> (PI-PP) <SEP> 2,29 <SEP> 2,60 <SEP> 0,11 <SEP> -0,05
<tb> <SEP> (n=7) <SEP> (n=5) <SEP> (n=3) <SEP> (n=6)
<tb> * Les résultats sont exprimés en utilisant le rapport ODMS
ODC dans lequel ODMS = densité optique moyenne de sérums de patients MS et ODC = densité optique moyenne de sérums HD.
RRMS-AR : SEP en poussée, RPMS : SEP progressive en poussée,
CPMS : SEP progressive et RRMS-R : SEP en rémission.
CPMS : SEP progressive et RRMS-R : SEP en rémission.
MS = SEP et C = contrôle
Dans une autre série d'expériences (test directs), on a étudié la liaison des sérums de 21 patients avec une
SEP active et 8 HD sur PI non phosphorylé, PI -4 monophosphate et PI -4,5 biphosphate.
Dans une autre série d'expériences (test directs), on a étudié la liaison des sérums de 21 patients avec une
SEP active et 8 HD sur PI non phosphorylé, PI -4 monophosphate et PI -4,5 biphosphate.
On ne relève aucune différence significative entre les réponses auto-immunes (voir tableau 1), ce qui montre que le site anticorps des anticorps anti-PI présents dans les sérums de patients atteints de SEP reconnaissent un épitope commun partagé par tous les phosphoinositides, c'est-à-dire le résidu inositol (Ins).
La spécificité PI - anticorps a été en outre testée dans des expériences d'inhibition hapténique (tests de compétition).
Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau 2 et la figure 4.
Tableau 2
<tb> <SEP> CPMS <SEP> CPMS <SEP> adl <SEP> Témoins
<tb> <SEP> RRMS-AR <SEP> (n=9) <SEP> (n=9) <SEP> (n=9)
<tb> <SEP> (n=9) <SEP> sans <SEP> après
<tb> <SEP> délipidation <SEP> délipidation
<tb> PI2 <SEP> 7X10-8M <SEP> 9X10-8M <SEP> 3X10-9M <SEP> > 10-5M
<tb> mIns <SEP> 2X10-8M <SEP> 4X10-8M <SEP> 2X10-9M <SEP> > 10-5M
<tb> PIP <SEP> 2X10-8M <SEP> 2X10-7M <SEP> 6X10-7M <SEP> > 10-5M
<tb> PIPP <SEP> 4X10-7M <SEP> 8X10-7M <SEP> 2X10-8M <SEP> > 10-5M <SEP>
<tb> G.G <SEP> > 10-5M <SEP> > 10-5M <SEP> > 10-5M <SEP> > 10-5M <SEP>
<tb>
Dans les sérums non délipidés de patients atteints de SEP progressive, malgré de faibles titres en anticorps, l'affinité relative des anticorps contre le PI et l'inositol est semblable à celle trouvée chez les patients en poussée de SEP.
<tb> <SEP> RRMS-AR <SEP> (n=9) <SEP> (n=9) <SEP> (n=9)
<tb> <SEP> (n=9) <SEP> sans <SEP> après
<tb> <SEP> délipidation <SEP> délipidation
<tb> PI2 <SEP> 7X10-8M <SEP> 9X10-8M <SEP> 3X10-9M <SEP> > 10-5M
<tb> mIns <SEP> 2X10-8M <SEP> 4X10-8M <SEP> 2X10-9M <SEP> > 10-5M
<tb> PIP <SEP> 2X10-8M <SEP> 2X10-7M <SEP> 6X10-7M <SEP> > 10-5M
<tb> PIPP <SEP> 4X10-7M <SEP> 8X10-7M <SEP> 2X10-8M <SEP> > 10-5M <SEP>
<tb> G.G <SEP> > 10-5M <SEP> > 10-5M <SEP> > 10-5M <SEP> > 10-5M <SEP>
<tb>
Dans les sérums non délipidés de patients atteints de SEP progressive, malgré de faibles titres en anticorps, l'affinité relative des anticorps contre le PI et l'inositol est semblable à celle trouvée chez les patients en poussée de SEP.
On constate également une affinité pour les gangliosides mais à un moindre degré, ce qui montre que les anticorps anti-PI donnent lieu partiellement à une tres faible réaction croisée entre le résidu inositol et les gangliosides.
Ces deux séries d'expériences mettent en évidence que l'élément immunodominant du déterminant antigênique PI est le résidu inositol.
La chromatographie G-200 de chaque fraction Ig provenant de 10 sérums a été testée sur des puits de plaques recouverts du PI. On n'a trouvé de liaison immunologique que dans les fractions d'immunoglobulines de classe G révélées par des anti-immunoglobulines G humaines marquées à la peroxydase.
Applications des anticorps anti-PI trouvés dans les fluides biologiques de malades atteints de SEP.
Après purification, ces anticorps sont utilisables comme agents pharmacologiques par leur reconnaissance des phosphoinositides intracellulaires. Leur application à l'intérieur de la cellule a permis un blocage de la transduction adrénergique.
A partir de ces anticorps purifiés, il est possible de développer des anti-anticorps qui présentent eux-mêmes des effets pharmacologiques ayant capacité à mimer le résidu inositol des phosphoinositides.
Ils sont également utilisables à la détection des anti-PI sériques.
Les anti-PI circulants et les récepteurs aux immunoglobulines anti-PI placés sur les lymphocytes peuvent etre également bloqués par ces anti-anticorps.
Ceci permet de visualiser les populations lymphocytaires porteuses des récepteurs anti-Pi.
Les complexes immuns, par leur isolement des fluides biologiques des malades atteints de SEP progressive, permettent une purification et un isolement de la protéine sur laquelle est accroché le PI.
Ils permettent également l'élaboration d'anticorps contre l'ensemble du complexe Ces mêmes anticorps pourront être utilisés comme moyens de diagnostic des complexes circulants.
Claims (14)
1. Méthode de diagnostic de la sclérose en plaques ou d'autres affections démyélinisantes, caractérisée en ce qu'elle met en jeu un déterminant antigénique comprenant le groupe inositol.
2. Méthode de diagnostic selon la revendication 1, caractérisée en ce que le déterminant antigénique comporte un enchaînement phosphate-inositol.
3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le déterminant antigénique comporte un enchaînement glycéryl-phosphate-inositol.
4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le déterminant antigénique est le phosphatidylinositol.
5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'on met en contact un prélèvement de fluide biologique d'un patient avec un déterminant antigénique tel que défini dans l'une des revendications 1 à 4 dans des conditions autorisant la formation d'un complexe antigène-anticorps et qu'on révèle le complexe selon les méthodes habituelles.
6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'étape de mise en contact est réalisée par incubation en milieu tampon.
7. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que le fluide biologique est du sang ou un constituant du sang, en particulier le sérum.
8. Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce que le fluide biologique est du liquide céphalorachidien.
9 . Trousse pour le diagnostic in vitre de sclérose en plaques ou autres affections démyélinisantes, caractérisée en ce qu'elle comprend
- un déterminant antigénique tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 4,
- les solvants, tampons et agents nécessaires pour réaliser les étapes d'incubation et/ou de révélation du complexe immunologique.
10. Complexe immunologique formé par un déterminant antigénique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et des anticorps dirigés spécifiquement contre ce complexe.
11. Les anticorps dirigés contre le complexe de la revendication 10.
12. Anticorps capables de reconnaître de manière spécifique un déterminant antigénique renfermant un groupe inositol tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 4, en établissant une liaison du type antigène - anticorps.
13. Anticorps selon la revendication 12, caractérisé en outre en ce qu'ils appartiennent à la classe des IgG.
14. Anticorps anti-idiotypes dirigés contre les anticorps de l'une des revendications Il à 13.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9012578A FR2667945A1 (fr) | 1990-10-11 | 1990-10-11 | Moyens et methodes pour le diagnostic in vitro de la sclerose en plaques et autres neuropathies demyelinisantes. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9012578A FR2667945A1 (fr) | 1990-10-11 | 1990-10-11 | Moyens et methodes pour le diagnostic in vitro de la sclerose en plaques et autres neuropathies demyelinisantes. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2667945A1 true FR2667945A1 (fr) | 1992-04-17 |
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ID=9401145
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9012578A Withdrawn FR2667945A1 (fr) | 1990-10-11 | 1990-10-11 | Moyens et methodes pour le diagnostic in vitro de la sclerose en plaques et autres neuropathies demyelinisantes. |
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| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2667945A1 (fr) |
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Citations (1)
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1990
- 1990-10-11 FR FR9012578A patent/FR2667945A1/fr not_active Withdrawn
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