NO170031B - Monoklonalt antistoff, murin-avledet hybridomcellelinje, samt anvendelse av antistoffet for isolering eller kvantitativ paavisning av human flerpotent granulocyttkolonistimulerende faktor (hpg-csf) - Google Patents
Monoklonalt antistoff, murin-avledet hybridomcellelinje, samt anvendelse av antistoffet for isolering eller kvantitativ paavisning av human flerpotent granulocyttkolonistimulerende faktor (hpg-csf) Download PDFInfo
- Publication number
- NO170031B NO170031B NO873334A NO873334A NO170031B NO 170031 B NO170031 B NO 170031B NO 873334 A NO873334 A NO 873334A NO 873334 A NO873334 A NO 873334A NO 170031 B NO170031 B NO 170031B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- csf
- hpg
- monoclonal antibody
- antibody
- cell line
- Prior art date
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 title claims description 9
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 title claims description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title abstract description 11
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 title description 4
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 title description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 48
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 29
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims abstract description 12
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 9
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 claims description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 4
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 31
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract description 9
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 34
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 17
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 14
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 13
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 5
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 4
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 3
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 3
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 3
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 208000010570 urinary bladder carcinoma Diseases 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 2-(diethylamino)ethyl 4-aminobenzoate;(2s,5r,6r)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;hydrate Chemical group O.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241001315286 Damon Species 0.000 description 1
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101001033279 Homo sapiens Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000000078 claw Anatomy 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000002281 colonystimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002327 eosinophilic effect Effects 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000044890 human EPO Human genes 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000003643 myeloid progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000007738 vacuum evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/243—Colony Stimulating Factors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Bakgrunn for oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse vedrører generelt materi-aler og fremgangsmåter for anvendelse i immunologiske fremgangsmåter for isolering og kvantitativ påvisning av hematopoietiske vekstfaktorer fra biologiske væsker. Spesielt ved-rører oppfinnelsen monoklonale antistoffer fremstilt ved hjelp av nye hybridomcellelinjer (som f.eks.
ATCC HB-8957, ATCC HB-8958, ATCC HB-8959, ATCC HB-8960, ATCC HB-8961 og ATCC HB-8962) som er spesifikt reak-
tive med hematopoietiske vekstfaktorer, og anvendelser av disse antistoffene ved isolering av hematopoietiske vekstfaktorer gjennom teknikker med affinitetsrensing, ved prøver for påvisning av hematopoietiske vekstfaktorer og i immunologiske teknikker for undersøkelse av slike vekstfaktorer. Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen monoklonale antistoffer som reagerer spesifikt med human flerpotent granulocyttkolonistimulerende faktor (hpG-CSF) fra naturlige og rekombinante kilder.
Det humane bloddannende (hematopoietiske) system sørger for erstatning av mange forskjellige hvite blodlegemer (inkludert neutrofiler, makrofager og basofiler/mastceller), røde blodlegemer (erythrocytter) og klump-dannende celler (megakaryocytter/blodplater). Det hematopoietiske system hos et gjennomsnittlig menneske av hannkjønn er blitt beregnet å produsere i størrelsesorden 4,5 x IO"<1>""'" granulocytter og
erythrocytter hvert år, noe som er ekvivalent med en årlig erstatning av hele kroppsvekten. Dexter, et al., BioEssays, 2, 154-158 (1985).
Det antas at små mengder av visse hematopoietiske vekstfaktorer er ansvarlige for differensieringen av et lite tall forløper-"stamceller" til de forskjellige blodcelle-linjer, for den voldsomme formering av disse cellelinjer,
og for den endelige differensiering av fullt utviklede blod-celler fra disse cellelinjene. Ettersom de hematopoietiske vekstfaktorer er til stede i svært små mengder, har påvis-ningen og identifiseringen av disse faktorene vært basert på en rekke prøver som hittil bare har skjelnet mellom de forskjellige faktorer på grunnlag av de stimulerende virkninger
på dyrkede celler under kunstige betingelser. Som et resultat av dette, er det laget et stort antall navn for å betegne et mye mindre antall faktorer. Som et eksempel på den resulterende forvirring, er uttrykkene IL-3, BPA, multi-CSF, HCGF, MCGF og PSF alle akronymer som nå antas å gjelde for en eneste murin hematopoietisk vekstfaktor. Metcalf, Science, 229, 16-22 (1985).
Anvendelsen av teknikker med rekombinant genetikk har brakt en viss orden i dette virvar. F.eks. er amino-syre- og DNA-sekvensene for humant erythropoietin, som stimulerer fremstillingen av erythrocytter, oppnådd. (Se Lin, PCT patentsøknad nr. 85/02610, publisert 20. juni 1985). Rekombinante metoder er også blitt anvendt til isolering av cDNA for en human granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) og human makrofag-spesifikk kolonistimulerende faktor (CSF-1). [se Lee, et al., Proe. Nati. Acad.
Sei. (USA), 8_2, 4360-4364 (1985); Wong, et al., Science, 228, 810-814 (1985) og Kowasaki, et al., Science, 230, 291-296 (1985).
En human hematopoietisk vekstfaktor kalt human flerpotent kolonistimulerende faktor (hpCSF) eller pluri-poietin, er blitt påvist å være til stede i dyrkningsmediet til en human urinblære-carcinomcellelinje betegnet 5637 og deponert under restriktive betingelser ved American Type Culture Collection, Rockville, Maryland som ATCC depon-eringsnr. HTB-9. hpCSF renset fra denne cellelinje, er blitt rapportert å stimulere formering og differensiering av flerpotente stamceller som fører til produksjonen av alle hovedblodcelletypene i prøver hvor det anvendes humane benmargstamceller. Welte, et al., Proe. Nati. Acad. Sei.
(USA), 82, 1526-1530 (1985).
Foreløpige undersøkelser indikerer at faktoren som er identifisert som hpCSF, i overveiende grad har granulocyttkolonistimulerende aktivitet i løpet av de første 7 dagene i en human CFU-GM-prøve.
En annen faktor betegnet human CSF-|3, er også blitt isolert fra human urinblærecarcinomcellelinje 5637 og er
125
blitt beskrevet som en konkurrent til munn I-merket
granulocyttkolonistimulerende faktor (G-CSF) for binding til WEHI-3B D+-celler i et doseresponsforhold som er identisk med forholdet til umerket murin G-CSF [Nicola, et al., Nature, 314, 625-628 (1985)]. Dette doseresponsforhold var tidligere blitt rapportert å være unikt for umerket murin G-CSF og ikke å finnes hos slike faktorer som M-CSF, GM-CSF, 11-3 [Nicola, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), J31, 3765-3769 (1984)]. Se også Metcalf, et al., Leukemia Research, bind 9, nr. 5, s. 521-527 (1985). CSF-(3 og G-CSF er også unike blant CSF-er ved at de deler en høy grad av evne til å indusere differensiering av WEHI-3B D<+->celler. Nicola, et al., Immunology Today, _5, 76-80 (1984). Ved høye konsentrasjoner stimulerer G-CSF blandede granulocytt-makrofag-kolonidannende celler [Nicola, et al., (1984) supra], noe som er i overensstemmelse med foreløpige resultater som indikerer fremkomsten av granulocyttiske, monocyttiske, blandede granulocyttiske/monocyttiske og eosinofile kolonier (CFU-GEMM) etter inkubering av humane benmargkulturer med hpCSF i 14 dager. Det er også blitt beskrevet at CSF-(3 stimulerer dannelse av neutrofile granulocyttiske kolonier i prøver hvor det anvendes benmargceller fra mus, en egenskap som har vært et kriterium for identifisering av en faktor som en G-CSF. På grunnlag av disse likheter er human CSF-|3 identifisert med G-CSF (granulocyttisk kolonistimulerende faktor). Se Nicola, et al., Nature, 314, 625-628 (1985).
Basert på de felles egenskaper synes det som om human CSF-(3 til Nicola et al., supra, og hpCSF til Welte et al., supra, er den samme faktor som passende kan henvises til som en human flerpotent granulocyttkolonistimulerende faktor (hpg-CSF).
I søkerens norske patentsøknad nr. 871679 er det beskrevet nye rekombinant-produserte polypeptider som har deler av eller hele den primære strukturkonformasjon og en eller flere av de biologiske egenskaper til human flerpotent granulocyttkolonistimulerende faktor. Det er også beskrevet DNA-sekvenser som koder for slike polypeptider, transformerte vertceller som koder for slike polypeptider og fremgangsmåter for syntesen av slike faktorer ved hjelp av rekombinante metoder.
Av interesse for bakgrunnen for oppfinnelsen er aktuell forskning fokusert på hybridomteknikker for fremstilling av tumorcellelinjer som vil produsere svært spesifikke monoklonale antistoffer mot et utvalgt antigent stoff. Teknikker for produksjonen av monoklonale antistoffer er generelt godt kjent innen teknikken. Typiske beskrivelser av disse fremgangsmåter kan finnes i Wands, J.R. og Zurawski, V.R., Gastroenterology 80:225 (1981); Marshak-Rothstein,
et al., J. Immunol. 122:2491 (1979); Oi, V.T. og L.A. Herzen-berg, "Immunoglobulin Producing Hybrid", Mishell, B.B. og S.M. Shiigi (red.), Selected Methods in Cellular Immunology, San Francisco, W.H. Freeman Publishing, 1979 og Goding, "Antibody Production by Hybridomas", J. of Immunol. Meth.
39, 285-308 (1980). Oppsummert i korte trekk så induseres lymfocytter fjernet fra milten hos et dyr som på forhånd er indusert med det aktuelle antigen, for å smelte sammen med myelomceller i nærvær av polyethylenglycol. Tusenvis av "hybrid"-myelomceller produseres ved sammensmeltingen. Supernatanten fra dyrking av hver "hybridom"-cellekultur testes for nærvær av den ønskede antistoffaktivitet. Etter at slik aktivitet er funnet i supernatanten fra en celle-kultur, klones den ved begrensende fortynning, og klonene testes hver for seg med hensyn på supernatantaktivitet.
På grunn av den svært spesifikke natur til disse immunologiske egenskaper har monoklonale antistoffer utviklet i henhold til hybridomteknikker, blitt foreslått for anvendelse som diagnostiske reagenser, terapeutiske midler og midler for affinitetsrensing av spesifikt kryssreaktive antigene proteiner fra urensede kilder. Se f.eks. Trends in Biotechnology, bind 3, nr. 7 (juli, 1985) og U.S. patent-skrifter nr. 4 465 624, 4 514 505 og 4 514 507.
Selv om det foreligger et vesentlig behov for spesifikke monoklonale antistoffer for bruk ved påvisning, isolering, rensing og undersøkelse av hematopoietiske vekstfaktorer, slik som human flerpotent granulocyttkolonistimulerende faktor, foreligger det ingen rapporter vedrørende vellykket bruk av hybridomteknikker når det gjelder å oppnå monoklonale antistoffer mot hpG-CSF.
Kort oppsummering
Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt monoklonalt antistoff for anvendelse in vitro som er kjennetegnet ved at det er dannet av en cellelinje som i sitt dyrkningsmedium er i stand til å danne et monoklonalt antistoff med evne til spesifikt å binde seg til human flerpotent granulocyttkolonistimulerende faktor (hpG-CSF), men ikke til kolonistimulerende faktor underklasse 1 (CSF-1), i en antigen/antistoff -reaksjon, og er av en undertype valgt fra gruppen bestående av IgM, IgG^ IgG2a, IgG2b" og IgG3.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer for første gang hybridomcellelinjer som produserer monoklonale antistoffer som reagerer spesifikt immunologisk med human flerpotent granulocyttkolonistimulerende faktor i en antigen/antistoff-reaksjon. Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebrakt murin-avledet hybridomcellelinje som er kjennetegnet ved at den i sitt dyrknings-medium er i stand til å danne et monoklonalt antistoff med evne til spesifikt å binde seg til human flerpotent granulocyttkolonistimulerende faktor (hpG-CSF), men ikke til kolonistimulerende faktor underklasse 1 (CSF-1), i en antigen/antistoff-reaksjon og hvor det monoklonale antistoff er av en undertype valgt fra gruppen bestående av IgM, IgGx, IgG2a, IgG2b og IgG3. Som en foretrukket utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse nye murin-avledede hybridomcellelinjer, ATCC HB-8957, ATCC HB-8958, ATCC HB-8959, ATCC HB-8960, ATCC HB-8961 og ATCC HB-8962, som hver produserer som en bestanddel i supernatanten fra dyrkingen i kultur, et monoklonalt antistoff som er spesifikt reaktivt med hpG-CSF. Hybridomcellelinjene ATCC HB-8957, ATCC HB-8958, ATCC HB-8959, ATCC HB-8960, ATCC HB-8961 og ATCC HB-8962 ble deponert ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852, 6. desember 1985.
Ved fremstillingen av den murin-avledede hybridomcellelinje ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles en hybrid tumorcellelinje ved å bruke en standard immuno-
"Inununoglobulin Producing Hybrid", supra, og Goding,
"Antibody Production by Hybridomas", J. of Immunol. Meth.
39 (1980), 285-308. Miltceller fra mus som er hyperimmunisert med naturlig hpG-CSF, smeltet sammen med en mus-myelomcellelinje i nærvær av polyethylenglycol. Supernatanten fra dyrkingen av hver "hybridom"-cellekultur testes med hensyn på tilstedeværelsen av den ønskede antistoffaktivitet. En utvalgt hybridomcelle klones for å formere en cellelinje
som produserer et antistoff i dyrkningssupernatanten som har svært spesifikk anti-hpG-CSF-aktivitet.
De monoklonale antistoffer anvendes ifølge oppfinnelsen for isolering av biologisk aktiv hpG-CSF fra en biologisk væske ved immunaffinitetskromatografi. Ved en slik anvendelse vil et utvalgt antistoff være immobilisert (f.eks. på en kolonne), og kildematerialet vil bli brakt i kontakt med det immobiliserte antistoff. hpG-CSF vil binde seg til antistoffet og vil deretter bli eluert fra det immobiliserte antistoff i en høyrenset form. Antistoffene anvendes også ifølge oppfinnelsen for kvantitativ påvisning av hpG-CSF i en biologisk væske ved immunaffinitetskromatografi.
Nærmere beskrivelse
De følgende eksempler illustrerer utøvelse av oppfinnelsen ved fremstillingen av en rekke hybridomcellelinjer, deriblant ATCC HB-8957, ATCC HB-8958, ATCC HB-8959, ATCC HB-8960, ATCC HB-8961 og ATCC HB-8962, isoleringen av antistoffer " mot hpG-CSF og forsterkningen og karakteriseringen av de monoklonale antistoffer.
Nærmere bestemt er eksempel 1 rettet mot stimulering av en murin vert mot produksjon av polyklonale serumanti-stoffer mot hpG-CSF, sammensmelting av miltceller med myelomceller og screeningen, kloningen og dyrkingen av hybridomceller og isolering av monoklonalt antistoff fra disse. Eksempel 2 vedrører karakteriseringen av de monoklonale antistoffene fremstilt på denne måte ved ELISA- og RIA-prøver, og prøver med konkurrerende inhibering og nøy-tralisering, samt forsterkningen av utbytter av monoklonalt antistoff ved hjelp av "ascites"-metoden. Eksempel 3 beskriver fremgangsmåter for isolering og rensing av hpG-CSF gjennom bruken av de monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen. Eksempel 4 beskriver fremgangsmåter for kvantitativ påvisning av hpG-CSF gjennom bruken av prøveteknikker hvor det benyttes antistoffer ifølge oppfinnelsen.
Eksempel 1
A. Fremstilling av polyklonalt serum
BALB/C-mus som hver var injisert med hpG-CSF renset ved hjelp av HPLC, fra human urinblærecarcinomcellelinje nr. 5637 (subklon 1A6) i henhold til fremgangsmåtene ifølge eksempel l(b) i norsk patentsøknad nr. 871679. Materialet ble renset med en C4 HPLC-kolonne inntil en renhet i over-kant av 85% og hadde en konsentrasjon på omtrent 60 ug/ml i en oppløsning som omfattet 50% propanol og 100 mM ammonium-acetat (pH 7). Hver av 10 mus ble først gitt flere subkutane injeksjoner som tilsammen utgjorde omtrent 0,1 ml, av en inokulant (7,2 ug hpG-CSF pr. mus) som omfattet 1,2 ml av hpG-CSF-oppløsningen som var blitt oppkonsentrert til 0,6 ml ved hurtig vakuumavdamping og deretter blandet ved hjelp av behandling med lydbølger med 0,6 ml BACTO-Freund's komplette adjuvans H37 Ra (DIFC0 3113-60). 18 dager senere ble hver av musene gitt flere subkutane forsterkningsinjeksjoner som tilsammen utgjorde omtrent 0,15 ml av en inokulant (7,2 ug hpG-CSF pr. mus) som omfattet 1,2 ml av hpG-CSF-oppløsningen i oppkonsentrert til 0,75 ml og blandet med 0,75 ml av Freund's ukomplette adjuvans (BACT0 0639-60-6 fra DIFCO)•
4 dager senere ble det tatt blodprøver fra musene, og seraene ble undersøkt ved hjelp av RIA med hensyn på produksjon av anti-hpG-CSF-antistoffer. hpG-CSF brukt i serumanalysen, omfattet omtrent 0,5 ml 80% ren hpG-CSF ved en konsentrasjon på omtrent 100 ug/ml i en oppløsning som omfattet 100 mM ammoniumsulfat og 50% propanol som var blitt oppkonsentrert 4 ganger. 250 ul av den ovenfor nevnte oppløsning ble oppkonsentrert til 150 ul og ble blandet med
i 5 ml 50 mM C03~2/HC03_1 buffer (pH 9,2). 50 ul av dette, materiale ble så tilført hver brønn i et 96-brØnners brett og inkubert i 2 timer ved værelsetemperatur og over natten ved 4°C. En blokkeringsforbindelse som omfattet 5% bovint serumalbumin (BSA), ble inkubert i 30 minutter i brønnene.
Testserum fortynnet i forhold på 1:5, 1:25, 1:625 og
1:3125, og kontrollserum (ikke-inokulert) fortynnet til forhold på 1:5 og 1:125, ble tilført brønnene med 50 ul pr. brønn og inkubert i 2 timer ved værelsetemperatur. Brønnene ble deretter skylt tre ganger under anvendelse av "Wash Solution" [(Kirkeguard & Perry Laboratories, (KPL) Gaithersburg, Maryland)]. Kanin-anti-mus-IgG-antistoff merket med <1>25I, ble så tilført slik at det ga omtrent 199.000 tellinger pr. minutt pr. 50 ul brønn, og inkubert i 1,5 timer ved værelsetemperatur. Brønnene ble så skylt fem ganger med "Wash Solution" og radioaktiviteten bestemt med en gammateller. 21 dager etter forsterkningsinjeksjonen ble 5 mus påvist ved hjelp av RIA å produsere anti-hpG-CSF-antistoffer, i den tredje injeksjon. Musene ble immunisert med det samme materiale som under forsterkningsinjeksjonen, men ble gitt omtrent 10 ug hpG-CSF pr. mus.
B. Cellefusjon
Ved fremgangsmåten for hybridomproduksjonen knuses miltene fra de inokulerte mus for å oppslemme lymfocytter som produserer anti-hpG-CSF-antistoff. Disse miltcellene smeltes sammen med celler fra en SP2/0 myelomcellelinje slik at det dannes hybridceller. Cellemembranene fra milt-og myelomcellene smelter sammen og omgir til å begynne med en felles cytoplasma med to eller flere kjerner. Flere dager etter fusjon av cellemembranene smelter kjernene sammen og blir i stand til å gi synkron mitose. Etter hvert som disse sammensmeltede celler deler seg, går et variabelt antall kromosomer fra begge de sammensmeltede partnere tapt inntil hybridcellelinjene stabiliserer seg. Et medium av hypoxanthin-aminopterin-thymidin (HAT) forhindrer SP2/0:SP2/0-hybrider produsert under hybridiseringsfrem-gangsmåten eller ikke sammensmeltede SP2/0-celler fra å vokse, mens milt:milt-cellehybrider eller ikke sammensmeltede miltceller vanligvis vil dø etter to uker i kultur. Således vil bare SP2/0:milt-hybridcellene overleve i kulturene. 3 dager etter den andre forsterkningsinokulasjon ble musene ofret ved hjelp av cervical dislokasjon og dyppet ned i 70% ethanol. Milter fra musene ble fjernet aseptisk og plassert i en steril petriskål på is som inneholdt DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, katalog nr. 320-1885, parti 18K3252 fra GIBCO) supplert med penicillin G-streptomycin-oppløsning (en "lX"-oppløsning), heretter betegnet "lXPS"-oppløsning (katalog nr. 9366 fra Irvine Scientific) omfattende 100 enheter penicillin G og 100 ug streptomycin pr. ml. Fettvev som satt fast på miltene, ble fjernet, og miltene ble vasket to ganger med DMEM som inneholdt 2XPS (200 enheter penicillin G og 200 ug streptomycin pr. ml) og plassert i en steril "stomacher"-pose på is. Til posen ble det tilsatt oppløsning omfattende DMEM - 2 XPS. Miltene ble revet opp i et "stomacher"-apparat og deretter filtrert gjennom fire lag med steril gass og inn i 50 ml sentrifuge-rør. Posen og filtrene ble vasket med opptil 40 ml oppløs-ning omfattende DMEM - 2XPS-oppløsning. Cellene ble deretter sentrifugert i 10 minutter ved 1000 rpm i en IEC NH-SII sentrifuge (Damon/IEC-avdeling), og supernatanten ble forsiktig sugd bort. Cellene ble deretter vasket to ganger med en oppløsning som omfattet DMEM - 2XPS og en gang med DMEM uten noen tilsetningsstoffer. Cellene ble så resuspendert i DMEM.
Myelomceller (Sp2/0) ble dyrket i HBlOl-medium som inneholdt 1XPS og 1% kalvefosterserum (FBS) (Irvine Scientific katalog nr. 3000, parti nr. 209 608, varme-inaktivert) og fikk formere seg i log-vekstfase i 3 dager. SP2/0-cellene ble innhøstet ved pelletering i en IEC NH-SII sentrifuge ved 1000 rpm i 10 minutter. Cellene ble vasket i DMEM-oppløsning og deretter oppslemmet i DMEM-oppløsning.
Miltcellene ble deretter slått sammen med myelomcellene i et 50 ml sentrifugerør ved et forhold på 4:1 og sentrifugert i 10 minutter ved 1000 rpm, og supernatanten ble sugd bort. Pelleten ble så plassert i et 37°C vannbad under en avtrekkshette. Polyethylenglycol (molekylvekt 1500, M.A. Bioproducts, katalog nr. 17-780Z, parti nr. 4J030) ble smeltet og deretter blandet i et volumforhold på 1:1 med DMEM-oppløsning for å lage en 50% oppløsning. PEG-oppløsningen ble så tilsatt til cellene i henhold til følg-ende fremgangsmåte. I løpet av det første minutt ble 1,0 ml av 50% PEG-oppløsningen tilsatt. I løpet av det andre minutt ble oppløsningen omrørt forsiktig ved anvendelse av en pipette som ble omrørt konstant med en sirkelbevegelse, men som man unngikk å berøre sidene eller bunnen i rørene med. I løpet av det tredje minutt ble 1,0 ml oppløsning omfattende DMEM, 10% FCS og 1XPS tilsatt. I løpet av det fjerde minutt ble 1,0 ml av den samme oppløsning på nytt tilsatt. I løpet av det femte og sjette minutt ble 8,0 ml av den samme oppløsning på nytt tilsatt. Blandingen ble deretter sentrifugert ved 1000 rpm i 10 minutter på IEC NH-SII-sentrifugen. Supernatanten i sentrifugerøret ble sugd bort, og cellene ble forsiktig resuspendert i 100 til 150 ml medium omfattende DMEM med 10% FBS og 1XPS. Cellesuspen-sjonen ble så platet ut ved en hastighet av 0,1 ml suspensjon pr. brønn i omtrent 800 brønner på åtte og en halv 96-brønners plater som var blitt forekvilibrert i en C02~ inkubator. Platene ble så returnert til en C02~inkubator med et omtrentlig 7% C02~innhold ved 37°C.
En dag senere ble 100 ul HAT-medium i DMEM og 10% FBS tilsatt til hver brønn. På den andre dag ble 100 ul brukt medium sugd bort fra hver brønn og erstattet med 100 pl friskt HAT-medium i DMEM med 10% FBS. Denne fremgangsmåte ble gjentatt på dag 2, dag 4, dag 7 og dag 11. På dag 14 ble 100 ul brukt medium fjernet fra hver brønn og erstattet med 100 ul HT-medium omfattende 1,36 mg/dl hypoxanthin og 0,76 mg/dl thymidin. Fremgangsmåten ble gjentatt på dag 18, dag 22 og dag 26. På dag 28 ble kulturene forsynt med et komplett medium omfattende DMEM med 10% FBS. Kulturene ble deretter på nytt forsynt to ganger i uken med dette komplette medium. På dag 17 ble brønnene undersøkt med hensyn på produksjon av immunglobulin under anvendelse av anti-mus-IgG-antistoffer. RIA- og ELISA-prøver viste at omtrent
260 av 800 brønner var signifikant positive med hensyn til mus-IgG.
Eksempel 2
A. Innledende karakterisering av monoklonale antistoffer
En ELISA-prøve ble utført for påvisning av de kloner som dannet anti-hpG-CSF-antistoffer. Brønner i 9 6-brønners brett ble belagt ved tilføring av omtrent 50 ul opp-løsning inneholdende 100' ng 90% ren hpG-CSF som var fortynnet i 50 mM C03 /HC03 -bufferoppløsning (pH 9,2) ved værelsetemperatur i 2 timer og deretter tilsatt til hver brønn i brettene, og ble inkubert over natten ved 4°C. Brønnene ble så behandlet med en 5%-ig BSA blokkeringsoppløsning som ble inkubert i 30 minutter.
Supernatant fra hybridomkulturene ble fortynnet i PBS-oppløsning (pH 7,0) inneholdende 1% BSA og ble så inkubert mot de belagte brønnene i 2 timer ved værelsetemperatur. Brønnene ble så vasket tre ganger med "Wash Solution" og ble behandlet med pepperrotperoxydasemerket anti-mus-IgG-antistoff (BMB nr. 605-250) ved en 1:300 fortynning i 1,5 timer. Brønnene ble så vasket fem ganger med "Wash Solution", og peroxydasesubstrat ABTS (KPL) ble tilsatt ved en hastighet på 50 ul pr. brønn. Brønnene ble deretter avlest med hensyn på optisk densitet ved 414 nm ved hjelp av et Titertek Multiscan (Flow Labs, McLean, VA) spektrofotometer. 23 av brønnene (nr. 3, 4, 5, 20, 21, 28, 35, 37, 39, 40, 58, 61, 63, 64, 66, 68, 72, 74, 75, 98, 151, 182 og 231) ble funnet signifikant å reagere med den reduserte hpG-CSF.
Formell kloning av hybridomceller erholdt fra de positive brønnene, ble utført ved fortynning av cellene i ytterligere brønner ved et slikt forhold at det var omtrent 1 celle pr. 3 brønner. Generelt ga formell kloning fra en aktiv brønn formelle kloner som syntes å være subkloner av den samme hybridomcelle, men i flere tilfeller avslørte forskjellige klonpopulasjoner som oppviste forskjellige antistoff-subtyper og reaksjonsegenskaper. Subkloner fra den samme brønn ble merket med en bokstav (f.eks. ble kloner erholdt fra brønn 4, merket 4A, 4B, etc.).
En ELISA-prøve ble utført for å bestemme reaktivitet av de monoklonale antistoffene mot naturlig hpG-CSF, samt redusert naturlig hpG-CSF. Supernatant erholdt fra brønner som var funnet å gi antistoffer som var reaktive med hpG-CSF, ble testet mot både naturlig hpG-CSF og naturlig hpG-CSF som var blitt denaturert med SDS/mercaptoethanol. Antistoffer fra klonene reagerte mot begge stoffer med omtrent
lik spesifisitet, noe som tyder på at antistoffene kan være spesifikt reaktive med antigene epitoper hovedsakelig bestemt ved hjelp av kontinuerlige sekvenser av aminosyrer (primærstrukturen) hos proteinet.
B. Reaktivitet av monoklonale antistoffer mot pattedyr-
og rekombinant hpG-CSF
I dette eksemplet ble det utført fastfase-RIA-
og ELISA-prøver for å måle reaktivitet til hybridom-
supernatant erholdt fra de aktive brønner, på pattedyr-
hpG-CSF samt rekombinant E. coli-produsert hpG-CSF. Bortsett fra i ett tilfelle reagerte monoklonalt antistoffmateriale som reagerte med pattedyrprodusert (naturlig) hpG-CSF, like godt med rekombinantprodusert hpG-CSF. Det tilfellet om-
fattet subklonene 35B, 35D og 351 som produserte antistoffer som var signifikant mindre reaktive med det rekombinante materiale enn med det pattedyravledede materiale i prøver med direkte binding.
C. Screening med hensyn på antistoff-subtyper
I dette eksemplet ble formelle kloner erholdt fra de
23 brønnene som opprinnelig var funnet å være aktive,
undersøkt ved hjelp av RIA for bestemmelse av antistoff-
subtype. 96-brønners brett ble behandlet med kanin-anti-mus-immunglobulin-antistoffer med forskjellige subtype-spesifisiteter. Anti-mus-immunglobulin-antistoffene omfattet kanin-anti-mus-IgG-, L (MILES Laboratories, Naperville, IL, 64-360-1), kanin-anti-mus-IgG0 (MILES, 64-361-1), kanin-anti-mus-IgG2j;) (MILES, 64-362-1) , kanin-anti-mus-IgG^
(MILES, 64-363-1), kanin-anti-mus-IgM (MILES, 64-365-1) og kanin-anti-mus-IgG (MILES, 65-157-2). Hver brønn ble belagt med 50 ul av anti-mus-immunglobulin-antistoffoppløsningen i
CO^ -2 /HCO-j -(pH 9,6) bufferoppløsning omfattende omtrent
0,5 ug antistoff, og ble inkubert i 2 timer ved værelsetemperatur og over natten ved 4°C. Brønnene ble deretter blokkert ved inkubasjon med 5% BSA-oppløsning i 30 minutter. Hver brønn ble så inkubert med hybridomvevkultursupernatant
i 2 timer ved værelsetemperatur og vasket tre ganger med "Wash Solution". Brønnene som var blitt behandlet med anti-IgG-antistoff, ble deretter inkubert i 1,5 timer med
125
50 ul pr. brønn av I-kanin-anti-mus-IgG-antistoff, mens brønnene som var blitt behandlet med anti-IgM, deretter ble
125
inkubert i 1,5 timer med 50 ul pr. brønn av I-kanm-anti-mus-IgM-antistoff. Brønnene ble så vasket fem ganger med "Wash Solution" og ble tellet i en gamma-teller. Resultatene fra analyser av de opprinnelige 23 klonene indikerer at 2 brønner (nr. 37 og 182) stanset syntese av IgG; 1 brønn ble angitt å være IgG-positiv, men oppviste ingen reaktivitet under tidlig screening mot hpG-CSF (nr. 58); 15 brønner viste seg å være positive for IgG-^ (nr. 4C, 5, 28, 39, 40, 61, 63, 64, 66, 68, 72, 74, 75, 98 og 231). En subklon av en av disse, nr. 5d, ble funnet å være reaktiv både med anti-IgG3~ og anti-IgM-antistoffer. 4 brønner var positive for IgG t0 . a-produksjon (nr. 3, 4A, 21 og 151) og 1 brønn for IgG2k-produksjon (nr. 35) .
D. Nøytralisering av hpG-CSF-aktivitet målt ved hjelp
av H-thymidm-opptak
I dette eksemplet ble monoklonale antistoffer frembrakt mot hpG-CSF, testet med hensyn på evne til å nøytral-isere den biologiske aktivitet av hpG-CSF når det gjelder å stimulere inkorporeringen av <3>H-thymidin i humane benmargceller. For å teste med hensyn på nøytralisering av <3>H-thymidinopptak, ble rekombinant eller naturlig hpG-CSF inkubert med forskjellige konsentrasjoner antistoffer ifølge oppfinnelsen ved 4°C i 12 timer. Oppløsningen ble deretter tilsatt til ikke-festende humane benmargceller med lav densitet og bearbeidet i henhold til fremgangsmåter beskrevet i eksempel 7 i U.S. patentsøknad nr. 768 959. Antistoffer fra
bl.a. kløn nr. 20A, 35B, 39B, 40A, 61D, 63D, 75A og 151K,
ble testet med antistoffer fra klon nr. 75A som var den mest effektive når det gjelder å nøytralisere virkningen av hpG-CSF på <3>H-thymidin-opptak, og hvor alle de ovenfor nevnte antistoffer oppviste forskjellige grader av nøytraliserings-virkning på <3>H-thymidin-opptak, bortsett fra antistoffer produsert av klon nr. 35B.
E. Nøytralisering av hpG-CSF-aktivitet målt ved hjelp av celledifferensieringsinduksjon
I dette eksemplet ble antistoffer frembrakt mot hpG-CSF, testet med hensyn på evne til å nøytralisere hpG-CSF's evne til å indusere differensiering av den murine myelommonocyttiske leukemicellelinje WEHI-3B D<+>. Forskjellige konsentrasjoner av antistoffene produsert ifølge oppfinnelsen (fra kloner nr. 20A, 39B, 40A, 61D, 63D og 75A) ble inkubert med hpG-CSF ved 4°C i 12 timer. Oppløsningene ble deretter.tilsatt til WEHI-3B D<+->celler i en agarsuspen-sjon ifølge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 7 i U.S. patentsøknad nr. 768 959. Antistoffer dannet ved hjelp av kloner nr. 40A, 61D og 75A, oppviste evne til å blokkere differensiering. Ettersom disse monoklonale antistoffer har forskjellig utfellingsdyktighet overfor hpG-CSF, kan det faktum at noen blokkerer den differensieringsinduserende evne hos hpG-CSF, mens andre ikke gjør det, ikke forklares enkelt på grunnlag av affinitetsstyrke. Det er verdt å legge merke til at monoklonalt antistoff dannet av klon 75A, ikke bare inhiberte differensiering av WEHI-3B D<+->cellene, men også inhiberte cellevekst, noe som antyder at den kan kryssreagere med en murin vekstfaktor utskilt av WEHI-3B D<+->celler og kan ha antiproliferative virkninger uavhengig av dens kapasitet til å binde hpG-CSF.
F. Epitop-karakterisering
I dette eksempel ble det utført undersøkelser ved-rørende konkurrerende binding ved å benytte <125>I-merket antistoff fra klonene 75A og 151 K, og immobilisert rekombinant-fremstilt hpG-CSF. I disse undersøkelsene fikk antistoffer fra andre kloner konkurrere mot 75A og 151K radio-aktivt merkede monoklonale antistoffer bundet til rekombinant-fremstilt hpG-CSF. Etter inkubasjon og vasking ifølge fremgangsmåter som er velkjente innen teknikken, ble det utført bestrålingstellinger for å bestemme i hvilken utstrekning enten 75A-produsert antistoff eller 151K-produsert antistoff var blitt fjernet fra hpG-CSF.
Resultater fra disse prøver indikerer at antistoffer produsert av klonene nr. 63D, 75A og 151K, kan ha til felles overlappende deler av en felles antigen epitop på hpG-CSF-proteinet. Resultatene indikerer også at antistoffer produsert av klon nr. 4C, 28A og 35B, synes å være reaktive med en epitop eller epitoper.av hpG-CSF-proteinet som de 75A- og 151K-produserte antistoffer ikke er spesifikt reaktive med. Resultatene antyder også at de hpG-CSF-bindende egenskaper til antistoffer produsert av klonene 40A og 61D, kan la seg skjelne fra egenskapene til antistoffer produsert av klonene 4C, 28A, 35B, 75A og 151K.
G. Egenskaper til antistoffer fra deponerte representative cellelinjer
Representative nye hybridomcellelinjer som er i stand til å produsere monoklonale antistoffer som er representative for de som er tilveiebrakt ved hjelp av foreliggende oppfinnelse, er blitt deponert ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852.
Disse cellelinjene svarer til cellelinjer utviklet under den formelle kloningsfremgangsmåte på følgende måte: klon 4C (ATCC HB-8962), klon 28A (ATCC HB-8957), klon 35B (ATCC HB-8960), klon 63D (ATCC HB-8958), klon 75A (ATCC HB-8959) og klon 151K (ATCC HB-8961). Egenskapene til antistoffer produsert ved hjelp av disse klonene, er oppsummert i tabell 1 nedenunder.
H. Forøkning av antistoffutbytter ved hjelp av "ascites"-metode
For å oppnå et mer konsentrert antistoff enn det som dannes i vevkultur, ble de monoklonale antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse supplert ved hjelp av "ascites"-metoden som er beskrevet generelt i Kenneth, et al.
(red.), Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analysis, s. 403, New York: Plenum Press
(1981). Ifølge denne fremgangsmåte prepareres mus med
0,5 ml "Pristane" (2,6,19,14-tetramethylpentadecan, erholdt fra Aldrich Chemical Co.) injisert i bukhulen ved hjelp av sprøyter av kaliber 25 eller 27. "Pristane"-behandling mulig-gjør vekst av tumorceller i en "ascitisk" form i bukhulen. Etter omtrent 1-2 uker ble omtrent 10 g hybridomceller injisert i bukhulene til musene i serumfritt Dulbecco's modifiserte Eagles medium (DMEM) (Irvine Scientific Co.) eller HB101 (Hanna Biologicals, Berkeley, Cal.). Settet med injeksjoner utføres på mus for hver av klonene.
Omtrent 1-3 uker etter injeksjonen av hybridom-cellene ble det erholdt ascites-væske fra bukhulene til musene ved å lage små kutt i huden og pipettere ut væsken. Ascites-væske ble klaret ved sentrifugering og deretter ned-fryst. Ascites-væske-antistoffer kan renses ytterligere fra ascites-væske-albumin ved utfelling med 45% ammoniumsulfat og protein A-Sepharose<®->kromatografering.
Eksempel 3
Isolering og rensing av hematopoietiske vekstfaktorer
Gjennom tilveiebringelsen av svært spesifikke og høyreaktive anti-hpG-CSF monoklonale antistoffer muliggjør foreliggende oppfinnelse for første gang isolering av hpG-CSF og hematopoietiske vekstfaktorer fra fermenterings-kulturer samt fra naturlige pattedyrkilder ved fremgangsmåter ved affinitetsrensing som er velkjente innen teknikken.
I korte trekk vil foretrukne isoleringsfremgangsmåter omfatte immobilisering av et antistoff ifølge oppfinnelsen på en fast bærer (f.eks. en kromatografisk kolonne), opprettelse av kontakt mellom hpG-CSF eller væsken som inneholder hematopoietisk faktor med det immobiliserte antistoff og deretter eluering av renset hpG-CSF eller hematopoietisk vekstfaktor fra immunkompleksforbindelse med antistoffet. Ved å regulere det bestemte antistoff som brukes, kan rense-teknikken muliggjøre isolering av naturlig hpG-CSF i dens korrekt foldede konformasjon fra ukorrekt foldet eller denaturert hpG-CSF. Analoger av hpG-CSF vil kunne isoleres og undersøkes, likeså vel som spesifikt antigene epitoper av hematopoietiske vekstfaktormolekyler.
Eksempel 4
Kvantitativ påvisning av hematopoietiske vekstfaktorer
Gjennom tilveiebringelsen av høyspesifikke anti-hpG-CSF monoklonale antistoffer muliggjør foreliggende oppfinnelse også nye prøver i fast eller flytende fase for kvantitativ påvisning av hpG-CSF og hematopoietiske vekstfaktorer i en væskeprøve hvor det anvendes mer enn ett antistoff. Prøver i fast fase ville typisk omfatte trinnene: (1) å bringe væsken i kontakt med et første iramo-bilisert antistoff som reagerer med en første antigendeter-minant i hpG-CSF i væsken slik at det dannes et immunologisk kompleks av hpG-CSF og det første antistoff; (2) å bringe det dannede kompleks i trinn (1) i kontakt med et andre antistoff som reagerer med en antigen determinant i hpG-CSF som er forskjellig fra den første antigene determinant, hvorved det dannes et immunologisk kompleks av hpG-CSF og det andre antistoff; og (3) kvantifisering av mengden av det andre antistoff bundet til det immunologiske kompleks dannet i trinn (2) .
Kompetitive prøver i flytende fase vil omfatte merk-ing av hpG-CSF og utfelling av denne med ett eller flere antistoffer ifølge oppfinnelsen. Kvantifisering av umerket hpG-CSF eller beslektede faktorer vil deretter kunne utføres ved en kompetitiv bindingsdannelse. Slike prøvefremgangs-måter vil fortrinnsvis omfatte to av de ovenfor beskrevne monoklonale antistoffer, men kan også utvikles under anvendelse av et av de monoklonale antistoffer og et polyklonalt serumavledet antistoff mot hpG-CSF.
5
Claims (8)
1. Monoklonalt antistoff for anvendelse in vitro, karakterisert ved at det er dannet av en cellelinje som i sitt dyrkningsmedium er i stand til å danne et monoklonalt antistoff med evne til spesifikt å binde seg til human flerpotent granulocyttkolonistimulerende faktor (hpG-CSF), men ikke til kolonistimulerende faktor underklasse 1 (CSF-1), i en antigen/antistoff-reaksjon, og er av en undertype valgt fra gruppen bestående av IgM, IgG17 IgG2a, IgG2b og IgG3.
2. Monoklonalt antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at cellelinjen er valgt fra gruppen bestående av ATCC HB-8957, HB-8958, HB-8959, HB-8960, HB-8961 og HB-8962.
3. Monoklonalt antistoff ifølge krav 2, karakterisert ved at det er i stand til å nøytralisere hpG-CSF's evne til å indusere differensiering av WEHI 3B D<+->celler i kultur, og hvor cellelinjen som anvendes er ATCC HB-8959 eller HB-8961.
4. Monoklonalt antistoff ifølge krav 2, karakterisert ved at det er i stand til å nøytralisere hpG-CSF's evne til å stimulere benmargcellers opptak av thymidin, og hvor cellelinjen som anvendes er ATCC HB-8959.
5. Murin-avledet hybridomcellelinje, karakterisert ved at den i sitt dyrknings-medium er i stand til å danne et monoklonalt antistoff med evne til spesifikt å binde seg til human flerpotent granulo
cyttkolonistimulerende faktor (hpG-CSF), men ikke til kolonistimulerende faktor underklasse 1 (CSF-1), i en antigen/anti-stof f -reaksjon og hvor det monoklonale antistoff er av en undertype valgt fra gruppen bestående av IgM, IgG^ IgG2a, IgG2b og IgG3.
6. Murin-avledet hybridomcellelinje ifølge krav 5, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen av cellelinjer bestående av ATCC HB-8957, HB-8958, HB-8959, HB-8960, HB-8961 og HB-8962.
7. Anvendelse av et monoklonalt antistoff ifølge kravene 1-4 for isolering av biologisk aktiv hpG-CSF fra en biologisk væske ved immunaffinitetskromatografi.
8. Anvendelse av et monoklonalt antistoff ifølge kravene 1-4 for kvantitativ påvisning av hpG-CSF i en biologisk væske ved immunaffinitetskromatografi.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US80675585A | 1985-12-09 | 1985-12-09 | |
| PCT/US1986/002554 WO1987003689A1 (en) | 1985-12-09 | 1986-11-26 | Hybridoma's to human pluripotent granulocyte colony stimulating factor |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO873334D0 NO873334D0 (no) | 1987-08-10 |
| NO873334L NO873334L (no) | 1987-08-10 |
| NO170031B true NO170031B (no) | 1992-05-25 |
| NO170031C NO170031C (no) | 1992-09-02 |
Family
ID=25194779
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO873334A NO170031C (no) | 1985-12-09 | 1987-08-10 | Monoklonalt antistoff, murin-avledet hybridomcellelinje, samt anvendelse av antistoffet for isolering eller kvantitativ paavisning av human flerpotent granulocyttkolonistimulerende faktor (hpg-csf) |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5552286A (no) |
| EP (1) | EP0227367B1 (no) |
| JP (1) | JPH0745519B2 (no) |
| KR (1) | KR970000637B1 (no) |
| CN (2) | CN1035628C (no) |
| AT (1) | ATE73491T1 (no) |
| AU (1) | AU601958B2 (no) |
| CA (1) | CA1296662C (no) |
| DE (1) | DE3684264D1 (no) |
| DK (1) | DK173517B1 (no) |
| ES (1) | ES2046173T3 (no) |
| FI (1) | FI91542C (no) |
| GR (1) | GR3004612T3 (no) |
| IL (1) | IL80718A (no) |
| NO (1) | NO170031C (no) |
| NZ (1) | NZ218336A (no) |
| PT (1) | PT83892B (no) |
| WO (1) | WO1987003689A1 (no) |
| ZA (1) | ZA869042B (no) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK203187A (da) * | 1986-04-22 | 1987-10-23 | Immunex Corp | Human g-csf proteinekspression |
| EP0347057A1 (en) * | 1988-05-31 | 1989-12-20 | Schering Biotech Corporation | Method of treating myeloid leukemias |
| JP3441763B2 (ja) * | 1993-06-30 | 2003-09-02 | キリン−アムジエン・インコーポレーテツド | モノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を用いたヒトｇ−ｃｓｆの測定法 |
| JP3708151B2 (ja) * | 1994-12-15 | 2005-10-19 | 協和醗酵工業株式会社 | Ｐｅｇ化したヒト顆粒球コロニー刺激因子の定量法 |
| JP3521382B2 (ja) * | 1997-02-27 | 2004-04-19 | 日本たばこ産業株式会社 | 細胞間接着及びシグナル伝達を媒介する細胞表面分子 |
| ATE510214T1 (de) | 2000-11-30 | 2011-06-15 | Crawford Healthcare Holdings Ltd | Krankheitsdiagnose |
| HUE032584T2 (en) * | 2006-02-08 | 2017-09-28 | Morphotek Inc | Antigen GM-CSF peptides and GM-CSF antibodies |
| NZ591235A (en) | 2008-07-23 | 2012-07-27 | Ambrx Inc | Modified bovine g-csf polypeptides comprising non natural amino acid and their uses treating infections such as mastitis |
| AR083006A1 (es) | 2010-09-23 | 2013-01-23 | Lilly Co Eli | Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas |
| CN103361355B (zh) * | 2013-07-29 | 2016-01-20 | 暨南大学 | 编码重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的基因及其应用 |
| CN103592439B (zh) * | 2013-09-03 | 2015-10-21 | 天津亿美诺生物科技有限公司 | 人尿路上皮癌特异性抗体及其应用 |
| JP6742300B2 (ja) | 2014-07-14 | 2020-08-19 | ジェンノヴァ バイオファーマシューティカルズ リミテッド | ｒＨｕ−ＧＣＳＦの精製のための新規プロセス |
| CN107748251A (zh) * | 2017-09-30 | 2018-03-02 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种粒细胞集落刺激因子检测试剂盒的制备方法 |
| CN107576806A (zh) * | 2017-09-30 | 2018-01-12 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种粒细胞集落刺激因子检测试剂盒及其使用方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6030654B2 (ja) * | 1980-12-31 | 1985-07-17 | 株式会社林原生物化学研究所 | ヒトコロニ−刺激因子の製造方法 |
| CA1209907A (en) * | 1982-04-12 | 1986-08-19 | Richard M. Bartholomew | Method of affinity purification employing monoclonal antibodies |
| US4558005A (en) * | 1982-09-13 | 1985-12-10 | University Patents, Inc. | Monoclonal anti-erythropoietin |
| US4504586A (en) * | 1983-02-03 | 1985-03-12 | Amgen | Hybridoma tumor cell lines and their monoclonal antibodies to human colony stimulating factor subclass number 1 |
| US4558006A (en) * | 1983-02-04 | 1985-12-10 | Kirin-Amgen, Inc. | A.T.C.C. HB8209 and its monoclonal antibody to erythropoietin |
| JPS61227526A (ja) * | 1984-07-25 | 1986-10-09 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 新規なコロニー刺激因子 |
| JPS63500636A (ja) * | 1985-08-23 | 1988-03-10 | 麒麟麦酒株式会社 | 多分化能性顆粒球コロニー刺激因子をコードするｄｎａ |
| US4810643A (en) * | 1985-08-23 | 1989-03-07 | Kirin- Amgen Inc. | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
| JPH0630619B2 (ja) * | 1985-12-03 | 1994-04-27 | 中外製薬株式会社 | モノクロ−ナル抗ヒト顆粒球コロニ−刺激因子抗体 |
-
1986
- 1986-11-19 NZ NZ218336A patent/NZ218336A/xx unknown
- 1986-11-21 IL IL80718A patent/IL80718A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-11-26 KR KR1019870700690A patent/KR970000637B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1986-11-26 AU AU66295/86A patent/AU601958B2/en not_active Expired
- 1986-11-26 JP JP61506316A patent/JPH0745519B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-11-26 WO PCT/US1986/002554 patent/WO1987003689A1/en active IP Right Grant
- 1986-12-01 ZA ZA869042A patent/ZA869042B/xx unknown
- 1986-12-05 CA CA000524714A patent/CA1296662C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-08 AT AT86309541T patent/ATE73491T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-12-08 ES ES198686309541T patent/ES2046173T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-08 EP EP86309541A patent/EP0227367B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-08 DE DE8686309541T patent/DE3684264D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-08 CN CN86107666A patent/CN1035628C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-09 PT PT83892A patent/PT83892B/pt unknown
-
1987
- 1987-08-06 FI FI873418A patent/FI91542C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-08-07 DK DK198704128A patent/DK173517B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-08-10 NO NO873334A patent/NO170031C/no not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-05-18 GR GR920400936T patent/GR3004612T3/el unknown
- 1992-12-12 CN CN92114700A patent/CN1070611C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-01-31 US US08/382,942 patent/US5552286A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4472500A (en) | Rat myeloma cell lines | |
| EP0014519B1 (en) | Cell lines, process for preparing them and process for producing antibodies | |
| US4578335A (en) | Interleukin 2 receptor | |
| FI91421C (fi) | Menetelmä ihmisen kasvainkuoliotekijän (TNF) kanssa reagoivan monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi ja vasta-ainetta tuottava hybridisolulinja | |
| US4504586A (en) | Hybridoma tumor cell lines and their monoclonal antibodies to human colony stimulating factor subclass number 1 | |
| NO303544B1 (no) | FremgangsmÕte for fremstilling av et polypeptid med Ún eller flere av de hematopoietiske biologiske egenskaper til granulocyttkolonistimulerende faktor (hpG-CSF) | |
| NO170031B (no) | Monoklonalt antistoff, murin-avledet hybridomcellelinje, samt anvendelse av antistoffet for isolering eller kvantitativ paavisning av human flerpotent granulocyttkolonistimulerende faktor (hpg-csf) | |
| US5051364A (en) | Anti-lipocortin-I and anti-lipocortin-II monoclonal antibodies | |
| US4845198A (en) | Hybridoma antibody which binds IL-2 receptor | |
| EP0265384A2 (en) | Monoclonal antibodies to a colony stimulating factor | |
| CA1330768C (en) | Monoclonal anti-human granulocyte colony stimulating factor antibody | |
| EP0519728A2 (en) | Anti-TCF-II monoclonal antibodies and method for the measurement of TCF-II by applying the antibodies | |
| EP0243485B1 (en) | Hybridoma tumor cell lines and their monoclonal antibodies to thaumatin | |
| EP0328690B1 (en) | Method for diagnosing chronic articular rheumatism | |
| US5262523A (en) | Antibodies reactive with normal and oncogenic forms of the ras p21 protein | |
| DK175551B1 (da) | Isoleret polypeptid med hæmatopoietiske biologiske egenskaber som naturligt forekommende hpG-CSF, DNA-sekvens kodende for denne, plasmider indeholdende sekvensen, hermed transformerede/transficerede..... | |
| JPS60204727A (ja) | 抗ヒトｖ型コラ−ゲン抗体 | |
| WO1986002366A1 (en) | Aotus interspecies hybridomas and monoclonal receptors produced thereby | |
| JPH0532034B2 (no) | ||
| JPH09131179A (ja) | 動物細胞培養用添加剤 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |