NO170031B - Monoklonalt antistoff, murin-avledet hybridomcellelinje, samt anvendelse av antistoffet for isolering eller kvantitativ paavisning av human flerpotent granulocyttkolonistimulerende faktor (hpg-csf) - Google Patents

Monoklonalt antistoff, murin-avledet hybridomcellelinje, samt anvendelse av antistoffet for isolering eller kvantitativ paavisning av human flerpotent granulocyttkolonistimulerende faktor (hpg-csf) Download PDF

Info

Publication number
NO170031B
NO170031B NO873334A NO873334A NO170031B NO 170031 B NO170031 B NO 170031B NO 873334 A NO873334 A NO 873334A NO 873334 A NO873334 A NO 873334A NO 170031 B NO170031 B NO 170031B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
csf
hpg
monoclonal antibody
antibody
cell line
Prior art date
Application number
NO873334A
Other languages
English (en)
Other versions
NO873334D0 (no
NO873334L (no
NO170031C (no
Inventor
David Chang
Bruce Altrock
Original Assignee
Kirin Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kirin Amgen Inc filed Critical Kirin Amgen Inc
Publication of NO873334D0 publication Critical patent/NO873334D0/no
Publication of NO873334L publication Critical patent/NO873334L/no
Publication of NO170031B publication Critical patent/NO170031B/no
Publication of NO170031C publication Critical patent/NO170031C/no

Links

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/243Colony Stimulating Factors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Bakgrunn for oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse vedrører generelt materi-aler og fremgangsmåter for anvendelse i immunologiske fremgangsmåter for isolering og kvantitativ påvisning av hematopoietiske vekstfaktorer fra biologiske væsker. Spesielt ved-rører oppfinnelsen monoklonale antistoffer fremstilt ved hjelp av nye hybridomcellelinjer (som f.eks.
ATCC HB-8957, ATCC HB-8958, ATCC HB-8959, ATCC HB-8960, ATCC HB-8961 og ATCC HB-8962) som er spesifikt reak-
tive med hematopoietiske vekstfaktorer, og anvendelser av disse antistoffene ved isolering av hematopoietiske vekstfaktorer gjennom teknikker med affinitetsrensing, ved prøver for påvisning av hematopoietiske vekstfaktorer og i immunologiske teknikker for undersøkelse av slike vekstfaktorer. Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen monoklonale antistoffer som reagerer spesifikt med human flerpotent granulocyttkolonistimulerende faktor (hpG-CSF) fra naturlige og rekombinante kilder.
Det humane bloddannende (hematopoietiske) system sørger for erstatning av mange forskjellige hvite blodlegemer (inkludert neutrofiler, makrofager og basofiler/mastceller), røde blodlegemer (erythrocytter) og klump-dannende celler (megakaryocytter/blodplater). Det hematopoietiske system hos et gjennomsnittlig menneske av hannkjønn er blitt beregnet å produsere i størrelsesorden 4,5 x IO"<1>""'" granulocytter og
erythrocytter hvert år, noe som er ekvivalent med en årlig erstatning av hele kroppsvekten. Dexter, et al., BioEssays, 2, 154-158 (1985).
Det antas at små mengder av visse hematopoietiske vekstfaktorer er ansvarlige for differensieringen av et lite tall forløper-"stamceller" til de forskjellige blodcelle-linjer, for den voldsomme formering av disse cellelinjer,
og for den endelige differensiering av fullt utviklede blod-celler fra disse cellelinjene. Ettersom de hematopoietiske vekstfaktorer er til stede i svært små mengder, har påvis-ningen og identifiseringen av disse faktorene vært basert på en rekke prøver som hittil bare har skjelnet mellom de forskjellige faktorer på grunnlag av de stimulerende virkninger
på dyrkede celler under kunstige betingelser. Som et resultat av dette, er det laget et stort antall navn for å betegne et mye mindre antall faktorer. Som et eksempel på den resulterende forvirring, er uttrykkene IL-3, BPA, multi-CSF, HCGF, MCGF og PSF alle akronymer som nå antas å gjelde for en eneste murin hematopoietisk vekstfaktor. Metcalf, Science, 229, 16-22 (1985).
Anvendelsen av teknikker med rekombinant genetikk har brakt en viss orden i dette virvar. F.eks. er amino-syre- og DNA-sekvensene for humant erythropoietin, som stimulerer fremstillingen av erythrocytter, oppnådd. (Se Lin, PCT patentsøknad nr. 85/02610, publisert 20. juni 1985). Rekombinante metoder er også blitt anvendt til isolering av cDNA for en human granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) og human makrofag-spesifikk kolonistimulerende faktor (CSF-1). [se Lee, et al., Proe. Nati. Acad.
Sei. (USA), 8_2, 4360-4364 (1985); Wong, et al., Science, 228, 810-814 (1985) og Kowasaki, et al., Science, 230, 291-296 (1985).
En human hematopoietisk vekstfaktor kalt human flerpotent kolonistimulerende faktor (hpCSF) eller pluri-poietin, er blitt påvist å være til stede i dyrkningsmediet til en human urinblære-carcinomcellelinje betegnet 5637 og deponert under restriktive betingelser ved American Type Culture Collection, Rockville, Maryland som ATCC depon-eringsnr. HTB-9. hpCSF renset fra denne cellelinje, er blitt rapportert å stimulere formering og differensiering av flerpotente stamceller som fører til produksjonen av alle hovedblodcelletypene i prøver hvor det anvendes humane benmargstamceller. Welte, et al., Proe. Nati. Acad. Sei.
(USA), 82, 1526-1530 (1985).
Foreløpige undersøkelser indikerer at faktoren som er identifisert som hpCSF, i overveiende grad har granulocyttkolonistimulerende aktivitet i løpet av de første 7 dagene i en human CFU-GM-prøve.
En annen faktor betegnet human CSF-|3, er også blitt isolert fra human urinblærecarcinomcellelinje 5637 og er
125
blitt beskrevet som en konkurrent til munn I-merket
granulocyttkolonistimulerende faktor (G-CSF) for binding til WEHI-3B D+-celler i et doseresponsforhold som er identisk med forholdet til umerket murin G-CSF [Nicola, et al., Nature, 314, 625-628 (1985)]. Dette doseresponsforhold var tidligere blitt rapportert å være unikt for umerket murin G-CSF og ikke å finnes hos slike faktorer som M-CSF, GM-CSF, 11-3 [Nicola, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), J31, 3765-3769 (1984)]. Se også Metcalf, et al., Leukemia Research, bind 9, nr. 5, s. 521-527 (1985). CSF-(3 og G-CSF er også unike blant CSF-er ved at de deler en høy grad av evne til å indusere differensiering av WEHI-3B D<+->celler. Nicola, et al., Immunology Today, _5, 76-80 (1984). Ved høye konsentrasjoner stimulerer G-CSF blandede granulocytt-makrofag-kolonidannende celler [Nicola, et al., (1984) supra], noe som er i overensstemmelse med foreløpige resultater som indikerer fremkomsten av granulocyttiske, monocyttiske, blandede granulocyttiske/monocyttiske og eosinofile kolonier (CFU-GEMM) etter inkubering av humane benmargkulturer med hpCSF i 14 dager. Det er også blitt beskrevet at CSF-(3 stimulerer dannelse av neutrofile granulocyttiske kolonier i prøver hvor det anvendes benmargceller fra mus, en egenskap som har vært et kriterium for identifisering av en faktor som en G-CSF. På grunnlag av disse likheter er human CSF-|3 identifisert med G-CSF (granulocyttisk kolonistimulerende faktor). Se Nicola, et al., Nature, 314, 625-628 (1985).
Basert på de felles egenskaper synes det som om human CSF-(3 til Nicola et al., supra, og hpCSF til Welte et al., supra, er den samme faktor som passende kan henvises til som en human flerpotent granulocyttkolonistimulerende faktor (hpg-CSF).
I søkerens norske patentsøknad nr. 871679 er det beskrevet nye rekombinant-produserte polypeptider som har deler av eller hele den primære strukturkonformasjon og en eller flere av de biologiske egenskaper til human flerpotent granulocyttkolonistimulerende faktor. Det er også beskrevet DNA-sekvenser som koder for slike polypeptider, transformerte vertceller som koder for slike polypeptider og fremgangsmåter for syntesen av slike faktorer ved hjelp av rekombinante metoder.
Av interesse for bakgrunnen for oppfinnelsen er aktuell forskning fokusert på hybridomteknikker for fremstilling av tumorcellelinjer som vil produsere svært spesifikke monoklonale antistoffer mot et utvalgt antigent stoff. Teknikker for produksjonen av monoklonale antistoffer er generelt godt kjent innen teknikken. Typiske beskrivelser av disse fremgangsmåter kan finnes i Wands, J.R. og Zurawski, V.R., Gastroenterology 80:225 (1981); Marshak-Rothstein,
et al., J. Immunol. 122:2491 (1979); Oi, V.T. og L.A. Herzen-berg, "Immunoglobulin Producing Hybrid", Mishell, B.B. og S.M. Shiigi (red.), Selected Methods in Cellular Immunology, San Francisco, W.H. Freeman Publishing, 1979 og Goding, "Antibody Production by Hybridomas", J. of Immunol. Meth.
39, 285-308 (1980). Oppsummert i korte trekk så induseres lymfocytter fjernet fra milten hos et dyr som på forhånd er indusert med det aktuelle antigen, for å smelte sammen med myelomceller i nærvær av polyethylenglycol. Tusenvis av "hybrid"-myelomceller produseres ved sammensmeltingen. Supernatanten fra dyrking av hver "hybridom"-cellekultur testes for nærvær av den ønskede antistoffaktivitet. Etter at slik aktivitet er funnet i supernatanten fra en celle-kultur, klones den ved begrensende fortynning, og klonene testes hver for seg med hensyn på supernatantaktivitet.
På grunn av den svært spesifikke natur til disse immunologiske egenskaper har monoklonale antistoffer utviklet i henhold til hybridomteknikker, blitt foreslått for anvendelse som diagnostiske reagenser, terapeutiske midler og midler for affinitetsrensing av spesifikt kryssreaktive antigene proteiner fra urensede kilder. Se f.eks. Trends in Biotechnology, bind 3, nr. 7 (juli, 1985) og U.S. patent-skrifter nr. 4 465 624, 4 514 505 og 4 514 507.
Selv om det foreligger et vesentlig behov for spesifikke monoklonale antistoffer for bruk ved påvisning, isolering, rensing og undersøkelse av hematopoietiske vekstfaktorer, slik som human flerpotent granulocyttkolonistimulerende faktor, foreligger det ingen rapporter vedrørende vellykket bruk av hybridomteknikker når det gjelder å oppnå monoklonale antistoffer mot hpG-CSF.
Kort oppsummering
Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebrakt monoklonalt antistoff for anvendelse in vitro som er kjennetegnet ved at det er dannet av en cellelinje som i sitt dyrkningsmedium er i stand til å danne et monoklonalt antistoff med evne til spesifikt å binde seg til human flerpotent granulocyttkolonistimulerende faktor (hpG-CSF), men ikke til kolonistimulerende faktor underklasse 1 (CSF-1), i en antigen/antistoff -reaksjon, og er av en undertype valgt fra gruppen bestående av IgM, IgG^ IgG2a, IgG2b" og IgG3.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer for første gang hybridomcellelinjer som produserer monoklonale antistoffer som reagerer spesifikt immunologisk med human flerpotent granulocyttkolonistimulerende faktor i en antigen/antistoff-reaksjon. Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebrakt murin-avledet hybridomcellelinje som er kjennetegnet ved at den i sitt dyrknings-medium er i stand til å danne et monoklonalt antistoff med evne til spesifikt å binde seg til human flerpotent granulocyttkolonistimulerende faktor (hpG-CSF), men ikke til kolonistimulerende faktor underklasse 1 (CSF-1), i en antigen/antistoff-reaksjon og hvor det monoklonale antistoff er av en undertype valgt fra gruppen bestående av IgM, IgGx, IgG2a, IgG2b og IgG3. Som en foretrukket utførelsesform tilveiebringer foreliggende oppfinnelse nye murin-avledede hybridomcellelinjer, ATCC HB-8957, ATCC HB-8958, ATCC HB-8959, ATCC HB-8960, ATCC HB-8961 og ATCC HB-8962, som hver produserer som en bestanddel i supernatanten fra dyrkingen i kultur, et monoklonalt antistoff som er spesifikt reaktivt med hpG-CSF. Hybridomcellelinjene ATCC HB-8957, ATCC HB-8958, ATCC HB-8959, ATCC HB-8960, ATCC HB-8961 og ATCC HB-8962 ble deponert ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852, 6. desember 1985.
Ved fremstillingen av den murin-avledede hybridomcellelinje ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles en hybrid tumorcellelinje ved å bruke en standard immuno-
"Inununoglobulin Producing Hybrid", supra, og Goding,
"Antibody Production by Hybridomas", J. of Immunol. Meth.
39 (1980), 285-308. Miltceller fra mus som er hyperimmunisert med naturlig hpG-CSF, smeltet sammen med en mus-myelomcellelinje i nærvær av polyethylenglycol. Supernatanten fra dyrkingen av hver "hybridom"-cellekultur testes med hensyn på tilstedeværelsen av den ønskede antistoffaktivitet. En utvalgt hybridomcelle klones for å formere en cellelinje
som produserer et antistoff i dyrkningssupernatanten som har svært spesifikk anti-hpG-CSF-aktivitet.
De monoklonale antistoffer anvendes ifølge oppfinnelsen for isolering av biologisk aktiv hpG-CSF fra en biologisk væske ved immunaffinitetskromatografi. Ved en slik anvendelse vil et utvalgt antistoff være immobilisert (f.eks. på en kolonne), og kildematerialet vil bli brakt i kontakt med det immobiliserte antistoff. hpG-CSF vil binde seg til antistoffet og vil deretter bli eluert fra det immobiliserte antistoff i en høyrenset form. Antistoffene anvendes også ifølge oppfinnelsen for kvantitativ påvisning av hpG-CSF i en biologisk væske ved immunaffinitetskromatografi.
Nærmere beskrivelse
De følgende eksempler illustrerer utøvelse av oppfinnelsen ved fremstillingen av en rekke hybridomcellelinjer, deriblant ATCC HB-8957, ATCC HB-8958, ATCC HB-8959, ATCC HB-8960, ATCC HB-8961 og ATCC HB-8962, isoleringen av antistoffer " mot hpG-CSF og forsterkningen og karakteriseringen av de monoklonale antistoffer.
Nærmere bestemt er eksempel 1 rettet mot stimulering av en murin vert mot produksjon av polyklonale serumanti-stoffer mot hpG-CSF, sammensmelting av miltceller med myelomceller og screeningen, kloningen og dyrkingen av hybridomceller og isolering av monoklonalt antistoff fra disse. Eksempel 2 vedrører karakteriseringen av de monoklonale antistoffene fremstilt på denne måte ved ELISA- og RIA-prøver, og prøver med konkurrerende inhibering og nøy-tralisering, samt forsterkningen av utbytter av monoklonalt antistoff ved hjelp av "ascites"-metoden. Eksempel 3 beskriver fremgangsmåter for isolering og rensing av hpG-CSF gjennom bruken av de monoklonale antistoffene ifølge oppfinnelsen. Eksempel 4 beskriver fremgangsmåter for kvantitativ påvisning av hpG-CSF gjennom bruken av prøveteknikker hvor det benyttes antistoffer ifølge oppfinnelsen.
Eksempel 1
A. Fremstilling av polyklonalt serum
BALB/C-mus som hver var injisert med hpG-CSF renset ved hjelp av HPLC, fra human urinblærecarcinomcellelinje nr. 5637 (subklon 1A6) i henhold til fremgangsmåtene ifølge eksempel l(b) i norsk patentsøknad nr. 871679. Materialet ble renset med en C4 HPLC-kolonne inntil en renhet i over-kant av 85% og hadde en konsentrasjon på omtrent 60 ug/ml i en oppløsning som omfattet 50% propanol og 100 mM ammonium-acetat (pH 7). Hver av 10 mus ble først gitt flere subkutane injeksjoner som tilsammen utgjorde omtrent 0,1 ml, av en inokulant (7,2 ug hpG-CSF pr. mus) som omfattet 1,2 ml av hpG-CSF-oppløsningen som var blitt oppkonsentrert til 0,6 ml ved hurtig vakuumavdamping og deretter blandet ved hjelp av behandling med lydbølger med 0,6 ml BACTO-Freund's komplette adjuvans H37 Ra (DIFC0 3113-60). 18 dager senere ble hver av musene gitt flere subkutane forsterkningsinjeksjoner som tilsammen utgjorde omtrent 0,15 ml av en inokulant (7,2 ug hpG-CSF pr. mus) som omfattet 1,2 ml av hpG-CSF-oppløsningen i oppkonsentrert til 0,75 ml og blandet med 0,75 ml av Freund's ukomplette adjuvans (BACT0 0639-60-6 fra DIFCO)•
4 dager senere ble det tatt blodprøver fra musene, og seraene ble undersøkt ved hjelp av RIA med hensyn på produksjon av anti-hpG-CSF-antistoffer. hpG-CSF brukt i serumanalysen, omfattet omtrent 0,5 ml 80% ren hpG-CSF ved en konsentrasjon på omtrent 100 ug/ml i en oppløsning som omfattet 100 mM ammoniumsulfat og 50% propanol som var blitt oppkonsentrert 4 ganger. 250 ul av den ovenfor nevnte oppløsning ble oppkonsentrert til 150 ul og ble blandet med
i 5 ml 50 mM C03~2/HC03_1 buffer (pH 9,2). 50 ul av dette, materiale ble så tilført hver brønn i et 96-brØnners brett og inkubert i 2 timer ved værelsetemperatur og over natten ved 4°C. En blokkeringsforbindelse som omfattet 5% bovint serumalbumin (BSA), ble inkubert i 30 minutter i brønnene.
Testserum fortynnet i forhold på 1:5, 1:25, 1:625 og
1:3125, og kontrollserum (ikke-inokulert) fortynnet til forhold på 1:5 og 1:125, ble tilført brønnene med 50 ul pr. brønn og inkubert i 2 timer ved værelsetemperatur. Brønnene ble deretter skylt tre ganger under anvendelse av "Wash Solution" [(Kirkeguard & Perry Laboratories, (KPL) Gaithersburg, Maryland)]. Kanin-anti-mus-IgG-antistoff merket med <1>25I, ble så tilført slik at det ga omtrent 199.000 tellinger pr. minutt pr. 50 ul brønn, og inkubert i 1,5 timer ved værelsetemperatur. Brønnene ble så skylt fem ganger med "Wash Solution" og radioaktiviteten bestemt med en gammateller. 21 dager etter forsterkningsinjeksjonen ble 5 mus påvist ved hjelp av RIA å produsere anti-hpG-CSF-antistoffer, i den tredje injeksjon. Musene ble immunisert med det samme materiale som under forsterkningsinjeksjonen, men ble gitt omtrent 10 ug hpG-CSF pr. mus.
B. Cellefusjon
Ved fremgangsmåten for hybridomproduksjonen knuses miltene fra de inokulerte mus for å oppslemme lymfocytter som produserer anti-hpG-CSF-antistoff. Disse miltcellene smeltes sammen med celler fra en SP2/0 myelomcellelinje slik at det dannes hybridceller. Cellemembranene fra milt-og myelomcellene smelter sammen og omgir til å begynne med en felles cytoplasma med to eller flere kjerner. Flere dager etter fusjon av cellemembranene smelter kjernene sammen og blir i stand til å gi synkron mitose. Etter hvert som disse sammensmeltede celler deler seg, går et variabelt antall kromosomer fra begge de sammensmeltede partnere tapt inntil hybridcellelinjene stabiliserer seg. Et medium av hypoxanthin-aminopterin-thymidin (HAT) forhindrer SP2/0:SP2/0-hybrider produsert under hybridiseringsfrem-gangsmåten eller ikke sammensmeltede SP2/0-celler fra å vokse, mens milt:milt-cellehybrider eller ikke sammensmeltede miltceller vanligvis vil dø etter to uker i kultur. Således vil bare SP2/0:milt-hybridcellene overleve i kulturene. 3 dager etter den andre forsterkningsinokulasjon ble musene ofret ved hjelp av cervical dislokasjon og dyppet ned i 70% ethanol. Milter fra musene ble fjernet aseptisk og plassert i en steril petriskål på is som inneholdt DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, katalog nr. 320-1885, parti 18K3252 fra GIBCO) supplert med penicillin G-streptomycin-oppløsning (en "lX"-oppløsning), heretter betegnet "lXPS"-oppløsning (katalog nr. 9366 fra Irvine Scientific) omfattende 100 enheter penicillin G og 100 ug streptomycin pr. ml. Fettvev som satt fast på miltene, ble fjernet, og miltene ble vasket to ganger med DMEM som inneholdt 2XPS (200 enheter penicillin G og 200 ug streptomycin pr. ml) og plassert i en steril "stomacher"-pose på is. Til posen ble det tilsatt oppløsning omfattende DMEM - 2 XPS. Miltene ble revet opp i et "stomacher"-apparat og deretter filtrert gjennom fire lag med steril gass og inn i 50 ml sentrifuge-rør. Posen og filtrene ble vasket med opptil 40 ml oppløs-ning omfattende DMEM - 2XPS-oppløsning. Cellene ble deretter sentrifugert i 10 minutter ved 1000 rpm i en IEC NH-SII sentrifuge (Damon/IEC-avdeling), og supernatanten ble forsiktig sugd bort. Cellene ble deretter vasket to ganger med en oppløsning som omfattet DMEM - 2XPS og en gang med DMEM uten noen tilsetningsstoffer. Cellene ble så resuspendert i DMEM.
Myelomceller (Sp2/0) ble dyrket i HBlOl-medium som inneholdt 1XPS og 1% kalvefosterserum (FBS) (Irvine Scientific katalog nr. 3000, parti nr. 209 608, varme-inaktivert) og fikk formere seg i log-vekstfase i 3 dager. SP2/0-cellene ble innhøstet ved pelletering i en IEC NH-SII sentrifuge ved 1000 rpm i 10 minutter. Cellene ble vasket i DMEM-oppløsning og deretter oppslemmet i DMEM-oppløsning.
Miltcellene ble deretter slått sammen med myelomcellene i et 50 ml sentrifugerør ved et forhold på 4:1 og sentrifugert i 10 minutter ved 1000 rpm, og supernatanten ble sugd bort. Pelleten ble så plassert i et 37°C vannbad under en avtrekkshette. Polyethylenglycol (molekylvekt 1500, M.A. Bioproducts, katalog nr. 17-780Z, parti nr. 4J030) ble smeltet og deretter blandet i et volumforhold på 1:1 med DMEM-oppløsning for å lage en 50% oppløsning. PEG-oppløsningen ble så tilsatt til cellene i henhold til følg-ende fremgangsmåte. I løpet av det første minutt ble 1,0 ml av 50% PEG-oppløsningen tilsatt. I løpet av det andre minutt ble oppløsningen omrørt forsiktig ved anvendelse av en pipette som ble omrørt konstant med en sirkelbevegelse, men som man unngikk å berøre sidene eller bunnen i rørene med. I løpet av det tredje minutt ble 1,0 ml oppløsning omfattende DMEM, 10% FCS og 1XPS tilsatt. I løpet av det fjerde minutt ble 1,0 ml av den samme oppløsning på nytt tilsatt. I løpet av det femte og sjette minutt ble 8,0 ml av den samme oppløsning på nytt tilsatt. Blandingen ble deretter sentrifugert ved 1000 rpm i 10 minutter på IEC NH-SII-sentrifugen. Supernatanten i sentrifugerøret ble sugd bort, og cellene ble forsiktig resuspendert i 100 til 150 ml medium omfattende DMEM med 10% FBS og 1XPS. Cellesuspen-sjonen ble så platet ut ved en hastighet av 0,1 ml suspensjon pr. brønn i omtrent 800 brønner på åtte og en halv 96-brønners plater som var blitt forekvilibrert i en C02~ inkubator. Platene ble så returnert til en C02~inkubator med et omtrentlig 7% C02~innhold ved 37°C.
En dag senere ble 100 ul HAT-medium i DMEM og 10% FBS tilsatt til hver brønn. På den andre dag ble 100 ul brukt medium sugd bort fra hver brønn og erstattet med 100 pl friskt HAT-medium i DMEM med 10% FBS. Denne fremgangsmåte ble gjentatt på dag 2, dag 4, dag 7 og dag 11. På dag 14 ble 100 ul brukt medium fjernet fra hver brønn og erstattet med 100 ul HT-medium omfattende 1,36 mg/dl hypoxanthin og 0,76 mg/dl thymidin. Fremgangsmåten ble gjentatt på dag 18, dag 22 og dag 26. På dag 28 ble kulturene forsynt med et komplett medium omfattende DMEM med 10% FBS. Kulturene ble deretter på nytt forsynt to ganger i uken med dette komplette medium. På dag 17 ble brønnene undersøkt med hensyn på produksjon av immunglobulin under anvendelse av anti-mus-IgG-antistoffer. RIA- og ELISA-prøver viste at omtrent
260 av 800 brønner var signifikant positive med hensyn til mus-IgG.
Eksempel 2
A. Innledende karakterisering av monoklonale antistoffer
En ELISA-prøve ble utført for påvisning av de kloner som dannet anti-hpG-CSF-antistoffer. Brønner i 9 6-brønners brett ble belagt ved tilføring av omtrent 50 ul opp-løsning inneholdende 100' ng 90% ren hpG-CSF som var fortynnet i 50 mM C03 /HC03 -bufferoppløsning (pH 9,2) ved værelsetemperatur i 2 timer og deretter tilsatt til hver brønn i brettene, og ble inkubert over natten ved 4°C. Brønnene ble så behandlet med en 5%-ig BSA blokkeringsoppløsning som ble inkubert i 30 minutter.
Supernatant fra hybridomkulturene ble fortynnet i PBS-oppløsning (pH 7,0) inneholdende 1% BSA og ble så inkubert mot de belagte brønnene i 2 timer ved værelsetemperatur. Brønnene ble så vasket tre ganger med "Wash Solution" og ble behandlet med pepperrotperoxydasemerket anti-mus-IgG-antistoff (BMB nr. 605-250) ved en 1:300 fortynning i 1,5 timer. Brønnene ble så vasket fem ganger med "Wash Solution", og peroxydasesubstrat ABTS (KPL) ble tilsatt ved en hastighet på 50 ul pr. brønn. Brønnene ble deretter avlest med hensyn på optisk densitet ved 414 nm ved hjelp av et Titertek Multiscan (Flow Labs, McLean, VA) spektrofotometer. 23 av brønnene (nr. 3, 4, 5, 20, 21, 28, 35, 37, 39, 40, 58, 61, 63, 64, 66, 68, 72, 74, 75, 98, 151, 182 og 231) ble funnet signifikant å reagere med den reduserte hpG-CSF.
Formell kloning av hybridomceller erholdt fra de positive brønnene, ble utført ved fortynning av cellene i ytterligere brønner ved et slikt forhold at det var omtrent 1 celle pr. 3 brønner. Generelt ga formell kloning fra en aktiv brønn formelle kloner som syntes å være subkloner av den samme hybridomcelle, men i flere tilfeller avslørte forskjellige klonpopulasjoner som oppviste forskjellige antistoff-subtyper og reaksjonsegenskaper. Subkloner fra den samme brønn ble merket med en bokstav (f.eks. ble kloner erholdt fra brønn 4, merket 4A, 4B, etc.).
En ELISA-prøve ble utført for å bestemme reaktivitet av de monoklonale antistoffene mot naturlig hpG-CSF, samt redusert naturlig hpG-CSF. Supernatant erholdt fra brønner som var funnet å gi antistoffer som var reaktive med hpG-CSF, ble testet mot både naturlig hpG-CSF og naturlig hpG-CSF som var blitt denaturert med SDS/mercaptoethanol. Antistoffer fra klonene reagerte mot begge stoffer med omtrent
lik spesifisitet, noe som tyder på at antistoffene kan være spesifikt reaktive med antigene epitoper hovedsakelig bestemt ved hjelp av kontinuerlige sekvenser av aminosyrer (primærstrukturen) hos proteinet.
B. Reaktivitet av monoklonale antistoffer mot pattedyr-
og rekombinant hpG-CSF
I dette eksemplet ble det utført fastfase-RIA-
og ELISA-prøver for å måle reaktivitet til hybridom-
supernatant erholdt fra de aktive brønner, på pattedyr-
hpG-CSF samt rekombinant E. coli-produsert hpG-CSF. Bortsett fra i ett tilfelle reagerte monoklonalt antistoffmateriale som reagerte med pattedyrprodusert (naturlig) hpG-CSF, like godt med rekombinantprodusert hpG-CSF. Det tilfellet om-
fattet subklonene 35B, 35D og 351 som produserte antistoffer som var signifikant mindre reaktive med det rekombinante materiale enn med det pattedyravledede materiale i prøver med direkte binding.
C. Screening med hensyn på antistoff-subtyper
I dette eksemplet ble formelle kloner erholdt fra de
23 brønnene som opprinnelig var funnet å være aktive,
undersøkt ved hjelp av RIA for bestemmelse av antistoff-
subtype. 96-brønners brett ble behandlet med kanin-anti-mus-immunglobulin-antistoffer med forskjellige subtype-spesifisiteter. Anti-mus-immunglobulin-antistoffene omfattet kanin-anti-mus-IgG-, L (MILES Laboratories, Naperville, IL, 64-360-1), kanin-anti-mus-IgG0 (MILES, 64-361-1), kanin-anti-mus-IgG2j;) (MILES, 64-362-1) , kanin-anti-mus-IgG^
(MILES, 64-363-1), kanin-anti-mus-IgM (MILES, 64-365-1) og kanin-anti-mus-IgG (MILES, 65-157-2). Hver brønn ble belagt med 50 ul av anti-mus-immunglobulin-antistoffoppløsningen i
CO^ -2 /HCO-j -(pH 9,6) bufferoppløsning omfattende omtrent
0,5 ug antistoff, og ble inkubert i 2 timer ved værelsetemperatur og over natten ved 4°C. Brønnene ble deretter blokkert ved inkubasjon med 5% BSA-oppløsning i 30 minutter. Hver brønn ble så inkubert med hybridomvevkultursupernatant
i 2 timer ved værelsetemperatur og vasket tre ganger med "Wash Solution". Brønnene som var blitt behandlet med anti-IgG-antistoff, ble deretter inkubert i 1,5 timer med
125
50 ul pr. brønn av I-kanin-anti-mus-IgG-antistoff, mens brønnene som var blitt behandlet med anti-IgM, deretter ble
125
inkubert i 1,5 timer med 50 ul pr. brønn av I-kanm-anti-mus-IgM-antistoff. Brønnene ble så vasket fem ganger med "Wash Solution" og ble tellet i en gamma-teller. Resultatene fra analyser av de opprinnelige 23 klonene indikerer at 2 brønner (nr. 37 og 182) stanset syntese av IgG; 1 brønn ble angitt å være IgG-positiv, men oppviste ingen reaktivitet under tidlig screening mot hpG-CSF (nr. 58); 15 brønner viste seg å være positive for IgG-^ (nr. 4C, 5, 28, 39, 40, 61, 63, 64, 66, 68, 72, 74, 75, 98 og 231). En subklon av en av disse, nr. 5d, ble funnet å være reaktiv både med anti-IgG3~ og anti-IgM-antistoffer. 4 brønner var positive for IgG t0 . a-produksjon (nr. 3, 4A, 21 og 151) og 1 brønn for IgG2k-produksjon (nr. 35) .
D. Nøytralisering av hpG-CSF-aktivitet målt ved hjelp
av H-thymidm-opptak
I dette eksemplet ble monoklonale antistoffer frembrakt mot hpG-CSF, testet med hensyn på evne til å nøytral-isere den biologiske aktivitet av hpG-CSF når det gjelder å stimulere inkorporeringen av <3>H-thymidin i humane benmargceller. For å teste med hensyn på nøytralisering av <3>H-thymidinopptak, ble rekombinant eller naturlig hpG-CSF inkubert med forskjellige konsentrasjoner antistoffer ifølge oppfinnelsen ved 4°C i 12 timer. Oppløsningen ble deretter tilsatt til ikke-festende humane benmargceller med lav densitet og bearbeidet i henhold til fremgangsmåter beskrevet i eksempel 7 i U.S. patentsøknad nr. 768 959. Antistoffer fra
bl.a. kløn nr. 20A, 35B, 39B, 40A, 61D, 63D, 75A og 151K,
ble testet med antistoffer fra klon nr. 75A som var den mest effektive når det gjelder å nøytralisere virkningen av hpG-CSF på <3>H-thymidin-opptak, og hvor alle de ovenfor nevnte antistoffer oppviste forskjellige grader av nøytraliserings-virkning på <3>H-thymidin-opptak, bortsett fra antistoffer produsert av klon nr. 35B.
E. Nøytralisering av hpG-CSF-aktivitet målt ved hjelp av celledifferensieringsinduksjon
I dette eksemplet ble antistoffer frembrakt mot hpG-CSF, testet med hensyn på evne til å nøytralisere hpG-CSF's evne til å indusere differensiering av den murine myelommonocyttiske leukemicellelinje WEHI-3B D<+>. Forskjellige konsentrasjoner av antistoffene produsert ifølge oppfinnelsen (fra kloner nr. 20A, 39B, 40A, 61D, 63D og 75A) ble inkubert med hpG-CSF ved 4°C i 12 timer. Oppløsningene ble deretter.tilsatt til WEHI-3B D<+->celler i en agarsuspen-sjon ifølge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 7 i U.S. patentsøknad nr. 768 959. Antistoffer dannet ved hjelp av kloner nr. 40A, 61D og 75A, oppviste evne til å blokkere differensiering. Ettersom disse monoklonale antistoffer har forskjellig utfellingsdyktighet overfor hpG-CSF, kan det faktum at noen blokkerer den differensieringsinduserende evne hos hpG-CSF, mens andre ikke gjør det, ikke forklares enkelt på grunnlag av affinitetsstyrke. Det er verdt å legge merke til at monoklonalt antistoff dannet av klon 75A, ikke bare inhiberte differensiering av WEHI-3B D<+->cellene, men også inhiberte cellevekst, noe som antyder at den kan kryssreagere med en murin vekstfaktor utskilt av WEHI-3B D<+->celler og kan ha antiproliferative virkninger uavhengig av dens kapasitet til å binde hpG-CSF.
F. Epitop-karakterisering
I dette eksempel ble det utført undersøkelser ved-rørende konkurrerende binding ved å benytte <125>I-merket antistoff fra klonene 75A og 151 K, og immobilisert rekombinant-fremstilt hpG-CSF. I disse undersøkelsene fikk antistoffer fra andre kloner konkurrere mot 75A og 151K radio-aktivt merkede monoklonale antistoffer bundet til rekombinant-fremstilt hpG-CSF. Etter inkubasjon og vasking ifølge fremgangsmåter som er velkjente innen teknikken, ble det utført bestrålingstellinger for å bestemme i hvilken utstrekning enten 75A-produsert antistoff eller 151K-produsert antistoff var blitt fjernet fra hpG-CSF.
Resultater fra disse prøver indikerer at antistoffer produsert av klonene nr. 63D, 75A og 151K, kan ha til felles overlappende deler av en felles antigen epitop på hpG-CSF-proteinet. Resultatene indikerer også at antistoffer produsert av klon nr. 4C, 28A og 35B, synes å være reaktive med en epitop eller epitoper.av hpG-CSF-proteinet som de 75A- og 151K-produserte antistoffer ikke er spesifikt reaktive med. Resultatene antyder også at de hpG-CSF-bindende egenskaper til antistoffer produsert av klonene 40A og 61D, kan la seg skjelne fra egenskapene til antistoffer produsert av klonene 4C, 28A, 35B, 75A og 151K.
G. Egenskaper til antistoffer fra deponerte representative cellelinjer
Representative nye hybridomcellelinjer som er i stand til å produsere monoklonale antistoffer som er representative for de som er tilveiebrakt ved hjelp av foreliggende oppfinnelse, er blitt deponert ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852.
Disse cellelinjene svarer til cellelinjer utviklet under den formelle kloningsfremgangsmåte på følgende måte: klon 4C (ATCC HB-8962), klon 28A (ATCC HB-8957), klon 35B (ATCC HB-8960), klon 63D (ATCC HB-8958), klon 75A (ATCC HB-8959) og klon 151K (ATCC HB-8961). Egenskapene til antistoffer produsert ved hjelp av disse klonene, er oppsummert i tabell 1 nedenunder.
H. Forøkning av antistoffutbytter ved hjelp av "ascites"-metode
For å oppnå et mer konsentrert antistoff enn det som dannes i vevkultur, ble de monoklonale antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse supplert ved hjelp av "ascites"-metoden som er beskrevet generelt i Kenneth, et al.
(red.), Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analysis, s. 403, New York: Plenum Press
(1981). Ifølge denne fremgangsmåte prepareres mus med
0,5 ml "Pristane" (2,6,19,14-tetramethylpentadecan, erholdt fra Aldrich Chemical Co.) injisert i bukhulen ved hjelp av sprøyter av kaliber 25 eller 27. "Pristane"-behandling mulig-gjør vekst av tumorceller i en "ascitisk" form i bukhulen. Etter omtrent 1-2 uker ble omtrent 10 g hybridomceller injisert i bukhulene til musene i serumfritt Dulbecco's modifiserte Eagles medium (DMEM) (Irvine Scientific Co.) eller HB101 (Hanna Biologicals, Berkeley, Cal.). Settet med injeksjoner utføres på mus for hver av klonene.
Omtrent 1-3 uker etter injeksjonen av hybridom-cellene ble det erholdt ascites-væske fra bukhulene til musene ved å lage små kutt i huden og pipettere ut væsken. Ascites-væske ble klaret ved sentrifugering og deretter ned-fryst. Ascites-væske-antistoffer kan renses ytterligere fra ascites-væske-albumin ved utfelling med 45% ammoniumsulfat og protein A-Sepharose<®->kromatografering.
Eksempel 3
Isolering og rensing av hematopoietiske vekstfaktorer
Gjennom tilveiebringelsen av svært spesifikke og høyreaktive anti-hpG-CSF monoklonale antistoffer muliggjør foreliggende oppfinnelse for første gang isolering av hpG-CSF og hematopoietiske vekstfaktorer fra fermenterings-kulturer samt fra naturlige pattedyrkilder ved fremgangsmåter ved affinitetsrensing som er velkjente innen teknikken.
I korte trekk vil foretrukne isoleringsfremgangsmåter omfatte immobilisering av et antistoff ifølge oppfinnelsen på en fast bærer (f.eks. en kromatografisk kolonne), opprettelse av kontakt mellom hpG-CSF eller væsken som inneholder hematopoietisk faktor med det immobiliserte antistoff og deretter eluering av renset hpG-CSF eller hematopoietisk vekstfaktor fra immunkompleksforbindelse med antistoffet. Ved å regulere det bestemte antistoff som brukes, kan rense-teknikken muliggjøre isolering av naturlig hpG-CSF i dens korrekt foldede konformasjon fra ukorrekt foldet eller denaturert hpG-CSF. Analoger av hpG-CSF vil kunne isoleres og undersøkes, likeså vel som spesifikt antigene epitoper av hematopoietiske vekstfaktormolekyler.
Eksempel 4
Kvantitativ påvisning av hematopoietiske vekstfaktorer
Gjennom tilveiebringelsen av høyspesifikke anti-hpG-CSF monoklonale antistoffer muliggjør foreliggende oppfinnelse også nye prøver i fast eller flytende fase for kvantitativ påvisning av hpG-CSF og hematopoietiske vekstfaktorer i en væskeprøve hvor det anvendes mer enn ett antistoff. Prøver i fast fase ville typisk omfatte trinnene: (1) å bringe væsken i kontakt med et første iramo-bilisert antistoff som reagerer med en første antigendeter-minant i hpG-CSF i væsken slik at det dannes et immunologisk kompleks av hpG-CSF og det første antistoff; (2) å bringe det dannede kompleks i trinn (1) i kontakt med et andre antistoff som reagerer med en antigen determinant i hpG-CSF som er forskjellig fra den første antigene determinant, hvorved det dannes et immunologisk kompleks av hpG-CSF og det andre antistoff; og (3) kvantifisering av mengden av det andre antistoff bundet til det immunologiske kompleks dannet i trinn (2) .
Kompetitive prøver i flytende fase vil omfatte merk-ing av hpG-CSF og utfelling av denne med ett eller flere antistoffer ifølge oppfinnelsen. Kvantifisering av umerket hpG-CSF eller beslektede faktorer vil deretter kunne utføres ved en kompetitiv bindingsdannelse. Slike prøvefremgangs-måter vil fortrinnsvis omfatte to av de ovenfor beskrevne monoklonale antistoffer, men kan også utvikles under anvendelse av et av de monoklonale antistoffer og et polyklonalt serumavledet antistoff mot hpG-CSF.
5

Claims (8)

1. Monoklonalt antistoff for anvendelse in vitro, karakterisert ved at det er dannet av en cellelinje som i sitt dyrkningsmedium er i stand til å danne et monoklonalt antistoff med evne til spesifikt å binde seg til human flerpotent granulocyttkolonistimulerende faktor (hpG-CSF), men ikke til kolonistimulerende faktor underklasse 1 (CSF-1), i en antigen/antistoff-reaksjon, og er av en undertype valgt fra gruppen bestående av IgM, IgG17 IgG2a, IgG2b og IgG3.
2. Monoklonalt antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at cellelinjen er valgt fra gruppen bestående av ATCC HB-8957, HB-8958, HB-8959, HB-8960, HB-8961 og HB-8962.
3. Monoklonalt antistoff ifølge krav 2, karakterisert ved at det er i stand til å nøytralisere hpG-CSF's evne til å indusere differensiering av WEHI 3B D<+->celler i kultur, og hvor cellelinjen som anvendes er ATCC HB-8959 eller HB-8961.
4. Monoklonalt antistoff ifølge krav 2, karakterisert ved at det er i stand til å nøytralisere hpG-CSF's evne til å stimulere benmargcellers opptak av thymidin, og hvor cellelinjen som anvendes er ATCC HB-8959.
5. Murin-avledet hybridomcellelinje, karakterisert ved at den i sitt dyrknings-medium er i stand til å danne et monoklonalt antistoff med evne til spesifikt å binde seg til human flerpotent granulo cyttkolonistimulerende faktor (hpG-CSF), men ikke til kolonistimulerende faktor underklasse 1 (CSF-1), i en antigen/anti-stof f -reaksjon og hvor det monoklonale antistoff er av en undertype valgt fra gruppen bestående av IgM, IgG^ IgG2a, IgG2b og IgG3.
6. Murin-avledet hybridomcellelinje ifølge krav 5, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen av cellelinjer bestående av ATCC HB-8957, HB-8958, HB-8959, HB-8960, HB-8961 og HB-8962.
7. Anvendelse av et monoklonalt antistoff ifølge kravene 1-4 for isolering av biologisk aktiv hpG-CSF fra en biologisk væske ved immunaffinitetskromatografi.
8. Anvendelse av et monoklonalt antistoff ifølge kravene 1-4 for kvantitativ påvisning av hpG-CSF i en biologisk væske ved immunaffinitetskromatografi.
NO873334A 1985-12-09 1987-08-10 Monoklonalt antistoff, murin-avledet hybridomcellelinje, samt anvendelse av antistoffet for isolering eller kvantitativ paavisning av human flerpotent granulocyttkolonistimulerende faktor (hpg-csf) NO170031C (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US80675585A 1985-12-09 1985-12-09
PCT/US1986/002554 WO1987003689A1 (en) 1985-12-09 1986-11-26 Hybridoma's to human pluripotent granulocyte colony stimulating factor

Publications (4)

Publication Number Publication Date
NO873334D0 NO873334D0 (no) 1987-08-10
NO873334L NO873334L (no) 1987-08-10
NO170031B true NO170031B (no) 1992-05-25
NO170031C NO170031C (no) 1992-09-02

Family

ID=25194779

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO873334A NO170031C (no) 1985-12-09 1987-08-10 Monoklonalt antistoff, murin-avledet hybridomcellelinje, samt anvendelse av antistoffet for isolering eller kvantitativ paavisning av human flerpotent granulocyttkolonistimulerende faktor (hpg-csf)

Country Status (19)

Country Link
US (1) US5552286A (no)
EP (1) EP0227367B1 (no)
JP (1) JPH0745519B2 (no)
KR (1) KR970000637B1 (no)
CN (2) CN1035628C (no)
AT (1) ATE73491T1 (no)
AU (1) AU601958B2 (no)
CA (1) CA1296662C (no)
DE (1) DE3684264D1 (no)
DK (1) DK173517B1 (no)
ES (1) ES2046173T3 (no)
FI (1) FI91542C (no)
GR (1) GR3004612T3 (no)
IL (1) IL80718A (no)
NO (1) NO170031C (no)
NZ (1) NZ218336A (no)
PT (1) PT83892B (no)
WO (1) WO1987003689A1 (no)
ZA (1) ZA869042B (no)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK203187A (da) * 1986-04-22 1987-10-23 Immunex Corp Human g-csf proteinekspression
EP0347057A1 (en) * 1988-05-31 1989-12-20 Schering Biotech Corporation Method of treating myeloid leukemias
JP3441763B2 (ja) * 1993-06-30 2003-09-02 キリン−アムジエン・インコーポレーテツド モノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を用いたヒトg−csfの測定法
JP3708151B2 (ja) * 1994-12-15 2005-10-19 協和醗酵工業株式会社 Peg化したヒト顆粒球コロニー刺激因子の定量法
JP3521382B2 (ja) * 1997-02-27 2004-04-19 日本たばこ産業株式会社 細胞間接着及びシグナル伝達を媒介する細胞表面分子
ATE510214T1 (de) 2000-11-30 2011-06-15 Crawford Healthcare Holdings Ltd Krankheitsdiagnose
HUE032584T2 (en) * 2006-02-08 2017-09-28 Morphotek Inc Antigen GM-CSF peptides and GM-CSF antibodies
NZ591235A (en) 2008-07-23 2012-07-27 Ambrx Inc Modified bovine g-csf polypeptides comprising non natural amino acid and their uses treating infections such as mastitis
AR083006A1 (es) 2010-09-23 2013-01-23 Lilly Co Eli Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas
CN103361355B (zh) * 2013-07-29 2016-01-20 暨南大学 编码重组rhHER2-mAb人源化单克隆抗体的基因及其应用
CN103592439B (zh) * 2013-09-03 2015-10-21 天津亿美诺生物科技有限公司 人尿路上皮癌特异性抗体及其应用
JP6742300B2 (ja) 2014-07-14 2020-08-19 ジェンノヴァ バイオファーマシューティカルズ リミテッド rHu−GCSFの精製のための新規プロセス
CN107748251A (zh) * 2017-09-30 2018-03-02 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 一种粒细胞集落刺激因子检测试剂盒的制备方法
CN107576806A (zh) * 2017-09-30 2018-01-12 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 一种粒细胞集落刺激因子检测试剂盒及其使用方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6030654B2 (ja) * 1980-12-31 1985-07-17 株式会社林原生物化学研究所 ヒトコロニ−刺激因子の製造方法
CA1209907A (en) * 1982-04-12 1986-08-19 Richard M. Bartholomew Method of affinity purification employing monoclonal antibodies
US4558005A (en) * 1982-09-13 1985-12-10 University Patents, Inc. Monoclonal anti-erythropoietin
US4504586A (en) * 1983-02-03 1985-03-12 Amgen Hybridoma tumor cell lines and their monoclonal antibodies to human colony stimulating factor subclass number 1
US4558006A (en) * 1983-02-04 1985-12-10 Kirin-Amgen, Inc. A.T.C.C. HB8209 and its monoclonal antibody to erythropoietin
JPS61227526A (ja) * 1984-07-25 1986-10-09 Chugai Pharmaceut Co Ltd 新規なコロニー刺激因子
JPS63500636A (ja) * 1985-08-23 1988-03-10 麒麟麦酒株式会社 多分化能性顆粒球コロニー刺激因子をコードするdna
US4810643A (en) * 1985-08-23 1989-03-07 Kirin- Amgen Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
JPH0630619B2 (ja) * 1985-12-03 1994-04-27 中外製薬株式会社 モノクロ−ナル抗ヒト顆粒球コロニ−刺激因子抗体

Also Published As

Publication number Publication date
PT83892A (en) 1987-01-01
CN1035628C (zh) 1997-08-13
IL80718A0 (en) 1987-02-27
DK412887D0 (da) 1987-08-07
FI91542C (fi) 1994-07-11
CN86107666A (zh) 1987-09-30
CA1296662C (en) 1992-03-03
EP0227367A3 (en) 1988-06-15
FI91542B (fi) 1994-03-31
PT83892B (pt) 1989-06-30
ES2046173T3 (es) 1994-02-01
US5552286A (en) 1996-09-03
CN1073208A (zh) 1993-06-16
JPH0745519B2 (ja) 1995-05-17
NZ218336A (en) 1991-08-27
FI873418A (fi) 1987-08-06
DK173517B1 (da) 2001-01-22
EP0227367B1 (en) 1992-03-11
GR3004612T3 (no) 1993-04-28
NO873334D0 (no) 1987-08-10
ATE73491T1 (de) 1992-03-15
NO873334L (no) 1987-08-10
AU6629586A (en) 1987-06-30
CN1070611C (zh) 2001-09-05
EP0227367A2 (en) 1987-07-01
JPS63501769A (ja) 1988-07-21
NO170031C (no) 1992-09-02
IL80718A (en) 1991-07-18
DE3684264D1 (de) 1992-04-16
WO1987003689A1 (en) 1987-06-18
ZA869042B (en) 1987-08-26
FI873418A0 (fi) 1987-08-06
KR880700936A (ko) 1988-04-13
AU601958B2 (en) 1990-09-27
KR970000637B1 (ko) 1997-01-16
DK412887A (da) 1987-08-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4472500A (en) Rat myeloma cell lines
EP0014519B1 (en) Cell lines, process for preparing them and process for producing antibodies
US4578335A (en) Interleukin 2 receptor
FI91421C (fi) Menetelmä ihmisen kasvainkuoliotekijän (TNF) kanssa reagoivan monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi ja vasta-ainetta tuottava hybridisolulinja
US4504586A (en) Hybridoma tumor cell lines and their monoclonal antibodies to human colony stimulating factor subclass number 1
NO303544B1 (no) FremgangsmÕte for fremstilling av et polypeptid med Ún eller flere av de hematopoietiske biologiske egenskaper til granulocyttkolonistimulerende faktor (hpG-CSF)
NO170031B (no) Monoklonalt antistoff, murin-avledet hybridomcellelinje, samt anvendelse av antistoffet for isolering eller kvantitativ paavisning av human flerpotent granulocyttkolonistimulerende faktor (hpg-csf)
US5051364A (en) Anti-lipocortin-I and anti-lipocortin-II monoclonal antibodies
US4845198A (en) Hybridoma antibody which binds IL-2 receptor
EP0265384A2 (en) Monoclonal antibodies to a colony stimulating factor
CA1330768C (en) Monoclonal anti-human granulocyte colony stimulating factor antibody
EP0519728A2 (en) Anti-TCF-II monoclonal antibodies and method for the measurement of TCF-II by applying the antibodies
EP0243485B1 (en) Hybridoma tumor cell lines and their monoclonal antibodies to thaumatin
EP0328690B1 (en) Method for diagnosing chronic articular rheumatism
US5262523A (en) Antibodies reactive with normal and oncogenic forms of the ras p21 protein
DK175551B1 (da) Isoleret polypeptid med hæmatopoietiske biologiske egenskaber som naturligt forekommende hpG-CSF, DNA-sekvens kodende for denne, plasmider indeholdende sekvensen, hermed transformerede/transficerede.....
JPS60204727A (ja) 抗ヒトv型コラ−ゲン抗体
WO1986002366A1 (en) Aotus interspecies hybridomas and monoclonal receptors produced thereby
JPH0532034B2 (no)
JPH09131179A (ja) 動物細胞培養用添加剤

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired