JP2016531090A - ヒト抗ｉｆｎ−アルファ抗体 - Google Patents

ヒト抗ｉｆｎ−アルファ抗体 Download PDF

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Abstract

ヒト起源の新規なＩＦＮ−α結合分子、具体的には、ヒト由来の抗ＩＦＮ−α抗体、ならびに、そのＩＦＮ−α結合性の断片、誘導体および変異体が提供される。加えて、診断および治療において使用されるための医薬組成物、キットおよび方法が記載される。

Description

本発明は概して、哺乳動物起源（好ましくはヒト起源）のＩＦＮ−αと結合する新規な分子、特に、ＩＦＮ−αの種々のサブタイプを認識するヒトモノクローナル抗体、ならびに、その断片、誘導体および変異体に関連する。具体的には、組換えによるヒト患者由来の抗ＩＦＮ−α抗体およびその作製方法が提供される。加えて、様々な障害の処置および診断において有用であるそのような結合分子、抗体およびその模倣体を含む組成物が記載される。さらに、本発明は、自己免疫性障害および自己炎症性障害ならびに悪性腫瘍（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および１型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）など）の免疫療法において使用されるための薬剤としての自己抗体、同様にまた、自己免疫性障害および自己炎症性障害ならびに悪性腫瘍（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および１型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）など）の治療的介入における標的としての自己抗体に関連する。より具体的には、本発明は、免疫調節に関与する遺伝子における変異に典型的には起因する損なわれた中枢性寛容および／または末梢性寛容あるいは自己寛容の喪失に冒された被験体に由来するＢ細胞から単離されているモノクローナル自己抗体に関連する。
免疫系の不適切な応答は、関与する生物に対するストレス性の症状を生じさせる場合がある。動物またはヒトの健康状態に対する著しい影響を通常の場合には有しない異物または身体状態に対する過度な免疫応答により、軽微な反応（例えば、皮膚のかぶれなど）から、命を脅かす状況（例えば、アナフィラキシーショックまたは様々なタイプの血管炎など）にまで及ぶ様々な症状を伴うアレルギーが引き起こされる場合がある。内因性抗原に対する免疫応答により、様々な自己免性疫障害（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、１型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病（Ｔ１ＤＭまたはＩＤＤＭ）および種々の形態の関節炎など）が生じる場合がある。
免疫反応は協調的に起こるものであり、いくつかの細胞が関与し、関与する細胞間のシグナル伝達分子（例えば、サイトカイン）による情報伝達を必要とする。この情報伝達は、例えば、シグナルの妨害または各受容体の遮断によって影響され得るかまたは阻害され得る。
サイトカインは、全身的レベルで作用するという点で古典的なホルモンのように挙動するナノモル濃度からピコモル濃度での体液性調節因子として作用し、また、正常な状態または病理学的な状態のどちらのもとでも個々の細胞および組織の機能的活性を調節する分泌された可溶性のタンパク質、ペプチドおよび糖タンパク質である。サイトカインは、特化した腺において組織される特化した細胞によって産生されないという点で、すなわち、様々なサイトカインが、先天免疫および適応免疫に関与する事実上すべての細胞によって、例えば、上皮細胞、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびとりわけＴ細胞（その中で際立っているのがＴヘルパー（Ｔｈ）リンパ球である）などによって発現されるように、これらの媒介因子のためのただ１つの器官供給源または細胞供給源が存在しないという点でホルモンとは異なる。
そのそれぞれの機能に依存して、サイトカインは、３つの機能的カテゴリー、すなわち、自然免疫応答を調節すること、適応免疫応答を調節すること、および、造血を刺激することの３つの機能的カテゴリーに分類される場合がある。前記３つのカテゴリーの中でのそれらの多面発現性活性のために、例えば、細胞の活性化、増殖、分化、動員または他の生理学的応答（例えば、炎症について特徴的なタンパク質の標的細胞による分泌）に関するそれらの多面発現的活性のために、異常に調節されたサイトカイン産生によって媒介される細胞シグナル伝達の妨害が、不完全な免疫応答に伴う多くの障害（例えば、炎症およびガンなど）の原因として見出されている。
インターフェロン（ＩＦＮ）は、３つの知られているタンパク質ファミリー（Ｉ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロンおよびＩＩＩ型インターフェロン）からなり、サイトカインの最も重要なクラスの１つを構成する。すべてのヒトＩ型インターフェロンは、２つの膜貫通タンパク質（ＩＦＮＡＲ−１およびＩＦＮＡＲ−２）からなる細胞表面受容体（ＩＦＮ−アルファ受容体、ＩＦＮＡＲ）に結合し、これにより、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ活性化、ＩＳＧＦ３の形成、および、それに続く遺伝子発現の開始を引き起こす（非特許文献１）。Ｉ型ＩＦＮの組成物、受容体およびシグナル伝達経路が、例えば、非特許文献２；非特許文献３において総説されている。Ｉ型インターフェロンは、構造的に関連するファミリー（ＩＦＮ−α（アルファ）、ＩＦＮ−β（ベータ）、ＩＦＮ−κ（カッパ）、ＩＦＮ−δ（デルタ）、ＩＦＮ−ε（エプシロン）、ＩＦＮ−τ（タウ）、ＩＦＮ−ω（オメガ）およびＩＦＮ−ζ（ゼータ））を形成しており、それらのうちのＩＦＮ−δおよびＩＦＮ−τはヒトには存在しない。ヒトのＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の遺伝子はヒト染色体９ｐ２１においてクラスターを形成し、マウスの遺伝子はマウス第４染色体における保存されたシンテニーの領域に位置する。今までのところ、１４個のＩＦＮ−α遺伝子および３個の偽遺伝子がマウスにおいて特定されている。ヒトにおいては、１３個のＩＦＮ−α（またはＩＦＮＡ）遺伝子（ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７およびＩＦＮＡ２１）および１個の偽遺伝子が特定されており、２つのヒトＩＦＮ−α遺伝子（ＩＦＮＡ１／ＩＦＮ−α１およびＩＦＮＡ１３／ＩＦＮ−α１３）が同一のタンパク質をコードする（非特許文献４）。
ＩＦＮ−γはただ１つのＩＩ型インターフェロンである。これは主に、マクロファージ刺激による抗菌機構および抗腫瘍機構の誘導に関与する。ＩＦＮ−γ受容体（ＩＦＮＧＲ）は、２つのシグナル伝達性ＩＦＮＧＲ２鎖と会合する２つのリガンド結合性ＩＦＮＧＲ１鎖から構成されるヘテロダイマー型受容体である（非特許文献５；非特許文献６）。ＩＩＩ型インターフェロンが３つのサブタイプからなり、ＩＦＮλとも呼ばれ（ＩＦＮλ１またはＩＬ−２９、ＩＦＮλ２またはＩＬ−２８Ａ、および、ＩＦＮλ３またはＩＬ−２８Ｂ）、抗ウイルス活性、抗腫瘍活性および免疫調節活性を有する。ＩＦＮ−λ受容体もまた、特異なリガンド結合鎖のＩＦＮ−λＲ１（これはまたＩＬ−２８Ｒαと称される）と、アクセサリー鎖のＩＬ−１０Ｒ２（これは、ＩＬ−１０関連サイトカインについての受容体と共有される）とからなるヘテロダイマー型複合体である（非特許文献７）。
Ｉ型インターフェロンは、抗ウイルス機能、抗腫瘍機能および免疫調節機能を有する多面発現性サイトカインである。状況に依存して、Ｉ型インターフェロンは、抗炎症性および組織保護的または前炎症性となる可能性があり、また、自己免疫を促進させることができる。ＩＦＮ−β１ａまたはＩＦＮ−β１ｂは、多発性硬化症の処置のために、また、ＩＦＮ−α２ｂ療法は多くのガン（黒色腫、造血性悪性腫瘍）のために使用される。上昇したＩＦＮ−α活性が全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者の血清においてしばしば検出されており、このことは、ＩＦＮ−αが中心的役割をＳＬＥの発症において果たすことを示している（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。
他方で、インターフェロン依存性遺伝子の特異的な発現パターン（これは「インターフェロンシグナチャー」と呼ばれる）が、様々な自己免疫性障害の患者（例えば、ＳＬＥ、Ｔ１ＤＭ、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、多発性硬化症（ＭＳ）、乾癬およびリウマチ性関節炎（ＲＡ）の患者など）の白血球において示される。加えて、炎症性関節炎、ＭＳおよびＴ１ＤＭの発症が、ＩＦＮ−α療法の期間中に繰り返し観察されており、このことは、ＩＦＮ−αがそれらの疾患を少なくとも促進させることを示している（非特許文献１２）。さらなるデータにより、ＩＦＮ−αの関与が、筋炎、全身性強皮症、慢性乾癬において示唆され（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）、また、自己免疫性甲状腺炎において示唆される（非特許文献１６）。
したがって、このような背景的状況に依存して、ＲＡ、ＭＳおよび種々の白血病の場合でのようなＩ型インターフェロンによる処置、または、例えば、ＳＬＥの場合でのような、Ｉ型インターフェロンを中和する抗体による処置が適応されることがある場合には、このまさに同じ処置は、自己免疫、炎症およびインターフェロン処置関連毒性を促進させることによって、または、それどころか、ＭＳおよびＴ１ＤＭなどの疾患の発症を引き起こすことによって患者には有害となることがある。これらの種々の影響における１つの要因が、種々のＩＦＮサブタイプが同じ細胞表面受容体複合体を活性化するにもかかわらず、これらのＩＦＮサブタイプが、細胞タイプ依存的でもある一定しない応答を媒介するという事実から生じることがある（非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９）。したがって、処置は好ましくは、選択的様式で、つまり、所与の病理学的状態に伴う特定のＩＦＮ−αサブタイプのみが患者に投与されるか、または、所与の病理学的状態に伴う特定のＩＦＮ−αサブタイプが中和される選択的様式で行われなければならない。ＩＦＮ−α処置に関して、そのような選択性が、治療目的のための高度に精製されたＩＦＮ−α調製物の使用によって得られる場合がある（非特許文献１８）。しかしながら、ＩＦＮ−α抗体の使用に関しては、選択性を特定のＩＦＮ−αサブタイプに関して得ることはより困難である。これは、アミノ酸レベルでの大きい度合の相同性が存在しており、８０％〜９５％の相同性が上記ＩＦＮ−αサブタイプの間には存在し、５０％の相同性がＩＦＮ−βに関して存在するからである。したがって、すべてのヒトＩＦＮＡサブタイプ、選択されたヒトＩＦＮＡサブタイプまたは特定のヒトＩＦＮＡサブタイプ（これらは、治療的適応および／または診断的適応に依存して選択的に使用され得るかもしれない）に対する様々な特異性の、ヒトにおいて許容され得るＩＦＮ−α抗体のプールを提供することが望ましいであろう。
この目的を達成するための第１の試みが既に行われている。例えば、特許文献１には、ヒトＩＦＮ−αの３個の異なるサブタイプおよび１３個の異なるサブタイプの間で中和するいくつかのマウス抗ヒトＩＦＮ−α抗体の単離が記載され、特許文献２には、ヒトＩＦＮ−αの７個のサブタイプを認識するマウス抗ヒトＩＦＮ−α抗体およびそのヒト化体が記載される。しかしながら、これまでに提供された、必ずしもすべてではないとしても、ほとんどの抗ＩＦＮ抗体がマウス起源のものであり、したがって、これらの抗ＩＦＮ抗体はヒトにおける有害な反応を受けやすい。
ヒトにおけるマウス抗体のような外来抗体に対する免疫学的応答（ＨＡＭＡ応答；非特許文献２０；非特許文献２１）のために、ほとんどヒト化された抗体が現在の治療アプローチでは使用される（非特許文献２２；非特許文献２３）。そのような抗体を獲得するための１つのアプローチが、相補性決定領域（ＣＤＲ）を完全にヒトのフレームワークに移し替えること、すなわち、抗体ヒト化として知られているプロセスであった（非特許文献２４）。このアプローチは多くの場合、マウスＣＤＲがヒトの可変ドメインフレームワークに容易に移らず、その結果、元になったそのマウス抗体と比較して、ヒト化抗体のより低い親和性が生じるという事実によって複雑化される。したがって、さらなる、そして、精巧な変異誘発実験が多くの場合、そのように操作された抗体の親和性を増大させるために要求される。ヒト化抗体を達成するための別のアプローチが、その生来の抗体遺伝子がヒト抗体遺伝子により置き換えられているマウスを免疫化すること、および、これらの動物によって産生される抗体を単離することである。しかしながら、この方法は依然として、抗原による免疫化を必要とし、そのため、この方法は、すべての抗原に関して、それらのいくつかの毒性のために可能であるとは限らない。さらには、この方法は、特定の系統のトランスジェニックマウスの作製に限定される。
別の方法が、例えば、特許文献３においてＩＬ−１３特異的抗体の作製のために記載されるようなヒト抗体のライブラリ（例えば、ファージディスプレイなど）を使用することである。この場合、バクテリオファージが、ヒト抗体遺伝子をファージ集団に挿入することによってヒトｓｃＦｖ／Ｆａｂ断片をバクテリオファージの表面に呈示させるために操作される。残念ながら、この方法のいくつかの欠点が同様に存在し、これらには、多価呈示のためのタンパク質配列のサイズ制限、タンパク質（すなわち、抗体ｓｃＦｖ／Ｆａｂ断片）を細菌から分泌させることが要求されること、ライブラリのサイズ制限、産生および試験される可能な抗体の限定された数、自然の免疫化によってもたらされる体細胞高頻度突然変を有する抗体の低下した割合、ならびに、ファージによってコードされるすべてのタンパク質が融合タンパク質であること（このことは、いくつかのタンパク質が結合するための活性または接近性を制限する場合がある）が含まれる。同様に、特許文献４には、自己抗体をファージに呈示される抗体セグメントレパートリーから生成することが記載される。ファージライブラリが、この点では免疫化されていないヒトから作製される（例えば、実施例１；１６頁４３行〜５１行；実施例２、１７頁、段落［０１５８］、５７行〜５８行を参照のこと）。しかしながら、この特許出願に記載される方法もまた、哺乳動物（すなわち、ヒト）の身体において産生され、かつ、成熟化される抗体と比較して、ファージライブラリから作製される抗体の上述の一般的な欠点に悩まされている。
同じことが、ほとんどのＩＦＮ−αサブタイプに結合し、これらを特異的に中和し、それにより、Ｉ型ＩＦＮ受容体を介するシグナル伝達を妨げる最も顕著な抗ＩＦＮαモノクローナル抗体のシファリムマブ（Ｓｉｆａｌｉｍｕｍａｂ）（以前はＭＥＤＩ−５４５）に当てはまる。シファリムマブは、「ヒト」抗ＩＦＮαモノクローナル抗体であると言われ、しかし、実際には、ヒト化マウス、すなわち、ヒト生殖系列レパートリーの最大画分が導入されたトランスジェニックマウスに基づく前身会社ＭｅｄａｒｅｘのＵｌｔｉＭａｂプラットフォームに由来している。
それにもかかわらず、ヒト化マウスに由来する抗体のアミノ酸配列はヒト起源のものであるが、これらの抗体は人為的であり、真にヒト型ではない。これは、それらは、ヒトにおける免疫化、組換え、選抜および親和性成熟を受けていないからであり、そのため、特にヒト由来抗体と比較して、それらは免疫原性であり、かつ、それほど効果的でないという危険性が依然として存在する。
上記のことを考慮すると、単独療法またはコンビナトリアルアプローチのどちらについてでもヒトにおいて許容され得る、特定のヒトＩＦＮ−αサブタイプについての大きい特異性があり、選択された範囲のＩＮＦ−αサブタイプについて特異的であり、または、すべてのＩＮＦ−αサブタイプについて特異的である、結合分子のようなさらなる新しい化合物が依然として求められている。
この問題に対する解決策が、さらには、下記における請求項において特徴づけられ、また、説明において開示され、また、実施例および図において例示されるような本発明の実施形態によって提供される。
米国特許出願公開ＵＳ２００９／０２１４５６５Ａ１ 米国特許第７，０８７，７２６号（Ｂ２） 国際出願公開ＷＯ２００５／００７６９９ 欧州特許出願ＥＰ０６１６６４０Ａ１
ＰｌａｔａｎｉａｓおよびＦｉｓｈ、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（１９９９）、１５８３〜１５９２ Ｓｔａｒｋ他、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）、２２７〜６４ Ｐｅｓｔｋａ Ｓ．、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（２０００）、２５４〜８７ ｖａｎ Ｐｅｓｃｈ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００４）、８２１９〜８２２８ Ｓｃｈｒｏｄｅｒ他、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．、７５（２００４）、１６３〜１８９ Ｂａｃｈ他、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５（１９９７）、５６３〜５９１ Ｌｉ他、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．、８６（２００９）、２３〜３２ ＲｏｎｎｂｌｏｍおよびＡｌｍ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（２００１）、Ｆ５９〜Ｆ６３ Ｃｒｏｗ ＭＫ、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．（２００３）、２３９６〜２４０１ Ｃｒｏｗ ＭＫ．、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００７）、３５９〜３８６ Ｃｒｏｗ ＭＫ．、Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．（２０１０）、１７３〜１８６ Ｃｒｏｗ ＭＫ．、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ．（２０１０）、増刊１：Ｓ５ Ｈｉｇｇｓ他、Ｅｕｒ Ｍｕｓｃ Ｒｅｖ（２０１２）、２２〜２８ Ｂｉｓｓｏｎｎｅｔｔｅ他、Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｄｅｒｍａｔｏｌ（２００９）、４２７〜４３６ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ＳＡ、Ａｒｔｈ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ（２０１０）：Ｓ４ ＰｒｕｍｍｅｌおよびＬａｕｒｂｅｒｇ、Ｔｈｙｒｏｉｄ（２００３）、５４７〜５５１ ｖａｎ Ｐｅｓｃｈ他、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７８（２００４）、８２１９〜８２２８ Ａｎｔｏｎｅｌｌｉ Ｇ．、Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３１（２００８）、３０５〜３１８ Ｇｉｂｂｅｒｔ他、ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．、８（２０１２）、ｅ１００２８６８ Ｓｃｈｒｏｆｆ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４５（１９８５）、８７９〜８８５ Ｓｈａｗｌｅｒ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３５（１９８５）、１５３０〜１５３５ ＣｈａｎおよびＣａｒｔｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１０（２０１０）、３０１〜３１６ Ｎｅｌｓｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、９（２０１０）、７６７〜７７４ Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１（１９８６）、５２２〜５２５
本発明は、ＩＦＮ−α特異的なヒトモノクローナル抗体およびそのＩＦＮ−α結合断片に関連する。具体的には、ＩＦＮ−αサブタイプに対する選択的な結合プロファイルを有し、かつ、実施例および図において示されるような結合活性および中和活性を示すヒトモノクローナル抗ＩＦＮ−α抗体が提供される。それらの中和特性のために、本発明の抗体は、治療的有用性、予後的有用性および診断的有用性を有しており、このような有用性は、本発明の抗体を、望まれない免疫応答の開始および／または維持におけるＩＦＮ−α活性に伴う／望まれない免疫応答の開始および／または維持におけるＩＦＮ−α活性を伴う多種多様な自己免疫性または自己炎症性の障害および状態に関連しての様々な適用のために特に有益にしており、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、様々な形態の関節炎（これには、関節リウマチ（ＲＡ）が含まれるが、これに限定されない）、１型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病（Ｔ１ＤＭまたはＩＤＤＭ）、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、多発性硬化症（ＭＳ）、乾癬、慢性乾癬、筋炎、全身性強皮症、自己免疫性甲状腺炎およびガン（白血病（ＡＬＬ）を含む）などに関連しての様々な適用のために特に有益にしている（Ｅｉｎａｖ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２４（２００５）、６３６７〜６３７５）；同様に、様々なＩＦＮ−αサブタイプおよびそれらの起こり得る併発障害、ならびに、関連した治療的応用、診断適応用および／または予後適用における本発明の抗体の可能な適応に対する関わり合いを記載する上記のセクション「背景技術」を参照のこと。
本発明の抗体は好ましくは、自己寛容の乱された発生または脱調節された発生（好ましくは、一遺伝子性の自己免疫性障害によって引き起こされるもの）に起因することがある、あるいは伴うことがある損なわれた中枢性寛容および／あるいは末梢性寛容または自己寛容の喪失に冒される哺乳動物（具体的にはヒト）から単離される。本発明による自己抗体のための特に好適な供給源を提供する哺乳動物の例が、ＡＩＲＥ（自己免疫調節因子）遺伝子における変異に伴う障害を有する哺乳動物（例えば、ヒト）、例えば、自己免疫性多腺性内分泌不全症症候群１型（ＡＰＳ１）（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ他、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８（２００８）、９４８〜９５７）、自己免疫性多腺性内分泌不全症症候群２型（ＡＰＳ２）（Ｂａｋｅｒ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、９５（２０１０）、Ｅ２６３〜Ｅ２７０）およびＸ連鎖免疫調節異常・多発性内分泌障害腸症候群（ＩＰＥＸ）（Ｐｏｗｅｌｌ他、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．、１００（１９８２）、７３１〜７３７；Ｏｃｈｓ他、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、２０３（２００５）、１５６〜１６４）などを有するヒトである。好ましくは、抗体が単離された患者は、紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）については無症状であり、かつ、血清反応性をｄｓＤＮＡおよびヒトＩＦＮ−αサブタイプの少なくとも１つ少なくとも１つに対して示すことによって特徴づけられるＡＰＳ１患者である。
具体的には、本発明によれば、初めて、ヒト由来およびヒト患者由来の様々な抗ＩＦＮ−α抗体には、異なるＩＦＮ−α結合プロファイルおよびＩＦＮ−α中和活性が備わっており、これにより、これらのヒト由来およびヒト患者由来の抗ＩＦＮ−α抗体は単独または組合せで、実質的にすべてのＩＦＮ−αサブタイプを網羅する。
したがって、１つの局面において、本発明は概して、いくつかのＩＦＮ−αサブタイプに対する高親和性の中和モノクローナル抗体に関連する。さらなる局面において、本発明は、下記で詳しく記載される、いくつかのＩＦＮ−αサブタイプに対するヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂまたはＭＡＢ）、すなわち、ヒトＩＦＮ−α（ＩＦＮＡ）サブタイプであるＩＦＮ−α１／１３（ＩＦＮＡ１／１３；ＩＦＮＡ１ｂ）、ＩＦＮ−α２（ＩＦＮＡ２）、ＩＦＮ−α４（ＩＦＮＡ４）、ＩＦＮ−α５（ＩＦＮＡ５）、ＩＦＮ−α６（ＩＦＮＡ６）、ＩＦＮ−α８（ＩＦＮＡ８）、ＩＦＮ−α１０（ＩＦＮＡ１０）、ＩＦＮ−α１４（ＩＦＮＡ１４）またはＩＦＮ−α２１（ＩＦＮＡ２１）のうちの少なくとも１つに対するヒトモノクローナル抗体であって、それらのサイトカインが関与する障害のための安全かつ効果的な治療剤とあると見なされるヒトモノクローナル抗体に関連する。１つの実施形態において、本発明のＩＦＮ−α分子は、何ら有意な程度に、ＩＦＮ−β（ベータ型インターフェロン、ＩＦＮＢ）、ＩＦＮ−γ（ガンマ型インターフェロン、ＩＦＮＧ）またはＩＦＮ−ω（インターフェロン・オメガ、ＩＦＮＷ）とは結合せず、ならびに／あるいは、ＩＦＮ−β（ベータ型インターフェロン、ＩＦＮＢ）、ＩＦＮ−γ（ガンマ型インターフェロン、ＩＦＮＧ）またはＩＦＮ−ω（インターフェロン・オメガ、ＩＦＮＷ）を中和しない。
別の実施形態において、本発明によれば、さらにＩＦＮ−ωに結合し、かつ、ＩＦＮ−ωの活性を中和する様々な抗ＩＦＮ−α抗体がそれぞれ提供され、これらは、その抗原特性においてＩＦＮ−αには関連がないとこれまで記載されたものである。この抗体は通常、免疫アッセイまたは抗ウイルス中和バイオアッセイにおいて抗血清またはモノクローナル抗体と交差反応しないからである。したがって、１つの局面において、本発明は、少なくとも１つのヒトＩＦＮ−αサブタイプおよびヒトＩＦＮ−ωに結合すること、ならびに、少なくとも１つのヒトＩＦＮ−αサブタイプの活性およびヒトＩＦＮ−ωの活性を中和することが可能である新規なＩＦＮ結合分子、好ましくはヒト由来モノクローナル抗体、ならびに、その断片および生物工学誘導体に関連する。好ましくは、ＩＦＮ結合分子の結合活性および中和活性はそれぞれ、ＩＦＮ−αサブタイプ（１つまたは複数）およびＩＦＮ−ωについての本質的に同じであり、または少なくとも同じ程度の大きさである。
当然のことながら、本発明は、本発明の抗体の少なくとも１つの可変領域、定常領域および／または相補性決定領域をコードする核酸（具体的にはｃＤＮＡ）、そのような核酸を含むベクター、抗体を産生する細胞株および組換え細胞にまで及ぶ。本発明はさらに、本発明に従って単離される抗体によって認識される結合分子またはペプチドを含む医薬組成物、診断アッセイおよびキット、ならびに、それらに基づく治療方法に関連する。
加えて、本発明は、ヒト由来の抗ＩＦＮＡモノクローナル抗体および抗ＩＦＮＡ／ＩＦＮＷモノクローナル抗体をそれぞれ、あるいは、そのＩＦＮ結合断片または生物工学誘導体を製造するための、あるいは、該抗ＩＦＮＡモノクローナル抗体および抗ＩＦＮＡ／ＩＦＮＷモノクローナル抗体をそれぞれ含み、またはそのＩＦＮ結合断片もしくは生物工学誘導体を含む組成物を製造するためのプロセスであって、その製造が、該抗体、そのＩＦＮ結合断片または生物工学誘導体を、前記抗体、そのＩＦＮ結合断片または生物工学誘導体をコードする形質転換用ＤＮＡの組換え宿主生物における発現によって調製する工程を含む、プロセスに関連する。１つの実施形態において、組成物は医薬組成物であり、該抗体、そのＩＦＮ結合断片または生物工学誘導体を調製する工程の後には、該抗体、そのＩＦＮ結合断片または生物工学誘導体を医薬組成物の製造において薬学的に許容され得る担体と混合することが続く。
本発明は、本発明に従って行われ、また、実施例に記載される実験において初めて得られたヒト由来抗体に言及することによって例示され、また、記載されるが、本発明の抗体または抗体断片には、本件抗体の機能的性質の１つまたは複数を保持する、具体的にはＩＦＮＡおよびＩＦＮＷに対するその中和活性を保持するどのような操作された抗体または抗体様ＩＦＮ結合分子（これらは化学的技術または組換え技術によって合成される）をも意味する抗体の合成誘導体および生物工学誘導体が含まれることを理解しなければならない。したがって、本発明は、簡潔さのために、抗体に言及することによって記載されることがあるが、別途述べられる場合を除き、その合成誘導体および生物工学誘導体、ならびに、等価なＩＦＮ結合分子が抗体の用語の意味により意味され、かつ、含まれることを理解されたい。
本発明のさらなる実施形態が下記の説明および実施例から明らかであろう。
本発明の抗ＩＦＮ−α特異的ヒト抗体の可変領域、すなわち、重鎖およびカッパ／ラムダ軽鎖（ＶＨ、ＶＬ）のアミノ酸配列。ＩｇＧ１型かつカッパ型の抗ＩＦＮ−α特異的抗体Ａ：５Ｄ１、Ｂ：１３Ｂ１１、Ｃ：１９Ｄ１１、Ｄ：２５Ｃ３、Ｅ：２６Ｂ９、Ｆ：３１Ｂ４、Ｇ：８Ｈ１、Ｈ：１２Ｈ５、および、Ｉ：５０Ｅ１１。フレームワーク領域（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）が示され、ＣＤＲには下線が引かれる。斜体字のアミノ酸は、配列決定がなされていないが、データベースから得られている配列を示している。クローニング戦略に起因して、重鎖および軽鎖のＮ末端におけるアミノ酸配列は潜在的にはプライマー誘発変化をＦＲ１において含有する場合があり、しかしながら、この変化は抗体の生物学的活性には実質的な影響を与えない。 交差競合−エピトープマッピング。異なった結合部位に対する、本発明の例示的な抗ＩＦＮＡ ＭＡＢの示差的結合を、Ａ：ＩＦＮＡ２、Ｂ：ＩＦＮＡ４およびＣ：ＩＦＮＡ１４についての交差競合実験において調べた。ＩＦＮ−α非結合コントロール（ｈＩｇＧ１）として、非関連の抗原に結合するヒト抗体が使用されている。 ＥＬＩＳＡによるＥＣ５０決定。５Ｄ１、１３Ｂ１１、２５Ｃ３および２６Ｂ９の各ｈＭＡＢの、Ａ：ＩＦＮＡ２、Ｂ：ＩＦＮＡ４、および、Ｃ：ＩＦＮＡ１４に対するＥＣ５０結合。ＩＦＮＡ２／−４／−１４に対する、Ｄ：１９Ｄ１１およびＥ：３１Ｂ４の各ｈＭＡＢのＥＣ５０結合。 ＡＰＳ１患者における知られている疾患関連自己抗体および保護的自己抗体の存在を相関させることにより、ＩＦＮ−α自己抗体がＡＰＳ１患者における紅斑性狼瘡の発症を妨げることが示される（ｄｓＤＮＡ欄〜ＩＦＮα１４欄）。標的：相関研究において調べられる特定のＡＰＳ１患者のコード化番号。抗ｄｓＤＮＡ抗体はＳＬＥについて非常に特異的であり、この疾患の診断において使用される。ＡＰＳ１患者は誰も、ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ分析（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって評価されるような抗ｄｓＤＮＡ抗体がよく存在するにもかかわらず、狼瘡を有しない。ＡＰＳ１患者は、顕著な血清反応性を、狼瘡が関わる多くの分子機構に関与する臨床的に関連した薬物標的であるいくつかのＩＦＮ−αサブタイプに対して示す。丸は存在を示し、空欄は特定の抗体の非存在を示す。患者２、患者４、患者１３および患者２１（黒矢印）はＴ１ＤＭ患者である。患者１０、患者１４、患者１６、患者１７および患者１８（白矢印）は、Ｔ１ＤＭであることの特徴を有しており、しかし、Ｔ１ＤＭ患者ではない。これらの結果は、Ｔ１ＤＭに罹患するＡＰＳ１患者、および、Ｔ１ＤＭ患者でないＡＰＳ１患者の血清における示差的な中和活性を示唆する。図３１および図３２から推測され得るように、この場合に認められるこの違いは、個々の抗ＩＦＮ抗体の中和活性における違いではなく、むしろ、抗ＩＦＮ抗体の力価が両方の患者クラスにおいて異なることに起因しているようであり、はるかにより大きい抗体力価が、Ｔ１ＤＭに罹患していないＡＰＳ１患者には存在する。 ヒト由来の抗ＩＦＮ−αモノクローナル抗体により、ｒｈＩＦＮＡ媒介のＳＴＡＴ１活性化がＨＥＫ２９３Ｔ細胞において中和される。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を非処置（−）のままにしたか、あるいは、抗体の非存在下、または、示されるようなヒト由来ＩＦＮＡモノクローナル抗体もしくはヒトコントロールＩｇＧ（Ｃｔｒｌ）の存在下、様々な組換えヒトｒｈＩＦＮＡまたはＩＦＮ−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質（ｇ１ ＩＦＮ）により刺激した（＋）。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、リン酸化ＳＴＡＴ１レベル（ｐＳＴＡＴ１）をウエスタンブロットで可視化した。総ＳＴＡＴ１レベルまたはチューブリンレベルが負荷コントロールとして役立つ。抗体濃度：５μｇ／ｍｌ。ｒｈＩＦＮＡ濃度：１０ｎｇ／ｍｌ（ｒｈＩＦＮＡ１）、２ｎｇ／ｍｌ（すべての他のｒｈＩＦＮ）；ＩＦＮ−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質を一過性に発現する２９３Ｔ細胞のｇ１ ＩＦＮＡ含有上清をそれらのそれぞれのＥＣ８０希釈で使用した。Ａ１：コントロール：１００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮＡ２／−４／−１４の刺激の後での２９３Ｔ細胞におけるウエスタンブロット（ＷＢ）による総ＳＴＡＴ１およびリン酸化ＳＴＡＴ１（ｐＳＴＡＴ１）の検出。ＩＦＮＡ２／−４／−１４による２９３Ｔ細胞の刺激。（ｉ）：リン酸化ＳＴＡＴ１、（ｉｉ）：総ＳＴＡＴ１、（ｉｉｉ）：チューブリン負荷コントロール。時間：それぞれのＩＦＮによる細胞の処置継続期間を示す。刺激後、リン酸化ＳＴＡＴ１を３つすべてのＩＦＮＡサブタイプについて認めることができる。それぞれの分子量（ｋＤａ）標準物バンドの位置が比較のためにブロットの左側に示される。Ａ２：コントロール：異なる用量のｒｈＩＦＮＡ１、ｒｈＩＦＮＡ２およびｒｈＩＦＮＡ１６による刺激の後での２９３Ｔ細胞におけるウエスタンブロット（ＷＢ）による総ＳＴＡＴ１およびリン酸化ＳＴＡＴ１（ｐＳＴＡＴ１）の検出。Ｂ：ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ｇ１ ＩＦＮＡ５、および、ＩＦＮＡ６による刺激。５Ｄ１を除くすべての例示的抗体がＩＦＮＡ１を効率的に中和し、すべての例示的抗体が、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４およびｇ１ ＩＦＮＡ５を中和する。２５Ｃ３、５Ｄ１および１３Ｂ１１の例示的抗体は、ＩＦＮＡ６のより弱い中和を示す。Ｃ：ＩＦＮＡ７、ｇ１ ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４およびＩＦＮＡ１６による刺激。すべての例示的抗体がＩＦＮＡ７を中和する。２５Ｃ３および１３Ｂ１１を除くすべての例示的抗体が、ｇ１ ＩＦＮＡ８を効率的に中和する。ＩＦＮＡ１０が、２５Ｃ３を除くすべての例示的抗体によって効率的に中和され、一方、ＩＦＮＡ１６が、１９Ｄ１１、５Ｄ１および１３Ｂ１１の例示的抗体によってのみ、効率的に中和される。Ｄ：ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２１、ＩＦＮＷ、ＩＦＮＢ、および、ｇ１ ＩＦＮＧによる刺激。すべての例示的抗体がＩＦＮＡ１７を中和し、１３Ｂ１１を除くすべての例示的抗体がＩＦＮＡ２１を効率的に中和する。ＩＦＮＷは明らかに、２６Ｂ９および３１Ｂ４の例示的抗体によって効率的に中和されるだけである。これらの例示的抗体はどれも、ＩＦＮＢまたはｇ１ ＩＦＮＧを中和しない。 ホタルルシフェラーゼレポーター構築物および内部正規化コントロールとして使用されるウミシイタケルシフェラーゼ構築物の概略図。ＴＲＥ−転写応答エレメント；ＣＭＶ−サイトメガロウイルス。 ヒト由来の抗ＩＦＮ−αモノクローナル抗体により、ｒｈＩＦＮＡ誘導のＩＳＲＥ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性化がＨＥＫ２９３Ｔ細胞において中和される。ＡおよびＢ：１９Ｄ１１、２５Ｃ３、２６Ｂ９および３１Ｂ４の例示的な抗ＩＦＮ−α抗体の試験。ＩＳＲＥ二重ルシフェラーゼレポーター構築物を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を示されるように、非処置（−）のままにしたか、あるいは、抗体の非存在下、または、ヒト由来ＩＦＮＡモノクローナル抗体もしくはヒトコントロールＩｇＧの存在下、様々なｒｈＩＦＮにより刺激した（＋）。ｒｈＩＦＮ濃度：２ｎｇ／ｍｌ；抗体濃度：５μｇ／ｍｌ、ＣおよびＤ：５Ｄ１および１３Ｂ１１の例示的な抗ＩＦＮ−α抗体の試験。ＩＳＲＥ二重ルシフェラーゼレポーター構築物を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を（Ａ／Ｂ）の場合のように処理し、ＩＳＲＥレポーター活性を２４時間後にアッセイした。ｒｈＩＦＮＡ濃度：１ｎｇ／ｍｌ；抗体濃度：５μｇ／ｍｌ。Ａ／Ｃ：相対的ルシフェラーゼユニットの測定、Ｂ／Ｄ：発現倍数変化の計算。Ｅ：本発明の例示的なヒト由来モノクローナル抗体（８Ｈ１および１２Ｈ５）によるｒｈＩＦＮＡ１、Ａ２、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１６、Ａ１７、Ａ２１、ｒｈＩＦＮＷおよびｒｈＩＦＮＢの中和。例示的抗体８Ｈ１は、ＩＦＮＡ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ１０、Ａ１６、Ａ１７およびＡ２１とともに、ＩＦＮＷを完全に中和し、一方で、ＩＦＮＡ２、Ａ８およびＡ１４のわずかにより弱い中和を示す。例示的抗体１２Ｈ５はすべてのＩＦＮＡサブタイプを中和し、ＩＦＮＷを中和しない。例示的抗体の８Ｈ１または１２Ｈ５はどちらも、ＩＦＮＢを中和しない。ＨＥＫ２９３Ｔ ＭＳＲをＡの場合のように処理し、ＩＳＲＥレポーター活性を２４時間後に分析した。ｒｈＩＮＦ濃度：１０ｎｇ／ｍｌ（ＩＦＮＡ１）、１．３ｎｇ／ｍｌ（ＩＦＮＡ１６）、４ｎｇ／ｍｌ（ＩＦＮＡ２１）、１ｎｇ／ｍｌ（ＩＦＮＡＢ）および２ｎｇ／ｍｌ（すべての他のＩＦＮ）。抗体濃度：５μｇ／ｍｌ。 ＩＳＲＥ−ルシフェラーゼレポーター中和アッセイによる、例示的なヒト由来ＩＦＮＡ ｍＡｂ（２６Ｂ９）のＩＣ５０分析。例示的抗体２６Ｂ９によるＩＣ５０中和グラフ：Ａ：ＩＦＮＡ２、Ｂ：ＩＦＮＡ４、Ｃ：ＩＦＮＡ５、Ｄ：ＩＦＮＡ８、Ｅ：ＩＦＮＡ１４。例示的抗体２６Ｂ９についての中和アッセイの確認的試験のＩＣ５０分析結果が示される：Ｆ：ＩＦＮＡ１、Ｇ：ＩＦＮＡ２、Ｈ：ＩＦＮＡ４、Ｉ：ＩＦＮＡ５、Ｊ：ＩＦＮＡ６、Ｋ：ＩＦＮＡ７、Ｌ：ＩＦＮＡ８、Ｍ：ＩＦＮＡ１０、Ｎ：ＩＦＮＡ１４、Ｏ：ＩＦＮＡ１６、Ｐ：ＩＦＮＡ１７、Ｑ：ＩＦＮＡ２１、および、Ｒ：ＩＦＮＷ。ＩＣ５０データが表４にまとめられる。Ｙ軸におけるＲＬＵ＝相対的光ユニット（先行する図の場合と同様）。 ＩＳＲＥ−ルシフェラーゼレポーター中和アッセイによる、例示的なヒト由来抗ＩＦＮ−α ｍＡｂ（２５Ｃ３）のＩＣ５０分析。アッセイが、図８に記載されるように行われる。例示的抗体２６Ｂ９によるＩＣ５０中和グラフ：Ａ：ＩＦＮＡ２、Ｂ：ＩＦＮＡ４、Ｃ：ＩＦＮＡ５、Ｄ：ＩＦＮＡ８、および、Ｅ：ＩＦＮＡ１４。 ＩＳＲＥ−ルシフェラーゼレポーター中和アッセイによる、例示的なヒト由来抗ＩＦＮ−α ｍＡｂ（１９Ｄ１１）のＩＣ５０分析。アッセイが、図８に記載されるように行われる。例示的抗体１９Ｄ１１による中和のＩＣ５０グラフ：Ａ：ＩＦＮＡ２、Ｂ：ＩＦＮＡ４、Ｃ：ＩＦＮＡ５、Ｄ：ＩＦＮＡ８、Ｅ：ＩＦＮＡ１４。例示的抗体１９Ｄ１１による確認的実験のＩＣ５０中和グラフ：Ｆ：ＩＦＮＡ１、Ｇ：ＩＦＮＡ２、Ｈ：ＩＦＮＡ４、Ｉ：ＩＦＮＡ５、Ｊ：ＩＦＮＡ６、Ｋ：ＩＦＮＡ７、Ｌ：ＩＦＮＡ８、Ｍ：ＩＦＮＡ１０、Ｎ：ＩＦＮＡ１４、Ｏ：ＩＦＮＡ１６、Ｐ：ＩＦＮＡ１７、および、Ｑ：ＩＦＮＡ２１。ＩＣ５０データが表４にまとめられる。 Ａ：ＥＬＩＳＡによるＩＦＮＡ１およびＩＦＮＡ２（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ）に対する本発明の例示的ＭＡＢ（１９Ｄ１１、２５Ｃ３、２６Ｂ９、５Ｄ１および１３Ｂ１１）の結合の決定および比較。例示的な抗ＩＦＮＡ−α抗体５Ｄ１はＩＦＮＡ１と交差反応しない。Ｂ：ＬＩＰＳによるＩＦＮＡ８およびＩＦＮＡ１４（ＩＦＮ−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質）に対する本発明の例示的ＭＡＢ（５Ｄ１、１３Ｂ１１、１９Ｄ１１、２５Ｃ３、２６Ｂ９および３１Ｂ４）の結合の決定および比較。例示的ＭＡＢの１３Ｂ１１はＩＦＮＡ８（ｇ１ＩＦＮＡ８）との交差反応性を有しない。Ｃ：ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ２１（すべてがＰＢＬから得られる）およびＩＦＮＡ１４（ＡＴＧｅｎ）に対する本発明の例示的ＭＡＢ（５Ｄ１、１３Ｂ１１、１９Ｄ１１、２５Ｃ３、２６Ｂ９および３１Ｂ４）の結合の決定および比較。例示的な抗ＩＦＮＡ−α抗体１３Ｂ１はＩＦＮＡ８およびＩＦＮＡ２１と交差反応しない。抗体１９Ｄ１１は、ＩＦＮＡ２１と、それ以外のＩＦＮＡサブタイプよりも低い親和性で交差反応する。ＭＡＢを（Ｃ）では１μｇ／ｍｌで試験した。 ＬＩＰＳアッセイ−異なるＩＦＮＡサブタイプ（ＩＦＮ−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質）に対する本発明の抗体の結合の決定。下記のサブタイプに対する本発明の例示的抗体の結合：Ａ：ＩＦＮＡ５、Ｂ：ＩＦＮＡ６、および、Ｃ：ＩＦＮＡ８。例示的な抗ＩＦＮ−α抗体１３Ｂ１１はＩＦＮＡ８との実質的な交差反応性を何ら示さない。ＩＦＮ−α非結合コントロール（ｈＩｇＧ１）として、非関連の抗原に結合するヒト抗体を使用した。 ＬＩＰＳアッセイ−下記のＩＦＮＡサブタイプに対する本発明の例示的抗体（５Ｄ１、１３Ｂ１１、１９Ｄ１１、２５Ｃ３、２６Ｂ９および３１Ｂ４）の結合特徴の決定：ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６およびＩＦＮＡ２１（ＩＦＮ−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質）。ＩＦＮ−α非結合コントロール（ｈＩｇＧ１）として、非関連の抗原に結合するヒト抗体を使用した。すべての抗体を０．５μｇ／ｍｌで試験した。図１２および図１３で使用されるすべてのＩＦＮ−αサブタイプがＩＦＮ−α−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質（ｇ１ＩＦＮＡ）である。 耳炎症アッセイ−マウスにおけるヒトＩＦＮサブタイプの前炎症性影響の試験。Ａ：例示的な６日間の実験予定表。Ｂ：それぞれのコホートについて、０日目の測定に対する変化倍数として計算され、その後、関連したＰＢＳコントロールに対して正規化されるＣｙｔｏＥａｒ耳厚さ測定値。Ｂ１：すべての正規化された測定値の影響の概略。Ｂ２：ＩＦＮａ２ａ注入およびＩＦＮａ２ｂ注入の影響。Ｂ３：ＩＦＮａ４注入およびＩＦＮａ１４注入の影響。試験された４つすべてのヒトＩＦＮＡサブタイプは耳の腫大をＩＤ後において著しく誘導することができた。すべての耳がＰＢＳ処置の耳よりも際だって厚くなっていた。ＩＦＮａ１４は最も強力な前炎症性作用因子であった。平均＋／−ＳＥＭ、Ｉ１〜Ｉ３またはＩＤ＝皮内へのサイトカイン注入、Ｍ＝測定値−耳厚さおよび動物体重、Ｓ＝動物の屠殺；短い矢印−サイトカイン注入；長い矢印−抗ＩＦＮ−α抗体注入の例示的な日。 耳炎症アッセイ−マウスにおけるヒトＩＦＮサブタイプの前炎症性影響の試験。ＣｙｔｏＥａｒ耳厚さ測定値がそれぞれのコホートについて絶対値（ｍｍ）として示される。Ａ：すべての測定値の影響の概略。Ｂ：ＩＦＮａ２ａ注入およびＩＦＮａ２ｂ注入の影響。Ｃ：ＩＦＮａ４注入およびＩＦＮａ１４注入の影響。すべての表示が図１４の場合の通りである。 耳炎症アッセイ−マウスにおけるヒトＩＦＮサブタイプの前炎症性影響の試験。ＣｙｔｏＥａｒ耳厚さ測定値がそれぞれのコホートについて０日目からの変化倍数として示される。０日目における厚さが１として設定されている。Ａ：すべての測定値の影響の概略。Ｂ：ＩＦＮａ２ａ注入およびＩＦＮａ２ｂ注入の影響。Ｃ：ＩＦＮａ４注入およびＩＦＮａ１４注入の影響。すべての表示が図１４の場合の通りである。 耳炎症の誘導についてのヒトＩＦＮ−αサブタイプの能力に関しての耳炎症アッセイのまとめ。Ｐ値が２元配置ＡＮＯＶＡ検定によって得られる：ｎｓ（非有意）＝Ｐ＞０．０５、＊＝Ｐ≦０．０５、＊＊＝Ｐ≦０．０１、＊＊＊＝Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝Ｐ＜０．０００１。すべての耳がＰＢＳ処置の耳よりも際だって厚くなっていた；このことは、２回目のＩＤの後、３日目から実験終了まで、すべての群において有意であった。 ＬＩＰＳアッセイ−下記のサブタイプに対する本発明の例示的な抗ＩＦＮ−α抗体（５Ｄ１、１３Ｂ１１、１９Ｄ１１、２５Ｃ３、２６Ｂ９および３１Ｂ４）の結合特徴の決定および比較：ＩＦＮγ（ＩＦＮＧ）、ＩＦＮ−β１（ＩＦＮＢ１）、ＩＦＮε（ＩＦＮＥ）、ＩＦＮ−ω（ＩＦＮＷ）、３つのＩＦＮλ（ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８ＢおよびＩＬ２９）およびＩＦＮＡ１０（すべてがＩＦＮ−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質である）。Ａ：異なるＩＦＮタイプに対する抗体の結合。Ｂ：逆の図、抗体によるＩＦＮの結合。例示的抗体の２６Ｂ９および３１Ｂ４は、ＩＦＮＡ１０に対するそれらの親和性のほかにＩＦＮ−ω（ＩＦＮＷ）の結合を示す。ＩＦＮ−β１（ＩＦＮＢ１）、ＩＦＮε（ＩＦＮＥ）、３つのＩＦＮλおよびＩＦＮγ（ＩＦＮＧ）の、例示的抗体の実質的な結合を認めることができなかった。 マウスＩＦＮＡに対するＭＡＢの交差反応性（ＥＬＩＳＡ）。ｈＩｇＧ１＝ＩＦＮＡ非関連の特異性の抗体（陰性コントロール）。Ａ：ＥＬＩＳＡアッセイにおける、ヒトおよびマウスのＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４およびＩＦＮＡ１４に対する例示的抗体（５Ｄ１、１３Ｂ１１、１９Ｄ１１、２５Ｃ３、２６Ｂ９および３１Ｂ４）の交差反応性の試験。マウスＩＦＮＡ２に対する交差反応性を示す抗体２５Ｃ３を除き、他の抗体は、試験されたマウスＩＦＮＡサブタイプに対する結合特異性を何ら示さないか、または、残留結合特異性を示すだけである。Ｂ：マウスＩＦＮＡに対するＭＡＢの交差反応性（ＬＩＰＳアッセイ）。抗体５Ｄ１および抗体１９Ｄ１１はマウスｇ１ｍＩＦＮＡ１に対する交差反応性を示し、この場合、他の抗体は、陰性コントロールについて認められるレベルよりも低い反応性を示すだけである。上記抗体のどれもがマウスＩＦＮ−αサブタイプのｇ１ｍＩＦＮＡ９に対する交差反応性を示さない。 ＩＳＲＥ−ルシフェラーゼレポーター中和アッセイによる、例示的なヒト由来抗ＩＦＮ−α ｍＡｂ（８Ｈ１）のＩＣ５０分析。例示的抗体８Ｈ１のＩＣ５０中和グラフ。Ａ：ＩＦＮＡ１、Ｂ：ＩＦＮＡ２、Ｃ：ＩＦＮＡ４、Ｄ：ＩＦＮＡ５、Ｅ：ＩＦＮＡ６、Ｆ：ＩＦＮＡ７、Ｇ：ＩＦＮＡ８、Ｈ：ＩＦＮＡ１０、Ｉ：ＩＦＮＡ１４、Ｊ：ＩＦＮＡ１６、Ｋ：ＩＦＮＡ１７、Ｌ：ＩＦＮＡ２１、および、Ｍ：ＩＦＮＷ。ＩＣ５０データが表４にまとめられる。 ＩＳＲＥ−ルシフェラーゼレポーター中和アッセイによる、例示的なヒト由来抗ＩＦＮ−α ｍＡｂ（１２Ｈ５）のＩＣ５０分析。例示的抗体１２Ｈ５のＩＣ５０中和グラフ。Ａ：ＩＦＮＡ１、Ｂ：ＩＦＮＡ２、Ｃ：ＩＦＮＡ４、Ｄ：ＩＦＮＡ５、Ｅ：ＩＦＮＡ６、Ｆ：ＩＦＮＡ７、Ｇ：ＩＦＮＡ８、Ｈ：ＩＦＮＡ１０、Ｉ：ＩＦＮＡ１４、Ｊ：ＩＦＮＡ１６、Ｋ：ＩＦＮＡ１７、および、Ｌ：ＩＦＮＡ２１。ＩＣ５０データが表４にまとめられる。 ＩＳＲＥ−ルシフェラーゼレポーター中和アッセイによる、例示的なヒト由来抗ＩＦＮ−α ｍＡｂ（５０Ｅ１１）のＩＣ５０分析。例示的抗体５０Ｅ１１のＩＣ５０中和グラフ。Ａ：ＩＦＮＡ１、Ｂ：ＩＦＮＡ２、Ｃ：ＩＦＮＡ４、Ｄ：ＩＦＮＡ５、Ｅ：ＩＦＮＡ６、Ｆ：ＩＦＮＡ７、Ｇ：ＩＦＮＡ８、Ｈ：ＩＦＮＡ１０、Ｉ：ＩＦＮＡ１４、Ｊ：ＩＦＮＡ１６、Ｋ：ＩＦＮＡ１７、Ｌ：ＩＦＮＡ２１、および、Ｍ：ＩＦＮＷ。ＩＣ５０データが表４にまとめられる。 ヒト由来の抗ＩＦＮ−αモノクローナル抗体により、ＩＦＮ受容体を内因的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ ＭＳＲ細胞に対するＩＦＮ−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質の結合が発光細胞結合アッセイにおいて中和される。細胞を、インターフェロン−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清と、阻害剤の非存在下（−）で、または、示されるような競合的阻害剤の存在下でインキュベーションした。Ａ：ルシフェラーゼに基づく化学発光細胞結合アッセイの概略図。目的とするリガンド（３）がＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（４）に融合される。この融合タンパク質を、目的とするリガンドに対する受容体（２）を発現する細胞（１）に結合させる。結合していない融合タンパク質を除いた後、ルシフェラーゼの基質を加え（５）、光の放射を記録する（６）。光の出力は、結合している融合タンパク質の量に比例している。目的とするリガンドの結合について受容体と競合する抗リガンド抗体（７）は、結合したリガンドにおける低下、および、低下した光の出力をもたらす。Ｂ：コントロール：ヒトＩＦＮＡ−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質は、ＨＥＫ２９３Ｔ ＭＳＲ細胞に特異的に結合する。ＨＥＫ２９３Ｔ ＭＳＲ細胞に対するＩＦＮＡ５−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質（ｇ１ ＩＦＮＡ５）の結合が、非標識のｒｈＩＦＮＡ２（３μｇ／ｍｌ）によって、また、例示的なヒト由来のモノクローナルなＩＦＮＡ抗体１９Ｄ１１（１．７μｇ／ｍｌ）によって阻害される。ヒトコントロール抗体（ｈｕＩｇＧ、１５μｇ／ｍｌ）は影響を何ら示さない。Ｃ：ＨＥＫ２９３Ｔ ＭＳＲ細胞に対する、ｇ１ ＩＦＮＡ２、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１６、Ａ１７およびＡ２１の各融合タンパク質の結合が、例示的なヒト由来のモノクローナルなＩＦＮ抗体１９Ｄ１１によって阻害される。ｇ１ ＩＦＮＢおよびＩＦＮＷの結合は１９Ｄ１１によって影響を受けない。すべてのｇ１ ＩＦＮの結合が、コントロールのヒト抗体（ｈｕＩｇＧ）によって影響を受けない。抗体濃度：５μｇ／ｍｌ。Ｄ：例示的抗体の１９Ｄ１１および２６Ｂ９によるｇ１ ＩＦＮＡ１６およびｇ１ ＩＦＮＷの結合中和。細胞を、抗体の非存在下（−）、あるいは、例示的抗体（１９Ｄ１１、２６Ｂ９）またはコントロールのヒト抗体（ｈｕＩｇＧ）の存在下、示されるように、ｇ１ ＩＦＮＡ１６およびｇ１ ＩＦＮＷにより処理した。抗体濃度：１０μｇ／ｍｌ。例示的抗体１９Ｄ１１は、ｇ１ ＩＦＮＡ１６を中和することにおいて２６Ｂ９よりも強力である。例示的抗体２６Ｂ９は、ｇ１ ＩＦＮＷの、２９３Ｔ ＭＳＲ細胞におけるその受容体に対する結合を効率的に阻止し、一方、例示的抗体１９Ｄ１１はこのリガンドに対する明らかな影響を何ら示さない。 ヒトＩＦＮＷ−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質は、膜貫通型の抗ＩＦＮＷ ｍＡｂを発現するＨＥＫ２９３Ｔ ＭＳＲ細胞に特異的に結合する。ＨＥＫ２９３Ｔ ＭＳＲ細胞を、抗ＩＦＮＷ ｍＡｂの２６Ｂ９の膜結合型（２６Ｂ９−ＴＭ）をコードするｃＤＮＡ、または、空ベクター（モック）の示された量によりリバーストランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間で、ＩＦＮＷ−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼを加え（ｇ１ ＩＦＮＷ）、結合を化学発光細胞結合アッセイで分析した。Ａ：コントロール：２６Ｂ９−ＴＭを、トランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ ＭＳＲ細胞の細胞表面に発現させる。表面の抗体発現を細胞に基づくＥＬＩＳＡでトランスフェクション後４８時間でアッセイした。Ｂ：ｇ１ ＩＦＮＷは、発光細胞結合アッセイにおいて、２６Ｂ９−ＴＭを発現する細胞に特異的に結合する。 抗ＩＦＮＷ抗体の交差競合アッセイ。２６Ｂ９−ＴＭに対するｇ１ ＩＦＮＷの結合が、可溶性２６Ｂ９による、また、クローン的に関連した３１Ｂ４抗体による用量依存的な競合を受ける。対照的に、結合は、コントロールＩｇＧによって、また、例示的な抗ＩＦＮＷ抗体８Ｈ１によって影響されない。 ＳＰＲ分析。Ａ：本発明の例示的抗体の１９Ｄ１１（Ａ１〜Ａ４）および２６Ｂ９（Ｂ１〜Ｂ４）に対するヒトＩＦＮＡ２ｂの結合（Ａ１／Ｂ１）、ＩＦＮＡ４の結合（Ａ２／Ｂ２）、ＩＦＮ１４の結合（Ａ３／Ｂ３）およびＩＦＮωの結合（Ａ４／Ｂ４）に関するセンソグラムの詳細な分析。１：１の結合速度論が認められた。抗原を、１ｎＭ、２．５ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭおよび１００ｎＭの濃度で注入した。計算された親和性（ＫＤ値［Ｍ］）が図中に示される。Ｃ：プロットは、すべての試験された抗体の会合（オン速度ｋａ）および解離（オフ速度ｋｄ）について近似曲線から導かれる速度論パラメータを示す。点線の対角線により、親和性（ＫＤ）が示される。Ｄ：ビオチン−ストラプトアビジン結合のＳＰＲ文献値との比較での本発明の例示的抗体のＫＤ値。ヒトＩＦＮＡ４およびＩＦＮＡ１４に対する親和性が、ＩＦＮ２ｂについてはそれぞれ、サブピコモル濃度範囲およびサブナノモル濃度範囲にある。２６Ｂ９はまた、サブピコモル濃度の親和性でヒトＩＦＮωと結合する。 エピトープマッピング。Ａ：マイクロアレイに結合させた全長抗原に対する本発明の抗体の結合。Ｙ軸は、Ｃｙ５コンジュゲート化二次抗体により検出されたときの蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。Ｂ：本発明の抗体１９Ｄ１１に対するヒトＩＦＮＡ２の１８ｍｅｒペプチドの一次ペプチドアレイ。下段パネルには、アスパラギン６５からリシン９８までの配列を網羅するペプチド、および、リシン１１７からセリン１５０までの配列を網羅するペプチドが示される。抗体１９Ｄ１１はペプチド１９およびペプチド３２に特異的に結合する。Ｃ：本発明の抗体２６Ｂ９に対するヒトＩＦＮＡ２の１８ｍｅｒペプチドの一次ペプチドアレイ。下段パネルには、アスパラギン酸７７からリシン１１０までの配列を網羅するペプチドが示される。抗体２６Ｂ９はペプチド２２に特異的に結合する。Ｄ：本発明の抗体２６Ｂ９に対するヒトＩＦＮＡＷの１８ｍｅｒペプチドの一次ペプチドアレイ。下段パネルには、メチオニン１０２からアラニン１３５までの配列を網羅するペプチドが示される。抗体２６Ｂ９はペプチド２３に特異的に結合する。 ＩＦＮＡ１４の耳炎症アッセイＣｙｔｏＥａｒ。本発明の異なるＩＦＮＡ阻止抗体の影響をｈＩＦＮＡ１４誘導による炎症の後において試験する。炎症を誘導するために、２０μｌのＩＦＮａ１４を耳あたり２５μｇ／ｍｌの濃度で注入した。厚さの測定はまた、注入を与える前に、そして、１つの耳について２回の測定により行った。Ａ：例示的な１０日間の実験予定表。Ｂ：実験動物群（Ａ〜Ｉ）の実験的処置の概要。Ｒｅｆ．Ａ−ＩＦＮＡ特異的な参照抗体。それぞれのコホートについて、０日目の測定値に対する変化倍数として計算され、その後、関連したＰＢＳコントロールに対して正規化されるＣｙｔｏＥａｒ耳厚さ測定値。Ｃ：すべての正規化された測定値の影響の概略。Ｄ：ＩＦＮａ１４注入の後における２６Ｂ９処置の影響。Ｅ：ＩＦＮａ１４注入の後における１９Ｄ１１処置の影響。Ｆ：ＩＦＮａ１４注入の後における参照用の抗ＩＦＮ−α抗体Ｒｅｆ．Ａによる処置の影響。本発明の抗体２６Ｂ９および抗体１９Ｄ１１による処置（それぞれ７日目、９日目、１０日目における、また、１９Ｄ１１については４日目、７日目〜１０日目における耳厚さの有意な減少）は、（ＩＦＮ−αに関連しない結合特異性の）ＩｇＧによるコントロール処置およびＲｅｆ．Ａによる処置と比較して、ＩＦＮａ１４注入から生じる耳厚さの顕著な減少を引き起こす。平均＋／−ＳＥＭ、ＩＤ＝皮内へのサイトカイン注入、Ｍ＝測定値−耳厚さ、Ｓ＝動物の屠殺；ＩＤ−サイトカイン注入；試験された抗体の２６Ｂ９および１９Ｄ１１、Ｒｅｆ．Ａ、ならびに、コントロールＩｇＧを０日目に注入した（ＩＰ）。 ＩＦＮＡ５の耳炎症アッセイＣｙｔｏＥａｒ。本発明の異なるＩＦＮＡ阻止抗体の影響をｈＩＦＮＡ５誘導による炎症の後において試験する。炎症を誘導するために、２０μｌのＩＦＮａ５を耳あたり２５μｇ／ｍｌの濃度で注入した。厚さの測定はまた、注入を与える前に、そして、１つの耳について２回の測定により行った。Ａ：例示的な１０日間の実験予定表。Ｂ：実験動物群（Ａ〜Ｉ）の実験的処置の概要。Ｒｅｆ．Ａ−参照用のＩＦＮＡ特異的抗体。それぞれのコホートについて、０日目の測定値に対する変化倍数として計算され、その後、関連したＰＢＳコントロールに対して正規化されるＣｙｔｏＥａｒ耳厚さ測定値。Ｃ：すべての正規化された測定値の影響の概略。Ｄ：ＩＦＮａ５注入の後における２６Ｂ９処置の影響。Ｅ：ＩＦＮａ５注入の後における１９Ｄ１１処置の影響。Ｆ：ＩＦＮａ５注入の後における参照用の抗ＩＦＮ−α抗体Ｒｅｆ．Ａによる処置の影響。本発明の抗体２６Ｂ９および抗体１９Ｄ１１による処置は、ＩＦＮａ５注入から生じる耳厚さの減少を引き起こす（２６Ｂ９については、４日目、６日目、７日目、８日目および９日目における有意な減少；１９Ｂ１１については７日目〜９日目における有意な減少）。さらなる詳細については図２６の説明を参照のこと。試験された抗体の２６Ｂ９および１９Ｄ１１、Ｒｅｆ．Ａ、ならびに、コントロールＩｇＧを０日目に注入した（ＩＰ）。 ＩＦＮｗの耳炎症アッセイＣｙｔｏＥａｒ。本発明の異なるＩＦＮＡ阻止抗体の影響をｈＩＦＮｗ（ＩＦＮω）誘導による炎症の後において試験する。炎症を誘導するために、２０μｌのＩＦＮｗを、耳あたり６．２５μｇ／ｍｌの濃度で注入した（１２５ｎｇ／耳）。厚さの測定はまた、注入を与える前に、そして、１つの耳について２回の測定により行った。Ａ：例示的な１０日間の実験予定表。Ｂ：実験動物群（Ａ〜Ｉ）の実験的処置の概要。Ｒｅｆ．Ａ−参照用のＩＦＮＡ特異的抗体。それぞれのコホートについて、０日目の測定値に対する変化倍数として計算され、その後、関連したＰＢＳコントロールに対して正規化されるＣｙｔｏＥａｒ耳厚さ測定値。Ｃ：すべての正規化された測定値の影響の概略。Ｄ：ＩＦＮｗ注入の後における２６Ｂ９処置の影響。Ｅ：ＩＦＮｗ注入の後における１９Ｄ１１処置の影響。Ｆ：ＩＦＮｗ注入の後における参照用の抗ＩＦＮ−α抗体（Ｒｅｆ．Ａ．）による処置の影響。本発明の抗体２６Ｂ９による処置は、ＩＦＮｗ注射から生じる耳厚さの有意な減少を実験９日目に引き起こす。１９Ｄ１１またはＲｅｆ．Ａによる処置は、明らかに耳厚さの減少がないことまたは非常にわずかな減少を引き起こす（すべての日においてコントロールＩｇＧ注入と比較して非有意（ｎｓ））。さらなる詳細については図２６の説明を参照のこと。試験された抗体の２６Ｂ９および１９Ｄ１１、Ｒｅｆ．Ａ、ならびに、コントロールＩｇＧを０日目に注入した（ＩＰ）。 １型糖尿病を伴う場合（Ｔ１Ｄ）または伴わない場合（Ｎ）のＡＰＳ１／ＡＰＥＣＥＤ患者の血清におけるＩＦＮ中和活性の比較。Ａ：ＩＦＮＡ１、Ｂ：ＩＦＮＡ２ａ、Ｃ：ＩＦＮＡ４、Ｄ：ＩＦＮＡ５、Ｅ：ＩＦＮＡ６、Ｆ：ＩＦＮＡ７、Ｇ：ＩＦＮＡ８、Ｈ：ＩＦＮＡ１０、Ｉ：ＩＦＮＡ１４、Ｊ：ＩＦＮＡ１６、Ｋ：ＩＦＮＡ１７、Ｌ：ＩＦＮＡ２１およびＭ：ＩＦＮＷ。 １型糖尿病を伴う場合（Ｔ１Ｄ）または伴わない場合（Ｎ）のＡＰＳ１／ＡＰＥＣＥＤ患者の血清におけるＩＦＮ中和活性の比較。図３１の通りであり、しかしながら、Ｙ軸での対数スケールが、Ｔ１Ｄを伴うＡＰＳ１／ＡＰＥＣＥＤ患者の血清において測定される中和活性のより良好な可視化のために用いられる。Ａ：ＩＦＮＡ１、Ｂ：ＩＦＮＡ２ａ、Ｃ：ＩＦＮＡ４、Ｄ：ＩＦＮＡ５、Ｅ：ＩＦＮＡ６、Ｆ：ＩＦＮＡ７、Ｇ：ＩＦＮＡ８、Ｈ：ＩＦＮＡ１０、Ｉ：ＩＦＮＡ１４、Ｊ：ＩＦＮＡ１６、Ｋ：ＩＦＮＡ１７、Ｌ：ＩＦＮＡ２１およびＭ：ＩＦＮＷ。Ｔ１Ｄに罹患していないＡＰＳ１患者（Ｎ）は、すべての抗体について、それらの血清において、Ｔ１Ｄ−ＡＰＳ１患者よりも大きい力価を示す。この力価の差により、両方の患者群における示差的な治療的要求が示される場合がある。
発明の詳細な説明
本発明は概して、哺乳動物起源（好ましくはヒト起源）のＩＦＮ−αと結合する新規な分子、特に、ＩＦＮ−αの種々のサブタイプを認識し、かつ、より重要なことにはそれらの活性を中和することができる患者由来のヒトモノクローナル抗体、ならびに、その断片、誘導体および変異体に関連する；ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７およびＩＦＮＡ２１を含めてＩＦＮＡサブタイプの説明については背景のセクション（上掲）もまた参照のこと。なお、ＩＦＮＡ１遺伝子およびＩＦＮＡ１３遺伝子は同じＩＦＮＡ１／１３サブタイプをコードする。
実施例において記載されるように、本発明の例示的な抗体は、損なわれた中枢性寛容および／または末梢性寛容あるいは自己寛容の喪失を有する患者（例えば、ＡＰＥＣＥＤ／ＡＰＳ１患者など）の血清を、ＩＮＦ−αタンパク質に対する自己抗体についてスクリーニングすること、同様にまた、抗体を自己免疫性障害または自己炎症性疾患に罹患する被験体のＢ細胞から単離する新規な方法（これは本出願人の国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４２０Ａ１の主題であり、かつ、それに開示される方法である）を使用することに基づく、本出願人の国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４１９Ａ１の主題であり、かつ、それに開示される方法によって単離されている。
本発明に従って行われた実験は、選択的なＩＦＮ−αサブタイプ特異性のＩＦＮ−α結合分子を提供すること、すなわち、免疫反応性が、例えば、ＳＬＥの発症に対して保護的であるとして、言い換えれば、ＳＬＥ症状の発現を少なくとも軽減させるとしてＡＰＥＣＥＤ／ＡＰＳ１患者において示されている抗体およびそのＩＦＮ−α結合断片を提供することに関した。
したがって、第１の一般的な局面において、本発明は、すべてのＩＦＮ−αサブタイプまたはほんの部分範囲のＩＦＮ−αサブタイプまたは特定のＩＦＮ−αサブタイプに対する結合特異性および好ましくは中和活性を示すヒト由来の抗インターフェロン−アルファ（ＩＮＦ−α）抗体あるいはそのＩＦＮ−α結合断片、合成誘導体または生物工学誘導体を提供する。本発明の好ましい実施形態において、抗ＩＦＮ−α抗体またはＩＦＮ−α結合断片は、
（ｉ）ヒトＩＦＮ−αサブタイプのＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ１０およびＩＦＮＡ１４に結合する；
（ｉｉ）少なくとも１つの、ヒトＩＦＮ−αサブタイプであるＩＦＮＡ１／１３（ＩＦＮＡ１ｂ）、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１６および／またはＩＦＮＡ２１に結合する；かつ／あるいは
（ｉｉｉ）該ヒトＩＦＮ−αサブタイプの少なくとも１つの生物学的活性を中和することができる。
したがって、本発明は、この技術分野において知られている抗体とは異なるＩＦＮαサブタイプ特異性を有し、かつ、それらよりも幅広い適用プロファイルを提供する一連の抗体を提供する。
すべてのＩＦＮαサブタイプがヘテロ二量体型のＩＦＮα／β受容体（ＩＦＮＡＲ）を利用しており、細胞質チロシンキナーゼのＴｙｋ２およびＪａｋ１により行われるＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ２（シグナル伝達・転写活性化因子）のリン酸化および付随した活性化を介してシグナルを、受け取る細胞において生じさせる。これらのＳＴＡＴタンパク質は核へ移行し、ＧＡＳ部位またはＩＳＲＥ部位のどちらかあるいは両方をそのプロモータに有する遺伝子の発現を活性化する（Ｂｏｒｄｅｎ他、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．、６（２００７）、９７５〜９９０；Ｈｕ他、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２２６（２００８）、４１〜５６；ｖａｎ Ｂｏｘｅｌ−Ｄｅｚａｉｒｅ他、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２５（２００６）、３６１〜３７２）。この活性化機構が本発明において使用されており、同様にまた、ＩＦＮ活性測定のインビトロ方法を設計するために、例えば、本発明の抗体の中和能をモニターするために本明細書中に記載されるような、また、本明細書中で使用されるような、例えば、実施例３および図５〜図７において記載されるような、また、使用されるような細胞型ＳＴＡＴ（シグナル伝達・転写活性化因子）活性化アッセイおよびＩＳＲＥ（インターフェロン刺激応答エレメント）レポーター遺伝子アッセイ（Ｃｉｇｎａｌ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ、Ｑｉａｇｅｎ）などを設計するために使用されている。それらにおいて詳しく記載されるように、本発明の抗体は、さらには下記で詳しく記載されるように、いくつかのＩＦＮＡサブタイプに対する強力な中和活性を有することが見出されている。
したがって、本発明の１つの実施形態において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合断片によって中和される生物学的活性が、細胞型ＳＴＡＴ（シグナル伝達・転写活性化因子）活性化アッセイ、ＩＳＲＥ（インターフェロン刺激応答エレメント）レポーター遺伝子アッセイおよび／または細胞結合アッセイにおけるＩＦＮ−αのシグナル伝達である（実施例９を参照のこと）。
そのうえ、本発明の抗体の結合親和性が、本明細書中に、例えば、実施例１、実施例２、実施例６および実施例９に記載されるような、また、図３、図７〜図１３および図１８〜図２７に示されるようなＥＬＩＳＡアッセイ、ＬＩＰＳアッセイおよび細胞結合アッセイによって調べられている。これらの実験の結果に従って、本発明は、異なった様々なＩＦＮＡサブタイプに対する示差的な結合親和性を示すいくつかの例示的な抗ＩＮＦ−α抗体を提供する。なお、これらのＩＦＮＡサブタイプにより、本明細書中に提供されるＩＮＦ−α結合分子の結合特徴および中和特徴が例示される。
例えば、本発明の例示的な抗ＩＦＮ−α抗体１９Ｄ１１は、少なくともヒトＩＦＮ−αサブタイプのＩＦＮＡ１／１３、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６およびＩＦＮＡ２１に結合し（例えば、図１３および図１８〜図２７を参照のこと）、実施例および図５〜図７において記載されるような中和特性を有する。したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合断片は、セクション（ｉ）（上掲）において規定されるＩＦＮ−αサブタイプに加えて、少なくともヒトＩＦＮ−αサブタイプのＩＦＮＡ１／１３、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１６およびＩＦＮＡ２１に結合する。したがって、１つの好ましい実施形態において、抗ＩＦＮ−α抗体あるいはそのＩＦＮ−α結合断片、合成誘導体または生物工学誘導体は、添付された実施例および図において、具体的には種々のＩＦＮ−αサブタイプに対するその中和活性に関して例示されるような、抗体１９Ｄ１１の免疫学的特徴および／または生物学的特性を有する。
本発明の例示的な抗ＩＦＮ−α抗体の２６Ｂ９および３１Ｂ４は、少なくともヒトＩＦＮ−αサブタイプのＩＦＮＡ１／１３、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４およびＩＦＮＡ２１に結合し（例えば、図１３および図１８〜図２７を参照のこと）、実施例および図５〜図７において記載されるような中和特性を有する。したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合断片は、セクション（ｉ）（上掲）において規定されるＩＦＮ−αサブタイプに加えて、少なくともヒトＩＦＮ−αサブタイプのＩＦＮＡ１／１３、ＩＦＮＡ８およびＩＦＮＡ２１に結合する。したがって、別の好ましい実施形態において、抗ＩＦＮ−α抗体あるいはそのＩＦＮ−α結合断片、合成誘導体または生物工学誘導体は、添付された実施例および図において、具体的には種々のＩＦＮ−αサブタイプに対するその中和活性に関して例示されるような、抗体２６Ｂ９または抗体３１Ｂ４の免疫学的特徴および／または生物学的特性を有する。
本発明の例示的な抗ＩＦＮ−α抗体２５Ｃ３は、少なくともヒトＩＦＮ−αサブタイプのＩＦＮＡ１／１３、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６およびＩＦＮＡ２１に結合し（例えば、図１３および図１８〜図１９を参照のこと）、実施例および図５〜図７において記載されるような中和特性を有しており、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０およびＩＦＮＡ１６に対する低下した中和能を示す。したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合断片は、セクション（ｉ）（上掲）において規定されるＩＦＮ−αサブタイプに加えて、少なくともヒトＩＦＮ−αサブタイプのＩＦＮＡ１／１３、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１６およびＩＦＮＡ２１に結合し、しかし、ＩＦＮＡ１６のほんの弱い中和を示すだけである。さらなる実施形態において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合断片は加えて、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ８およびＩＦＮＡ１０のほんの弱い中和を示すだけである。したがって、別の好ましい実施形態において、抗ＩＦＮ−α抗体あるいはそのＩＦＮ−α結合断片、合成誘導体または生物工学誘導体は、添付された実施例および図において、具体的には種々のＩＦＮ−αサブタイプに対するその中和活性に関して例示されるような、抗体２５Ｃ３の免疫学的特徴および／または生物学的特性を有する。
本発明の例示的な抗ＩＦＮ−α抗体５Ｄ１は、少なくともヒトＩＦＮ−αサブタイプのＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６およびＩＦＮＡ２１に結合し、しかし、ＩＦＮＡ１／１３には結合せず、かつ、実施例および図５〜図７において記載されるような中和特性を有する。したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合断片は、セクション（ｉ）（上掲）において規定されるＩＦＮ−αサブタイプに加えて、少なくともヒトＩＦＮ−αサブタイプのＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１６およびＩＦＮＡ２１に結合し、しかし、ＩＦＮＡ１／１３には結合しない。したがって、別の好ましい実施形態において、抗ＩＦＮ−α抗体あるいはそのＩＦＮ−α結合断片、合成誘導体または生物工学誘導体は、添付された実施例および図において、具体的には種々のＩＦＮ−αサブタイプに対するその中和活性に関して例示されるような、抗体５Ｄ１の免疫学的特徴および／または生物学的特性を有する。
本発明の例示的な抗ＩＦＮ−α抗体１３Ｂ１１は、少なくともヒトＩＦＮ−αサブタイプのＩＦＮＡ１／１３、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４およびＩＦＮＡ１６に結合し、しかし、ＩＦＮＡ８には結合せず、かつ、実施例および図５〜図７において記載されるような中和特性を有する。したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合断片は、セクション（ｉ）（上掲）において規定されるＩＦＮ−αサブタイプに加えて、少なくともヒトＩＦＮ−αサブタイプのＩＦＮＡ１／１３およびＩＦＮＡ１６に結合し、しかし、ＩＦＮＡ８には結合しない。したがって、さらなる好ましい実施形態において、抗ＩＦＮ−α抗体あるいはそのＩＦＮ−α結合断片、合成誘導体または生物工学誘導体は、添付された実施例および図において、具体的には種々のＩＦＮ−αサブタイプに対するその中和活性に関して例示されるような、抗体１３Ｂ１１の免疫学的特徴および／または生物学的特性を有する。
本発明の例示的な抗ＩＦＮ−α抗体８Ｈ１は、少なくともヒトＩＦＮ−αサブタイプのＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７およびにＩＦＮＡ２１に結合し、一方で、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ８およびＩＦＮＡ１４のより弱い中和を示し、かつ、実施例および図７において記載されるような中和特性を有する。したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合断片は、セクション（ｉ）（上掲）において規定されるＩＦＮ−αサブタイプに加えて、少なくともヒトＩＦＮ−αサブタイプのＩＦＮＡ１／１３、ＩＦＮＡ１７およびＩＦＮＡ２１に結合する。したがって、なおさらなる好ましい実施形態において、抗ＩＦＮ−α抗体あるいはそのＩＦＮ−α結合断片、合成誘導体または生物工学誘導体は、添付された実施例および図において、具体的には種々のＩＦＮ−αサブタイプに対するその中和活性に関して例示されるような、抗体８Ｈ１の免疫学的特徴および／または生物学的特性を有する。
本発明の例示的な抗ＩＦＮ−α抗体１２Ｈ５は、すべてのヒトＩＦＮ−αサブタイプ、すなわち、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７およびＩＦＮＡ２１に結合し、それらを中和し、かつ、実施例および図７において記載されるような中和特性を有する。したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合断片はすべてのヒトＩＦＮ−αサブタイプに結合する。したがって、なおさらなる好ましい実施形態において、抗ＩＦＮ−α抗体あるいはそのＩＦＮ−α結合断片、合成誘導体または生物工学誘導体は、添付された実施例および図において、具体的には種々のＩＦＮ−αサブタイプに対するその中和活性に関して例示されるような、抗体１２Ｈ５の免疫学的特徴および／または生物学的特性を有する。
１つの実施形態において、本発明の抗ＩＦＮ−α抗体またはＩＦＮ−α結合断片はＩＦＮＡ２１を認識し、かつ／または、ＩＦＮＡ２１を中和し、ただし、この場合、好ましくは、ＩＦＮＡ２１の認識および／または中和には、この抗体または断片によって認識され、かつ／または中和されるいずれかの他のＩＦＮＡの場合と少なくとも実質的に同じ結合優先／中和活性が伴う。
そのうえ、本発明の範囲内で行われる実験において得られる予備的結果により、本発明によって提供される例示的抗体が、少なくとも１つのＩＦＮＡサブタイプに加えて、別のＩ型インターフェロンに、すなわち、図１８において抗体２６Ｂ９および抗体３１Ｂ４について例示的に示されるようなＩＦＮ−オメガ（これはまた、ＩＦＮＷまたはＩＦＮ−ωとして本明細書中では示される）に結合することが既に示された後において、さらなる実験により、ＩＦＮＷに対する本件抗体のうちのいくつかの驚くべき中和特性が、すなわち、図５における抗体２６Ｂ９および抗体３１Ｂ４について、また、図２４における抗体１９Ｄ１１との比較での抗体２６Ｂ９について、図２５〜図２６における抗体２６Ｂ９について、図２５における抗体３１Ｂ４について、図７および図２０における抗体８Ｈ１について、また、図２２における抗体５０Ｅ１１について確認された。したがって、１つの実施形態において、本発明はまた、少なくとも１つのＩＮＦＡサブタイプのほかに、さらには少なくとも１つの他のＩ型インターフェロンと結合する抗ＩＦＮ−α抗体およびそのＩＮＦ−α結合断片に関連し、この場合、好ましくは、該他のＩ型インターフェロンはヒトＩＦＮ−ω（ＩＦＮＷ）である。対応するＩＦＮ結合分子はまた、ＩＦＮＡ／ＩＦＮＷ結合分子または抗ＩＦＮＡ／ＩＦＮＷ抗体として示される場合がある。好ましくは、本発明の抗ＩＦＮ−α抗体またはＩＦＮ−α結合断片は、少なくとも１つのＩＦＮ−αサブタイプに加えて、ヒトＩＦＮ−ω（ＩＦＮＷ）の生物学的活性を中和することができる。そのような抗体は、より大きい力価のＩＦＮＷを有する患者の防止、処置または診断における使用のために、ならびに／あるいは、増大した力価のＩＦＮＡサブタイプおよび増大した力価のＩＦＮＷの両方を示す患者のために特に有益である。したがって、なおさらなる好ましい実施形態において、抗ＩＦＮ−α抗体あるいはそのＩＦＮ−α結合断片、合成誘導体または生物工学誘導体は、添付された実施例および図において、具体的にはＩＦＮ−ωに対するその中和活性に関して例示されるような、抗体２６Ｂ９、抗体３１Ｂ４、抗体８Ｈ１または抗体５０Ｅ１１の免疫学的特徴および／または生物学的特性を有する。
本発明のＩＦＮＡ／ＩＦＮＷ結合分子は、被験体におけるＩＦＮＷの増大した発現または増大したレベルの活性に伴う疾患、特に、ＩＦＮＡの発現または活性レベルが同様に増大している場合の疾患の防止、治療および／または診断において特に有用である。例えば、ＩＦＮＷが、上昇したレベルのＩＦＮＡサブタイプに加えて、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および腎臓疾患を有する患者の血清において見出される；例えば、Ｍ Ｃ Ｄａｌｌ’Ｅｒａ他、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．６４（２００５）、１６９２〜１６９７、および、Ｈａｎ他、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４（２００３）、１７７〜１８６を参照のこと。したがって、多数のＩ型ＩＦＮを広範囲に阻止する本発明のＩＦＮＡ／ＩＦＮＷ結合分子は、潜在的な治療剤として、ＩＦＮＡのみについて特異的な抗体よりも好都合である場合がある。加えて、関節リウマチを有する患者の血清が、ＩＦＮ−βのほかに、正常なコントロールと比較して、ＩＦＮ−αではなく、ＩＦＮ−ωの上昇したレベルを有することが報告されている；Ｌａｖｏｉｅ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８６（２０１１）、１８６、会議アブストラクト１０１．３７を参照のこと。したがって、本発明のＩＦＮＡ／ＩＦＮＷ結合分子はまた、ＩＦＮＷ以外にはＩＦＮＡを伴わない、または有意に伴わない自己免疫性障害の処置において有用であることが判明する場合がある。
したがって、さらなる局面において、本発明は、ヒト由来の抗ＩＦＮ−α抗体の２６Ｂ９、３１Ｂ４、８Ｈ１または５０Ｅ１１の合成誘導体または生物工学誘導体であるＩＦＮＷ結合分子の中で、ＩＦＮＷに対するそれらの中和活性を実質的に保持し、しかし、１つまたは複数のＩＦＮ−αサブタイプに対するそれらの結合特異性あるいはＩＦＮ−αと結合する能力を全く失っているＩＦＮＷ結合分子に関連する。加えて、本発明は、ヒト由来の抗ＩＦＮ−α抗体の２６Ｂ９、３１Ｂ４、８Ｈ１または５０Ｅ１１のいずれかと、実施例に記載されるアッセイのいずれかにおいてＩＦＮＷと結合することおよび／またはＩＦＮＷを中和することについて競合し、しかし、ＩＦＮ−αと結合することおよび／またはＩＦＮ−αを中和することに関しては必ずしも競合しないどのようなＩＦＮＷ結合分子（好ましくは抗体または抗体断片）にも関連する。
そのうえ、図１８に示されるように、本発明の例示的な抗ＩＦＮ−α抗体は、Ｉ型インターフェロンのＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−βに対する、ＩＩ型インターフェロンとしてのＩＦＮ−γに対する、および／または、ＩＩＩ型インターフェロンとしてのＩＦＮ−λ（図１８におけるＩＬ−２９、ＩＬ−２８ＡおよびＩＬ−２８Ｂ）に対するはるかにより弱い親和性を示すか、または、親和性を全く示さない。したがって、１つの実施形態において、本発明は、ＩＩ型インターフェロンおよび／またはＩＩＩ型インターフェロンよりもＩ型インターフェロンと好ましくは結合する抗ＩＦＮ−α抗体およびそのＩＦＮ−α結合断片に関連し、より好ましくは、本発明の抗ＩＦＮ−α抗体およびＩＦＮ−α結合断片はＩＩ型インターフェロンおよびＩＩＩ型インターフェロンを実質的に認識しない。
本発明では、その可変領域において、すなわち、結合ドメインにおいて、（ＶＨ）（配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３８、配列番号７６、配列番号８４および配列番号９２）および（ＶＬ）（配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号７８、配列番号８６および配列番号９４）の図１に示されるアミノ酸配列を含む可変領域のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことによって一般には特徴づけられることがあるＩＦＮ−α結合分子、すなわち、抗体およびそのＩＦＮ−α結合断片が例示される。図１において下線が引かれ、また、表１において特定される例示的なＣＤＲ配列を参照のこと。しかしながら、下記で議論されるように、当業者は、加えて、または、代替として、様々なＣＤＲが使用されることがあり、ただし、これらのＣＤＲは、それらのアミノ酸配列において、図１に示されるアミノ酸配列から、特にＣＤＲ２およびＣＤＲ３の場合には１つ、２つ、３つ、または、それどころか、それ以上のアミノ酸によって異なるという事実を十分に承知している。
実施例および図において示されるような具体的なＩＦＮ−αサブタイプおよびＩＦＮＷに対する特定の結合優先および中和能に関して、上記で提供される一般的な特徴づけは、ＩＦＮ−α結合分子（すなわち、本発明の抗体およびその結合断片）の下記の群に細分される場合がある。
１つの実施形態において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合断片はヒト由来の抗体であり、かつ、ＩＦＮＡ１／１３、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６およびＩＦＮＡ２１からなる群から選択される少なくとも１つのＩＦＮ−αサブタイプに結合し、ただし、その可変領域において、
（ａ）図１（ＶＨ）（配列番号１８）および図１（ＶＬ）（配列番号２０）に示されるＶＨ可変領域アミノ酸配列および／またはＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｂ）図１に示されるようなＶＨ領域および／またはＶＬ領域のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；ならびに／あるいは
（ｄ）（ｂ）のアミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域
を含む。
加えて、または、代替において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合断片は、例示的抗体１９Ｄ１１の結合特徴を示すことによって特徴づけられる。
実施例５において例示されるように、また、図２７Ａ／Ｂに示されるように、例示的抗体１９Ｄ１１によって特異的に認識されるＩＦＮＡ２におけるエピトープが特定されている。したがって、１つの実施形態において、本発明の抗体あるいはＩＦＮ−α結合断片、合成誘導体または生物工学誘導体は、アミノ酸配列ＳＡＡＷＤＥＴＬＬＤＫＦＹＴＥＬＹＱ（配列番号９９）および／またはアミノ酸配列ＲＩＴＬＹＬＫＥＫＫＹＳＰＣＡＷＥＶ（配列番号１００）からなるＩＦＮＡ２におけるエピトープと結合することができる。
別の実施形態において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合断片はヒト由来の抗体であり、かつ、ＩＦＮＡ１／１３、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４およびＩＦＮＡ２１からなる群から選択される少なくとも１つのＩＦＮ−αサブタイプに結合し、ただし、その可変領域において、
（ａ）図１（ＶＨ）（配列番号３０または配列番号３８）および図１（ＶＬ）（配列番号３２または配列番号４０）に示されるＶＨ可変領域アミノ酸配列および／またはＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｂ）図１に示されるようなＶＨ領域および／またはＶＬ領域のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；ならびに／あるいは
（ｄ）（ｂ）のアミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域
を含む。
加えて、または、代替において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合断片は、例示的抗体２６Ｂ９または例示的抗体３１Ｂ４の結合特徴を示すことによって特徴づけられる。したがって、この実施形態において、抗ＩＦＮ−α抗体またはＩＦＮ−α結合断片は好ましくはまた、ＩＦＮＷを認識し、かつ、ＩＦＮＷを中和する；上記もまた参照のこと。
実施例５において例示されるように、また、図２７Ｃ／Ｄに示されるように、例示的抗体２６Ｂ９によって特異的に認識されるＩＦＮＡ２およびＩＦＮＷにおけるエピトープが特定されている。従って、１つの実施形態において、本発明の抗体あるいはＩＦＮ−α結合断片、合成誘導体または生物工学誘導体は、アミノ酸配列ＹＴＥＬＹＱＱＬＮＤＬＥＡＣＶＩＱＧ（配列番号１０１）からなるＩＦＮＡ２のエピトープ、および／または、アミノ酸配列ＴＧＬＨＱＱＬＱＨＬＥＴＣＬＬＱＶＶ（配列番号１０２）からなるＩＦＮＡＷのエピトープと結合することができる。
別の実施形態において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合断片はヒト由来の抗体であり、かつ、ＩＦＮＡ１／１３、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６およびＩＦＮＡ２１のサブタイプからなる群から選択される少なくとも１つのＩＦＮ−αサブタイプに結合し、ただし、その可変領域において、
（ａ）図１（ＶＨ）（配列番号２２）および図１（ＶＬ）（配列番号２４）に示されるＶＨ可変領域アミノ酸配列および／またはＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｂ）図１に示されるようなＶＨ領域および／またはＶＬ領域のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；ならびに／あるいは
（ｄ）（ｂ）のアミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域
を含む。
加えて、または、代替において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合断片は、例示的抗体２５Ｃ３の結合特徴を示すことによって特徴づけられる。
別の実施形態において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合断片はヒト由来の抗体であり、かつ、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６およびＩＦＮＡ２１のサブタイプからなる群から選択される少なくとも１つのＩＦＮ−αサブタイプに結合し、しかし、ＩＦＮＡ１／１３には結合せず、ただし、その可変領域において、
（ａ）図１（ＶＨ）（配列番号２）および図１（ＶＬ）（配列番号４）に示されるＶＨ可変領域アミノ酸配列および／またはＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｂ）図１に示されるようなＶＨ領域および／またはＶＬ領域のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；ならびに／あるいは
（ｄ）（ｂ）のアミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域
を含む。
加えて、または、代替において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合断片は、例示的抗体５Ｄ１の結合特徴を示すことによって特徴づけられる。
別の実施形態において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合断片はヒト由来の抗体であり、かつ、ＩＦＮＡ１／１３、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４およびＩＦＮＡ１６のサブタイプからなる群から選択される少なくとも１つのＩＦＮ−αサブタイプに結合し、ただし、その可変領域において、
（ａ）図１（ＶＨ）（配列番号１０）および図１（ＶＬ）（配列番号１２）に示されるＶＨ可変領域アミノ酸配列および／またはＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｂ）図１に示されるようなＶＨ領域および／またはＶＬ領域のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；ならびに／あるいは
（ｄ）（ｂ）のアミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域
を含む。
加えて、または、代替において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合断片は、例示的抗体１３Ｂ１１の結合特徴を示すことによって特徴づけられる。
別の実施形態において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合断片はヒト由来の抗体であり、かつ、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７およびＩＦＮＡ２１からなる群から選択される少なくとも１つのＩＦＮ−αサブタイプに結合し、ただし、その可変領域において、
（ａ）図１（ＶＨ）（配列番号７６）および図１（ＶＬ）（配列番号７８）に示されるＶＨ可変領域アミノ酸配列および／またはＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｂ）図１に示されるようなＶＨ領域および／またはＶＬ領域のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；ならびに／あるいは
（ｄ）（ｂ）のアミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域
を含む。
加えて、または、代替において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合断片は、例示的抗体８Ｈ１の結合特徴を示すことによって特徴づけられる。したがって、この実施形態において、抗ＩＦＮ−α抗体またはＩＦＮ−α結合断片は好ましくはまた、ＩＦＮＷを認識し、かつ、ＩＦＮＷを中和する；上記もまた参照のこと。
別の実施形態において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合断片はヒト由来の抗体であり、かつ、ＩＦＮＡ１／１３、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４およびＩＦＮＡ２１からなる群から選択される少なくとも１つのＩＦＮ−αサブタイプに結合し、ただし、その可変領域において、
（ａ）図１（ＶＨ）（配列番号８４）および図１（ＶＬ）（配列番号８６）に示されるＶＨ可変領域アミノ酸配列および／またはＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｂ）図１に示されるようなＶＨ領域および／またはＶＬ領域のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；ならびに／あるいは
（ｄ）（ｂ）のアミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域
を含む。
加えて、または、代替において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合断片は、例示的抗体１２Ｈ５の結合特徴を示すことによって特徴づけられる。
別の実施形態において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合断片はヒト由来の抗体であり、かつ、ＩＦＮＡ１／１３、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４およびＩＦＮＡ２１からなる群から選択される少なくとも１つのＩＦＮ−αサブタイプに結合し、ただし、その可変領域において、
（ａ）図１（ＶＨ）（配列番号９２）および図１（ＶＬ）（配列番号９４）に示されるＶＨ可変領域アミノ酸配列および／またはＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｂ）図１に示されるようなＶＨ領域および／またはＶＬ領域のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；ならびに／あるいは
（ｄ）（ｂ）のアミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域
を含む。
加えて、または、代替において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合断片は、例示的抗体５０Ｅ１１の結合特徴を示すことによって特徴づけられる。したがって、この実施形態において、抗ＩＦＮ−α抗体またはＩＦＮ−α結合断片は好ましくはまた、少なくともある程度、ＩＦＮＷを認識し、かつ、ＩＦＮＷを中和する；上記もまた参照のこと。
まとめると、１つの局面において、本発明は、本明細書中に例示されるヒト由来のモノクローナル抗体およびＩＦＮ−α結合断片、ならびに、本件抗体の合成誘導体および生物工学誘導体に関連し、ただし、これらはその可変領域において、
（ａ）下記に示されるＶＨ可変領域アミノ酸配列および／またはＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｉ）図１（ＶＨ）（配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３８、配列番号７６、配列番号８４および配列番号９２）；および
（ｉｉ）図１（ＶＬ）（配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号７８、配列番号８６および配列番号９４）；
（ｂ）図１に示されるようなＶＨ領域および／またはＶＬ領域のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；ならびに／あるいは
（ｄ）（ｂ）のアミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域
を含み、
好ましくは、該抗体、そのＩＦＮ−α結合断片または合成誘導体および生物工学誘導体は、実施例に記載される本件抗体のいずれかの免疫学的特徴および／または生物学的活性の少なくとも１つ（例えば、種々のＩＦＮＡサブタイプおよび／またはＩＦＮＷに対する中和活性）を保持する。
加えて、１つの局面において、本発明は、少なくとも１つのＩＦＮ−αサブタイプおよび／またはＩＦＮＷに対する結合ならびに／あるいは少なくとも１つのＩＦＮ−αサブタイプおよび／またはＩＦＮＷの中和について、本明細書中上記で定義されるような前記抗体またはその断片と競合するＩＦＮ−α中和抗体またはそのＩＦＮ−α結合断片に関連する。そのうえ、１つの実施形態において、本発明の抗体またはそのＩＦＮ−α結合断片は少なくとも、
（ｉ）図１（ＶＨ）（配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３８、配列番号７６、配列番号８４および配列番号９２）；および
（ｉｉ）図１（ＶＬ）（配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号７８、配列番号８６および配列番号９４）
において示されるＶＨ可変領域および／またはＶＬ可変領域のＣＤＲ３、
あるいは、６個、５個または４個のアミノ酸、好ましくは３個以下のアミノ酸、最も好ましくはわずかに２個または１個のアミノ酸の置換、欠失および／または付加によってそのアミノ酸配列において異なる対応するＣＤＲ３を含有する。
治療的適用のために特に好適である抗体を提供するために、すなわち、外来抗体（例えば、ヒトにおけるマウス抗体など）について認められるような本発明の抗体に対する免疫学的応答（ＨＡＭＭ応答）を回避するために、本発明は好ましくは、完全なヒト抗体またはヒト由来の抗体に関連する。なぜならば、例示的なＩＦＮ−α抗体が、本発明を例示する実施例において記載されるが、これらは、ヒト患者に由来するものであるからである。
これに関連して、ヒト化抗体および他の場合にはヒト様抗体に反して、下記の議論もまた参照のこと。本発明のヒト由来抗体は、ヒト身体によって認められているＣＤＲを含むことによって特徴づけられ、したがって、免疫原性である危険性を実質的に有していない。したがって、本発明の抗体は、抗体の可変軽鎖および可変重鎖の一方または両方の少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくは２つのＣＤＲ、最も好ましくは３つすべてのＣＤＲが、本明細書中に例示されるヒト抗体に由来するならば、依然として、ヒト由来であると示される場合がある。
本発明のヒト由来抗体はまた、そのような抗体が、実際にヒト被験体によって最初に発現されたものであり、例えば、ヒト免疫グロブリンを発現するファージライブラリによって生じるインビトロ選択された構築物、または、ヒト免疫グロブリンレパートリーの一部を発現するトランスジェニック動物において生じる異種抗体でないことを強調するために、「ヒト自己抗体」と呼ばれる場合がある（なお、それらはこれまで、ヒト様抗体を提供するために試みるための最も一般的な方法を表していた）。他方で、本発明のヒト由来抗体は、プロテインＡカラムまたは親和性カラムによって精製される場合があるヒト血清抗体そのものから区別するために、合成（的）、組換え（型）および／または生物工学（的）であると示される場合がある。
しかしながら、本発明では、本発明の抗体のさらなる研究が動物モデルにおいて、例えば、ヒトＩＦＮ−αを発現するトランスジェニックマウスにおいて使用され、また、想定される。ヒトにおけるＨＡＭＡ応答と類似した実験動物における免疫原性影響を避けるために、１つの局面において、本発明の抗体は、ヒト化抗体、異種抗体またはヒト−マウスのキメラ抗体、好ましくは齧歯類−ヒトのキメラ抗体または齧歯類化抗体、最も好ましくはマウス−ヒトのキメラ抗体またはマウス化抗体である場合がある。
本明細書中下記においてより詳しく記載されるように、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、免疫グロブリン分子のどのようなタイプ、クラスまたはサブクラスのものでも可能であり、あるいは、免疫グロブリン分子のどのようなタイプ、クラスまたはサブクラスにも由来することができる。しかしながら、好ましい実施形態において、ＩｇＧイソタイプのものである本発明の抗体が提供され、最も好ましくは、ＩｇＧ１サブクラスのものである本発明の抗体が提供される。
そのようなヒト化抗体、キメラ抗体および具体的には完全なヒト抗体、その断片および／または生来的なＦａｂ断片を提供するために、本発明の抗体は好ましくはさらに、表１に示されるＣＨアミノ酸配列およびＣＬアミノ酸配列（配列番号６、配列番号８、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３６、配列番号４２、配列番号４４、配列番号７２、配列番号７４、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９６および配列番号９８）から選択されるアミノ酸配列、あるいは、言及された参照配列に対する少なくとも６０％の同一性、好ましくは７０％の同一性、より好ましくは８０％の同一性、なお一層より好ましくは９０％の同一性、特に好ましくは少なくとも９１％の同一性、９２％の同一性、９３％の同一性、９４％の同一性、９５％の同一性、９６％の同一性、９７％の同一性、９８％の同一性または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＨ定常領域および／またはＣＬ定常領域を含む。
加えて、または、代替において、本発明の抗体のフレームワーク領域は、図１（ＶＨ）（配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３８、配列番号７６、配列番号８４および配列番号９２）および図１（ＶＬ）（配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号７８、配列番号８６および配列番号９４）から選択されるアミノ酸配列、あるいは、言及された参照配列に対する少なくとも６０％の同一性、好ましくは７０％の同一性、より好ましくは８０％の同一性、一層より好ましくは９０％の同一性、特に好ましくは少なくとも９１％の同一性、９２％の同一性、９３％の同一性、９４％の同一性、９５％の同一性、９６％の同一性、９７％の同一性、９８％の同一性または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
上記で述べられるように、本発明の抗体は、ＡＰＥＣＥＤ／ＡＰＳ１患者から単離されたものである。これに関連して、本出願人の同時係属中の国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４１９に開示される様々な実験では驚くべきことに、ＡＰＥＣＥＤ／ＡＰＳ１患者は、オートイムノソーム（ａｕｔｏ−ｉｍｍｕｓｏｍｅ）、すなわち、種々のＩＦＮαサブタイプについて特異的である広範囲にわたる結合分子を同様に含む自己抗体プロファイルを示すことが明らかにされた。ＡＰＳ１は、自己免疫調節因子（ＡＩＲＥ）遺伝子における変異によって引き起こされる希な自己免疫疾患である。ＡＩＲＥタンパク質が、発達途中の胸腺細胞を許容するためにＭＨＣによって提示される多くの末梢自己抗原（例えば、インスリン）の胸腺髄質上皮における発現を支配している。ＡＰＳ１において、ＡＩＲＥの変異は、異常な負の選抜を引き起こし、このことは、自己反応性Ｔ細胞が末梢に逃れることを可能にする。したがって、患者は、極めて不定である一連の様々な臨床的特徴をＡＰＳ１において示し、しかし、通常の場合には、内分泌腺組織のいくつかの自己免疫性障害を伴っている。定義となるようなＡＰＳ１の三徴候には、慢性皮膚粘膜カンジダ症、副甲状腺機能低下症および副腎機能不全が含まれる（Ｐｅｒｈｅｅｎｔｕｐａ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．３１（２００２）、２９５〜３２０）。ＡＰＥＣＥＤ患者において見られる他の臨床状態には、甲状腺自己免疫疾患、真性糖尿病、性腺機能不全、白斑、脱毛症、慢性肝炎、慢性胃炎および悪性貧血、ならびに、種々の形態の他の胃腸症状が挙げられる。ＡＰＥＣＥＤ／ＡＳＰ１患者およびそれらのオートイムノソームのスクリーニングに関するさらなる詳細については、国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４１９およびそれに記載される実施例の記載、特に、１１２頁〜１１７頁における「材料および方法」のセクション、１１７頁〜１１８頁における実施例１、ならびに、１２８頁における実施例７および続く表１〜表１４、そして、１６８頁〜１７１頁における実施例１７を参照のこと（それらの開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。
上記で詳しく記載されるように、また、実施例１において示されるように、１つの好ましい実施形態において、本発明の抗体は、自己免疫性多腺性内分泌不全症・カンジダ症・外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ／ＡＰＳ１）に冒されたヒト被験体のサンプルから、または、類似する自己免疫疾患に冒された患者から、国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４１９およびそれにおける実施例（特に、１１２頁〜１１７頁における「材料および方法」のセクション、１１７頁〜１１８頁における実施例１、１５６頁〜１６１頁における実施例１０、具体的には、その１５６頁におけるセクション「患者およびコントロール」、ならびに、１６８頁〜１７１頁における実施例１７；それらの開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載されるように得られる。
これに関連して、本発明の本件抗ＩＦＮ−α抗体が、ヒト抗体を単離する新規かつ独占権のある方法によってクローン化されていることは特筆される。なお、この方法は本出願人の同時係属中の国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４２０に開示されており、その開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる。
簡単に記載すると、目的とする抗体を単離するためのサンプルは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と、可能な抗体反応性を検出するための血清とを含むか、または、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と、可能な抗体反応性を検出するための血清とからなる。被験体に由来するサンプルは、例えば、所望される抗体（１つまたは複数）の１つまたは複数に対する血清反応性を試験するためにそのまま使用される場合があり、あるいは、さらに処理される場合があり、例えば、Ｂリンパ球について富化される場合がある。具体的には、サンプルは、目的とする抗体を産生するＢ細胞、最も好ましくはメモリーＢ細胞を含むこと、または、そのようなＢ細胞に由来することが好ましい。メモリーＢ細胞が、所望される抗原に対して反応性である細胞をＢ細胞培養物から選び出すまで典型的には最大でも１週間〜２週間、メモリーＢ細胞の明確な寿命のみを可能にする条件のもとで培養され、続いて、単一分取細胞のＲＴ−ＰＣＲが、免疫グロブリン遺伝子レパートリーを得るために行われる；詳細な説明については、国際公開ＷＯ２０１３／０９８４１９の１１８頁〜１２０頁における実施例１および実施例２、ならびに、特に、国際公開ＷＯ２０１３／０９８４２０の２７頁〜３１頁における実施例１〜実施例４を参照のこと（それらの開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。当然のことながら、本発明は、本明細書中上記および下記で定義されるような明確かつ独特の特徴を有する抗体を産生する不死化されたヒトＢメモリーリンパ球およびヒトＢ細胞にまでそれぞれ及ぶ。
したがって、選択された患者プールを使用することのほかに、抗ＩＦＮ−α抗体が、ヒトモノクローナル抗体を自己免疫疾患の患者（例えば、ＡＰＥＣＥＤ／ＡＰＳ１患者など）のＢ細胞から単離するために特別に開発され、かつ、適合化される特定の方法を用いることによって提供されている。
１つの実施形態において、本発明の抗体またはＩＦＮ−α結合分子は、図１に示されるようなＶＨ領域および／またはＶＬ領域のアミノ酸配列、あるいは、表１に示されるような対応する核酸によってコードされるようなＶＨ領域および／またはＶＬ領域のアミノ酸配列を含む。加えて、別の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのヒトＩＦＮ−αサブタイプおよび／またはＩＦＮ−ωに対する特異的結合について、本明細書中上記で定義されるような本発明の抗体と競合する抗ＩＦＮ−α抗体またはＩＦＮ−α結合分子に関連する。
具体的には、実施例および図において例示される抗体について概説されるような免疫学的結合特徴および／または生物学的特性を示す抗ＩＦＮ−α抗体が提供される。存在する場合、抗原との抗体の用語「免疫学的結合特徴」または他の結合特徴はその文法的形態のすべてで、抗体の特異性、親和性、交差反応性および他の結合特徴を示す。
実施例において明らかにされるように、本発明の抗体は、大多数のＩＦＮＡサブタイプに対する、ならびに、２６Ｂ９抗体、３１Ｂ４抗体および８Ｈ１抗体の場合にはＩＦＮＷに対する、サブナノモル濃度の範囲におけるそれらの大きい中和活性によって特に特徴づけられる。好ましくは、ヒト由来のモノクローナル抗体およびＩＦＮ−α結合断片、ならびに、その合成誘導体および生物工学誘導体は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個またはほとんどすべてのＩＦＮＡサブタイプについて、また、必要な場合にはＩＦＮＷについて本明細書中に例示される本件抗体のＩＳＲＥ（インターフェロン刺激応答エレメント）レポーター遺伝子アッセイで求められるようなＩＣ５０値を示し、あるいは、それらのＩＣ５０値は、ＩＦＮＡサブタイプのいずれかについて、また、必要な場合にはＩＦＮＷについて実施例および図において例示される本件抗体に関して求められるＩＣ５０値との差が最大でも５０％であり、好ましくは４０％未満であり、より好ましくは３０％未満であり、なお一層より好ましくは２０％未満であり、特に好ましくは１０％未満である。好ましい実施形態において、本発明の抗体または類似のＩＦＮ結合分子は、ＩＣ５０値が、少なくとも５個、好ましくは６個、より好ましくは７個、なお一層より好ましくは８個、または、好都合には９個もしくは１０個のヒトＩＦＮ−αサブタイプおよび／またはヒトＩＦＮ−ωについて≦１０ｎｇである。
さらなる実施形態において、本発明の抗体は抗体断片である。例えば、本発明の抗体または抗体断片は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片および単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡＢ）からなる群から選ばれる場合がある。
本発明の抗体のさらなる利点が、体液性免疫応答がその生理学的環境および細胞環境において生来的抗原に対して誘発されているという事実のために、典型的には、当該抗原の立体配座エピトープを、例えば、他の細胞成分を伴う状況でのその提示、細胞表面膜におけるその提示、および／または、受容体に対するその結合に起因して認識する自己抗体が産生され、かつ、この自己抗体を単離することができることである。対照的に、モノクローナル抗体（例えば、マウスのモノクローナル体など）、そのヒト化型、または、ファージディスプレイから得られる抗体を作製する従来の方法では典型的に、標的タンパク質の抗原性断片が、非ヒト哺乳動物を免疫化することおよび検出のためにそれぞれ用いられ、このときには通常、生来型タンパク質の存在をその生理学的状況および細胞状況において認識するのではなく、むしろ、免疫原の二次元構造に限定される線状エピトープまたは立体配座エピトープを認識する抗体が得られる。それによれば、本発明の自己抗体がそのエピトープ特異性の面で独特であると予想することは慎重なことである。したがって、本発明はまた、本発明の方法に従って単離される自己抗体と実質的に同じ結合特異性を示す抗体および同様な結合分子に関連する。そのような抗体は、例えば、競合的ＥＬＩＳＡによって、または、より適切には、細胞に基づいた中和アッセイによって、本発明の自己抗体およびそのモノクローナル誘導体を参照抗体としてそれぞれ使用して容易に試験することができ、また、実施例に記載されるか、または、そうでない場合には当業者に知られている免疫学的試験によって容易に試験することができる。
実施例において、また、図において、例えば、図１９において例示されるように、本発明の抗体は、好ましくはヒトドナーから単離され、したがって、ヒトＩＦＮＡサブタイプと結合する。したがって、１つの実施形態において、本発明の抗ＩＦＮ−α抗体およびＩＦＮ−α結合断片はヒト抗原のみを認識し、または、他の生物種（例えば、マウスなど）に由来する対応する抗原よりも少なくとも優先的にヒト抗原を認識する。別の実施形態において、本発明の抗ＩＦＮ−α抗体およびＩＦＮ−α結合断片は他の生物種の少なくとも１つのＩＦＮＡサブタイプと結合し、ただし、この場合、好ましくは、他の生物種はマウスである。本発明の抗体の結合特徴（例えば、特異性および親和性など）が、本明細書中において、例えば、実施例２、実施例５および実施例６、ならびに、図２、図３、図８〜図１３および図１８〜図２７において記載されるような、また示されるようないくつかの実験アッセイで試験されている。
本発明の抗体についてさらに明らかにされているように、本発明の様々な抗体はそれらの標的タンパク質の生物学的活性を中和することができる；例えば、実施例３および図５〜図７において記載されるＳＴＡＴ１リン酸化アッセイおよびインターフェロン特異的応答エレメントレポーター遺伝子アッセイの結果を参照のこと。これに関連して、用語「中和（する）」は、本発明の抗体が、生化学的アッセイまたは細胞型アッセイにおけるその標的タンパク質の生物学的活性を、それぞれのアッセイを本発明の本件抗体の存在下で行うことによって評価され得るように妨害することができることを意味し、この場合、標的タンパク質の生物学的活性が、本発明の抗体の存在を伴わない場合、および、標的タンパク質の生物学的活性を本質的に影響されないままにしておくことが知られている化合物（例えば、コントロール抗体）の存在下におけるタンパク質の生物学的活性と比較して、アッセイに供される本発明の抗体のレベルを増大させることに付随して低下する。そのような生化学的アッセイおよびインビトロ型アッセイはまた、例えば、本発明の抗ＩＦＮ−α抗体について示されているような標的タンパク質の生物学的活性を中和できることが知られている参照抗体を使用して、また、候補抗体を試験サンプルに供して行うことができ、この場合、参照抗体および候補抗体の組み合わされた活性から生じる付加的な中和効果が認められる場合があり、または、どちらかの抗体を標識することによって明らかにされることがある候補抗体および参照抗体の競合が認められる。したがって、本発明の好ましい実施形態において、本発明の方法によって得られる抗体はその抗原の生物学的活性を中和することができ、例えば、少なくとも１つのヒトＩＦＮ−αサブタイプの生物学的活性を中和することができる。
本発明の抗体または抗原結合断片（例えば、ペプチド、ポリペプチドまたは融合タンパク質）が、上記で示されるように、例えば、宿主細胞における発現またはインビトロ無細胞翻訳系における発現によって提供される場合がある。ペプチド、ポリペプチドまたは融合タンパク質を宿主細胞において発現させるために、前記ペプチド、ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸分子が、適切な発現ベクターに、すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳のための必要なエレメントを含有するベクターに挿入される場合がある。当業者によく知られている様々な方法が、目的とするポリペプチドをコードする配列ならびに適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントを含有する発現ベクターを構築するために使用される場合がある。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ遺伝子組換えが含まれる。そのような技術が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）、および、Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９）に記載される；さらには下記の「ポリヌクレオチド」および「発現」のセクション、ならびに、この点についてのさらなる詳細については実施例のセクションで引用される参考文献を参照のこと。
生成物の発現のための好適な宿主細胞は、どのような原核生物細胞または真核生物細胞であってもよい；例えば、細菌細胞（例えば、大腸菌または枯草菌など）、昆虫細胞（バキュロウイルス）、酵母細胞、植物細胞または動物細胞。しかしながら、効率的なプロセッシングのためには、哺乳動物細胞が好ましい。この目的のために有用である典型的な哺乳動物細胞株には、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞およびＮＳＯ細胞が含まれる。
本発明の単離された抗体は、当然のことながら、そのようなものとして、患者に適用され得るのではなく、通常の場合には、例えば、患者におけるその安定性、受容性および生物学的利用能を保証するために薬学的に配合されなければならない。したがって、１つの実施形態において、単離されたモノクローナル抗体またはその断片を薬学的に許容され得る担体と混合する工程をさらに含む本発明の方法が提供される。薬学的に許容され得る担体がさらに下記において詳しく記載される。
本発明の様々な結合分子の安定的かつ永続的な供給源を得るための方策として、特に薬学的用途のためには、これらの結合分子をコードする異種遺伝子が、直接的クローニング、ＰＣＲ増幅または人為的合成によって単離され、好適な宿主細胞または生物において導入され、発現させられる場合がある。したがって、組換えヒト抗ＩＦＮ−α抗体またはそのＩＦＮ−α結合断片を産生させるために有用である組換え細胞を調製するための方法であって、下記の工程を含む方法を提供することもまた、本発明の目的である：
（ａ）Ｂ細胞を上記で記載されるような方法によって調製する工程；
（ｂ）下記のものをコードする核酸を配列決定し、および／または、下記のものをコードする核酸をＢ細胞から得る工程：
（ｉ）表１に示されるＣＨアミノ酸配列およびＣＬアミノ酸配列（配列番号６、配列番号８、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３６、配列番号４２、配列番号４４、配列番号７２、配列番号７４、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８８、配列番号９２、配列番号９６および配列番号９８）の少なくとも１つ、または、少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉｉ）下記に示されるＶＨ可変領域アミノ酸配列および／またはＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：
・図１（ＶＨ）（配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３８、配列番号７６、配列番号８４および配列番号９２）；および
・図１（ＶＬ）（配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号７８、配列番号８６および配列番号９４）；
（ｉｉｉ）図１に示されるようなＶＨ領域および／またはＶＬ領域のアミノ酸配列；
（ｉｖ）（ａ）のアミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；
（ｖ）（ｉｉ）のアミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域；ならびに／あるいは
（ｃ）核酸を、発現宿主における目的とする抗体の発現を可能にするために発現宿主に挿入する工程。
本明細書中に記載されるような宿主細胞は、先の方法において同様に、また、本明細書の「宿主」のセクションで詳しく記載されるように使用される場合がある。この点に関して、１つの実施形態において、発現宿主が酵母細胞、植物細胞または動物細胞である上記方法が提供される。
さらに、１つの実施形態において、ＩＦＮ−αおよび／またはＩＦＮ−ωの発現および活性に伴う障害を処置することにおいて使用されるための医薬組成物を調製するための方法が提供され、この方法は、
（ａ）上記で定義されるような宿主細胞を培養すること；
（ｂ）本発明の抗体、そのＩＦＮ−α結合断片、それらの生物工学誘導体または免疫グロブリン鎖を培養物から医薬品グレードにまで精製すること；および
（ｃ）本発明の抗体、そのＩＦＮ−α結合断片またはそれらの生物工学誘導体を薬学的に許容され得る担体と混合すること
を含む。
目的とするそれぞれの抗体を産生させるための上記方法に関して、１つの実施形態において、本発明は、制限部位を導入するために、コドン使用頻度を変更するために、ならびに／あるいは、転写調節配列および／または翻訳調節配列を加え、または最適化するために、核酸が上記の工程（ｂ）と工程（ｃ）との間で操作される方法を提供する。
添付された実施例２および実施例３において明らかにされるように、また、表４にまとめられるように、特に大きい見かけの結合親和性（ＥＣ５０／ＥＤ５０）および／または特に大きいインビトロ中和活性を少なくとも１つのヒトＩＦＮ−αサブタイプについての低い阻害濃度（ＩＣ５０）とともに示す結合分子（すなわち、抗体）が特定されており、また、クローン化されている。この点に関して、１つの実施形態において、本発明の抗ＩＦＮ−α抗体およびそのＩＦＮ−α結合断片は、そのそれぞれの標的分子について大きい親和性を有しており、例えば、本明細書中上記で定義されるような様々なヒトＩＦＮ−αサブタイプについて大きい親和性を有しており、ＥＣ５０を１００ｎｇ／ｍｌ未満の濃度で示し、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ未満の濃度で示し、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ未満の濃度で示す。代替において、または、加えて、１つの実施形態において、抗ＩＦＮ−α抗体およびそのＩＦＮ−α結合断片は、少なくとも１つのヒトＩＦＮ−αサブタイプについて高い中和能を有しており、ＩＣ５０を、５００ｎｇ／ｍｌ未満、４００ｎｇ／ｍｌ未満、３００ｎｇ／ｍｌ未満または１００ｎｇ／ｍｌ未満の濃度で示し、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ未満の濃度で示し、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ未満の濃度で示し、最も好ましくは５ｎｇ／ｍｌ未満の濃度で示す。本発明の抗体の結合親和性に関してより詳しくは、例えば、さらに下記のセクション「結合特徴」を参照のこと。
本発明はまた、本発明の抗体または抗原結合断片の免疫グロブリン鎖の可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチドに関連する。好ましくは、前記可変領域は、図１に示されるような可変領域のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
導出された配列の場合、前記配列は、少なくとも６０％の同一性、より好ましくは（次の順で）少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、最も好ましくは９５％、少なくとも９６％〜９９％、または、さらには、１００％の同一性を、上記で言及され、また、配列表において特定されるそのような配列からなる群の配列に対して示す。２つの配列の間におけるパーセント同一性は、ギャップの数を考慮に入れた場合のこれらの配列によって共有される同一位置の数、および、それぞれのギャップの長さの関数であり、この場合、ギャップは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要がある。配列の比較および２つの配列の間におけるパーセント同一性の決定を、当業者にはよく知られている数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。本明細書中で言及される同一性は、本明細書中下記でさらに言及されるようなＢＬＡＳＴプログラムを使用して決定されなければならない。
上記で述べられるように、好ましい実施形態において、本発明は、実質的に完全なヒト抗体に関連し、好ましくは、定常重鎖Ｉ（ＣＨ１）と定常領域の対応する軽鎖とを少なくとも含むＩｇＧ、すなわち、γ−１、γ−２、γ−３またはγ−４をラムダまたはカッパとの組合せで含むＩｇＧに関連する。特に好ましい実施形態において、実施例において例示される本件抗体について単離されるそのような定常領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が、下記の表１において、また、ヌクレオチド配列に関しては配列番号５、配列番号７、配列番号１３、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３５、配列番号４１、配列番号４３、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９５および配列番号９７において、ならびに／あるいは、アミノ酸配列に関しては配列番号６、配列番号８、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３６、配列番号４２、配列番号４４、配列番号７２、配列番号７４、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９６および配列番号９８において、または、前記で示されるこれらに対して少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列において示されるように使用される。
上記によれば、本発明はまた、本発明の抗ＩＦＮ−α抗体またはＩＦＮ−α結合断片の１つの免疫グロブリン鎖の可変領域を少なくともコードするポリヌクレオチド、具体的には組換えポリヌクレオチドに関連する。典型的には、このようなポリヌクレオチドによってコードされる前記可変領域は、前記抗体の可変領域のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。抗体の可変領域および定常領域が下記のセクション「ＩｇＧ構造」においてより詳しく記載される。本発明の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、下記の表１に示されるような本発明の抗体のＶＨ領域またはＶＬ領域をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸を含むか、あるいは、そのような核酸から本質的になるか、あるいは、そのような核酸からなる。この点に関して、当業者は、軽鎖および／または重鎖の可変ドメインを少なくともコードするポリヌクレオチドは様々な免疫グロブリン鎖またはそれらの１つのみのどちらかの可変ドメインをコードし得ることを容易に理解するであろう。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書中上記で定義されるような抗ＩＦＮ−α抗体またはＩＦＮ−ａ結合断片をコードする。
表１：本発明のＩｇＧ１型かつカッパ型のＩＦＮ−α特異的な５Ｄ１抗体、１３Ｂ１１抗体、１９Ｄ１１抗体、２５Ｃ３抗体、２６Ｂ９抗体、３１Ｂ４抗体、８Ｈ１抗体、１２Ｈ５抗体および５０Ｅ１１抗体の可変領域および定常領域（ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ、ＣＬ）領域のヌクレオチド配列。下線が引かれた太字のヌクレオチドまたはアミノ酸により、可変鎖配列におけるＣＤＲコード領域が示される。下線が引かれた斜体字のヌクレオチドまたはアミノ酸により、配列決定がなされていないが、データベースから得られている配列が示される。定常鎖において、そのような領域がデータベースにおける該当するヒト生殖系列可変領域配列とアライメントされ、それらと一致させられる；例えば、ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）によって管理されるＶｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ）を参照のこと。
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当業者は、上記可変ドメインを有する抗体の可変ドメインが、所望される特異性および生物学的機能の他のポリペプチドまたは抗体を構築するために使用され得ることを容易に理解するであろう。したがって、本発明はまた、上記で記載された可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲを含み、かつ、好都合には、添付された実施例において記載される抗体と実質的に同じ結合特性または類似する結合特性を有するポリペプチドおよび抗体を包含する。当業者は、本明細書中に記載される可変ドメインまたはＣＤＲを使用して、様々な抗体が、この技術分野において知られている方法に従って、例えば、欧州特許出願ＥＰ０４５１２１６Ａ１および同ＥＰ０５４９５８１Ａ１に記載されるように構築され得ることを容易に理解するであろう。さらに、当業者は、結合親和性が、アミノ酸置換をＣＤＲ内において、または、Ｋａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲと部分的に重なる超可変ループ（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）、９０１〜９１７）の内部において行うことによって強化されることがあることを知っている。したがって、本発明はまた、述べられたＣＤＲの１つまたは複数が１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、好ましくは２つ以下のアミノ酸置換を含む抗体に関連する。好ましくは、本発明の抗体は、その免疫グロブリン鎖の一方または両方において、ＶＨ領域については配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３８、配列番号７６、配列番号８４および配列番号９２に示されるような可変領域、ならびに、ＶＬ領域については配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号７８、配列番号８６および配列番号９４に示されるような可変領域、あるいは、図１に示されるような可変領域の２つのＣＤＲまたは３つすべてのＣＤＲを含む。
上記抗体をコードする本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成的に生産されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらのポリヌクレオチドのいずれかを単独でまたは組み合わせて含む組換え的に生産されたキメラ核酸分子であり得る。一実施形態ではポリヌクレオチドは可変領域と定常ドメインの少なくとも一部をコードするｃＤＮＡである。好ましい実施形態では、場合により、前記抗体の他方の免疫グロブリン鎖の可変領域をコードする前記ポリヌクレオチドと組み合わせて、上記ポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。このようなベクターは、適切な宿主細胞中、適切な条件下で前記ベクターの選択を可能にするマーカ遺伝子などのさらなる遺伝子を含み得る。
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、原核細胞または真核細胞における発現を可能にする発現制御配列に機能的に連結される。前記ポリヌクレオチドの発現は、翻訳可能なｍＲＮＡへのポリヌクレオチドの転写を含む。真核細胞、好ましくは、哺乳動物細胞における発現を確実にする調節要素は、当業者に周知である。それらは、通常、転写開始を確実にする調節配列と、場合により、転写終止および転写産物の安定化を確実にするポリＡシグナルとを含む。さらなる調節要素は、転写および翻訳エンハンサ、ならびに／または本来的に結合しているプロモータ領域もしくは異種プロモータ領域を含み得る。
これに関して、当業者であれば、軽鎖および／または重鎖の少なくとも可変ドメインをコードするポリヌクレオチドは、両方の免疫グロブリン鎖または一方の鎖のみの可変ドメインをコードし得ることを容易に認識するであろう。
同様に、前記ポリヌクレオチドは同じプロモータの制御下にあってもよいし、または別個に発現制御されてもよい。原核生物宿主細胞における発現を可能にする有望な調節要素は、例えば、大腸菌の場合にはＰＬ、ｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモータを含み、真核生物宿主細胞における発現を可能にする調節要素の例は、酵母の場合にはＡＯＸ１またはＧＡＬ１プロモータ、または哺乳動物および他の動物細胞の場合にはＣＭＶ−、ＳＶ４０−、ＲＳＶ−プロモータ、ＣＭＶ−エンハンサ、ＳＶ４０−エンハンサまたはグロビンイントロンである。
転写開始に関与する要素に加えて、このような調節要素は、ポリヌクレオチドの下流に、ＳＶ４０−ポリＡ部位またはｔｋ−ポリＡ部位などの転写終止シグナルも含み得る。さらに、使用される発現系に応じて、ポリペプチドを細胞区画に方向付けるかまたはそれを培地に分泌させることができるリーダ配列を本発明のポリヌクレオチドのコード配列に付加することができ、当技術分野において周知である。リーダ配列は、翻訳、開始および終止配列と適切な段階で会合し、好ましくは、リーダ配列は、翻訳されたタンパク質またはその一部を周辺腔または細胞外培地に分泌させることができる。場合により、異種配列は、所望の特徴、例えば、発現された組換え産物の安定化または簡単な精製を付与するＣ末端またはＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。本文脈では、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）などの適切な発現ベクターが当技術分野において公知である。
好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができるベクター中の真核生物プロモータ系であるが、原核生物宿主用の制御配列も使用し得る。ベクターが適切な宿主に組み込まれたら、ヌクレオチド配列の高レベルの発現に適切な条件下で宿主を維持し、所望により、免疫グロブリン軽鎖、重鎖、軽鎖／重鎖二量体またはインタクトな抗体、結合断片または他の免疫グロブリン形態を回収および精製する；Ｂｅｙｃｈｏｋ，Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，（１９７９）を参照のこと。
さらに、本発明は、場合により、本発明の抗体の他方の免疫グロブリン鎖の可変ドメインをコードする本発明のポリヌクレオチドと組み合わせて、抗原または好ましくは本発明の抗体の免疫グロブリン鎖の可変ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子工学で通常使用されるベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージに関する。好ましくは、前記ベクターは、発現ベクターおよび／または遺伝子導入もしくは標的化ベクターである。
レトルウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルスまたはウシ乳頭腫ウイルスなどのウイルス由来の発現ベクターを、標的細胞集団への本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの送達に使用することができる。組換えウイルスベクターを構築するために、当業者に周知の方法を使用することができる；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）に記載されている技術を参照のこと。あるいは、標的細胞への送達のために、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターをリポソームに再構成することができる。本発明のポリヌクレオチドを含有するベクター（例えば、免疫グロブリン鎖の重および／または軽可変ドメインをコードする配列および発現制御配列）を、周知方法（これは、細胞宿主の種類に応じて変化する）によって宿主細胞に導入することができる。例えば、原核細胞の場合には塩化カルシウムトランスフェクションが一般的に用いられるのに対して、他の細胞宿主の形質転換の場合にはリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが使用され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照のこと）。
上記に関して、本発明はさらに、前記ポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞に関する。前記宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。宿主細胞中に存在する本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得るか、または染色体外で維持され得る。宿主細胞は、細菌、昆虫、真菌、植物、動物またはヒト細胞などの任意の原核細胞または真核細胞であり得る；本発明の抗体を生産するのに適切な宿主細胞および方法は、以下のセクション「宿主細胞」により詳細に記載されている。
上述の宿主細胞を使用して、本発明の抗体を、例えば、薬学的使用のために、または、治療的介入のための標的として産生させ、また調製することが可能である。したがって、１つの実施形態において、抗ＩＦＮ−α抗体またはそのＩＦＮ−α結合断片を調製するための方法であって、下記の工程を含む方法を提供することもまた、本発明の目的である：
（ａ）本明細書中上記で定義されるような細胞を培養する工程；および
（ｂ）前記抗体またはそのＩＦＮ−α結合断片を培養物から単離する工程。
したがって、本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる、あるいは、抗ＩＦＮ−α抗体またはその免疫グロブリン鎖を調製するための上述の方法によって得ることができる組換え抗体またはそのＩＦＮ−α結合断片、その免疫グロブリン鎖に関連する。抗体およびその模倣体の組換え産生のための様々な手段および方法、ならびに、競合する結合分子（これは抗体である場合があり、または、抗体でない場合がある）についてスクリーニングする様々な方法がこの技術分野において知られている。しかしながら、本明細書中に記載されるように、特にヒトにおける治療的適用に関しては、本発明の抗体は、前記抗体の適用が、キメラ抗体について、また、さらには、ヒト化抗体について他の場合には認められるそのような抗体に対する免疫応答を実質的に有していないという意味で、組換えヒト抗体である。
結合分子、抗体またはその断片は、治療薬として直接使用することができる。しかしながら、一実施形態では、本発明によって提供される抗体または抗原結合断片は、検出可能に標識されるか、または薬物に結合され、ここで、検出可能な標識は、酵素、放射性同位体、フルオロフォア、ペプチドおよび重金属からなる群より選択される。標識された本発明の抗体または抗原結合断片は、「免疫化学／免疫標識」のようなインビトロアッセイを含め、インビボまたはインビトロで特定の標的を検出するのに使用することができる。インビボにおいて、それらは、目的の抗原を発現する組織、細胞または他の物質を検出するために、核医学イメージング技術と同様の方法で使用することができる。標識、それらの診断での使用、およびそれらと本発明の結合分子とのカップリングは、さらに以下のセクション「標識および診断」により詳細に記載されている。
本発明の抗体は、自己免疫性障害に冒された動物またはヒトから単離される。他方で、本発明において特定されるＩＦＮ−α特異的抗体は、罹患個体の免疫系（例えば、ＡＰＥＣＥＤ患者において認められる症状に関連する免疫系）を重度に損なうことに関与する場合がある。したがって、自己免疫性障害に罹患する被験体の病理学的反応を、自己抗体の数および／またはその影響を罹患したヒト患者または動物において最小限に抑えるための手段および対策を提供することによって消滅させること、または少なくとも緩和することが、本発明のさらなる局面である。したがって、１つの実施形態において、本発明はまた、本発明の自己抗体によって特異的に認識されるエピトープを含むペプチドまたはペプチド型化合物に関連する。競合的抗原の適用による場合と同様な効果で、それにより、様々な自己抗体がそれらのそれぞれの標的に結合しないようにすること、また、様々な自己抗体がそれらのそれぞれの標的に結合することを妨げることが、さらに下記で詳しく記載されるように抗イディオタイプ抗体によって得られる場合がある。したがって、１つの実施形態において、本発明はまた、本発明の自己抗体の抗イディオタイプ抗体を提供する。
既に上述したように、本発明はまた、上記に定義された障害（すなわち、自己寛容の発生障害または無秩序な発生に関連する障害）の処置に使用するための、本発明の抗イディオタイプ抗体またはペプチドもしくはペプチド系化合物に関する。これらの単離された本発明の抗体またはその断片は、モノクローナル抗イディオタイプのパネルを作製するために免疫原として使用することができる。抗イディオタイプ抗体を作製するのに適切な方法については、Ｒａｙｃｈａｄｈｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７（１９８６），１７４３を参照し、Ｔ細胞については、Ｅｒｔｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５９（１９８５），１７７６を参照のこと。Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７（１９８６），１７４３によって詳細に記載されているように、当技術分野においてルーチンに実施される標準的なアッセイを使用すれば、抗イディオタイプ抗体は、内部イメージおよび非内部イメージイディオトープの表示を特徴とするであろう。抗イディオタイプ抗体が、それが結合するかまたは結合される抗体の抗原を構造的に模倣する場合、その抗原の「内部イメージ」と称される。
自己免疫性疾患関連自己抗体（複数の自己抗体）のイディオタイプを模倣する分子を提供する方法は、当技術分野において説明されている；例えば、国際公開第０３／０９９８６８号（この開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。例えば、このような方法は、以下の工程：（ａ）本発明の方法にしたがって自己抗体を提供すること；（ｂ）該自己抗体を固相に結合してアフィニティマトリックスを形成すること；（ｃ）免疫グロブリンを含むプールした血漿もしくはＢ細胞を該アフィニティマトリックスと接触させ、次いで未結合の血漿成分を除去すること；（ｄ）自己抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗Ｉｄ）である結合した免疫グロブリンをマトリックスから溶出すること；（ｅ）複数の分子メンバーを含む分子ライブラリを提供すること；ならびに（ｅ）該抗Ｉｄを該分子ライブラリと接触させ、該抗Ｉｄが結合した結合分子を単離すること（該結合分子は、自己抗体のイディオタイプを模倣する分子である）を含み得る。自己抗体を単離する方法は、国際公開第２０１０／１３６１９６号（この開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されており、自己免疫性疾患および免疫系障害を処置するための、正常ヒト血清（ＮＨＳ）から単離された天然ポリクローナルＩｇＧ反応性抗体（Ａｂ）を含有する免疫グロブリン調製物が記載されている。ＩｇＧ反応性Ａｂは、抗原結合部位内またはその付近（例えば、オーバーラップしている）のいずれかに位置するそれらの抗原決定基に結合することよって、自己免疫性疾患を患っている患者の血清中に存在する疾患関連または病原性自己抗体を強力に中和する。
本発明はまた、上述の抗ＩＦＮ−α抗体および／またはＩＦＮ−α結合断片、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、細胞、ペプチドまたはペプチド型化合物、ならびに／あるいは、組合せで本発明の抗体またはそのＩＦＮ−α結合断片の特徴を示す抗体またはそのＩＦＮ−α結合断片のカクテルのうちのいずれか１つを含む組成物に関連する。加えて、または、代替として、１つの実施形態において、本発明の組成物またはキットは本発明の抗イディオタイプ抗体を含む。１つの実施形態において、組成物は医薬組成物であり、かつ、薬学的に許容され得る担体をさらに含む。薬学的に許容され得る担体、投与経路および投薬計画は、当業者に知られている対応する文献から採用することができ、さらには下記の「薬学的担体」および「投薬計画」のセクションにおいてもより詳しく記載される。
生化学的アッセイおよび細胞型インビトロアッセイのほかに、本発明の抗体の治療的有用性は、適切な動物モデルにおいて、例えば、ＲＡ、乾癬、ＳＬＥまたはＴ１ＤＭなどについての動物モデルにおいて確認することができる；下記の実施例、例えば、実施例４を参照のこと。
一実施形態では、医薬組成物は、好ましくは、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、コルチコステロイド、抗ヒスタミンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、炎症または自己免疫性障害を処置するのに有用なさらなる薬剤をさらに含む。加えてまたはあるいは、さらなる実施形態では、医薬組成物は、免疫抑制薬および抗炎症または「抗リウマチ」薬からなる群より選択される、炎症関連疾患を処置するのに有用なさらなる薬剤をさらに含む。
別の実施形態では、組成物は診断組成物又はキットであり、免疫診断法または核酸ベースの診断法に通常使用される試薬をさらに含む。
さらに、本発明は、下記の方法において使用されるための上述の抗ＩＦＮ−α抗体およびそのＩＦＮ−α結合断片のいずれか１つ、あるいは、本明細書中上記で定義されるような組成物に関連する：
（ａ）免疫媒介もしくは自己免疫性の疾患もしくは状態を処置するか、または、免疫媒介もしくは自己免疫性の疾患もしくは状態の進行を妨げる方法；
（ｂ）免疫媒介もしくは自己免疫性の疾患もしくは状態に伴う症状を改善する方法；ならびに／あるいは
（ｃ）免疫媒介もしくは自己免疫性の疾患もしくは状態の存在について、または、免疫媒介もしくは自己免疫性の疾患もしくは状態を発症することについての被験体の危険性を明らかにするために被験体を診断するか、またはスクリーニングする方法；ただし、前記疾患または状態は患者におけるＩＦＮ−αおよび／またはＩＦＮ−ωの発現に伴う。
これに関して、いくつかの適用経路を用いることができる。本発明の一実施形態では、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、非経口投与、またはエアロゾルとして投与されるように設計されている、上記抗体もしくは抗原結合断片、抗イディオタイプ抗体またはペプチドもしくはペプチド系化合物、及び／又は、組合せによって本発明の抗体の特徴を示す抗体のカクテルが提供される。
上記で示されるように、それらの結合特異性のために、本発明の様々な分子（例えば、抗体およびその断片など）は好ましくは、免疫媒介または自己免疫性の障害または状態の処置、改善、診断および／またはスクリーニングの上記で規定される方法において使用される場合がある。例えば、上昇したＩＦＮ−α活性がしばしば、ＳＬＥを有する患者の血清において検出されている（Ｒｏｎｎｂｌｏｍ他、Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎ． ２３（２０１１）、１１３〜１２１）。インターフェロン依存性遺伝子の特異的な発現パターン（これは「インターフェロンシグナチャー」と呼ばれる）がさらに、様々な自己免疫性障害の患者（例えば、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、多発性硬化症（ＭＳ）、乾癬、１型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病（Ｔ１ＤＭまたはＩＤＤＭ）の患者および一部のＲＡ患者など）の白血球において示される（例えば、Ｈｉｇｇｓ他、Ｅｕｒ Ｍｕｓｃ Ｒｅｖ（２０１２）、２２〜２８を参照のこと）。加えて、炎症性関節炎、ＭＳおよびＴ１ＤＭの発症が、ＩＦＮ−α療法の期間中に繰り返し報告されており、このことは、ＩＦＮ−αがそれらの疾患を少なくとも促進させることを示している（Ｃｒｏｗ ＭＫ．、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ．（２０１０）、増刊１：Ｓ５）。さらなるデータにより、ＩＦＮ−αの関与が、筋炎、全身性強皮症、慢性乾癬において示唆され（Ｈｉｇｇｓ他、Ｅｕｒ Ｍｕｓｃ Ｒｅｖ（２０１２）、２２〜２８；Ｂｉｓｓｏｎｎｅｔｔｅ他、Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｄｅｒｍａｔｏｌ（２００９）、４２７〜４３６；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ＳＡ、Ａｒｔｈ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ（２０１０）：Ｓ４）、また、自己免疫性甲状腺炎において示唆される（ＰｒｕｍｍｅｌおよびＬａｕｒｂｅｒｇ、Ｔｈｙｒｏｉｄ（２００３）、５４７〜５５１）。したがって、１つの実施形態において、上記方法において使用されるための抗体またはそのＩＦＮ−α結合断片あるいは本明細書中上記で定義されるような組成物が提供され、この場合、前記疾患は自己免疫疾患であり、好ましくは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、皮膚エリテマトーデス（ＣＬＥ）、円板状エリテマトーデス（ＤＬＥ）、１型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、乾癬、自己免疫性甲状腺炎、関節リウマチ、脊椎関節炎、強皮症、および、白血病を含む種々のガン形態（例えば、乳ガンおよび卵巣ガンならびに小児リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ；Ｅｉｎａｖ他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２４（２００５）、６３６７〜６３７５）からなる群から選択される自己免疫疾患である。予備的結果では、加えてＴ１ＤＭに罹患する、または罹患していないＡＰＳ１患者から得られる抗体の中和活性における違いが示唆された（図４）。しかしながら、患者血清のより詳細な分析により、両方の種類の患者における個々の抗ＩＦＮＡ抗体の中和活性が実質的に同じである場合があり、一方で、抗体力価およびＩＦＮ中和活性の総レベルが有意に異なり、非常に低い力価がＴ１ＤＭ患者において認められることが明らかにされた；図３１および図３２を参照のこと。したがって、１つの実施形態において、本発明はまた、血清のサンプルが、コントロールサンプルと比較して、すなわち、健康な被験体から得られる血清、または、疾患症状を有していないＴＤ１Ｍ患者から得られる血清と比較して、より低い中和活性を少なくとも１つのＩＦＮ−αサブタイプのサイトカインに対して示すと判定された患者におけるＴ１ＤＭの処置において使用されるための本明細書中に記載されるＩＦＮ−α結合性およびＩＦＮ−α／ω結合性の分子、ならびに、他のＩＦＮ−α結合分子に関連する。
処置において好適である分子、例えば、本明細書中に示される炎症に伴う障害の処置において好適である分子の多さのために、本発明はまた、そのような障害（好ましくは、免疫媒介または自己免疫性の疾患または状態はＩＦＮ−αおよび／またはＩＦＮ−ωの発現に伴う）の処置、そのような障害の診断、ならびに／あるいは、そのような障害の起こりそうな経過および結果を予後判定する方法に関連し、また、本発明の分子の使用に関連する。１つの実施形態において、そのような障害を処置するための方法が提供され、この方法は、その必要性のある被験体に、治療有効量の上述の抗体またはその抗原結合断片、組合せで本発明の抗体の特徴を示す抗体のカクテル、抗イディオタイプ抗体またはペプチドもしくはペプチド型化合物を投与することを含む。
さらに、１つの実施形態において、本発明は、ＩＦＮ−αおよび／またはＩＦＮ−ωの発現に伴う免疫媒介または自己免疫性の疾患または状態を処置する方法であって、被験体に、
（ｉ）本発明の抗ＩＦＮ−α抗体およびＩＦＮ−α結合断片の少なくとも１つのＣＤＲ
；あるいは
（ｉｉ）本明細書中上記で定義されるような少なくとも１つの抗イディオタイプ抗体および／またはペプチドもしくはペプチド型化合物
を含むリガンド結合分子の治療有効量を投与することを含む方法に関連する。
疾患に関連づけられるか、または疾患を引き起こす特定の抗原のエピトープについて特異的であるただ１つのモノクローナル抗体を使用することに基づく処置方法は、いくつかの欠点に悩まされる場合がある。例えば、処置の困難さおよびおそらくは非効率性が、いくつかの抗原を同時に標的とすることを必要とする特定の障害を引き起こす病原性機構の多さから生じる場合がある。そのうえ、患者集団の本来的な多様性を、少なくとも使用されるモノクローナル抗体の低下した結合効率を引き起こすことがある異なる患者または一人の患者のどちらにおいてでも、例えば、所与抗原の多型、グリコシル化の不均一性またはわずかな変性に関して考慮に入れなければならない。これらの欠点のいくつかは、例えば、抗原が、処置されることが意図される患者に免疫学的に関連しているかどうかを、また、どのようなエピトープ変化であれ、エピトープ変化が特定の患者において存在するかどうかを判定するための処置前のスクリーニングによって回避される場合がある。しかしながら、そのようなスクリーニングは多くの場合、処置の緊急性のために、または、費用抑制のために省かれる。したがって、本発明はさらに、２つ以上のタイプの結合分子を一度に患者に適用することに基づく方法、すなわち、結合分子のカクテルを適用することに基づく方法に関連する。これらの結合分子は、異なるエピトープにおいて１つのＩＦＮＡサブタイプに、および／または、ＩＦＮ−ωのエピトープに特異的に結合する場合があり、この場合、適用される結合分子のそれぞれが別のＩＦＮＡサブタイプと特異的に結合する場合があり、または、２つ以上のＩＦＮＡサブタイプのいくつかのエピトープおよび／またはＩＦＮ−ωに結合するいくつかの結合分子が使用される。本発明の様々な結合分子が抗原としての１つのＩＦＮＡサブタイプに向けられる（特異的に結合する）場合、それらの結合特異性は前記抗原の異なったエピトープに向けられる。そのようなカクテルの使用が、自己免疫性障害（例えば、ＡＰＳ１など）に罹患する患者を処置するために特に想定される。これは、そのような患者は、約３０００の内因性抗原に対する自己抗体の存在を考慮すると、１つの特定の抗体による単独療法を受け入れないことが多いからである。そのような場合には、同じ抗原特異性または異なる抗原特異性を有する本発明の２つ以上のモノクローナル抗体および／またはペプチドおよびペプチド型化合物による併用療法は、症状の少なくとも何らかの軽減を達成することが予想される。
したがって、１つの実施形態において、障害を処置するさらなる方法であって、
・本明細書中上記で定義されるようなＩＦＮＡサブタイプおよび／またはＩＦＮ−ωと特異的に結合する本発明の抗ＩＦＮ−α抗体およびＩＦＮ−α結合断片；ならびに／あるいは
・本発明の抗イディオタイプ抗体および／または本発明のペプチドもしくはペプチド型化合物（ただし、そのようなペプチドもしくはペプチド型化合物は、本発明の抗ＩＦＮ−α抗体およびＩＦＮ−α結合断片によって特異的に認識されるエピトープを含む）
からなる群から選択される少なくとも２つ、３つ、４つ、５つおよびそれ以上の成分から本質的になるカクテルの治療有効量を被験体に投与することを含む方法が提供される。
本発明は当然のことながら、ＩＦＮ−αの１つもしくは複数のサブタイプおよび／またはＩＦＮ−ωの発現に伴う免疫媒介または自己免疫性の状態および障害を診断することに向けられる診断方法および予後方法、ならびに／あるいは、そのような疾患の発症の予後、すなわち、その進行、処置に対する応答または回復にもまた及ぶ。したがって、１つの実施形態において、本発明は、ＩＦＮ−αの発現に伴う被験体における免疫媒介または自己免疫性の疾患または状態を診断するための方法であって、被験体の生物学的サンプルを本発明の抗ＩＦＮ−α抗体およびＩＦＮ−α結合断片と接触させること、ならびに、ＩＦＮ−αおよび／またはＩＦＮ−ωの存在を検出することを含む方法に関連する。さらに、１つの実施形態において、本発明は、単離された生物学的サンプルにおいてＩＦＮ−αおよび／またはＩＦＮ−ωを検出するか、または測定する方法であって、該サンプルを本発明の抗ＩＦＮ−α抗体と混合すること、当該抗体により、混合物に存在するいずれかのＩＦＮ−αサブタイプおよび／またはＩＦＮ−ωとの複合体を形成させること、ならびに、該混合物に存在する該複合体を検出することを含む方法に関連する。
既に上記で述べられたように、１つの実施形態において、本発明は、ＩＦＮ−αおよび／またはＩＦＮ−ωの発現に伴う免疫媒介または自己免疫性の疾患または状態を診断するためのキットであって、上述の抗ＩＦＮ−α抗体およびＩＦＮ−α結合断片、抗イディオタイプ抗体またはペプチドもしくはペプチド型化合物、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞を、必要な場合には使用のための試薬および／または説明書と一緒に含むキットに関連する。本発明のキットには、例えば、キットを含む容器の内部に、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められる形式での通知が伴い得る（そのような通知は、ヒト投与のための製造、使用または販売の当局による承認を反映する）。加えて、または、代替において、キットは、適切な診断アッセイにおいて使用されるための試薬および／または説明書を含む。本発明の組成物、すなわち、キットは、当然のことではあるが、上記で述べられるような疾患を処置するために特に適用可能である、ＩＦＮ−αの発現に伴う障害の診断、防止および処置のために特に適している。特に好ましい実施形態において、障害はＩＦＮ−αサブタイプの１つもしくは複数および／またはＩＦＮ−ωの発現に伴う。
別の実施形態では、本発明は、上記本発明の結合分子、抗体、抗原結合断片、ペプチドもしくはペプチド系化合物、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞のうちのいずれか１つ、および場合により、免疫診断法または核酸ベースの診断法で通常使用される試薬などの検出に適切な手段を含む診断組成物に関する。本発明の抗体は、例えば、それらを液相でまたは固相担体に結合して利用することができるイムノアッセイで使用するのに適切である。本発明の抗体を利用することができるイムノアッセイの例は、直接または間接フォーマットのいずれかの競合および非競合イムノアッセイである。このようなイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ（イムノメトリックアッセイ）、フローサイトメトリおよびウェスタンブロットアッセイである。本発明の抗原および抗体を多くの異なる担体に結合させ、それらに特異的に結合した細胞を単離するのに使用することができる。周知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および改変セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよびマグネタイトが挙げられる。担体の性質は、本発明の目的のために、可溶性または不溶性のいずれかであり得る。当業者に公知の多くの異なる標識および標識方法がある。本発明に使用することができる標識の種類の例としては、酵素、放射性同位体、コロイド状金属、蛍光化合物、化学発光化合物および生物発光化合物が挙げられる（上記実施形態も参照のこと）。
この関連において、本発明はまた、この目的のために特に設計される手段に関連する。例えば、タンパク質または抗体に基づくアレイが使用される場合があり、アレイには、例えば、１つまたは複数のＩＦＮ−αサブタイプに由来し、自己免疫疾患（具体的には、ＳＬＥまたはＡＰＥＣＥＤ／ＡＰＳ１）に罹患する患者に存在するかもしれない自己抗体を検出するための疾患関連抗原を含有する抗原が装荷されるか、あるいは、そのような炎症関連抗原のいずれか１つを特異的に認識する本発明の抗体または同等な抗原結合分子が装荷される。マイクロアレイでの免疫アッセイの設計が、Ｋｕｓｎｅｚｏｗ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ５（２００６）、１６８１〜１６９６において要約される。したがって、本発明はまた、結合分子、具体的には、本発明の抗ＩＦＮ−α抗体およびＩＦＮ−α結合断片または本発明に従って特定される抗原が装荷されるマイクロアレイに関連する。
定義および実施形態
別途記載される場合を除き、本明細書中で使用されるような用語および実施形態には、国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４１９および国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４２０において提供されるような、また、使用されるような定義が与えられる。補充として、本明細書中で使用されるような一般的な用語には、Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９７年、２０００年改訂および２００３年再版、ＩＳＢＮ ０１９８５０６７３２）において提供されるような定義が与えられる。
用語「ａ」または「ａｎ」の実体は、その実体の１つ以上を指すことに留意する；例えば、「抗体」は、１つ以上の抗体を表すと理解される。したがって、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書で互換的に使用され得る。
用語「中和する」および用語「中和抗体」はそれぞれ、抗原または生きている微生物の少なくとも何らかの生物学的活性を低下させるか、または無効にする抗体が意味されるという点でこの技術分野において一般的であるように使用される。例えば、本発明のサブタイプ特異的な抗ＩＦＮ−α抗体は、十分な量で、それぞれのＩＦＮ−αサブタイプの活性を、例えば、実施例に記載されるようなアッセイにおいて無効にするか、または低下させるならば、中和抗体である。中和は５０％阻害濃度（ＩＣ５０）によって一般に定義され、中和滴定曲線下面積（ＡＵＣ）に基づいて統計学的に評価することができる。本発明の例示的な抗ＩＦＮ−α抗体のＩＣ５０値が、本明細書中において、例えば、図８〜図１０において、また、表４において記載され、また、示される。
中枢性寛容および末梢性寛容
中枢性寛容および末梢性寛容が国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４１９の６２頁〜６３頁でのそれぞれの章においてより詳しく記載される（その開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。
ペプチドおよびポリペプチド：
用語「ペプチド」は、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」（これは、本明細書では時には互換的に使用され得る）、ならびにその意味の範囲内で、任意のアミノ酸配列、例えば、本発明の重鎖および軽鎖可変領域ならびに定常領域のアミノ酸配列を含むと理解される。同様に、タンパク質およびポリペプチドの断片も意図され、本明細書では「ペプチド」と称され得る。それにもかかわらず、用語「ペプチド」は、好ましくは、少なくとも５個の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも１０個の連続するアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５個の連続するアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２０個の連続するアミノ酸、特に好ましくは少なくとも２５個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味する。加えて、本発明によるペプチドは、典型的には、１００個以下の連続するアミノ酸、好ましくは８０個未満の連続するアミノ酸、より好ましくは５０個未満の連続するアミノ酸を有する。
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」、例えば、本発明の抗体を包含することを意図し、（ペプチド結合としても公知である）アミド結合によって直線的に連結したモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２個以上のアミノ酸からなる任意の１つまたは複数の鎖を指し、特定の長さの産物を指さない。したがって、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「オリゴペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２個以上のアミノ酸からなる１つまたは複数の鎖を指すのに使用される他の任意の用語が「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかに代えてまたはこれと互換的に使用され得る。
用語「ポリペプチド」はまた、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解による切断、または天然に存在しないアミノ酸による改変を含むポリペプチドの発現後修飾産物を指すことを意図する。ポリペプチドは天然の生物学的供給源に由来するものでもよいし、または組換え技術によって生産されるものでもよいが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるものではない。それは、化学合成を含む任意の方法で作製され得る。
本発明のポリペプチドは、約３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１，０００個以上または２，０００個以上のアミノ酸のサイズであり得る。それにもかかわらず、用語「ポリペプチド」は、好ましくは、少なくとも１００個のアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味する。ポリペプチドは一定の三次元構造を有し得るが、それらは必ずしもこのような構造を有するものではない。一定の三次元構造を有するポリペプチドは折り畳まれていると称され、一定の三次元構造を持たず、むしろ多数の異なる立体構造をとり得るポリペプチドは折り畳まれていないと称される。本明細書で使用される場合、糖タンパク質という用語は、アミノ酸残基、例えば、セリン残基またはアスパラギン残基の酸素含有側鎖または窒素含有側鎖を介してタンパク質に結合する少なくとも１つの炭水化物部分に結合したタンパク質を指す。
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、変異体もしくは誘導体は、その自然環境下にないポリペプチドを意図する。特定の精製レベルは必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然または自然の環境から取り出され得る。宿主細胞で発現された組換的に生産されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって分離、分画または部分的もしくは実質的に精製された天然ポリペプチドまたは組換えポリペプチドがそうであるように、本発明の目的のために単離されたとみなされる。
「組換えペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質」は、組換えＤＮＡ技術によって生産された（すなわち、所望のペプチドを含む融合タンパク質をコードする外因性の組換えＤＮＡ発現構築物によって形質転換された細胞、微生物または哺乳動物から産生された）ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。ほとんどの細菌培養物で発現されたタンパク質またはペプチドは、典型的には、グリカンを含まないであろう。酵母で発現されたタンパク質またはポリペプチドは、哺乳動物細胞で発現されたものとは異なるグリコシル化パターンを有し得る。
本発明のポリペプチドには、上記ポリペプチドの断片、誘導体、類似体および変異体ならびにそれらの任意の組み合わせも含まれる。用語「断片」、「変異体」、「誘導体」および「類似体」は、天然ペプチドのアミノ酸配列と十分に類似のアミノ酸配列を有するペプチドおよびポリペプチドを含む。用語「十分に類似の」は、第１および第２のアミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を有するように、第１のアミノ酸配列が、第２のアミノ酸配列と同一または同等のアミノ酸残基の十分数または最小数を含有することを意味する。例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％同一の共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列が、本明細書では十分に類似のものと定義される。好ましくは、変異体は、本発明の好ましいペプチドのアミノ酸配列と、特に抗体もしくは抗体断片と、または本発明の抗体もしくはそれらのいずれかの断片、変異体、誘導体もしくは類似体よって認識されるエピトープを含む合成ペプチドもしくはペプチド系化合物と十分に類似である。このような変異体は、一般に、本発明のペプチドの機能活性を保持する（すなわち、本発明の抗体によって結合される）。変異体は、１個以上のアミノ酸の欠失、付加、および／または置換によって、アミノ酸配列がそれぞれ天然および野生型（ｗｔ）ペプチドとは異なるペプチドを含む。これらは、天然に存在する変異体および人工的に設計されたものであり得る。
用語「断片」、「変異体」、「誘導体」および「類似体」は、本発明の抗体または抗体ポリペプチドに言及する場合、対応する天然結合分子、抗体またはポリペプチドの抗原結合特性の少なくとも一部を保持する任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチド断片は、本明細書の他の箇所で議論される特定の抗体断片に加えて、タンパク質分解断片および欠失断片を含む。本発明の抗体および抗体ポリペプチドの変異体は、上記断片、およびさらにアミノ酸の置換、欠失または挿入によりアミノ酸配列を改変したポリペプチドを含む。変異体は天然に存在するものでもよいし、または天然に存在しないものでもよい。天然に存在しない変異体は、当技術分野において公知の突然変異誘発技術を使用して生産され得る。変異体ポリペプチドは、保存的または非保存的なアミノ酸置換、欠失または付加を含むことができる。本発明の結合分子、例えば、本発明の抗体および抗体ポリペプチドの誘導体は、天然ポリペプチドでは見られないさらなる特徴を示すように改変されたポリペプチドである。例としては、融合タンパク質が挙げられる。変異体ポリペプチドは、本明細書では「ポリペプチド類似体」とも称され得る。本明細書で使用される場合、結合分子もしくはその断片、抗体または抗体ポリペプチドの「誘導体」は、官能側基の反応によって化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有する主題ポリペプチドを指す。「誘導体」としては、２０種の標準的アミノ酸の１個以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドも挙げられる。例えば、プロリンを４−ヒドロキシプロリンに置換することができる；リシンを５−ヒドロキシリシンに置換することができる；ヒスチジンを３−メチルヒスチジンに置換することができる；セリンをホモセリンに置換することができる；そして、リシンをオルニチンに置換することができる。
抗イディオタイプ抗体：
用語「抗イディオタイプ抗体」は、抗体または他の結合分子に言及する場合、抗原結合部位付近におけるまたは抗原結合部位における抗体の可変領域上に位置する固有の抗原性ペプチド配列に結合して、これによって、所定の自己抗体により別の方法で引き起こされる特異的免疫反応を阻害する分子を含む。同様に、本発明の抗体によって特異的に認識されるエピトープを含む合成ペプチドまたはペプチド系化合物を使用することができる。
抗イディオタイプ抗体は、他の抗体と同様の方法で得ることができる。特定の抗イディオタイプ抗体は、凝集（比濁法アッセイまたは比濁分析アッセイ）、沈殿（放射免疫拡散）、またはサンドイッチイムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡによって、任意の種類の架橋により検出される。米国特許出願公開第２００２０１４２３５６号明細書は、高濃度高分子量の標的抗原に対して特異的な抗体に対する抗イディオタイプモノクローナル抗体集団を得るための方法であって、前記抗イディオタイプ抗体集団が、前記標的抗原に対して特異的な選択抗体に対して多種多様な結合親和性を有し、特定の用途に必要な親和性を有する前記抗イディオタイプ抗体集団のサブセットが選択され得る方法を提供する。
米国特許出願公開第２００２０１４２３５６号明細書には、抗体をコートとしておよび抗イディオタイプ抗体を検出として使用した（その逆もまた同様である）抗原の競合イムノアッセイが記載されている。抗イディオタイプ抗体を代理抗原として使用することが開示されている他の参考文献としては、Ｌｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５５（１９９５）（２３ ｓｕｐｐｌ．Ｓ）：Ｓ５９７８−Ｓ５９８２；Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９２（１９９６），７３−８５；Ｂａｒａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，９２（２００１），８８−９５；およびＫｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２（２０００），１９３−２０１が挙げられる。疾患の処置においてまたは寄生虫に対して抗イディオタイプ抗体を使用することは、当技術分野において公知である；例えば、Ｓａｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐｅｒ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５５（１９８２），１１０８−１１１９を参照のこと。
分子の類似性および／または同一性の決定：
２つのペプチド間の「類似性」は、第１のペプチドのアミノ酸配列を第２のペプチドの配列と比較することによって決定される。第１のペプチドのアミノ酸は、それが同一または保存的アミノ酸置換である場合、第２のペプチドの対応するアミノ酸と類似する。保存的置換としては、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｅｄ．，Ｔｈｅ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７８）、およびＡｒｇｏｓ，ＥＭＢＯ Ｊ．８（１９８９），７７９−７８５に記載されているものが挙げられる。例えば、以下の群の１つに属するアミノ酸は、保存的変化または置換を表す：−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；および−Ａｓｐ、Ｇｌｕ。
２つの配列間の％同一性または類似性の決定は、好ましくは、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７の数学的アルゴリズムを使用して達成される。このようなアルゴリズムは、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｅ）で利用可能なＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｐプログラム中に組み込まれている。
％同一性または類似性の決定は、ＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｐプログラムの標準的パラメータを用いて実施される。
ＢＬＡＳＴポリヌクレオチド検索は、ＢＬＡＳＴｎプログラムを用いて実施される。一般的パラメータについて、「最大標的配列」のボックスを１００に設定し得、「ショートクエリ」のボックスにチェックマークを付け得、「予測閾値」のボックスを１０に設定し得、「ワードサイズ」のボックスを２８に設定し得る。スコアリングパラメータについて、「一致／不一致スコア」を１，−２に設定し得、「ギャップコスト」のボックスを線形に設定し得る。フィルタおよびマスキングパラメータについて、「低複雑度領域」のボックスにチェックマークを付け得、「種特異的反復」のボックスにはチェックマークを付けなくてもよく、「ルックアップテーブルのみについてマスク」のボックスにチェックマークを付け得、「小文字をマスク」のボックスにはチェックマークを付けなくてもよい。
ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴｐプログラムを用いて実施される。一般的パラメータについて、「最大標的配列」のボックスを１００に設定し得、「ショートクエリ」のボックスにチェックマークを付け得、「予測閾値」のボックスを１０に設定し得、「ワードサイズ」のボックスを「３」に設定し得る。スコアリングパラメータについて、「マトリックス」のボックスを「ＢＬＯＳＵＭ６２」に設定し得、「ギャップコスト」のボックスを「存在：１１ 伸長：１」に設定し得、「組成調整」のボックスを「条件的組成スコアマトリックス調整」に設定し得る。フィルタおよびマスキングパラメータについて、「低複雑度領域」のボックスにはチェックマークを付けなくてもよく、「ルックアップテーブルのみについてマスク」のボックスにはチェックマークを付けなくてもよく、「小文字をマスク」のボックスにはチェックマークを付けなくてもよい。
ポリヌクレオチド：
用語「ポリヌクレオチド」は、単数の核酸および複数の核酸を包含することを意図し、単離された核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、通常のホスフォジエステル結合または非通常型結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含むことができる。用語「核酸」は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１つ以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドは、その天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えば、ベクターに含まれる抗体をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されたとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞で維持される組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の（部分的または実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子としては、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写産物が挙げられる。本発明にしたがって単離されたポリヌクレオチドまたは核酸としてはさらに、合成的に生産されたこのような分子が挙げられる。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモータ、リボソーム結合部位または転写ターミネータなどの調節要素でもよいし、またはこれらを含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないがコード領域の一部とみなされ得るが、例えば、プロモータ、リボソーム結合部位、転写ターミネータ、イントロンなどの任意の隣接配列はコード領域の一部ではない。本発明の２つ以上のコード領域が単一のポリヌクレオチド構築物内に、例えば、単一のベクター上に、または別々のポリヌクレオチド構築物内に、例えば、別々の（異なる）ベクター上に存在することができる。また、任意のベクターは、単一のコード領域を含有することもできるし、または２つ以上のコード領域を含むことができ、例えば、単一のベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードすることができる。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、結合分子、抗体またはそれらの断片、変異体もしくは誘導体をコードする核酸に融合しているかまたは融合していない異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域は、限定されないが、分泌シグナルペプチドまたは異種機能性ドメインなどの特別な要素またはモチーフを含む。
ある実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡである。ＤＮＡの場合では、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、１つ以上のコード領域と機能的に結合されたプロモータおよび／または他の転写もしくは翻訳制御要素を含むことができる。機能的な結合は、遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）のコード領域が、遺伝子産物の発現を調節配列の影響下または制御下に置くような方法で１つ以上の調節配列と結合している場合である。プロモータ機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、および２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が遺伝子産物の発現を指令する発現調節配列の能力を妨害しないか、または鋳型ＤＮＡの転写される能力を妨害しない場合、２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域およびそれと結合するプロモータ）は、「機能的に結合されている」かまたは「機能的に連結されている」。したがって、プロモータがポリペプチドをコードする核酸の転写をもたらすことができる場合、プロモータ領域はその核酸と機能的に結合されているであろう。プロモータは、所定の細胞でのみＤＮＡの実質的な転写を指令する細胞特異的プロモータであり得る。プロモータの他に、例えば、エンハンサ、オペレータ、リプレッサおよび転写終結シグナルなどの他の転写制御要素が、細胞特異的転写を指令するためにポリヌクレオチドと機能的に結合され得る。適切なプロモータおよび他の転写制御領域は、本明細書で開示される。
様々な転写制御領域が当業者に公知である。これらとしては、限定されないが、脊椎動物細胞で機能する転写制御領域、例えば限定されないが、サイトメガロウイルス（イントロン−Ａを含む前初期プロモータ）、シミアンウイルス４０（初期プロモータ）および（ラウス肉腫ウイルスなどの）レトロウイルス由来のプロモータおよびエンハンサセグメントが挙げられる。他の転写制御領域としては、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβグロビンなどの脊椎動物遺伝子由来のもの、ならびに真核細胞での遺伝子発現を制御することができる他の配列が挙げられる。他の適切な転写制御領域としては、組織特異的プロモータおよびエンハンサ、ならびにリンホカイン誘導性プロモータ（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモータ）が挙げられる。
同様に、様々な翻訳制御要素が当業者に公知である。これらとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始および停止コドン、ならびにピコルナウイルス由来の要素（特に、ＣＩＴＥ配列とも称される内部リボソーム侵入部位またはＩＲＥＳ）が挙げられる。
他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ：ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または任意の他のＲＮＡ産物の形態のＲＮＡである。
本発明のポリヌクレオチドコード領域および核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指令する分泌またはシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と結合することができる。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されたタンパク質は、成長中のタンパク質鎖が粗面小胞体通って輸送され始めると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダ配列を有する。当業者であれば、脊椎動物細胞によって分泌されたポリペプチドは、一般に、前記ポリペプチドのＮ末端に融合したシグナルペプチドを有し、これが完全または「全長」ポリペプチドから切断されて分泌型または「成熟」型ポリペプチドが産生されることを理解している。ある実施形態では、天然のシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖のシグナルペプチド、またはその配列の機能性誘導体であって、それと機能的に結合されたポリペプチドの分泌を指令する能力を保持している機能性誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチドまたはその機能性誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダ配列をヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダ配列で置換することができる。しかしながら、ポリペプチド、特に本発明の免疫グロブリン及びその断片の細胞内生産もまた可能である。
発現：
用語「発現」は、本明細書で使用される場合、遺伝子が生化学物質、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドを生成する過程を指す。この過程は、限定されないが、遺伝子ノックダウンならびに一過性発現および安定発現の両方を含む、細胞内における遺伝子の機能的存在の任意の顕在化を含む。それとしては、限定されないが、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または任意の他のＲＮＡ産物への転写、およびこのようなｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が挙げられる。所望の最終産物が生化学物質である場合、発現は、その生化学物質および任意の前駆体の作製を含む。遺伝子の発現は、「遺伝子産物」を生成する。本明細書で使用される場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、遺伝子の転写によって生成されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写産物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載される遺伝子産物としてはさらに、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化を受けた核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク質分解切断などを受けたポリペプチドが挙げられる。
様々な発現ベクター／宿主系を用いて、ポリヌクレオチド配列を含有および発現させることができる。これらとしては、限定されないが、組換えバクテリオファージ、プラスミドもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ：）もしくは細菌発現ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系；または動物細胞系が挙げられる。
ペプチド、ポリペプチドまたは融合タンパク質（以下、「産物」と称される）を宿主細胞中で発現させるために、以下のような手順を使用することができる。前記産物をコードするＤＮＡ配列を含有する制限断片を、宿主細胞で機能する複製起点および適切な選択可能マーカを含有する適切な組換えプラスミドにクローニングすることができる。プラスミドは、産物の誘導性発現用のプロモータ（例えば、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ ６９（１９８８），３０１ ３１５）およびｐＥＴｌ Ｉｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０），６０ ８９）を含むことができる。組換えプラスミドを、例えば、エレクトロポレーションによって宿主細胞に導入することができ、組換えプラスミドを含有する細胞を、プラスミド上のマーカについて選択することによって特定することができる。産物に対して特異的なアッセイを使用して、産物の発現を宿主細胞で誘導および検出することができる。
いくつかの実施形態では、産物／ペプチドをコードするＤＮＡを宿主細胞での発現のために最適化することができる。例えば、ＤＮＡは、１つ以上のアミノ酸に対するコドンであって、この同じアミノ酸に対する他のコドンと比べて宿主細胞において優勢なコドンを含むことができる。
あるいは、産物の発現は、無細胞抽出物中でのインビトロタンパク質合成によって実施することができ、これは、機能的研究のための改変または非天然アミノ酸の導入にも特に適している（下記も参照のこと）。過剰発現産物が宿主細胞に対して毒性である場合、産物が不溶性であるかまたは封入体を形成する場合、またはタンパク質が細胞内プロテアーゼによって急速なタンパク質分解を受ける場合、インビトロ翻訳系の使用は、インビボ遺伝子発現よりも利点を有し得る。最も頻繁に使用される無細胞翻訳系は、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽および大腸菌由来の抽出物からなる。すべてが、外因性ＲＮＡの翻訳に必要なすべての高分子成分（７０Ｓまたは８０Ｓリボソーム、ｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、開始、伸長および終結因子など）を含む粗抽出物として調製される。効率的な翻訳を確実にするためには、アミノ酸、エネルギー源（ＡＴＰ、ＧＴＰ）、エネルギー再生系（真核生物系の場合にはクレアチンリン酸およびクレアチンホスホキナーゼ、ならびに大腸菌溶解物の場合にはホスホエノールピルビン酸およびピルビン酸キナーゼ）、および当技術分野において公知の他の補因子（Ｍｇ２＋、Ｋ＋など）を各抽出物に補充しなければならない。適切な転写／翻訳系は、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、およびＡｍｂｉｏｎ、すなわち、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１（１９８３），６３５−６４４；Ａｒｄｕｅｎｇｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ Ｒａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｉｎ，Ｋｕｄｌｉｃｋｉ，Ｋａｔｚｅｎ ａｎｄ Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｄｓ．，Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｏｌ．２００７．Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｘ：Ｌａｎｄｅｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｐｐ．１−１８；Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｚｕｂａｙ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１（１９８３），６７４−９０；Ｅｚｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２２（２００６），１５７０−１５７７）。
宿主細胞：
本発明に関して、宿主細胞は、細菌、昆虫、真菌、植物、動物またはヒト細胞などの原核細胞または真核細胞であり得る。好ましい真菌細胞は、例えば、サッカロマイセス属のもの、特に、Ｓ．セレビシエ種のものである。用語「原核生物の」は、本発明の抗体または対応する免疫グロブリン鎖の発現のためのＤＮＡまたはＲＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクトされ得るすべての細菌を含むことを意味する。原核生物宿主としては、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ネズミチフス菌、セラチア・マルセッセンスおよび枯草菌などのグラム陰性ならびにグラム陽性細菌が挙げられ得る。用語「真核生物の」は、酵母、高等植物、昆虫および好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはＨＥＫ２９３、ＮＳＯ、ＣＳＯおよびＣＨＯ細胞を含むことを意味する。組換え生産手順で用いられる宿主に応じて、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる抗体または免疫グロブリン鎖は、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。本発明の抗体、または対応する免疫グロブリン鎖も、最初のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。本発明のポリヌクレオチドは、当業者に一般に公知の技術のいずれかを使用して、宿主を形質転換またはトランスフェクトするのに使用され得る。さらに、機能的に連結された融合遺伝子を調製し、それらを、例えば、哺乳動物細胞および細菌で発現させるための方法は、当技術分野において周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）。そこに記載されている遺伝子構築物および方法は、真核生物または原核生物の宿主における本発明の抗体または対応する免疫グロブリン鎖の発現に用いられ得る。一般に、挿入されたポリヌクレオチドの効率的な転写を促進するプロモータ配列を含有する発現ベクターが、宿主と併せて使用される。発現ベクターは、典型的には、複製起点、プロモータ、およびターミネータ、ならびに形質転換細胞の表現型選択を提供することができる特定の遺伝子を含む。ＤＮＡ配列に適切な細胞源ならびに免疫グロブリンの発現および分泌用の宿主細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」，Ｆｉｆｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８５）Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．（これは、参照により本明細書に組み込まれる））などの多数の供給源から得ることができる。さらに、本発明の細胞を含むトランスジェニック動物、好ましくは哺乳動物は、本発明の抗体の大規模生産に使用され得る。
発酵槽で形質転換宿主を成長させ、当技術分野において公知の技術にしたがって培養して、最適な細胞成長を達成し得る。発現されたら、本発明の全抗体、それらの二量体、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態を、硫酸アンモニウム沈降法、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィ、ゲル電気泳動などを含む当技術分野の標準手順にしたがって精製し得る；Ｓｃｏｐｅｓ，「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照のこと。次いで、本発明の抗体またはその対応する免疫グロブリン鎖を、成長培地、細胞溶解物、または細胞膜画分から単離し得る。例えば、本発明の組換え発現された抗体または免疫グロブリン鎖の単離および精製は、任意の従来の手段、例えば、本発明の抗体の定常領域に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用を含むものなどの分取クロマトグラフィ分離および免疫学的分離によるものであり得る。例えば、薬物標的化およびイメージング用途のために、本発明の抗体を他の部分にさらにカップリングし得ることは、当業者に明らかである。結合部位に対する抗体または抗原の発現後にこのようなカップリングを化学的に行ってもよいし、またはカップリング産物をＤＮＡレベルで本発明の抗体または抗原に人為操作してもよい。次いで、ＤＮＡを適切な宿主系で発現させ、必要な場合、発現タンパク質を収集および変性させる。
医薬用途の場合、少なくとも約９０〜９５％の同質性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％またはそれ以上の同質性が最も好ましい。部分的にまたは所望により同質性まで精製したら、次いで、抗体を治療的（体外的を含む）に使用してもよいし、またはアッセイ手順の開発および実施に使用してもよい。
本発明はまた、本発明の抗体またはその対応する免疫グロブリン鎖を発現することができる細胞を生産するための方法であって、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを用いて、細胞を遺伝子操作することを含む方法に関する。本発明の方法によって得ることができる細胞は、例えば、本発明の抗体とその抗原との相互作用を試験するのに使用され得る。
ＥＬＩＳＡアッセイ：
様々な抗原のための酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）としては、比色分析、化学発光および蛍光測定ベースのものが挙げられる。ＥＬＩＳＡは、薬物、ならびに血漿および尿試料中の他の抗原性成分が低量の検出に上手く適用されており、抽出工程を伴わず、実施が簡単である。タンパク質抗原に対する抗体の検出のためのＥＬＩＳＡでは、短い合成ペプチドをマイクロタイタープレートのプラスチック表面に直接結合する使用が多い。ペプチドは、一般に、それらの合成的性質および高速液体クロマトグラフィを使用した効率的な精製方法により非常に純粋である。短いペプチドの欠点は、それらが通常は、立体構造または不連続エピトープではなく直鎖状エピトープを表すことである。立体構造エピトープを提示するためには、長いペプチドまたは完全な天然タンパク質のいずれかを使用する。タンパク質抗原をプレートの疎水性ポリスチレン支持体に直接結合すると、結合したタンパク質が部分的または完全に変性し、立体構造エピトープが失われ得る。抗原の固定化（捕捉ＥＬＩＳＡ）を媒介する抗体でプレートをコーティングすることにより、この影響を回避することができる。
しかしながら、多くの場合、過剰発現された組換えタンパク質は不溶性であり、立体構造エピトープに対する抗体を分析しようとする場合には変性条件下での精製および復元を必要とする。例えば、コートタンパク質として組換え融合タンパク質を使用した一般的なＥＬＩＳＡについては、米国特許出願公開第２００３００４４８７０号明細書を参照のこと。
結合分子：
「結合分子」は、本発明との関連で使用される際には、主に抗体およびその断片に関連し、しかし、本発明の「目的とする分子」に結合する他の非抗体分子もまた指すことがあり、この場合、目的とする分子は、サイトカインとして知られている糖タンパク質のクラスのタンパク質であり、具体的には、種々のＩＦＮ−αサブタイプの群から選択されるインターフェロンである。本発明の目的とする分子は、上記および下記における本発明の特定の実施形態の記載の範囲内においてさらに詳しく定義される。本発明の結合分子には、ホルモン、受容体、リガンド、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子、シャペロン（例えば、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）など）、ならびに、細胞間接着分子（例えば、カドヘリンスーパーファミリー、インテグリンスーパーファミリー、Ｃ型レクチンスーパーファミリーおよび免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーなど）が含まれるが、これらに限定されない。したがって、明瞭性だけのために、また、本発明の範囲を限定することなく、下記の実施形態のほとんどが、治療剤および診断剤を開発するための好ましい結合分子を代表する抗体および抗体様分子に関して議論される。
抗体：
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、本明細書では互換的に使用される。抗体または免疫グロブリンは、上記および下記に定義される本発明の目的の分子に結合する分子であって、少なくとも重鎖の可変ドメインを含み、通常、少なくとも重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む分子である。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリンの構造は、比較的よく理解されている；例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）を参照のこと。用語「結合する」および「認識する」は、本発明の結合分子（例えば、抗体）の結合親和性に関して互換的に使用される。
上記および下記に定義されているように、目的の分子に特異的に結合するのに十分な構造を含む任意の抗体または免疫グロブリン断片は、本明細書では、「結合分子」、「結合断片」または「免疫特異的断片」と互換的に表される。
本発明の抗体またはその抗原結合断片、免疫特異的断片、変異体もしくは誘導体としては、限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、マウス化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬドメインまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって生産された断片、ならびに抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書で開示される抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）が挙げられる。ＳｃＦｖ分子は当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号明細書に記載されている。これに関して、抗体の抗原結合断片は、単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢ）またはｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（商標）（Ａｂｌｙｎｘ，Ｇｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）としても公知のドメイン抗体（ｄＡｂ）でもあり得る。例えば、Ｄｅ Ｈａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７（２００５），４５３１−４５４１；Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（２００３），４８４−４９０を参照のこと。以下により詳細に議論されるように、用語「免疫グロブリン」は、生化学的に区別することができる様々な広いクラスのポリペプチドを含む。当業者であれば、重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）に分類され、それらの中にいくつかのサブクラスがある（例えば、γ１〜γ４）ことを認識するであろう。この鎖の性質が抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹと決定するものである。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などはよく特徴付けられており、機能分化を付与することが公知である。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２など）またはサブクラスの免疫グロブリン分子であり得る。当業者であれば、本開示を考慮して、これらのクラスおよびアイソタイプのそれぞれの改変型を容易に識別可能であり、したがってこれらは本発明の範囲内である。すべての免疫グロブリンのクラスが明らかに本発明の範囲内にあるが、以下の議論は、一般に、ＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子を対象とする。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチド、および分子量５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖ポリペプチドを含む。典型的には、４本の鎖がジスルフィド結合によって「Ｙ」構造で結合され、ここで、「Ｙ」の入り口で始まり可変領域を通じて継続する重鎖と軽鎖がひとまとまりに繋がっている。
上記の表１に列記される本発明の例示的な抗ＩＦＮ−α抗体の分類から明白であるように、本発明の例示的抗体はＩｇＧ１クラスのものであり、このことから、調節性Ｔ細胞応答および／または上皮が場合によっては、これらのＡＩＲＥ欠乏状態におけるそれらの開始において暗示される。これらの知見が、Ｋａｒｎｅｒ他によってＣｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１２）（ｄｏｉ：１０．１１１１／ｃｅｉ．１２０２４）に記載されるＡＩＲＥ欠損マウスにおいて見出される対応する自己抗体の分類によって確認される（その開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。したがって、本発明の好ましい実施形態において、本発明の抗体はＩｇＧタイプのものであり、一層より好ましくはＩｇＧ１である。
ＩｇＧの構造：
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかと結合することができる。一般に、ハイブリドーマ、Ｂ細胞または遺伝子操作した宿主細胞のいずれかによって免疫グロブリンが産生される場合、軽鎖および重鎖は互いに共有結合し、２本の重鎖の「テール」部分は共有結合性ジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合する。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ構造のフォークヘッド末端にあるＮ末端から各鎖の下部にあるＣ末端へと延びている。
軽鎖および重鎖の両方が、構造的および機能的相同性の領域に分けられる。用語「定常」および「可変」は、機能的に使用される。これに関して、軽鎖部分および重鎖部分の両方の可変ドメイン（ＶＬおよびＶＨ）は、抗原認識および抗原特異性を決定することが認識されよう。反対に、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）は、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。慣例では、定常領域ドメインが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠ざかるにつれて、定常領域ドメインのナンバリングが増加する。Ｎ末端部分は可変領域であり、定常領域はＣ末端部分にある；ＣＨ３およびＣＬドメインは、実際には、それぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。
上記のように、可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することを可能にする。すなわち、抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメインまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが組み合わさって、三次元の抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。この四要素の抗体構造が、Ｙの各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖それぞれの３つのＣＤＲによって規定される。本発明の目的の分子に特異的に結合するのに十分な構造を含有する任意の抗体または免疫グロブリン断片は、本明細書では「結合断片」または「免疫特異的断片」と互換的に表される。
天然に存在する抗体では、抗体は、各抗原結合ドメイン中に存在する「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも称される６つの超可変領域を含み、それらは、水性環境での抗体の三次元構造を想定して、抗原結合ドメインを形成するように特別に配置されている短い非連続的なアミノ酸配列である。「ＣＤＲ」は、より少ない分子間の多様性を示す４つの比較的保存された「フレームワーク」領域または「ＦＲ」に隣接する。フレームワーク領域は主としてβシート立体構造をとり、ＣＤＲは、βシート構造と連結し、いくつかの場合では、その一部を形成するループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間非共有結合性相互作用によってＣＤＲの正しい方向での配置を提供する足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲによって形成された抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに対して相補的な表面を規定する。この相補性表面は、抗体のその同種エピトープへの非共有結合を促進する。それぞれＣＤＲおよびフレームワーク領域を含むアミノ酸は、正確に定義されているので、当業者であれば、任意の所定の重鎖または軽鎖可変領域についてそれらを容易に同定することができる；「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）；およびＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７），９０１−９１７（これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
当技術分野において使用されており、および／または認められている用語の定義が２つ以上ある場合、本明細書で使用される用語の定義は、特に明確な反対の指定がない限り、すべてのこのような意味を含むことを意図する。具体例は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる非連続的な抗原結合部位を説明する用語「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の使用である。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）およびＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７），９０１−９１７（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）によって記載されており、ここで、これらの定義は、互いに比較するとアミノ酸残基のオーバーラップまたはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体またはその変異体のＣＤＲを指すいずれかの定義の適用は、本明細書で定義および使用される用語の範囲内にあることを意図する。上記で引用した各参考文献によって定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表２に示す。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列およびサイズに応じて変化する。当業者であれば、どの残基がヒトＩｇＧサブタイプの抗体の特定の超可変領域またはＣＤＲを含むかを、その抗体の可変領域のアミノ酸配列を考慮してルーチンに決定することができる。
表２：ＣＤＲの定義１
Figure 2016531090
 １表２におけるすべてのＣＤＲ定義の番号表記は、Ｋａｂａｔ他によって示される番号表記慣例に従う（下記を参照のこと）。
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列のナンバリングシステムを定義した。当業者であれば、配列それ自体以外のいかなる実験データにも頼ることなく、任意の可変ドメイン配列にこの「Ｋａｂａｔナンバリング」システムを明確に割り当てることができる。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔナンバリング」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって示されるナンバリングシステムを指す。特に明記されない限り、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体における特定のアミノ酸残基の位置のナンバリングについての言及は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従うものであるが、それは理論上のものであり、本発明のあらゆる抗体に等しく適用することはできない。例えば、最初のＣＤＲの位置に応じて、以降のＣＤＲがいずれかの方向にシフトする場合がある。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＭまたは５価構造を有するその誘導体ではない。特に、本発明の特定の用途、特に治療用途では、ＩｇＭは、その５価構造および親和性成熟の欠如のために非特異的な交差反応性および非常に低い親和性を示すことが多いので、ＩｇＭは、ＩｇＧおよび他の２価抗体または対応する結合分子よりも有用ではない。
特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ポリクローナル抗体ではない。すなわち、それは、血漿免疫グロブリン試料から得られる混合物ではなく１つの特定の抗体種から実質的になる。
抗体断片、動物化：
単鎖抗体を含む抗体断片は、可変領域を単独で、または以下のものの全部もしくは一部と組み合わせて含むことができる：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン。本発明の目的の分子に結合する断片であって、可変領域と、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせをまた含む断片も本発明に含まれる。本発明の方法にしたがって単離されたモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体と同等の本発明の抗体またはその免疫特異的断片は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起源であり得る。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、リャマ、ウマまたはニワトリ抗体である。別の実施形態では、可変領域は、起源がコンドリクトイド（例えば、サメ由来）であり得る。
本発明の特に好ましい実施形態において、抗体は、ヒト被験体からクローン化される天然に産出するヒトモノクローナル抗体またはその結合断片、誘導体および変異体であり、ただし、これらは、上記および下記において、例えば、表１、図（具体的には図１〜図４）および実施例（例えば、実施例２および実施例６）において詳しく定義されるように本発明の特定のＩＦＮαサブタイプに特異的に結合するものである。
場合により、ヒト抗体のフレームワーク領域がデータベースにおける該当するヒト生殖系列可変領域配列に従ってアライメントされ、また、取り入れられる；例えば、ＭＲＣ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）によって提供されるＶｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を参照のこと。例えば、真の生殖系列配列から潜在的に逸脱すると見なされるアミノ酸は、クローニング過程の期間中に組み込まれるＰＣＲプライマー配列に起因し得ると思われる。人為的に作製されたヒト様抗体、例えば、ファージディスプレイされた抗体ライブラリまたは異種マウスに由来する単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）などと比較した場合、本発明のヒトモノクローナル抗体は、（ｉ）代理動物の免疫応答ではなく、むしろ、ヒトの免疫応答を使用して得られること、すなわち、抗体が、ヒト体内におけるその関連する立体配座における天然型ＩＦＮαサブタイプに対する応答で作製されていること、（ｉｉ）個体を疾患（例えば、ＳＬＥ）の症状の存在から保護しているか、または、疾患（例えば、ＳＬＥ）の症状の存在を少なくとも有意に最小限に抑えていること、そして、（ｉｉｉ）抗体がヒト起源であるので、自己抗原に対する交差反応性の危険性が最小限に抑えられることによって特徴づけられる。したがって、本発明によれば、用語「ヒトモノクローナル抗体」、用語「ヒトモノクローナル自己抗体」および用語「ヒト抗体」などは、ヒト起源のものである特定のＩＦＮ−αサブタイプ特異性のＩＦＮ−α結合分子を示すために、すなわち、ヒト細胞（例えば、Ｂ細胞またはそのハイブリドーマなど）から単離されているか、あるいは、ｃＤＮＡがヒト細胞（例えば、ヒトメモリーＢ細胞）のｍＲＮＡから直接にクローン化されている特定のＩＦＮ−αサブタイプ特異性のＩＦＮ−α結合分子を示すために使用される。ヒト抗体は、アミノ酸置換がたとえ、例えば、その結合特徴を改善するために、当該抗体において行われるにしても、依然として「ヒト」であると見なされる。
下記の、および例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号明細書に記載されているように、ヒト免疫グロブリンライブラリ由来の抗体、または内在性免疫グロブリンを発現しない１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックな動物由来の抗体は、それらを本発明の真のヒト抗体から区別するためにヒト様抗体と表される。
例えば、典型的にはファージディスプレイから単離された合成および半合成抗体などのヒト様抗体の重鎖および軽鎖の対合は、それらが元のヒトＢ細胞で生じたような元の対合を必ずしも反映しない。したがって、従来技術で一般的に使用されている組換え発現ライブラリから得られたＦａｂおよびｓｃＦｖ断片は、免疫原性および安定性に対するすべての可能な関連効果に関して人工的であるとみなされ得る。
対照的に、本発明は、ヒトにおけるその治療有用性を特徴とする、選択されたヒト被験体から単離された親和性成熟抗体を提供する。
移植抗体（等価物）
本発明はまた、それぞれ抗ＩＦＮ−α抗体などの本発明の抗体由来のＣＤＲを含む移植抗体（互換的に、等価物と称される）を提供する。このような移植ＣＤＲとしては、本発明の抗体のＣＤＲが移植されたか、または１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＤＲが移植される動物化抗体が挙げられる。ＣＤＲは、上記のように、ヒトフレームワークまたは動物起源由来の抗体フレームワークに直接移植され得る。所望により、フレームワークライブラリを作製することによって、フレームワーク変化も組み込まれ得る。以下により詳細に記載されるように、ＣＤＲおよび／またはフレームワーク配列の最適化を独立しておよび連続的に組み合わせて実施することもできるし、または同時に実施することもできる。
移植抗体を作製するために、本発明の抗体のドナーＣＤＲを、抗体アクセプタ可変領域フレームワークに移植する。活性を最適化するために抗体を移植してＣＤＲ変異体作製するための方法は、以前に記載されている（例えば、国際公開第９８／３３９１９号；国際公開第００／７８８１５号；国際公開第０１／２７１６０号を参照のこと）。この手順を実施して、ドナーＣＤＲの移植および親和性の再獲得を同時プロセスで達成し得る。可変領域の結合親和性を改変または最適化するために、この方法を単独でまたはＣＤＲ移植と組み合わせて同様に使用することができる。ドナーＣＤＲの結合親和性をアクセプタ可変領域に付与するための方法は、重鎖および軽鎖可変領域の両方に適用可能であり、それ自体を使用して抗体可変領域を移植し、それと同時に抗体可変領域の結合親和性を最適化することができる。
ドナーＣＤＲ内の全位置または選択位置に複数の異なるアミノ酸残基変化を含むように、ドナーＣＤＲを改変することができる。ＣＤＲ種の様々な集団を生産するために、例えば、２０種の天然に存在するアミノ酸残基または予め選択されたサブセットのランダムな組み込みまたは偏った組み込みをドナーＣＤＲに導入することができる。ＣＤＲ変異体種を可変領域の様々な集団に含めることにより、所定の抗原に対して最適化された結合親和性を示す変異体種の作製が可能になる。一定範囲の可能な変化をドナーＣＤＲの位置で行うことができる。変化のために選択され得る可能な変化の一部または全部を、移植ドナーＣＤＲの集団に導入することができる。変化を導入するためにＣＤＲ内の単一位置を選択することもできるし、またはアミノ酸を改変した様々な位置が組み合わせて活性についてスクリーニングすることもできる。
１つのアプローチは、例えば、全２０種の天然に存在するアミノ酸を各位置で置換することによって、ＣＤＲに沿ってすべてのアミノ酸位置を変化させることである。ＣＤＲの大部分が基準のドナーＣＤＲ配列を維持し、したがってドナーＣＤＲの結合親和性を維持するように、他のドナーＣＤＲアミノ酸位置との関連で各位置の置換を行うことができる。例えば、アクセプタ可変領域フレームワーク（天然または改変フレームワークのいずれか）に、ＣＤＲ内の各位置に単一位置の置換を含むＣＤＲの集団を移植することができる。同様に、全２０種のアミノ酸残基またはアミノ酸のサブセットを組み込むように変化させた２個以上の位置を含むＣＤＲの集団による移植のために、アクセプタ可変領域フレームワークを標的とすることができる。移植するべきＣＤＲ内またはＣＤＲ群内の１つ以上のアミノ酸位置を改変し、アクセプタ可変領域フレームワークに移植して移植抗体の集団を作製することができる。１つ以上の改変位置を有するＣＤＲは、所望により、１つ以上の改変位置を有する１つ以上の他のＣＤＲと組み合わせることができると理解される。
１つ以上の改変位置を有するＣＤＲ変異体種の集団を、可変領域の結合ポケットを構成するＣＤＲのいずれかまたはすべてと組み合わせることができる。したがって、重鎖または軽鎖における１つ、２つまたは全３つのレシピエントＣＤＲ位置にドナーＣＤＲ変異体集団を同時に組み込むために、アクセプタ可変領域フレームワークを標的とすることができる。アミノ酸位置変化で標的とするためのＣＤＲまたはＣＤＲの数の選択は、例えば、アクセプタへの完全なＣＤＲ移植が望ましいか、または結合親和性の最適化のためにこの方法が実施されるかに依存するであろう。
ドナーＣＤＲの結合親和性を抗体アクセプタ可変領域フレームワークに付与するために変化のためのドナーＣＤＲアミノ酸を選択するための別のアプローチは、公知のまたは容易に同定可能なＣＤＲ位置であって非常に変わりやすいものを選択することである。例えば、可変領域ＣＤＲ３は、一般に、非常に変わりやすい。したがって、結合親和性の再獲得もしくは増強を単独でまたは関連アクセプタ可変フレームワーク変化と一緒に確実にする移植手順では、この領域をアミノ酸位置変化の選択的な標的とすることができる。
マウス化抗体：
上記のように、移植によって作製される抗体の例は、マウス化抗体である。本明細書で使用される場合、用語「マウス化抗体」または「マウス化免疫グロブリン」は、本発明のヒト抗体由来の１つ以上のＣＤＲ、およびマウス抗体配列に基づくアミノ酸置換および／または欠失および／または挿入を含有するヒトフレームワーク領域を含む抗体を指す。ＣＤＲを提供するヒト免疫グロブリンは「親」または「アクセプタ」と称され、フレームワーク変化をもたらすマウス抗体は「ドナー」と称される。定常領域は存在する必要がないが、存在する場合、それらは、通常、マウス抗体の定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、好ましくは約９５％またはそれ以上同一である。したがって、いくつかの実施形態では、全長マウス化ヒト重鎖免疫グロブリンまたは軽鎖免疫グロブリンは、マウス定常領域、ヒトＣＤＲ、および多数の「マウス化」アミノ酸置換を有する実質的にヒトのフレームワークを含有する。典型的には、「マウス化抗体」は、マウス化可変軽鎖および／またはマウス化可変重鎖を含む抗体である。例えば、キメラ抗体の可変領域全体は非マウスであるため、マウス化抗体は典型的なキメラ抗体を包含しないであろう。「マウス化」の工程によって「マウス化」された改変抗体は、ＣＤＲを提供する親抗体と同じ抗原に結合し、マウスでは親抗体と比較して免疫原性が通常低い。
抗体断片：
本明細書で使用される場合、用語「重鎖部分」は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖部分を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中部および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたはその変異体もしくは断片の少なくとも１つを含む。例えば、本発明に使用される結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部およびＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含むことができる。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明に使用される結合ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠くことができる。上記のように、当業者であれば、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）のアミノ酸配列が天然に存在する免疫グロブリン分子と異なるように、これらのドメインを改変することができると理解するであろう。
本明細書で開示される特定の抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体では、多量体の１つのポリペプチド鎖の重鎖部分は、多量体の第２のポリペプチド鎖上の重鎖部分と同一である。あるいは、本発明の重鎖部分含有単量体は同一ではない。例えば、各単量体は、異なる標的結合部位を含むことができ、例えば、二重特異性抗体または二特異性抗体を形成する。
別の実施形態では、本明細書で開示される抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、ｓｃＦｖなどの単一ポリペプチド鎖から構成され、潜在的なインビボ治療用途および診断用途のために細胞内に発現され得る（細胞内抗体）。
本明細書で開示される診断方法および治療方法に使用される結合ポリペプチドの重鎖部分は、様々な免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメイン、およびＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含むことができる。別の例では、重鎖部分は、ＩｇＧ１分子に部分的に由来するヒンジ領域、およびＩｇＧ３分子に部分的に由来するヒンジ領域を含むことができる。別の例では、重鎖部分は、ＩｇＧ１分子に部分的に由来するキメラヒンジ、およびＩｇＧ４分子に部分的に由来するキメラヒンジを含むことができる。
したがって、実施例にも例示されているように、一実施形態では、本発明の抗体の定常領域またはその一部、特にＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン、しかし場合によりＣＨ１ドメインは、本発明の方法にしたがって単離されたネイティブなヒトモノクローナル抗体の可変領域に対して異種性である。本文脈では、異種定常領域は、本発明の抗体の治療用途の場合には、好ましくはヒト起源のものであるが、動物研究の場合には、例えば齧歯類起源のものであり得る（実施例も参照のこと）。
本明細書で使用される場合、用語「軽鎖部分」は、免疫グロブリン軽鎖由来のアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖部分は、ＶＬまたはＣＬドメインの少なくとも１つを含む。
先に示したように、様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元構造が周知である。本明細書で使用される場合、用語「ＶＨドメイン」は免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、用語「ＣＨ１ドメイン」は免疫グロブリン重鎖の第１の（最もアミノ末端の）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインはＶＨドメインに隣接し、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端側にある。
本明細書で使用される場合、用語「ＣＨ２ドメイン」は、例えば、従来のナンバリングスキームを使用すれば抗体の約残基２４４〜残基３６０（Ｋａｂａｔナンバリングシステムでは残基２４４〜３６０；およびＥＵナンバリングシステムでは残基２３１〜３４０、Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．前掲書を参照のこと）に及ぶ重鎖分子の部分を含む。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対合していないという点が固有である。どちらかといえば、２つのＮ−結合分岐状炭水化物鎖が、インタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に挿入される。ＣＨ３ドメインはＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ末端に及び、約１０８個の残基を含むこともまた詳細に記載されている。
本明細書で使用される場合、用語「ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに結合する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は約２５個の残基を含み、柔軟であり、したがって２つのＮ末端抗原結合領域が独立して動くことを可能にする。ヒンジ領域を３つの異なるドメイン：上部、中部および下部ヒンジドメインに細分化することができる；Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（１９９８），４０８３を参照のこと。
本明細書で使用される場合、用語「ジスルフィド結合」は、２個の硫黄原子間に形成される共有結合を含む。アミノ酸システインは、ジスルフィド結合を形成することができるか、または第２のチオール基と架橋することができるチオール基を含む。天然に存在するＩｇＧ分子の大部分では、ＣＨ１およびＣＬ領域はジスルフィド結合によって連結され、２本の重鎖は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用すれば２３９位および２４２位に対応する位置で（ＥＵナンバリングシステムでは、２２６位または２２９位）２つのジスルフィド結合によって連結される。
本明細書中で使用される場合、用語「連結される」、「融合される」または「融合」は交換可能に使用される。これらの用語は、化学的コンジュゲート化または組換え手段を含むどのような手段によってでも、２つ以上の要素または成分を一緒につなぐことを示す。「読み枠を合わせた融合」は、２つ以上のポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、これらの元々のＯＲＦの正しい翻訳読み枠を維持する様式で、連続したより長いＯＲＦを形成するためにつなぐことを示す。したがって、組換え融合タンパク質は、元々のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメントを含有する単一タンパク質である（そのようなセグメントは通常、自然界ではそのようにつながれない）。したがって、読み枠が、融合されたセグメントの全体にわたって連続にされるにもかかわらず、これらのセグメントは、例えば、読み枠を合わせたリンカー配列によって物理的または空間的に隔てられる場合がある。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドが、読み枠を合わせて融合される場合があり、しかし、「融合された」ＣＤＲが、連続したポリペプチドの一部として共翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域またはさらなるＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドによって隔てられる場合がある。したがって、１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、可変領域と、定常ドメインの少なくとも一部とをコードするｃＤＮＡである。１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書中で定義されるような本発明の抗体の可変領域および定常ドメインをコードするｃＤＮＡである。
エピトープ：
抗体のためのペプチドまたはポリペプチドのエピトープの最小サイズは約４〜５個のアミノ酸であると考えられる。ペプチドまたはポリペプチドのエピトープは好ましくは、少なくとも７個のアミノ酸を含有し、より好ましくは少なくとも９個のアミノ酸を含有し、最も好ましくは少なくとも約１５〜約３０個の間のアミノ酸を含有する。ＣＤＲは抗原性のペプチドまたはポリペプチドをその三次形態で認識することができるので、エピトープを構成するアミノ酸は連続している必要はなく、いくつかの場合には、同じペプチド鎖に存在していないことさえある。本発明において、本発明の抗体によって認識されるペプチドまたはポリペプチドのエピトープは、抗体が２つ以上のサブタイプを認識する場合には、本発明の目的とする分子、すなわち、少なくとも１つのＩＦＮＡサブタイプ、またはそれ以外のＩＦＮＡサブタイプの相同的配列の少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、より好ましくは少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、約１５〜約３０個の間または約３０〜約５０個の間の連続したアミノ酸または不連続なアミノ酸からなる配列を含有する。本発明の例示的抗体の１９Ｄ１１および２６Ｂ９についてのＩＦＮＡ２のエピトープのマッピング、ならびに、例示的抗体２６Ｂ９についてのＩＦＮＷのエピトープのマッピングについては、図２７を参照のこと。
結合特性：
本明細書で互換的に使用される「結合する」または「認識する」は、一般に、結合分子、例えば、抗体がその抗原結合ドメインを介して所定のエピトープに結合すること、およびその結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間のある程度の相補性を必要とすることを意味する。この定義によれば、抗体がランダムな無関係のエピトープに結合するよりも容易に、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合する場合、その抗体はそのエピトープに「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、本明細書では、ある特定の抗体がある特定のエピトープに結合する相対的親和性を特定するのに使用される。例えば、抗体「Ａ」が抗体「Ｂ」よりも所定のエピトープに対して高い特異性を有するとみなしてもよいし、または抗体「Ａ」が、関連エピトープ「Ｄ」に対して有するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言うこともできる。無関係のエピトープは、通常、所定の結合分子の結合特異性の評価に使用され得る非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼインまたは任意の他の特定のポリペプチド）の一部である。これに関して、用語「特異的結合」は、抗体が、非特異的抗原に対する結合のそのＫＤよりも少なくとも２倍低いＫＤで、所定の抗原に結合することを指す。本明細書で使用される場合、用語「高特異的」結合は、特定の標的エピトープに対する抗体の相対ＫＤが、他のリガンドに対するその抗体の結合のＫＤよりも少なくとも１０倍低いことを意味する。
存在する場合、抗体の抗原との「免疫学的結合特性」または他の結合特性という用語は、そのすべての文法の形式で、抗体の特異性、親和性、交差反応性および他の結合特性を指す。
「優先的に結合する」によって、結合分子、例えば、抗体が、関連したエピトープ、類似したエピトープ、相同的なエピトープまたは相似的なエピトープに結合するであろうよりも容易に、ある１つのエピトープに特異的に結合することが意味される。したがって、所与のエピトープに「優先的に結合する」抗体は、そのような抗体が関連のエピトープと交差反応することがあるとしても、そのエピトープに結合する可能性が、関連したエピトープに結合することができる場合よりも大きいであろう。特定の抗原、例えば、具体的なＩＦＮＡサブタイプなどに関しては、用語「優先的に結合する」は、結合分子が、例えば、抗体が、関連したＩＦＮＡサブタイプ、類似したＩＦＮＡサブタイプ、相同的なＩＦＮＡサブタイプまたは相似的なＩＦＮＡサブタイプに結合するであろうよりも容易に、ある１つのＩＦＮＡサブタイプに特異的に結合することを意味する。
非限定的な例として、結合分子、例えば、抗体が、その抗体の第２のエピトープに対する解離定数（ＫＤ）よりも低いＫＤで第１のエピトープに結合する場合、それは第１のエピトープに選択的に結合するとみなされ得る。別の非限定的な例では、抗体が、その抗体の第２のエピトープに対するＫＤよりも少なくとも１桁低い親和性で第１のエピトープに結合する場合、抗体は前記第１の抗原に選択的に結合するとみなされ得る。別の非限定的な例では、抗体が、その抗体の第２のエピトープに対するＫＤよりも少なくとも２桁低い親和性で第１のエピトープに結合する場合、抗体は前記第１のエピトープに選択的に結合するとみなされ得る。
別の非限定的な例では、結合分子、例えば、抗体が、その抗体の第２のエピトープに対する解離速度（ｋ（ｏｆｆ））よりも低いｋ（ｏｆｆ）で第１のエピトープに結合する場合、それは第１のエピトープに選択的に結合するとみなされ得る。別の非限定的な例では、抗体が、その抗体の第２のエピトープに対するｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも１桁低い親和性で第１のエピトープに結合する場合、抗体は第１のエピトープに選択的に結合するとみなされ得る。別の非限定的な例では、抗体が、その抗体の第２のエピトープに対するｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも２桁低い親和性で第１のエピトープに結合する場合、抗体は第１のエピトープに選択的に結合するとみなされ得る。
本明細書で開示される結合分子、例えば、抗体または抗原結合断片、変異体または誘導体は、５×１０−２秒−１、１０−２秒−１、５×ｌ０−３秒−１またはｌ０−３秒−１以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で、本発明の目的の分子またはその断片もしくは変異体と結合すると言うことができる。より好ましくは、本発明の抗体は、５×１０−４秒−１、１０−４秒−１、５×１０−５秒−１、または１０−５秒−１５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１または１０−７秒−１以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で、本発明の目的の分子またはその断片もしくは変異体と結合すると言うことができる。
本明細書で開示される結合分子、例えば、抗体または抗原結合断片、変異体または誘導体は、１０３Ｍ−１秒−１、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０４Ｍ−１秒−１または５×１０４Ｍ−１秒−１以上の結合速度（ｋ（ｏｎ））で、本発明の目的の分子またはその断片もしくは変異体と結合すると言うことができる。より好ましくは、本発明の抗体は、１０５Ｍ−１秒−１、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１、または５×１０６Ｍ−１秒−１または１０７Ｍ−１秒−１以上の結合速度（ｋ（ｏｎ））で、本発明の目的の分子またはその断片もしくは変異体と結合すると言うことができる。
結合分子、例えば、抗体が、所定のエピトープに対する基準抗体の結合をいくらか遮断する程度にそのエピトープに選択的に結合する場合、所定のエピトープに対する基準抗体の結合を競合的に阻害すると言われる。当技術分野において公知の任意の方法、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイによって競合的阻害を判定することができる。抗体は、所定のエピトープに対する基準抗体の結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％競合的に阻害すると言うことができる。
本明細書で使用される場合、用語「親和性」は、結合分子、例えば、個々のエピトープと、免疫グロブリン分子のＣＤＲとの結合強度の程度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．（１９８８）の第２７頁〜第２８頁を参照のこと。本明細書で使用される場合、用語「結合活性」は、免疫グロブリンの集団と抗原との間の複合体の総合的な安定性、すなわち、免疫グロブリン混合物と抗原との機能的結合強度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗの第２９頁〜第３４頁を参照のこと。結合活性は、集団中の個々の免疫グロブリン分子と特異的エピトープとの親和性、およびさらに免疫グロブリンおよび抗原の結合価の両方に関連する。例えば、２価のモノクローナル抗体と、ポリマーなどの高頻度反復エピトープ構造を有する抗原との間の相互作用は、高い結合活性の１つであろう。任意の適切な方法を使用して抗原に対する抗体の親和性または結合活性を実験的に決定することができる。例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）、Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）、および本明細書に記載される方法を参照のこと。抗原に対する抗体の親和性を測定するための一般的な技術としては、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよび表面プラズモン共鳴が挙げられる。異なる条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ）で測定する場合、特定の抗体抗原間相互作用の測定された親和性は変化し得る。したがって、標準化した抗体抗原溶液および標準化した緩衝液を用いて、親和性および他の抗原結合パラメータ、例えば、ＫＤ、ＩＣ５０を測定することが好ましい。
本発明の結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体はまた、それらの交差反応性に関して記載または明示され得る。本明細書で使用される場合、用語「交差反応性」は、第１の抗原に対して特異的な抗体の第２の抗原と反応する能力；２つの異なる抗原性物質間の関連性の程度を指す。したがって、抗体が、その抗体の形成を誘導したエピトープと異なるエピトープに結合する場合、その抗体は交差反応性である。交差反応性エピトープは、一般に、抗体を誘導したエピトープと同じ相補的な構造的特徴の多くを含み、いくつかの場合では、実際には元のエピトープよりも適合する可能性がある。
例えば、ある特定の抗体が、関連するが同一ではないエピトープ、例えば、基準エピトープに対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、および少なくとも５０％の（当技術分野において公知の、および本明細書に記載される方法を使用して計算されるような）同一性を有するエピトープに結合するという点で、それらはある程度の交差反応性を有する。抗体が基準エピトープに対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、および５０％未満の（当技術分野において公知の、および本明細書に記載される方法を使用して計算されるような）同一性を有するエピトープに結合しない場合、それは交差反応性をほとんど、または全く持たないと言うことができる。抗体があるエピトープの他の任意の類似体、オーソログまたは相同体に結合しない場合、それはそのエピトープに対して「非常に特異的である」とみなすことができる。
本発明の結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体はまた、本発明の目的の分子に対する結合親和性に関して記載または明示され得る。好ましい結合親和性には５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ未満の解離定数またはＫＤを有するものが含まれる。典型的には、抗体は、１０−７Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で、その所定の抗原に結合する。好ましくは、抗体は、１０−９Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で、さらにより好ましくは１０−１１Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で、その同種抗原に結合する。
抗体の改変：
免疫グロブリンまたはそれをコードするｃＤＮＡをさらに改変することができる。したがって、さらなる実施形態では、本発明の方法は、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、二重特異性抗体、融合抗体、標識抗体またはこれらのいずれか１つの類似体を生産する工程のいずれか１つを含む。対応する方法が当業者に公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８８に記載されている。ファージディスプレイ技術によって前記抗体の誘導体を得る場合、本発明に提供される抗体のいずれか１つのものと同じエピトープに結合するファージ抗体の効率性を上昇させるために、ＢＩＡｃｏｒｅシステムにおいて用いられるように、表面プラズモン共鳴を使用することができる（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ７（１９９６），９７−１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３（１９９５），７−１３）。例えば、国際公開第８９／０９６２２号には、キメラ抗体の生産が記載されている。欧州特許出願公開第０２３９４００号明細書および国際公開第９０／０７８６１号には、ヒト化抗体の生産方法が記載されている。本発明にしたがって用いられる抗体のさらなる供給源は、いわゆるゼノジニック抗体である。例えば、国際公開第９１／１０７４１号、国際公開第９４／０２６０２号、国際公開第９６／３４０９６号および国際公開第９６／３３７３５号には、マウスにおけるヒト抗体などのゼノジニック抗体の生産についての一般的原理が記載されている。上記のように、本発明の抗体は、完全抗体の他に、例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２を含む様々な形態で、ならびに単鎖形態で存在し得る。例えば、国際公開第８８／０９３４４号を参照のこと。
当技術分野において公知の従来の技術を使用して、例えば、アミノ酸の欠失、挿入、置換、付加、および／または組換えおよび／または当技術分野において公知の任意の他の改変を単独でまたは組み合わせて使用することによって、本発明の抗体またはそれらの対応する免疫グロブリン鎖をさらに改変することができる。免疫グロブリン鎖アミノ酸配列の基礎となるＤＮＡ配列にこのような改変を導入する方法は当業者に周知である；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）を参照のこと。本発明の抗体の改変としては、アセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド化、および炭水化物もしくは脂質部分、補因子などの結合を含む、側鎖改変、骨格改変、ならびにＮ末端およびＣ末端改変を含む、１つ以上の構成アミノ酸における化学的および／または酵素的誘導体化が挙げられる。同様に、本発明は、標識または薬物などの異種性分子がアミノ末端に融合された記載される抗体またはそのいくつかの断片を含むキメラタンパク質の生産を包含する。このようにして作製された抗原結合分子は、それぞれ罹患細胞および組織の適切な表面構造を発現する細胞への薬物局在化に使用することができる。この標的化および細胞への結合は、治療的または診断的に活性な薬剤の送達および遺伝子治療／遺伝子送達に有用であり得る。本発明の抗体を有する分子／粒子は、目的の特定の抗原を発現する細胞／組織に特異的に結合するので、診断用途および治療用途を有し得る。
試料：
本明細書で使用される場合、用語「試料」又は「生物学的試料」は、被験体または患者から得られる任意の生物学的物質を指す。一態様では、試料は、血液、脳脊髄液（「ＣＳＦ」）または尿を含み得る。他の態様では、試料は、全血、血漿、末梢血から濃縮された単核細胞（ＰＢＭＣ）、例えば、リンパ球（すなわち、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはＢ細胞）、単球、マクロファージ、樹状細胞および好塩基球；および培養細胞（例えば、被験体由来のＢ細胞）を含み得る。試料はまた、腫瘍組織を含む生検または組織試料を含み得る。さらに他の態様では、試料は、全細胞および／または細胞溶解物を含み得る。一実施形態では、試料は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。当技術分野において公知の方法によって試料を採取することができる。
抗ＩＦＮ−α抗体の特定、対応するＢ細胞の単離および抗ＩＦＮ−α抗体の組換え発現：
表１に列記されるような、また、いくつかのＩＦＮ−αサブタイプについて例示的に示されるような本発明の抗ＩＦＮ−α抗体について特異的であるＢ細胞の特定、および、目的とする特異性を示す抗体の分子クローニング、ならびに、それらの組換え発現および機能的特徴づけを概して、国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４１９および同ＷＯ２０１３／０９８４２０に記載されるように行うことができる；それらにおける実施例のセクションを参照のこと、具体的には、国際公開ＷＯ２０１３／０９８４１９の１１８頁〜１２０頁における実施例１および実施例２、ならびに、国際公開ＷＯ２０１３／０９８４２０の２７頁〜３１頁における実施例１〜実施例４を参照のこと（それらの開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。
簡単に記載すると、本発明の１つの実施形態において、単一のＢ細胞またはオリゴクローナルなＢ細胞の培養物が、実施例に記載されるように培養され、また、前記Ｂ細胞によって産生される抗体を含有する培養物の上清が、実施例に記載されるように、ＩＦＮ−αサブタイプの１つまたは複数について特異的である抗体の存在および親和性についてスクリーニングされた。別の実施形態において、患者血清が、様々なＩＦＮ−αサブタイプに対する自己抗体の存在について最初にスクリーニングされ、その後、大きい力価を有する自己抗体が末梢血単核細胞の単離のために選択された：国際公開ＷＯ２０１３／０９８４１９の１１８頁〜１２０頁における実施例２を参照のこと（その開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。スクリーニングプロセスは、ＩＦＮ−αサブタイプの断片、ペプチドまたは誘導体に関して結合についてスクリーニングすることを含む。続いて、結合が検出される抗体、または、前記抗体を産生する細胞が単離された；国際公開ＷＯ２０１３／０９８４１９の１２０頁における実施例３を参照のこと（その開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。したがって、予備的スクリーニングを、抗体分泌細胞を含有するサンプル（例えば、全末梢血または血清など）を使用して候補ドナーのパネルに対して行うことができる。具体的には、単核細胞を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するための標準的な分離技術（例えば、勾配遠心分離など）を使用して血液またはリンパ組織から単離することができる。この分離工程の後および／または前において、（異なる患者から、異なる組織から、および／または異なる時点で得られる）血清（または血漿）、細胞培養物上清または細胞のサンプルを、抗体および抗体分泌細胞の存在を検出するための標準的な技術（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ、ＳＥＲＰＡ、抗原アレイ、細胞培養系におけるウイルス感染の中和、または、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）を使用して予備スクリーニングすることができる。文献はこれらの技術のいくつかの例を提供しており、例えば、ワクチン接種されたドナーにおける免疫応答を特徴づけるためのＥＬＩＳＰＯＴの使用（Ｃｒｏｔｔｙ他、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．２８６（２００４）、１１１〜１２２）、新たに感染した患者のための診断ツールとしての抗原マイクロアレイの使用（Ｍｅｚｚａｓｏｍａ他、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．４８（２００２）、１２１〜１３０）、および、抗原特異的な免疫応答を測定するための他の技術（Ｋｅｒｎ他、Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（２００５）、４７７〜４８４）を示す。
候補の抗ＩＦＮ−α抗体、および、候補の抗ＩＦＮ−α抗体を分泌するＢ細胞がそれぞれ特定された後で、目的とする抗体をコードする核酸配列が得られ、この場合には、Ｂ細胞を調製する工程、および、目的する抗体をコードする核酸をＢ細胞から得る／配列決定する工程、および、さらには、その核酸を、目的とする抗体を発現することができる発現宿主に挿入するか、または、その核酸を使用して、目的とする抗体を発現することができる発現宿主を調製する工程、発現宿主を、目的とする抗体が発現させられる条件のもとで培養または継代培養する工程、および、必要な場合には、目的とする抗体を精製する工程が含まれる。核酸は、制限部位を導入するために、コドン使用頻度を変更するために、ならびに／あるいは、転写調節配列および／もしくは翻訳調節配列を加えるために、または最適化するためにその間で操作されることがあることは言うまでもないことである。これらの技術は最先端であり、過度な負担を伴うことなく当業者によって行うことができる。例えば、重鎖定常領域を異なるイソタイプの重鎖定常領域に交換することができ、または、完全に除くことができる。可変領域を、単鎖のＦｖ領域をコードするために連結することができる。多数のＦｖ領域を、２つ以上の標的に対する結合能を与えるために連結することができ、または、重鎖および軽鎖のキメラな組合せを用いることができる。遺伝物質が入手可能となると、所望の標的と結合するそれらの能力をともに保持する上記で記載されるようなアナログの設計は直截的である。抗体可変領域のクローニングおよび組換え抗体の作製のための様々な方法が当業者には知られており、例えば、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ他、Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４７（１９９６）、１〜２０；Ｄｏｅｎｅｃｋｅ他、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１１（１９９７）、１７８７〜１７９２に記載される。しかしながら、本発明の好ましい実施形態において、Ｂ細胞が、国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４２０に記載される方法によって、具体的には、その２８頁〜３０頁における実施例３に記載される方法によって発現させられる（その開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。
疾患および障害：
特に指定がない限り、用語「障害」および「疾患」は、本明細書では互換的に使用される。本明細書で使用される場合、用語「自己免疫性障害」は、個体自身の組織または器官またはその同時分離体または徴候またはそれらから生じる症状から生じるかまたそれらに対する疾患または障害である。自己免疫性疾患は適応免疫反応の脱調節によって主に引き起こされ、自己構造に対する自己抗体または自己反応性Ｔ細胞が形成される。ほぼすべての自己免疫性疾患は、炎症性成分を有する。自己炎症性疾患は主に炎症性であり、いくつかの古典的な自己炎症性疾患は、先天性炎症経路の遺伝的欠陥によって引き起こされる。自己炎症性疾患では、自己反応性Ｔ細胞または自己抗体は見られない。これらの自己免疫性および自己炎症性障害の多くにおいて、限定されないが、高ガンマグロブリン血症、高レベルの自己抗体、組織中の抗原抗体複合体沈着、副腎皮質ステロイドまたは免疫抑制性処置から恩恵を受けるもの、および罹患組織中のリンパ系細胞凝集塊を含む多くの臨床用および研究用のマーカが存在し得る。Ｂ細胞媒介性自己免疫性障害に関する理論に限定されないが、Ｂ細胞は、自己抗体産生、免疫複合体形成、樹状およびＴ細胞活性化、サイトカイン合成、ケモカインの直接放出、および異所性新リンパ形成に対しての病巣の提供を含む、多くの機構的な経路によりヒト自己免疫性疾患において病原性効果を示すことが考えられる。これらの経路のそれぞれが、自己免疫性疾患の病状に異なった度合いで寄与し得る。
本明細書中で使用される場合、「自己免疫性障害」は、器官特異的疾患であること（すなわち、免疫応答が、器官系に対して、例えば、内分泌系、造血系、皮膚、心肺系、胃腸系および肝臓系、腎臓系、甲状腺、耳、神経筋系、中枢神経系などに対して特異的に向けられる）、または、多数の器官系を冒し得る全身性疾患（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、多発性筋炎、自己免疫性多腺性内分泌不全症症候群１型（ＡＰＳ１）／自己免疫性多腺性内分泌不全症・カンジダ症・外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）など）であることが可能である。好ましいそのような疾患には、自己免疫性のリウマチ学的障害（例えば、関節リウマチ、シェーグレン症候群、強皮症、狼瘡（例えば、ＳＬＥおよびループス腎炎など）、多発性筋炎／皮膚筋炎および乾癬性関節炎など）、自己免疫性の皮膚科学的障害（例えば、乾癬、天疱瘡群疾患、水疱性類天疱瘡疾患および皮膚エリテマトーデスなど）、および、自己免疫性の内分泌障害（例えば、糖尿病関連の自己免疫疾患（例えば、１型糖尿病またはインスリン依存性糖尿病（Ｔ１ＤＭまたはＩＤＤＭ）など）、自己免疫性の甲状腺疾患（例えば、グレーブス病および甲状腺炎）など）、および、自己免疫の生成に影響を及ぼす疾患（例えば、自己免疫性多腺性内分泌不全症症候群１型（ＡＰＳ１）／自己免疫性多腺性内分泌不全症・カンジダ症・外胚葉ジストロフィー（ＡＰＥＣＥＤ）、重症筋無力症（ＭＧ／胸腺腫）など）が含まれる。
好ましい疾患には、例えば、ＳＬＥ、ＲＡ、Ｔ１ＤＭ、ＭＳ、シェーグレン症候群、グレーブス病、甲状腺炎、ならびに、糸球体腎炎ならびにＡＰＳ１が含まれる。一層より好ましいものが、ＲＡ、ＳＬＥおよびＭＳであり、最も好ましいものがＳＬＥである。
標識および診断：
標識剤は、本発明の抗体または抗原に直接的または間接的のいずれかでカップリングされ得る。間接的カップリングの一例は、スペーサ部分の使用によるものである。さらに、本発明の抗体は、共有結合または非共有結合によって連結されているさらなるドメインを含み得る。この連結は、当技術分野において公知の上記方法による遺伝的融合に基づくものでもよいし、または例えば国際公開第９４／０４６８６号に記載されている化学的架橋によって実施することもできる。本発明の抗体を含む融合タンパク質中に存在するさらなるドメインは、好ましくは、可撓性リンカー、有利にはポリペプチドリンカーによって連結され得、前記ポリペプチドリンカーは、前記さらなるドメインのＣ末端と本発明の抗体のＮ末端との間（またはその逆も同様である）の距離に及ぶのに十分な長さの、複数の親水性ペプチド結合アミノ酸を含む。治療的または診断的に活性な薬剤が、様々な方法によって、本発明の抗体またはその抗原結合断片にカップリングされ得る。これとしては、例えば、共有的な方法、例えばペプチド結合によって、治療的または診断的に活性な薬剤にカップリングされた、本発明の抗体の可変領域を含む単鎖融合タンパク質が挙げられる。さらなる例としては、さらなる分子に共有結合または非共有結合によってカップリングされた抗原結合断片を少なくとも含む分子が挙げられ、以下の非限定的な例示的リスト中のものが挙げられる。Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｐ．ＳｕＤＰ ７（１９９２），５１−５２には、ＣＤ３に対するＦｖ領域が、可溶性ＣＤ４または他のリガンド、例えばＯＶＣＡおよびＩＬ−７にカップリングされている、二重特異性試薬ヤヌシンが記載されている。同様に、本発明の抗体の可変領域をＦｖ分子に構築して、引用文献に示されている代替的リガンドにカップリングすることができる。Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅ １６６（１９９２），１９８−２０２には、ＧＰ１２０のＶ３領域中の特定の配列に対する抗体に架橋されたＯＫＴ３からなるヘテロコンジュゲート抗体が記載されている。このようなヘテロコンジュゲート抗体はまた、本発明の方法の抗体中に含まれる少なくとも可変領域を使用して構築され得る。特異的抗体のさらなる例としては、Ｆａｎｇｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｓ．６８（１９９３），１８１−１９４およびＦａｎｇｅｒ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（１９９２），１０１−１２４に記載されている抗体が挙げられる。従来の抗体を含む免疫毒素であるコンジュゲートは、当技術分野において広く記載されている。従来のカップリング技術によって毒素を抗体にカップリングしてもよいし、またはタンパク質毒素部分を含む免疫毒素を融合タンパク質として生産してもよい。本発明の抗体は、このような免疫毒素を得るための対応する方法で使用され得る。このような免疫毒素の例示は、Ｂｙｅｒｓ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（１９９１），５９−７０およびＦａｎｇｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １２（１９９１），５１−５４によって記載されているものである。
上記融合タンパク質は、プロテアーゼにより切断可能なリンカーまたは切断部位をさらに含み得る。これらのスペーサ部分は順に不溶性でもよいしまたは可溶性でもよく（Ｄｉｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１（１９８６），１４８）、標的部位における抗原からの薬物放出を可能にするように選択され得る。免疫療法のための本発明の抗体および抗原にカップリングされ得る治療剤の例は、ケモカイン、ホーミング分子、薬物、放射性同位体、レクチンおよび毒素である。本発明の抗体および抗原にコンジュゲートされ得る薬物は、コンジュゲート分子を使用しようとする疾患状況に依存する。例えば、腫瘍疾患の処置に有用な標的に対して特異的な抗体を、古典的には抗腫瘍薬物と称される化合物、例えば、マイトマイシンＣ、ダウノルビシンおよびビンブラスチンにコンジュゲートすることができる。例えば、腫瘍免疫療法のために、放射性同位体とコンジュゲートした本発明の抗体または抗原を使用する際には、特定の同位体が、白血球分布ならびに安定性および放射などの因子に応じて、他の同位体よりも好ましい場合がある。自己免疫反応に応じて、いくつかの放射体が、他の放射体よりも好ましい場合がある。一般に、α粒子およびβ粒子を放射する放射性同位体が、免疫療法では好ましい。ショートレンジの高エネルギー放射体、例えば２１２Ｂｉが好ましい。治療目的では、本発明の抗体または抗原に結合され得る放射性同位体の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１２Ａｔ、２１１Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄおよび１８８Ｒｅである。本発明の抗体または抗原にカップリングされ得る他の治療剤、ならびにエクスビボおよびインビボの治療プロトコールは公知であるか、または当業者であれば容易に確認することができる。標識するのに適切な放射性核種の非限定的な例は、１９８Ａｕ、２１２Ｂｉ、１１Ｃ、１４Ｃ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、１８Ｆ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、３Ｈ、１９７Ｈｇ、１６６Ｈｏ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２７Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１５Ｏ、１３Ｎ、３２Ｐ、３３Ｐ、２０３Ｐｂ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、３５Ｓ、１５３Ｓｍおよび９９ｍＴｃである。標識するのに適切な他の分子は、蛍光色素または発光色素、磁気粒子、金属、および二次的な酵素または結合工程によって検出可能な分子、例えば、酵素またはペプチドタグである。本発明で標識として使用するのに適切な市販の蛍光プローブは、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（この開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に列挙されている。磁気粒子ベースのアッセイ（ＭＰＡ）に使用するのに適切な磁気粒子は、常磁性物質、反磁性物質、強磁性物質、強磁性物質および超常磁性物質から選択され得る。
診断目的に有用な分子および細胞生化学の一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９６）などの標準的な教科書に見られ得る。診断目的用の試薬、検出手段およびキットは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈなどの商業ベンダー、ならびに本明細書で引用されている参考文献、特に特許文献のいずれか１つに示されている供給源から市販されている。
処置および薬物：
本明細書で使用される場合、用語「処置する」または「処置」は、自己免疫性疾患および／または自己炎症性疾患の発症などの望ましくない生理的変化または障害を防止するか、または遅延（減少）させることを目的とする治療的処置および予防的または防止的手段の両方を指す。有益なまたは所望の臨床結果としては、限定されないが、検出可能であるかまたは検出不可能であるかにかかわらず、症候の軽減、疾患の程度の縮小、安定化した（すなわち、悪化していない）疾患状態、疾患進行の遅延または緩慢化、疾患状態の寛解または緩和、および（部分的であるかまたは完全であるかにかかわらず）寛解が挙げられる。「処置」はまた、処置を受けない場合に予想される生存期間と比較して生存期間を延長させることを意味し得る。処置を必要とする者としては、症状または障害を既に有する者、ならびに症状または障害を有する傾向がある者、または症状または障害の徴候を防止するべき者が挙げられる。
特に指定がなければ、用語「薬物」、「医薬」または「医薬品」は、本明細書では互換的に使用され、限定されないが、（Ａ）内用または外用の物品、医薬および調製物、ならびにヒトまたは他の動物のいずれかの疾患の診断、治癒、緩和、処置または予防に使用することを目的とする任意の物質または物質の混合物；ならびに（Ｂ）ヒトまたは他の動物の体の構造または任意の機能に影響を与えることを目的とする物品、医薬および調製物（食品を除く）；ならびに（Ｃ）項目（Ａ）および（Ｂ）で指定された任意の物品の成分として使用することを目的とする製品を含むものである。用語「薬物」、「医薬」または「医薬品」は、１つ以上の「薬剤」、「化合物」、「物質」または「（化学）組成物」、ならびにいくつかの他の文脈ではさらに充填剤、崩壊剤、潤滑剤、流動促進剤、結合剤のような他の薬学的に不活性な賦形剤、またはヒトもしくは他の動物の体内の目的の標的部位（例えば、皮膚、胃または腸内）における「薬物」、「医薬」もしくは「医薬品」の容易な運搬、崩壊、分解、溶解および生物学的アベイラビリティを確保するものを含有する、ヒトまたは他の動物のいずれかで使用することを目的とする調製物の製剤一式を含むものである。用語「薬剤」、「化合物」または「物質」は、本明細書では互換的に使用され、より具体的な文脈では、限定されないが、すべての薬理学的に活性な薬剤（すなわち、所望の生物学的または薬理学的効果を誘導するか、または本発明の方法によってこのような可能な薬理学的効果を誘導する能力について調査または試験される薬剤）を含むものである。
「抗リウマチ薬」および免疫抑制薬の例としては、クロロキン、ヒドロキシクロロキノン、ミオクリシン、オーラノフィン、スルファサラジン、メトトレキセート、レフルノミド、エタネルセプト、インフリキシマブ（プラス経口および皮下用メトトレキセート）、アダリムマブなど、アザチオプリン、Ｄ−ペニシラミン、ゴールド塩類（経口）、ゴールド塩類（筋肉内）、ミノサイクリン、シクロスポリンＡおよび局所性シクロスポリンを含むシクロスポリン、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、シクロホスファミド、ブドウ球菌プロテインＡ（Ｇｏｏｄｙｅａｒ ａｎｄ Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９７（２００３），１２５−３９）が挙げられ、これらの塩および誘導体などを含む。
「非ステロイド系抗炎症薬」または「ＮＳＡＩＤ」の例としては、アスピリン、アセチルサリチル酸、イブプロフェンおよびイブプロフェン遅延剤、フェノプロフェン、ピロキシカム、フルルビプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、ナプロキセン、テノキシカム、ベノリレート、ジクロフェナク、ナプロキセン、ナブメトン、インドメタシン、ケトプロフェン、メフェナム酸、ジクロフェナク、フェンブフェン、アザプロパゾン、アセメタシン、チアプロフェン酸、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、フェニルブタゾン、ジクロフェナクおよびジクロフェナク遅延剤、ＧＲ２５３０３５などのシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−２インヒビター、ＭＫ９６６、セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）；４−（５−（４−メチルフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾロ−１−イル）ベンゼンスルホンアミドおよびバルデコキシブ（ＢＥＸＴＲＡ（登録商標））、およびメロキシカム（ＭＯＢＩＣ（登録商標））が挙げられ、これらの塩および誘導体などを含む。好ましくは、これらは、アスピリン、ナプロキセン、イブプロフェン、インドメタシンまたはトルメチンである。このようなＮＳＡＩＤは、場合により、鎮痛剤、例えば、コデイン、トラマドール、および／またはジヒドロコデインまたは麻酔剤、例えば、モルヒネと共に使用される。
「被験体」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後予測、予防または治療に望ましい任意の被験体、特に哺乳動物被験体、例えば、ヒト患者を意味する。
医薬担体：
薬学的に許容し得る担体および投与経路は、当業者に公知の対応文献から採用することができる。当技術分野において周知の方法にしたがって本発明の医薬組成物を製剤化することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）ｂｙ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＩＳＢＮ ０−６８３−３０６４７２，Ｖａｃｃｉｎｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ，２００３；Ｂａｎｇａ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ．２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ．（２００６），ＩＳＢＮ：０−８４９３−１６３０−８を参照のこと。適切な医薬担体の例は当技術分野において周知であり、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。周知の従来の方法によってこのような担体を含む組成物を製剤化することができる。適切な用量で被験体にこれらの医薬組成物を投与することができる。様々な方法で、適切な組成物の投与をもたらすことができる。例としては、薬学的に許容し得る担体を含有する組成物を、経口、鼻腔内、直腸、局所、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮下、経皮、くも膜下および頭蓋内の方法により投与することが挙げられる。点鼻薬製剤などのエアロゾル製剤は、保存剤および等張剤を有する、活性薬剤の精製した水溶液または他の溶液を含む。このような製剤は、好ましくは、鼻粘膜に適合するｐＨおよび等張状態に調節される。経口投与用医薬組成物、例えば、単一ドメイン抗体分子（例えば、「ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）」なども本発明で想定される。このような経口製剤は、錠剤、カプセル剤、粉末、液体または半固体形態であり得る。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントなどの固体担体を含むことができる。直腸投与用または経膣投与用の製剤は、適切な担体を有する坐剤として提供され得る；Ｏ’Ｈａｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２（９）（２００３），７２７−７３５も参照のこと。様々な種類の投与に適切な製剤に関するさらなる指針は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１７ｔｈ ｅｄ．（１９８５）および対応する最新版に見ることができる。薬物送達方法の簡単な総説については、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９（１９９０），１５２７−１５３３を参照のこと。
投与計画：
投与計画は、担当の医師および臨床的要因によって決定される。医学分野で周知であるように、任意のある患者への投与量は、その患者のサイズ、体表面、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および経路、一般的健康状態、同時に投与されている他の薬物を含む多数の要因に依存する。典型的な用量は、例えば、０．００１〜１０００μｇの範囲内であり得る（すなわち、この範囲内の、発現のためのまたは発現阻害のための核酸）；しかしながら、この例示的な範囲よりも少ないかまたは多い用量が、特に前述の要因を考慮して想定される。一般に、医薬組成物の定期投与としての計画は、１μｇ〜１０ｍｇ単位／日の範囲内とするべきである。計画が持続注入である場合も、それぞれ１μｇ〜１０ｍｇ単位／キログラム体重／分の範囲内とするべきである。定時的評価によって経過をモニタリングすることができる。非経口投与用の製剤は、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびエチルオレエートなどの注射可能な有機エステルである。水性担体としては、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール溶液／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられる。非経口投与用のビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖液、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル液、または固定化油が挙げられる。静脈内投与用のビヒクルとしては、体液および栄養補充液、（リンゲルブドウ糖液に基づくものなどの）電解質補充液などが挙げられる。例えば、抗微生物薬、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどの保存剤および他の添加物も存在し得る。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の目的用途に応じて、抗腫瘍剤および細胞毒性薬物などの薬剤をさらに含むことができる。
加えて、他の薬剤の同時投与または連続投与が望ましい場合がある。治療有効用量または治療有効量は、症候または症状を改善するのに十分な有効成分の量を指す。細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）によって、このような化合物の治療有効性および毒性を決定することができる。治療効果と毒性効果との間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０の比と表すことができる。
好ましくは、組成物中の治療薬は、炎症の予防または免疫反応の抑制に十分な量で存在する。
これらおよび他の実施形態は、本発明の記載および実施例によって開示および包含される。本発明にしたがって用いられる材料、方法、使用法および化合物のうちのいずれか１つに関するさらなる文献は公開ライブラリおよびデータベースから、例えば、電子機器を使用して検索され得る。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎおよび／またはＮａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈが主催する公開データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」を活用することができる。Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＥＭＢＬ）の一部であるＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）のデータベースとアドレスなどのさらなるデータベースとウェッブアドレスが当業者に公知であり、インターネットの検索エンジンを用いてそれらを得ることもできる。遡及的な検索および現状の認識に有用な生物工学の特許情報の概要、および関連する特許情報の供給源の調査は、Ｂｅｒｋｓ，ＴＩＢＴＥＣＨ １２（１９９４），３５２−３６４において与えられる。
上記開示は、一般に、本発明を説明する。いくつかの文書が本明細書の本文を通して引用される。本明細書の末尾、特許請求の範囲の直前に、完全な書誌引用を見出すことができる。引用されているすべての参考文献（本出願を通して引用されている参考文献、発行特許、公開特許出願、および製造業者の仕様書、説明書などを含む）の内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる；しかしながら、引用されているいかなる文書も実に本発明に対する従来技術であると認めるものではない。以下の具体的な実施例を参照することにより、さらに完全な理解を得ることができるが、これらは例証のみを目的として本明細書に提供するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
以下の実施例１〜９および対応する図１〜３２は本発明をさらに例証するが、本発明の範囲を何ら限定するものと解釈するべきではない。本明細書で用いられるものなどの従来の方法についての詳細な説明は、引用されている文献に見出すことができる；「Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎｔｈ Ｅｄ．ｅｄ．ｂｙ Ｂｅｅｒｓ ａｎｄ Ｂｅｒｋｏｗ（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，２００３）も参照のこと。
本発明の実施は、特に指示がない限り、当技術分野の技術の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を用いる。分子遺伝学および遺伝子工学の方法は、一般に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇａｉｔ ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ ａｎｄ Ａｌａｎ，Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．）；およびＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｗｕ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）．Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ（Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）の最新版に記載されている。この開示で言及されている遺伝子操作のための試薬、クローニングベクターおよびキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよびＣｌｏｎｔｅｃｈなどの商業ベンダーから入手可能である。細胞培養および培地回収の一般的な技術は、Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８（１９９７），１４８）；Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉａ（Ｋｉｔａｎｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７（１９９１），７３）；Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（１９９１），３７５）；およびＳｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｂｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９（１９９０），２５１に概説されている。
材料および方法
患者選択、ＡＰＥＣＥＤ／ＡＰＳ１患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）単離、メモリーＢ細胞培養および抗体単離を、国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４１９および同ＷＯ２０１３／０９８４２０に記載されるように、ただし、単離および分析された抗体の特異性が、述べられたＰＣＴ出願において具体的に使用されたＩＬ−１７およびＩＬ−２２の代わりに本明細書中上記および下記で定義されるようなＩＦＮＡサブタイプに対してのものであったという違いを伴って行った；それらにおける実施例のセクションを参照のこと、具体的には、国際公開ＷＯ２０１３／０９８４１９の１１７頁〜１２０頁における実施例１および実施例２ならびに１６８頁〜１７１頁における実施例１７、そして、国際公開ＷＯ２０１３／０９８４２０の２７頁〜３１頁における実施例１〜実施例４を参照のこと（それらの開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。
本発明のヒト抗体の分子クローニングならびにその後の抗体産生および抗体精製を国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４１９に記載されるように行った；その出願明細書の実施例のセクションを参照のこと、具体的には、その１１７頁〜１２０頁における実施例１〜実施例３を参照のこと（それらの開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。ＡＩＲＥ遺伝子の変異分析を国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４１９に記載されるように行った；その実施例のセクションを参照のこと、具体的には、１１５頁〜１１６頁における実施例の材料および方法における「ＡＩＲＥ遺伝子の変異分析」のセクションを参照のこと（その開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。ただし、特定の工程を国際公開ＷＯ９９／１５５５９に記載されるように行った。この関連において、ＡＩＲＥ（ＡＰＥＣＥＤ）遺伝子におけるそれぞれの変異の遺伝子型解析が、国際出願公開ＷＯ９９／１５５５９において１２頁〜１３頁での実施例２に記載されるように行われる；ＡＩＲＥ遺伝子のエクソン２およびエクソン６における変異の確認が、１３頁５行から１４頁１３行にまで及ぶ国際出願公開ＷＯ９９／１５５５９の実施例３に記載されるように行われる（それらの開示内容はその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。具体的には、変異分析のために、ＤＮＡサンプルが、ＡＰＥＣＥＤの患者、および、ＡＰＥＣＥＤの疑われる保因者、および、正常な健常者コントロールから得られる末梢血単核細胞から（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．（ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ）に従って）精製され、すべての特定されたエクソンについて特異的なプライマーを使用するＰＣＲに供される。
実施例１：患者の血清におけるサイトカイン特異的抗体の検出
ＡＰＥＣＥＤ（自己免疫性多腺性内分泌不全症・カンジダ症・表皮異形成、これはまた、自己免疫性多腺性内分泌不全症１型（ＡＰＳ１）とも呼ばれる）の遺伝子状態に罹患する患者の血清における様々なサイトカイン特異的抗体および疾患特異的抗体の大まかな存在が、本出願人の国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４１９の１２８頁における実施例７に記載されような、また、１２８頁〜１３０頁における表１および表２に示されるようなプロトアレイ分析によって求められている（それらの開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。合計で２３名の患者から得られる血清（これらはＡＰＳ１−１からＡＰＳ１−２３までの符号によって示される）をアッセイにおいて使用した。８個のコントロール血清を、患者と年齢が一致する健康な研究室職員から得て、Ｃ１〜Ｃ８としてコード化した。試験された２３名の患者におけるＩＦＮＡサブタイプ特異的抗体およびｄｓＤＮＡ特異的抗体の存在を示す図４を参照のこと。図４に示される血清反応性に加えて、ＡＰＳ１−９およびＡＰＳ１−２の患者は、ＩＦＮＡ１／１３、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６およびＩＦＮＡ２１に対する血清反応性を示している。
抗ｄｓＤＮＡ抗体はＳＬＥについて非常に特異的であり、この疾患の診断において使用される。驚くべきことに、ＡＰＳ１患者は誰も、抗ｄｓＤＮＡ抗体の頻繁な存在にもかかわらず、狼瘡を有しない。しかしながら、ＡＰＳ１患者は、狼瘡が関わる多くの分子機構に関与する臨床的に関連した薬物標的であるいくつかのインターフェロン−αサブタイプに対する顕著な血清反応性を示し、このことから、これらの抗体はＳＬＥ処置において好適であり得ることが暗示される。
ＥＬＩＳＡ−ＩＦＮ−α
９６ウエルマイクロプレート（Ｃｏｓｔｅｒ、米国）を、ヒトＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ）、ＩＦＮＡ４（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ２１（すべてがＰＢＬから得られる）およびＩＦＮＡ１４（ＡＴＧｅｎ）またはＩＦＮＡ８（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）により被覆した。プレートをＰＢＳ−Ｔにより洗浄し、２％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）を含有するＰＢＳにより室温で１時間、ブロッキング処理した。患者血清、Ｂ細胞馴化培地または組換え抗体調製物を室温で２時間インキュベーションした。目的とする抗原に対するヒトＩｇＧの結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲート化されたヤギ抗ヒトＦｃガンマ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ、英国）を使用して測定し、その後、ＨＲＰ活性の測定を、ＴＭＢ基質溶液（ＴＭＢ、Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）を使用して行った。ヒトＦｃ融合のマウスＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ１４（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）に対する結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲート化された抗Ｆ（ａｂ’）２特異的抗体を用いて検出した（図１９Ａを参照のこと）。
実施例２：本発明の抗体のＥＣ５０のＥＬＩＳＡ決定
ＩＦＮＡ２（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ）、ＩＦＮＡ４（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＩＦＮＡ１４（ＡＴＧｅｎ）に対する本発明の様々なｈＭＡＢのＥＣ５０結合をＥＬＩＳＡによって求めた（使用された組換えタンパク質に関する詳細については下記の表３もまた参照のこと）。ＭＡＢの連続希釈物（１０００ｎｇ／ｍｌから０．０１６９ｎｇ／ｍｌまで）を抗原被覆プレート（ＰＢＳにおける１μｇ／ｍｌでの一晩の被覆、続いて、洗浄、および、ＰＢＳにおける２％ＢＳＡによるブロッキング処理）と２時間インキュベーションした。続いてプレートを洗浄し、ＭＡＢの結合を、抗ヒトＨＲＰコンジュゲート化二次抗体を用いて検出した。それぞれの抗原に対する最大結合の半分をもたらすＭＡＢの濃度（ＥＣ５０、ｎｇ／ｍｌ）を、濃度の対数をＯＤの４５０ｎｍでの測定値に対してプロットすることによって得られるＳ字形の用量応答曲線（可変スロープ、４パラメータ）に対して、Ｐｒｉｓｍ ４ ＧｒａｐｈＰａｄソフトウエアを使用して計算した；図３および下記の表４を参照のこと。
Figure 2016531090
 表３：Ｅｌｉｓａアッセイで使用された組換えタンパク質のリスト
Figure 2016531090
 表４：ＩＳＲＥ二重ルシフェラーゼレポーターアッセイで得られるような、本発明の例示的な抗ＩＦＮ−α抗体の１９Ｄ１１、２６Ｂ９、８Ｈ１、１２Ｈ５および５０Ｅ１１のＩＣ５０中和値のまとめ。
表３に示されるような商用供給者から得られるＩＦＮＡタンパク質、ならびに、本発明に従って作製されるＩＦＮＡタンパク質のｇＩＦＮＡ２／−４および−１４を使用する、例示的な抗ＩＦＮ−α抗体の本発明に従って行われたＥＣ５０結合対ＩＣ５０中和の前回のアッセイは、類似する結果を与えた。
加えて、ＩＦＮＡ１（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ）に対する本発明の例示的ＭＡＢの１９Ｄ１１、２５Ｃ３、２６Ｂ９、５Ｄ１および１３Ｂ１１の結合を、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮＡ２（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ）に対するこれらの抗体の結合と比較した。この実験では、試験されたＭＡＢ（３００ｎｇ／ｍｌ）を抗原被覆プレート（ＰＢＳにおける１μｇ／ｍｌでの一晩の被覆、続いて、洗浄、および、ＰＢＳにおける２％ＢＳＡによるブロッキング処理）と２時間インキュベーションした。続いてプレートを洗浄し、ＭＡＢの結合を、抗ヒトＨＲＰコンジュゲート化二次抗体を用いて検出した。例示的ＭＡＢの１９Ｄ１１、２５Ｃ３、２６Ｂ９および１３Ｂ１１は、ＩＦＮＡ１およびＩＦＮＡ２に対する同程度の結合親和性を示した（図１１Ａを参照のこと）。しかしながら、例示的な抗ＩＦＮ−αＭＡＢの５Ｄ１はＩＦＮＡ２と結合し、ＩＦＮＡ１とは交差反応しない（図１１Ａを参照のこと）。さらなる実験において、ＩＦＮＡ８に対する本発明の例示的ＭＡＢの１９Ｄ１１、２５Ｃ３、２６Ｂ９、５Ｄ１および１３Ｂ１１の結合を、ＬＩＰＳによって、ＩＦＮＡ１４に対するこれらの抗体の結合と比較した（ともにＩＦＮ−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質）。この場合、例示的ＭＡＢの１３Ｂ１１はＩＦＮＡ８との交差反応性を示さなかった。それ以外の例示的抗体（１９Ｄ１１、２５Ｃ３、２６Ｂ９および５Ｄ１）は、ＩＦＮＡ１４の結合よりも強いＩＦＮＡ８の結合を示している（図１１Ｂを参照のこと）。さらなる実験において、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ２１（すべがてＰＢＬから得られる）およびＩＦＮＡ１４（ＡＴＧｅｎ）に対する本発明の例示的ＭＡＢの５Ｄ１、１３Ｂ１１、１９Ｄ１１、２５Ｃ３、２６Ｂ９および３１Ｂ４の結合を求め、比較した。例示的な抗ＩＦＮ−α抗体１３Ｂ１はＩＦＮＡ８およびＩＦＮＡ２１と交差反応せず、抗体１９Ｄ１１は、ＩＦＮＡ２１と、それ以外のＩＦＮＡサブタイプとの場合よりも低い親和性で交差反応した（図１１Ｃを参照のこと）。
実施例３：中和アッセイ
中和アッセイが、研究されたサイトカインに応答する細胞株に対して、すなわち、必要な受容体を保有する細胞株に対して行われる。受容体に対するリガンド結合は、対応するシグナル伝達経路、核への転写因子の移行を活性化し、応答因子遺伝子の転写、翻訳、および、適用可能であるならば、生成物分泌をアップレギュレーションする。使用されるサイトカイン濃度が、アッセイの感度を最大にするために用量応答曲線の直線部分の開始部から選択される。抗体の中和能を試験するために、標的サイトカインの最適な濃度を、血清、上清または精製抗体のサンプルの連続希釈物とプレインキュベーションする。結果が、陽性コントロールと陰性コントロールとの間において中間の値を示す抗体の力価または濃度として表される。
ホスホ−ＳＴＡＴ１アッセイ
３０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ ＭＳＲ細胞を、ポリ−Ｌ−リシン被覆された９６ウエルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、米国）に、または、通常の組織培養処理された９６ウエルプレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．３５９８、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、米国）にそれぞれ播種した。翌日、様々なｒｈＩＦＮＡ、または、ＩＦＮ−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質（ｇ１ ＩＦＮ）を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清を、抗ＩＦＮＡ ｍＡｂまたはコントロールＩｇＧ（５μｇ／ｍｌ）と混合し、３７℃で１時間プレインキュベーションした。プレインキュベーション後、混合物を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ ＭＳＲ細胞を３７℃で１０分間刺激した。刺激後、細胞を、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｃ２９７８、同Ｐ５７２６、同Ｐ００４４、同Ｐ８３４０、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）が補充されるＣｅｌＬｙｔｉｃ（商標）Ｍ溶解緩衝液を用いて溶解し、回収された溶解物を卓上型遠心分離機において１３，０００ＲＰＭで、４℃で清澄化した。溶解物を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロースメンブランにブロットした。メンブランを、０．２５％ウシゼラチン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する緩衝液により室温で１時間、ブロッキング処理し、その後、リン酸化ＳＴＡＴ１に対するウサギモノクローナル抗体（Ｔｙｒ７０１、ブロッキング緩衝液で１：１０００希釈、Ｃａｔ．Ｎｏ．９１６７、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、米国）と４℃で一晩インキュベーションした。翌日、ブロットをブロッキング緩衝液により３回洗浄し、その後、ウサギＩｇＧに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（ブロッキング緩衝液で１：２０，０００希釈、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１１−０３５−１４４、Ｊａｃｋｓｏｎｌ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、米国）とインキュベーションした。３回のさらなる洗浄工程の後、ＥＣＬ基質を加え（Ｃａｔ．Ｎｏ．３４０８７、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、米国）、反応性バンドをオートラジオグラフィーにより可視化した。結合した抗体を、Ｒｅｓｔｏｒｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ緩衝液（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１０５９、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）におけるインキュベーションによって除き、ウサギポリクナール抗ＳＴＡＴ１血清を使用して、総ＳＴＡＴ１レベルを可視化した（ブロッキング緩衝液で１：１０００希釈、Ｃａｔ．Ｎｏ．９１７２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
下記では、例示的な抗ＩＦＮ−α特異的抗体の５Ｄ１、１９Ｄ１１、２５Ｃ３、２６Ｂ９、３１Ｂ４および１３Ｂ１１を用いて行われた２回のホスホ−ＳＴＡＴ１アッセイの結果が議論される。図５Ｂおよび図５Ｃにおいて認められ得るように、例示的な抗ＩＦＮ−α特異的抗体の１９Ｄ１１、２５Ｃ３、２６Ｂ９、３１Ｂ４および１３Ｂ１１の添加は、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４およびＩＦＮＡ１４に依存するＳＴＡＴ１のリン酸化を妨げており、このことは本発明のこれらの抗体のＩＦＮ−α中和能を示している。加えて、例示的な抗ＩＦＮ−α特異的抗体の１９Ｄ１１、２６Ｂ９および３１Ｂ４はまた、ＩＦＮＡ１、ｇ１ ＩＦＮＡ５およびＩＦＮＡ６に依存するＳＴＡＴ１のリン酸化を妨げており、抗体２６Ｂ９の中和能がＩＦＮＡ５に対してわずかに低下している。抗体２５Ｃ３はＩＦＮＡ６活性およびＩＦＮＡ１４活性に関しては、ＩＦＮＡ２およびＩＦＮＡ４に対するその中和能との比較においてわずかにより弱い中和能を示した。本発明の例示的な抗ＩＦＮ−α特異的抗体５Ｄ１の添加は、ＩＦＮＡ２およびＩＦＮＡ４に対するこの抗体の中和活性を示し、ＩＦＮＡ１４依存的なＳＴＡＴ１リン酸化に関しては中和を認めることができず、または、非常に弱い中和を認めることができ（図５Ｃ、右側パネル）、ＩＦＮＡ６のわずかにより弱い中和を認めることができた。
ＩＦＮＡ１ｂまたはＩＦＮＡ１６による刺激の後、例示的抗体の１９Ｄ１１、２５Ｃ３、２６Ｂ９、３１Ｂ４および１３Ｂ１１は、ＩＦＮＡ１ｂ（ＩＦＮＡ１／１３）活性に対する中和能を示しており、中和を抗体５Ｄ１に関しては認めることができなかった（図５Ｂ）。ＩＦＮＡ１６に関して、１９Ｄ１１、５Ｄ１および１３Ｂ１１の抗体だけが中和能を示しており、例示的抗体の２５Ｃ３、２６Ｂ９および３１Ｂ４は、ＩＦＮＡ１６に対する少なくとも大幅に低下した中和能を示し、または、ＩＦＮＡ１６に対する中和能の喪失さえも示した（図５Ｃ）。例示的抗体１３Ｂ１１は、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４およびｇ１ ＩＦＮＡ５を強力に中和し、これに対して、非常に弱い中和をＩＦＮＡ６依存的なＳＴＡＴ１リン酸化に関して認めることができた。使用時のｒｈＩＦＮ濃度は、１０ｎｇ／ｍｌ（ＩＦＮＡ１ｂ）、２ｎｇ／ｍｌ（ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ１６）であった。ｇ１ ＩＦＮＡ５の上清をそのＥＣ８０希釈で使用した。
１３Ｂ１１を除くすべての例示的抗体がこの機能的アッセイにおいてＩＦＮＡ２１を中和した（図５Ｄ）が、例示的抗体の２５Ｃ３および１３Ｂ１１はＩＦＮＡ６を中和しなかった（図５Ｂ）。ＭＡＢの濃度が５μｇ／ｍｌにおいてであり、ｒｈＩＦＮＡ（ＰＢＬ）は２ｎｇ／ｍｌにおいてであった。
すべての抗体がＩＦＮＡ５（ｇ１ＩＦＮＡ５）を中和した（図５Ｂ）。抗体２５Ｃ３および抗体１３Ｂ１１はＩＦＮＡ８（ｇ１ＩＦＮＡ８）を中和しなかった。本発明抗体の例示的な抗ＩＦＮ−α抗体のどれもがＩＦＮ−γ（ＩＦＮ−ガンマ／ＩＦＮＧ）を中和しなかった（図５Ｄ）。上記の一般的な実験説明における場合とは別に、ここでは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を図５Ｄに示されるように、非処置（−）のままにしたか、あるいは、抗体の非存在下、または、５μｇ／ｍｌのヒト由来の例示的なヒトＭＡＢもしくはヒトコントロールＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ）の存在下、ヒトＩＦＮ−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清により刺激した（＋）。
２回目の実験では、さらなるＩＦＮＡサブタイプが試験されている。これら２回の実験の結果が図５において一緒にされている。ＩＦＮＡ７、ｇ１ ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４またはＩＦＮＡ１６による刺激の後、例示的抗体１９Ｄ１１は、すべての試験されたＩＦＮに対する中和能を示しており、例示的抗体の２６Ｂ９および３１Ｂ４はＩＦＮＡ１６を中和することができなかった（図５Ｃ）。例示的抗体２５Ｃ３はＩＦＮＡ７を完全に中和し、しかし、ｇ１ ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４およびＩＦＮＡ１６のより弱い中和を示した。例示的抗体５Ｄ１は、ＩＦＮＡ７、ｇ１ ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０およびＩＦＮＡ１６を中和し、しかし、ＩＦＮＡ１４の中和は全く認められなかった。例示的抗体１３Ｂ１１は、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４およびＩＦＮＡ１６の中和を示し、しかし、ｇ１ ＩＦＮＡ８の中和は全く認められなかった。使用時のｒｈＩＦＮ濃度は、２ｎｇ／ｍｌ（ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６）であった。ｇ１ ＩＦＮＡ８の上清をそのＥＣ８０希釈で使用した。
すべての例示的抗体がこの機能的アッセイにおいてＩＦＮＡ１７を中和した（図５Ｄ）。１３Ｂ１１を除くすべての例示的抗体がＩＦＮＡ２１を中和した。２つの例示的抗体（２６Ｂ９および３１Ｂ４）だけがこの機能的アッセイにおいてＩＦＮＷを中和し、一方で、例示的抗体のどれもが、ＩＦＮＢまたはｇ１ ＩＦＮＧを中和しなかった。ｒｈＩＦＮＡの濃度は２ｎｇ／ｍｌであり、ｇ１ ＩＦＮＧの上清をそのＥＣ８０希釈で使用した。
ＩＳＲＥ−ルシフェラーゼレポーターアッセイ
２０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞または１０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ ＭＳＲ細胞を、ポリ−Ｌ−リシン被覆された９６ウエルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ）（白色ハーフエリア９６ウエルプレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．３６８８、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）−括弧内の値は、ＨＥＫ２９３Ｔ ＭＳＲ細胞を用いた２回目の実験選択肢における違いを示す）に播種し、Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤを製造者の説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）に従って使用して１００ｎｇ（５０ｎｇ）の事前に混合されたＩＳＲＥ−ホタルルシフェラーゼレポーター構築物およびウミシイタケルシフェラーゼ構築物（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＣＳ−００８Ｌ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）によりリバーストランスフェクションした（図６Ａにおける構築物の概略図を参照のこと）。ウミシイタケルシフェラーゼを発現する構築物が内部正規化コントロールとして役立った。細胞を、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０％（０．５％）のウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）が補充されるＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍにおいて一晩、加湿雰囲気中、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。一晩のインキュベーションの後、細胞を、３７℃で１時間プレインキュベーションされていた抗ＩＦＮＡ ｍＡｂまたはコントロールＩｇＧを伴って、または伴うことなく、ｒｈＩＦＮＡの混合物を含有する培地により２４時間刺激した。２４時間の刺激の後、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイを製造者の説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って行った。
図７において認められ得るように、例示的な抗ＩＦＮ−α特異的抗体の１９Ｄ１１、２５Ｃ３、２６Ｂ９、３１Ｂ４（図７Ａおよび図７Ｂ）および１３Ｂ１１（図７Ｃおよび図７Ｄ）の添加は、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４およびＩＦＮＡ１４に依存するＩＳＲＥ−ルシフェラーゼレポーター活性化を妨げており、このことは本発明のこれらの抗体のＩＦＮ−α中和能を示している。本発明の例示的な抗ＩＦＮ−α特異的抗体５Ｄ１の添加は、ＩＦＮＡ２およびＩＦＮＡ４に対するこの抗体の中和活性を示し、ＩＦＮＡ１４依存的なＩＳＲＥ−ルシフェラーゼ活性化に関しては中和を認めることができず、または、非常に弱い中和を認めることができた（図７Ｃおよび図７Ｄ）。ホスホ−ＳＴＡＴ１アッセイにおいて既に認められたように、抗体２５Ｃ３は、ＩＦＮＡ１４活性に関しては、ＩＦＮＡ２およびＩＦＮＡ４に対するその中和能との比較においてわずかにより弱い中和能を示した。同様に、例示的な抗ＩＦＮ−α特異的抗体１３Ｂ１１は、ＩＦＮＡ１４に対するわずかに弱い中和能を示している（図７Ｃおよび図７Ｄ）。例示的抗体８Ｈ１は、ＩＦＮＡ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ１０、Ａ１６、Ａ１７およびＡ２１に加えてＩＦＮＷを中和し、一方で、ＩＦＮＡ２、Ａ８およびＡ１４のわずかにより弱い中和を示す（図７Ｅ）。例示的抗体１２Ｈ５は、すべてのアルファ型インターフェロンによる、すなわち、ＩＦＮＡ１、Ａ２、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１６、Ａ１７およびＡ２１によるＩＳＲＥ−ルシフェラーゼレポーター誘導を強く阻害し、一方で、ＩＦＮＷ媒介のレポーター誘導には事実上影響を及ぼしていない。例示的抗体の８Ｈ１または１２Ｈ５のどちらもがＩＦＮＢ媒介のレポーター誘導を妨害していない（図７Ｅ）。
図８に示されるように、例示的抗体２６Ｂ９は、ｒｈＩＦＮＡ１、Ａ２、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１７、Ａ２１およびｒｈＩＦＮＷを強力に中和し、一方で、ｒｈＩＦＮＡ１６を弱く中和する。ｒｈＩＦＮの濃度は、１０ｎｇ／ｍｌ（ＩＦＮＡ１）、１．３ｎｇ／ｍｌ（ＩＦＮＡ１６）および２ｎｇ／ｍｌ（すべての他のｒｈＩＦＮ）であった。ＩＳＲＥ−ルシフェラーゼレポーターアッセイで求められるようなＩＣ５０値のまとめが表４に示される。
図９において認められ得るように、例示的抗体１９Ｄ１１は、すべてのｒｈＩＦＮＡ分子、すなわち、ＩＦＮＡ１、Ａ２、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１６、Ａ１７およびＡ２１を中和する。ｒｈＩＦＮの濃度は、１０ｎｇ／ｍｌ（ＩＦＮＡ１）、１．３ｎｇ／ｍｌ（ＩＦＮＡ１６）および２ｎｇ／ｍｌ（すべての他のｒｈＩＦＮ）であった。ＩＳＲＥ−ルシフェラーゼレポーターアッセイで求められるようなＩＣ５０値のまとめが表４に示される。
化学発光細胞結合アッセイ
３０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ ＭＳＲ細胞を、白色ハーフエリア９６ウエル組織培養プレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．３６８８、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）に播種した。翌日、ヒトＩＦＮ−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清を、抗ＩＦＮＡ ｍＡｂ、コントロールＩｇＧ、または、過剰濃度の標識されていない組換えＩＦＮＡ２と混合し、３７℃で１時間プレインキュベーションした。プレインキュベーション後、混合物を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ ＭＳＲ細胞を３７℃で４０分間刺激した。結合すると、細胞をＰＢＳにより３回洗浄し、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼアッセイを、Ｇａｕｓｓｉａ Ｆｌａｓｈ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを製造者の説明書に従って使用して発色させた（Ｃａｔ．Ｎｏ．１６１５９、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
図１０Ｃに示されるように、例示的抗体１９Ｄ１１は、ＩＦＮ受容体を内因的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ ＭＳＲ細胞に対する、ｇ１ ＩＦＮＡ２、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１６、Ａ１７およびＡ２１の結合を効率的に中和する。対照的に、例示的抗体１９Ｄ１１は事実上、ｇ１ ＩＦＮＢおよびｇ１ ＩＦＮＷの結合を妨害しない。本実施例で示されるすべてのｇ１ ＩＦＮの結合は明らかに、コントロールのヒト抗体（ｈｕＩｇＧ）によって影響されない。抗体濃度：５μｇ／ｍｌ。
図１０Ｄにおいて認められ得るように、ＨＥＫ２９３Ｔ ＭＳＲ細胞に対する、ｇ１ ＩＦＮＡ１６の結合が、例示的抗体２６Ｂ９と比較した場合、例示的抗体１９Ｄ１１によってより効率的に中和される。しかしながら、例示的抗体２６Ｂ９は、ＨＥＫ２９３Ｔ ＭＳＲ細胞に対する、ｇ１ ＩＦＮＷの結合を強く中和しており、これに対して、例示的抗体１９Ｄ１１は、このリガンドに対する明らかな中和能を全く示さない。ｇ１ ＩＦＮＡ１６およびｇ１ ＩＦＮＷの両方の結合は、コントロールのヒト抗体（ｈｕＩｇＧ）によって影響されないままである。抗体濃度：１０μｇ／ｍｌ。
実施例４：本件抗体の有効性確認
本発明によって提供される様々な抗体が、動物疾患モデルにおいてヒトＩＦＮ−αに対するそれらの中和活性に関して試験される。そのような実験を行うときには、ヒトＩＦＮ−αサブタイプが病的表現型をマウスにおいて誘導すること、および、交差反応が本発明の試験されたＩＦＮ−α抗体とマウスＩＦＮ−αホモログとの間で生じないことが保証されなければならない。ＩＦＮ−αについての適切なモデル系が先行技術において利用可能でなかったので、本実施例では、マウスＩＦＮと交差反応しないＩＦＮ−アルファ中和抗体を試験するためのそのような系が記載され、提供される。最初に、種々のＩＦＮ−αサブタイプの影響を耳炎症の誘導についてインビボで試験した。具体的には、ヒトサブタイプのＩＦＮＡ２ａ、ＩＦＮＡ２ｂ、ＩＦＮＡ４およびＩＦＮＡ１４の前炎症性活性が試験されている。ＩＦＮＡ２ａはアミノ酸２３によってＩＦＮＡ２ｂと異なる（ＩＦＮＡ２ａではＬｙｓであり、ＩＦＮＡ２ｂではＡｒｇである）。
耳炎症アッセイ
耳炎症の表現型を、それぞれの耳への２０μｌのＰＢＳにおけるヒトＩＦＮＡ２ａ、ＩＦＮＡ２ｂ、ＩＦＮＡ４およびＩＦＮＡ１４またはＰＢＳコントロールの皮内注入を、３０ゲージのニードルを使用して１日おきに、０日目、２日目および４日目に与えること（２０μｌ／耳、５００ｎｇ／耳、１μｇ総量／マウス／日）によって８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから得られる）において誘導した。マウスを６日目に屠殺した；表５（下記）および実験予定表についての図１４Ａを参照のこと。
Figure 2016531090
 表５：試験される異なるサイトカインへの動物群割り当て。ｎ−群における動物数、ｎｇ／２０μｌ−耳あたり注入されたサイトカインの量。
注入されたＩＦＮＡサブタイプの前炎症性影響を試験するために、動物の耳厚さ測定を、０日目におけるサイトカイン注入の前、および、（図１４ＡにおいてＭの文字によって示される）１日目、３日目、５日目での１日おきに、また、代替として、または、加えて、６日目において動物屠殺後に、耳あたり２回の測定によってサイトカイン投与の期間中、Ｍｉｔｕｔｏｙｏデジタルマイクロメーターを用いて行った。
さらに、体重が、炎症誘導に起因する何らかの起こり得る体重変化または加えられた処置に起因するそのそれぞれの減少を観測するために処置期間中モニターされる。加えて、動物の屠殺の後、耳のＨ＆Ｅ（ヘマトキシリンおよびエオシン）組織学染色（Ｈａｒｒｉｓ，Ｈ．Ｆ．、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ＩＩＩ（１９００）、７７７〜７８１、および、Ｍａｌｌｏｒｙ，Ｆ．Ｂ．、Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｓａｕｎｄｅｒｓ（１９３８）を参照のこと）が行われる。
試験された４つすべてのヒトＩＦＮＡサブタイプがサイトカイン注入後における耳の腫大を有意に誘導することができた；図１４〜図１６、および、図１７において表にまとめられる実験の結果を参照のこと。すべての耳がＰＢＳ処置の耳よりも際だって厚くなっていた；このことは、２回目の皮内注入の後、３日目から実験終了まで、すべての群において有意であった。ＩＦＮＡ１４がこの実験ではとりわけ５日目において最も強力であった。ＩＦＮＡ２ａおよびＩＦＮＡ４は、類似するレベルの耳肥厚を誘導した。ＩＦＮＡ２ｂが、ＩＦＮＡ４誘導腫大およびＩＦＮＡ１４誘導腫大の両方に対して最も類似していた。ＩＦＮＡ２ｂは、この実験ではＩＦＮＡ２ａイソフォームよりも多く腫大を誘導した；図１４〜図１６、および、図１７において表にまとめられる実験結果を参照のこと。
この実験の結果は、この耳炎症アッセイが本発明の抗体の治療的適用可能性の試験のために適用可能であることを示す。本発明の例示的な抗ＩＦＮ−α抗体の１９Ｄ１１、２６Ｂ９、３１Ｂ４、５Ｄ１および１３Ｂ１１は、少なくともマウスＩＦＮ−αサブタイプ２、サブタイプ４およびサブタイプ１４との明らかな交差反応を何ら示さなかった（図１９Ａを参照のこと）ので、それらが、炎症の誘導のために使用されるヒトＩＦＮ−αに対するそれらの中和特性に関して上記のアッセイで試験される。例示的な抗ＩＦＮ−α抗体２５Ｃ３の、マウスＩＦＮＡ２に対する明らかな結合親和性、ならびに、例示的な抗ＩＦＮ−α抗体の５Ｄ１および１９Ｄ１１の、マウスＩＦＮＡ１に対する親和性が、本明細書中に記載されるインビボＣｙｔｏＥａｒ中和実験を設計するときには考慮に入れられる。
そのような処置試験が、抗体を、ヒトＩＦＮ−αによる炎症の誘導を試験するための上記の立案された実験予定表（図１４Ａもまた参照のこと）の期間中において種々の時点で注入することによって、本発明の例示的な抗ＩＦＮ−α抗体を用いて行われる。例えば、防止効果および／または治療効果を試験するために、本発明の例示的抗体の１つまたは複数が、実験の０日目にＩＦＮＡサブタイプ（１つまたは複数）と一緒に、あるいは、ＩＦＮＡサブタイプ（１つまたは複数）とは別個に注入される。加えて、または、代替として、本発明の抗体またはそのＩＦＮ−α結合断片の１つまたは複数が１日おきにＩＦＮＡサブタイプ（１つまたは複数）とともに注入される。例えば、ＩＦＮＡサブタイプ（１つまたは複数）が、０日目、２日目および４日目（図１４Ａにおける短い矢印）に上記で示されるように注入されるならば、抗体が、１日おきの１日目、３日目および／または５日目（図１４Ａにおける長い矢印）に注入される。
誘導された耳炎症の表現型を軽減する、および／または、そのような誘導を防止する本発明の抗体またはそのＩＦＮ−α結合断片の中和能が、抗ＩＦＮ−α抗体処置を受ける動物、および、ＰＢＳ、または、ヒトＩＦＮＡサブタイプとは別の分子に対する結合特異性（ＩＦＮ−α非関連の結合特異性）のヒトＩｇＧのどちらかを受けるコントロール群において認められる耳腫大（厚さ）の比較によって調べられる。
さらに、または、代替として、体重が、炎症誘導に起因する何らかの起こり得る体重変化または加えられた処置に起因するそのそれぞれの減少を観測するために処置期間中にモニターされる。加えて、動物の屠殺の後、耳のＨ＆Ｅ（ヘマトキシリンおよびエオシン）組織学染色（上記を参照のこと）が行われる。このアッセイが、好ましくは乾癬のための代用モデルとして使用される。
２回目の実験では、上記で示されたアッセイが、ヒトＩＦＮＡ１４（図２８）、ＩＦＮＡ５（図２９）およびＩＦＮＷ（図３０）の注入によってマウスの耳に誘導される炎症に対する本発明の例示的抗体の２６Ｂ９および１９Ｄ１１の中和特性を試験するためにいくつかの改変を伴って使用されている。図２８Ａ、図２９Ａおよび図３０Ａに示される時間スキームから認められ得るように、実験予定表がこの場合、実験０日目に（ＩＰ）注入される試験抗体およびコントロール、１日目、３日目、６日目および８日目での皮内へのサイトカイン注入、ならびに、１０日目での試験動物の屠殺により１０日に延長されている。試験された種々のサイトカインへの動物群割り当て、ならびに、サイトカインのそれぞれの濃度および量、試験されたそれぞれの抗体が、それぞれの図のパネルＢにおいて表に示される。両方の抗体、すなわち、２６Ｂ９および１９Ｄ１１は、ＩｇＧコントロールとの比較において、ＩＦＮＡ１４誘導による耳炎症（図２８Ｄおよび図２８Ｅ）およびＩＦＮＡ５誘導による耳炎症（図２９Ｄおよび図２９Ｅ）の後でのいくつかの実験日における耳厚さの有意な低下に起因する顕著な予防的潜在的可能性および／または治療的潜在的可能性を示している。参照用のＩＦＮ−α特異的抗体（図２８および図２９（具体的には図２８Ｆおよび図２９Ｆ）におけるＲｅｆ．Ａ）による処置もまた、いくつか実験日においてＩＦＮＡ１４処置後での耳腫大の有意な減少を引き起こし、しかしながら、わずかにより少ない減少が、本発明の抗体２６Ｂ９および抗体１９Ｄ１１と比較して、１０日目に認められた（図２８Ｄにおける２６Ｂ９についての曲線Ｆおよび図２８Ｅにおける１９Ｄ１１についての曲線Ｇを図２８ＦにおけるＲｅｆ．Ａについての曲線Ｈと、また、ＩｇＧコントロールについてのそれぞれの図における曲線Ｅと比較のこと）。そのうえ、例示的抗体２６Ｂ９はＩＦＮＷ誘導の耳腫大の有意な減少を実験９日目に示し（図３０Ｄ）、抗体１９Ｄ１１およびＲｅｆ．Ａの注入は、非特異的ＩｇＧによる処置と比較して、耳腫大の有意な減少を何ら示さなかった。したがって、本発明により提供される抗体は、高まったＩＦＮＡ活性および／またはＩＦＮＷ活性に伴う疾患の防止および／または処置において使用されるための大きい潜在的可能性を有する。
ＣｙｔｏＡｎｋｌｅアッセイ：
このアッセイでは、マウスコホート（ｃ５７／ｂｌ６、７週〜８週）に、１０ｕｌのＰＢＳにおける６２．５ｎｇ〜１０００ｎｇのサイトカイン、例えば、少なくとも１つのＩＦＮＡサブタイプ（例えば、ＩＦＮＡ２ａ、ＩＦＮＡ２ｂ、ＩＦＮＡ４またはＩＦＮＡ１４など）またはいくつかのＩＦＮＡサブタイプの混合物）（またはＰＢＳコントロール）が４８時間〜７２時間毎に足首に関節内（ＩＡ）注入される。その後、軸に沿った足首の厚さ測定をＭｉｔｕｔｏｙｏデジタルマイクロメーターにより行う。動物は重量測定を毎日受け、それぞれのＩＦＮＡサブタイプ（１つまたは複数）が、マウスをイソフルオランにより麻酔しながら投与される。実験の時間枠が、本発明の抗ＩＦＮ−α抗体（１つまたは複数）の注入を伴って耳炎症アッセイについて上記で示されるように設計され、この場合には、それぞれ、コントロール群はＰＢＳまたは上記で示されるようなＩＦＮ−α非関連の結合特異性のヒトＩｇＧのどちらかを受ける。足首腫大の軽減が本発明の抗体の治療効果の読み取りとして使用される。このアッセイが、好ましくは関節炎（例えば、関節リウマチ）のための代用モデルとして使用される。
実施例５：例示的なＩＦＮ−α抗体のエピトープマッピング
マッピングの第１の工程として、異なった抗原結合部位に対する本発明の様々な抗ＩＦＮ−αＭＡＢの示差的結合を、異なる結合部位の数を求めるために調べた。
この目的のために、様々なＭＡＢをヒト（ｈＭＡＢ）またはマウス（ｈｍＭＡＢ）のどちらかのＦｃとともに発現させ、交差競合実験を、抗原をプレートに被覆することによって、また、大過剰のヒトＭＡＢの存在下におけるｈｍＭＡＢの結合を検出することによって行った。リガンドに結合したｈｍＭＡＢの検出を、一次抗体のＦｃ部分に対して向けられるＨＲＰコンジュゲート化二次抗体によって行った。
図２Ａおよび下記の表６Ａから認められ得るように、本発明の例示的な抗ＩＦＮ−α抗体の１９Ｄ１１、２６Ｂ９、３１Ｂ４および１３Ｂ１１は、ＩＦＮＡ２の結合について相互に競合し、しかし、抗体５Ｄ１および抗体２５Ｃ３とは競合せず、このことは、５Ｄ１および２５Ｃ３が、１９Ｄ１１、２６Ｂ９、３１Ｂ４および１３Ｂ１１とは別のＩＦＮＡ２の部位と結合することを示している。同じ競合パターンがＩＦＮＡ４およびＩＦＮＡ１４について認められる場合があり、しかしながら、１３Ｂ１はＩＦＮＡ４の結合について競合せず、ＩＦＮＡ１４の競合について、１９Ｄ１１、２６Ｂ９、３１Ｂ４とほんの弱く競合するだけであり、このことは、これらの抗体が結合するエピトープがこのＩＦＮ−αサブタイプにおいて保存されていないかもしれないこと、具体的にはＩＦＮＡ４において一致していないかもしれないことを示している。１回目のアプローチの結果はまた、ＩＦＮＡ２およびＩＦＮＡ４の結合についての本発明の抗ＩＦＮ−α抗体の５Ｄ１および２５Ｃ３の相互の弱い競合を示しており、このことは、これらの抗体の、可能性のある部分的に重複するエピトープを示している；図２Ａ、図２Ｂ、ならびに、表５Ａ、表５Ｂを参照のこと。そのうえ、ＩＦＮＡ１４に対する一致しない競合パターンが認められる場合があり、この場合、ｈＭＡＢ ２５Ｃ３は、ｈｍＭＡＢ ５Ｄ１との強い競合を示し、しかし、逆の状況におけるほんの弱い競合（ｈｍＭＡＢ ２５Ｃ３に対する、ｈＭＡＢ ５Ｄ１）が認められる場合があり、このことは、ＩＦＮＡ１４特異的エピトープに対する２５Ｃ３抗体の優先の可能性を示している；図２Ｃおよび下記の表６Ｃを参照のこと。
Figure 2016531090
 表６：本発明の例示的抗体の交差競合実験の結果。ヒトＭＡＢ（ｈＭＡＢ）を、マウスＦｃを有するＭＡＢ（ｈｍＭＡＢ）を加える前に、それぞれの抗原により被覆されるプレートに大過剰で加えた。
そのそれぞれの抗原に対するＭＡＢの結合領域を、例えば、ＰｅｐＳｔａｒ（商標）分析によってマッピングすることができる。したがって、重複する２０ｍｅｒのペプチド（１５アミノ酸の重複）が、目的とするＩＦＮ−αサブタイプ（例えば、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４およびＩＦＮＡ１４、すべての知られている変異体を含む）を網羅するために設計される。これらのペプチドおよび（陽性コントロールとしての）全長抗原をマイクロアレイにスポットし、このペプチドマイクロアレイを一次抗体とインキュベーションし、その後、一次抗体のＦｃ部分に対して向けられる蛍光標識された二次抗体とインキュベーションする。立体障害によって引き起こされる偽陰性を避けるために、最適化された親水性リンカー部分がガラス表面と抗原由来ペプチド配列との間に挿入される。
そのようなペプチドマッピングが、ヒトＩＦＮＡ２、それぞれのヒトＩＦＮＡＷの１８ｍｅｒペプチドのペプチドアレイの上で、本発明の例示的抗体の１９Ｄ１１および２６Ｂ９について行われている。アッセイの結果が図２７に示される。例示的抗体１９Ｄ１１はＩＦＮＡ２のペプチド１９（ＳＡＡＷＤＥＴＬＬＤＫＦＹＴＥＬＹＱ、配列番号９９）およびペプチド３２（ＲＩＴＬＹＬＫＥＫＫＹＳＰＣＡＷＥＶ、配列番号１００）に特異的に結合する（図２７Ｂ）。抗体２６Ｂ９はＩＦＮＡ２のペプチド２２（ＹＴＥＬＹＱＱＬＮＤＬＥＡＣＶＩＱＧ、配列番号１０１）に特異的に結合し（図２７Ｃ）、かつ、ＩＦＮＡＷのペプチド２３（ＴＧＬＨＱＱＬＱＨＬＥＴＣＬＬＱＶＶ、配列番号１０２）に特異的に結合する（図２７Ｄ）。
実施例６：ＬＩＰＳアッセイによるＩＦＮＡサブタイプに対するＭＡＢ結合の決定
ＥＬＩＳＡアッセイに加えて、種々のＩＦＮＡサブタイプに対するＭＡＢの結合をＬＩＰＳアッセイによって求めた。ＩＦＮＡ５−、ＩＦＮＡ６−およびＩＦＮＡ８−Ｇａｕｓｓｉａ融合タンパク質を、下記の表８に示されるプライマーを使用して、本出願人の国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４１９における１５８頁の実施例１０および１６５頁〜１６７頁の実施例１５に記載されるように（それらの開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）、ＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼとＮ末端でそれぞれが融合されるＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６およびＩＦＮＡ８をクローン化し、それらをＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションによって個々に発現させること（２日後での上清の採取）によって産生させた。ＭＡＢ（４μｇ／ｍｌ）を、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＨＴＳ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のウエルにおいて緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で希釈し、等量のプロテインＡアガロースビーズ（Ｅｘａｌｐｈａ）と１時間、回転式振とう機の上でインキュベーションした。ＩＦＮＡ５−またはＩＦＮＡ６−またはＩＦＮＡ８−Ｇａｕｓｓｉａ融合タンパク質の２つの体積（１００万ＬＵ）を加え、プレートを１時間インキュベーションした。プレートを緩衝液Ａにより５回洗浄し、さらに２回、ＰＢＳにより洗浄し、その後、基質（Ｇａｕｓｓｉａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｆｌａｓｈ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ）を加えた。ルミネセンス（ＣＰＳ）を、ＥｎＳｐｒｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して読み取った（図１１Ｂ、図１２Ａ〜図１２Ｃおよび図１３を参照のこと）。非関連の抗原に結合するヒト抗体（ヒトＭＡＢ）が陰性コントロールとして使用されている。
図１１および図１２に示される結果から認めることができるように、例示的ＭＡＢの１３Ｂ１１は、ＩＦＮＡ２、４、５、６、１０および１４に結合し、しかし、ＩＦＮＡ１／１３には結合しないか、または弱く結合し、ＩＦＮＡ８には結合しない。さらに、本明細書中に記載される実験において提供される結果、例えば、実施例２および実施例３において提供される結果は、例示的ＭＡＢの１３Ｂ１１が、ＩＦＮＡ２、４、５、１４を中和し、しかし、ＩＦＮＡ６、８およびＩＦＮＡ２１を中和しないことを示す。実施例２、実施例３および実施例６に記載される実験によって提供されるような本発明の例示的抗体の結合特性および中和特性に関するすべての結果が下記の表７にまとめられる。
Figure 2016531090
 表７：本明細書中に記載されるＥＬＩＳＡアッセイ、ＬＩＰＳアッセイまたは中和アッセイで得られるような本発明の例示的抗体による種々のＩＦＮサブタイプの結合（Ｂ）および中和（Ｎ）。本発明の例示的なヒト抗ＩＦＮ−α抗体の１９Ｄ１１はすべてのＩＦＮＡサブタイプを中和し、ＩＦＮＷを中和しない。例示的抗体２６Ｂ９は、ＩＦＮＷと、ＩＦＮＡ１６を除くすべてのＩＦＮＡサブタイプとを中和する。＋／＋＋／＋＋＋＝結合、それぞれの中和；−＝結合／中和の欠如。ｎｄ＝測定されず；Ｂ＝結合、これは、市販の組換えタンパク質を用いたＥＬＩＳＡによって、または、自社製造されたＩＦＮ−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質を用いたＬＩＰＳによって求められる；Ｎ＝中和、これは、ＩＳＲＥ−ルシフェラーゼレポーターアッセイによって、または、ホスホ−ＳＴＡＴ１アッセイによって求められる。
ＥＬＩＳＡアッセイ、ＬＩＰＳアッセイおよび中和アッセイにおける本発明の例示的抗体による種々のＩＦＮＡサブタイプの結合および中和に関する以前の実験は、類似した結果を与えた。
Figure 2016531090
Figure 2016531090
 表８：Ｇａｕｓｓｉａ−ルシフェラーゼ−ＩＦＮ融合構築物をクローン化するために使用されるすべてのＩＦＮタンパク質および使用されたプライマー配列の概略
Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼに対する融合でのヒトＩＦＮサブタイプのクローニング
シグナルペプチドを伴わない、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２１、ＩＦＮＷ、ＩＦＮＢ、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＥおよびＩＦＮＫのコード配列を、ホタルルシフェラーゼに代わってプラスミドに置き換えられる生来的に分泌されるＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）の下流側において改変ｐＰＫ−ＣＭＶ−Ｆ４融合ベクター（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）にクローン化した。
実施例７：ＩＳＲＥルシフェラーゼレポーター中和アッセイによる、例示的なヒト由来ＩＦＮＡ ｍＡｂのＩＣ５０分析
ＩＳＲＥ−ホタルルシフェラーゼレポーター構築物およびウミシイタケルシフェラーゼ構築物（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＣＳ−００８Ｌ、Ｑｕｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ ＭＳＲ細胞（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ７９５０７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）を示されるように、ヒト由来のＩＦＮＡ ｍＡｂの２６Ｂ９（図８Ａ〜図８Ｅ）、２５Ｃ３（図９Ａ〜図９Ｅ）または１９Ｄ１１（図１０Ａ〜図１０Ｅ）の存在下、２ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮＡ２、ｒｈＩＦＮＡ４、ｒｈＩＦＮＡ１４により、または、ヒトＩＮＦ−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質（ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ８）を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清により刺激した。２４時間の刺激の後、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイを製造者の説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）に従って行った。
確認実験では、上記で記載されるようにＩＳＲＥ−ホタルルシフェラーゼレポーター構築物およびウミシイタケルシフェラーゼ構築物を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ ＭＳＲ細胞を示されるように、ヒト由来のＩＦＮＡ ｍＡｂの２６Ｂ９（図８Ｆ〜図８Ｒ）または１９Ｄ１１（図１０Ｆ〜図１０Ｑ）の存在下、１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮＡ１、２ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮＡ２、ｒｈＩＦＮＡ４、ｒｈＩＦＮＡ５、ｒｈＩＦＮＡ６、ｒｈＩＦＮＡ８、ｒｈＩＦＮＡ１０、ｒｈＩＦＮＡ１４、ｒｈＩＦＮＡ１７、ｒｈＩＦＮＡ２１、１．３ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＦＮＡ１６により刺激した。２４時間の刺激の後、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイを製造者の説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）に従って行った。同じ実験構成がさらに、ヒト由来ｍＡｂの８Ｈ１（図２０）、１２Ｈ５（図２１）および５０Ｅ１１（図２２）のＩＣ５０分析を行うために使用されている。アッセイの結果が上記の表４にまとめられる。
実施例８：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用する抗体親和性測定
本発明の抗体の親和性決定のために、ＳＰＲ測定が、国際出願公開ＷＯ２０１３／０９８４１９の１６３頁〜１６５頁での実施例１４（その開示内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載されるような類似した実験構成において本発明の目的とする分子を使用して、ＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲ３６装置を製造者（ＢＩＯ−ＲＡＤ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、米国）の説明書に従って使用して行われる。代替として、または、加えて、類似する分析が、Ｂｉａｃｏｒｅ ＳＰＲ装置を製造者の説明書に従って使用して行われる。
本発明の例示的抗体の１９Ｄ１１および２６Ｂ９に対して行われるＳＰＲ測定についての結果が図２６に示され、１：１の結合速度論が、ＩＦＮＡ２ｂ、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ１４に対してこれらの抗体について認められ、抗体２６Ｂ９に関してはＩＦＮＷに対してもまた認められる。ヒトＩＦＮＡ４およびＩＦＮＡ１４に対する親和性が、ＩＦＮ２ｂについてはサブピコモル濃度範囲およびサブナノモル濃度範囲にある。２６Ｂ９はまた、サブピコモル濃度の親和性でヒトＩＦＮＷと結合する。
実施例９：化学発光細胞結合アッセイ
インターフェロン−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ
３０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ ＭＳＲ細胞を白色ハーフエリア９６ウエル組織培養プレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．３６８８、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）に播種した。翌日、ヒトＩＦＮ−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清を、抗ＩＦＮＡ ｍＡｂ、コントロールＩｇＧ、または、過剰濃度の標識されていない組換えＩＦＮＡ２と混合し、３７℃で１時間プレインキュベーションした。プレインキュベーション後、その混合物を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ ＭＳＲ細胞を３７℃で４０分間刺激した。結合すると、細胞をＰＢＳにより３回洗浄し、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼアッセイを、Ｇａｕｓｓｉａ Ｆｌａｓｈ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを製造者の説明書に従って使用して発色させた（Ｃａｔ．Ｎｏ．１６１５９、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
膜貫通抗体に対する結合
３０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ ＭＳＲ細胞を白色ハーフエリア９６ウエル組織培養プレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．３６８８、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）に播種した。播種期間中に、細胞を、Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ２３１１、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）を使用して、抗ＩＦＮ ｍＡｂの２６Ｂ９の膜貫通型（２６Ｂ９−ＴＭ）をコードするｃＤＮＡの１００ｎｇによりトランスフェクションした。表面の抗体（２６Ｂ９−ＴＭ）発現をトランスフェクション後４８時間で、細胞に基づくＥＬＩＳＡで分析した（図２４Ａ）。トランスフェクション後４８時間で、ヒトＩＦＮＷ−Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ融合タンパク質（ｇ１ ＩＦＮＷ）を一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の上清を使用して、事前にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ ＭＳＲ細胞を３７℃で４０分間刺激した。代替として、ｇ１ ＩＦＮＷの上清を抗ＩＦＮ ｍＡｂまたはコントロールＩｇＧと混合し、３７℃で１時間プレインキュベーションした。プレインキュベーション後、混合物を使用して、２６Ｂ９−ＴＭを一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｔ ＭＳＲ細胞を３７℃で４０分間刺激した。結合すると、細胞をＰＢＳにより３回洗浄し、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼアッセイを、Ｇａｕｓｓｉａ Ｆｌａｓｈ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを製造者の説明書に従って使用して発色させた（Ｃａｔ．Ｎｏ．１６１５９、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。これにより、ｇ１ ＩＦＮＷが、２６Ｂ９−ＴＭを発現する細胞に特異的に結合することが示された（図２４Ｂ）。
抗ＩＦＮＷ抗体の交差競合アッセイ
上記実験構成はまた、本発明の例示的抗体の２６Ｂ９、３１Ｂ４および８Ｈ１との間での交差競合を試験するために使用されている（図２５を参照のこと）。ＨＥＫ２９３Ｔ ＭＳＲ細胞を、２６Ｂ９−ＴＭをコードするｃＤＮＡによりリバーストランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間で、ｇ１ ＩＦＮＷを、可溶性抗ＩＦＮＷ抗体の２６Ｂ９、３１Ｂ４、８Ｈ１、またはコントロールＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ）と混合し、１時間プレインキュベーションした。インキュベーション後、混合物を、トランスフェクションされた細胞に加え、結合を化学発光細胞結合アッセイで分析した。２６Ｂ９−ＴＭに対するｇ１ ＩＦＮＷの結合が、可溶性２６Ｂ９による、また、クローン的に関連した３１Ｂ４抗体による用量依存的な競合を受ける。対照的に、結合は、コントロールＩｇＧによって、また、例示的な抗ＩＦＮＷ抗体８Ｈ１によって影響されない。これらの結果は、例示的抗体の２６Ｂ９および３１Ｂ４が、類似するエピトープを共有し、一方、８Ｈ１は、異なったエピトープに結合するようであることを示している。

Claims (23)

  1. ヒト抗インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−α）抗体またはそのＩＦＮ−α結合断片。
  2. （ｉ）ヒトＩＦＮ−αサブタイプであるＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ１０およびＩＦＮＡ１４に結合する；
    （ｉｉ）少なくとも１つの、ヒトＩＦＮ−αサブタイプであるＩＦＮＡ１／１３（ＩＦＮＡ１ｂ）、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１６および／またはＩＦＮＡ２１に結合する；かつ
    （ｉｉｉ）前記ヒトＩＦＮ−αサブタイプの少なくとも１つの生物学的活性を中和することができる、
    請求項１に記載の抗体またはＩＦＮ−α結合断片。
  3. ＩＦＮ−ωに結合することができ、かつ／または、ＩＦＮ−ωの活性を中和することができる、請求項１または２に記載の抗ＩＦＮ−α抗体またはＩＦＮ−α結合分子。
  4. その可変領域において、
    （ａ）下記に示されるＶＨ可変領域アミノ酸配列および／またはＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：
    （ｉ）図１（ＶＨ）（配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２２または配列番号８４）；および
    （ｉｉ）図１（ＶＬ）（配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２４または配列番号８６）；
    （ｂ）図１に示されるようなＶＨ領域および／またはＶＬ領域のアミノ酸配列；
    （ｃ）（ａ）のアミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；ならびに／あるいは
    （ｄ）（ｂ）のアミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域
    を含む、請求項１または２に記載の抗体またはＩＦＮ−α結合断片あるいはその合成誘導体または生物工学誘導体。
  5. アミノ酸配列ＳＡＡＷＤＥＴＬＬＤＫＦＹＴＥＬＹＱ（配列番号９９）および／またはアミノ酸配列ＲＩＴＬＹＬＫＥＫＫＹＳＰＣＡＷＥＶ（配列番号１００）からなるＩＦＮＡ２のエピトープと結合することができる、請求項４に記載の抗体あるいはＩＦＮ−α結合断片、合成誘導体または生物工学誘導体。
  6. その可変領域において、
    （ａ）下記に示されるＶＨ可変領域アミノ酸配列および／またはＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：
    （ｉ）図１（ＶＨ）（配列番号配列番号３０、配列番号３８、配列番号７６または配列番号９２）；および
    （ｉｉ）図１（ＶＨ）（配列番号配列番号３２、配列番号４０、配列番号７８または配列番号９４）；
    （ｂ）図１に示されるようなＶＨ領域および／またはＶＬ領域のアミノ酸配列；
    （ｃ）（ａ）のアミノ酸配列のいずれか１つの部分的変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；ならびに／あるいは
    （ｄ）（ｂ）のアミノ酸配列の部分的変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域
    を含む、請求項３に記載の抗体またはＩＦＮ−α結合断片あるいはその合成誘導体または生物工学誘導体。
  7. アミノ酸配列ＹＴＥＬＹＱＱＬＮＤＬＥＡＣＶＩＱＧ（配列番号１０１）からなるＩＦＮＡ２のエピトープ、および／または、アミノ酸配列ＴＧＬＨＱＱＬＱＨＬＥＴＣＬＬＱＶＶ（配列番号１０２）からなるＩＦＮＡＷのエピトープを認識する、請求項６に記載の抗体あるいはＩＦＮ−α結合断片、合成誘導体または生物工学誘導体。
  8. ＩｇＧ１である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体またはＩＦＮ−α結合断片。
  9. 表１に示されるＣＨアミノ酸配列およびＣＬアミノ酸配列（配列番号６、配列番号８、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３４、配列番号３６、配列番号４２、配列番号４４、配列番号７２、配列番号７４、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８８、配列番号９０、配列番号９６および配列番号９８）から選択されるアミノ酸配列または少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＨ定常領域および／またはＣＬ定常領域を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはＩＦＮ−α結合断片。
  10. 少なくとも１つのヒトＩＦＮ−αサブタイプおよび／またはヒトＩＦＮ−ωに対する特異的な結合について、請求項１〜９のいずれか一項に記載される抗体と競合する抗体またはＩＦＮ結合分子。
  11. 少なくとも５つのヒトＩＦＮ−αサブタイプおよび／またはヒトＩＦＮ−ωについて１０ｎｇ以下のＩＣ５０値を有する、先行する請求項のいずれか一項に記載の抗体またはＩＦＮ結合分子。
  12. 単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片および単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡＢ）からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体またはＩＦＮ−α結合断片。
  13. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載される抗体またはＩＦＮ−α結合断片をコードするポリヌクレオチドであって、好ましくは、前記可変領域と、前記定常ドメインの少なくとも一部とをコードするｃＤＮＡである、ポリヌクレオチド。
  14. 請求項１３に記載されるポリヌクレオチドを含むベクター。
  15. 請求項１３に記載されるポリヌクレオチドまたは請求項１４に記載されるベクターを含む宿主細胞。
  16. 検出可能に標識されるか、または、薬物に結合させられ、好ましくは、検出可能な標識が、酵素、放射性同位体、蛍光団、ペプチドおよび重金属からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
  17. 請求項１〜１２または１６のいずれか一項に記載される抗体またはそのＩＦＮ−α結合断片、請求項１３に記載されるポリヌクレオチド、請求項１４に記載されるベクター、請求項１５に記載される細胞、ならびに／あるいは、請求項１〜１２または１６のいずれか一項に記載される抗体またはそのＩＦＮ−α結合断片の特徴を組合せで示すＩＦＮ−α抗体および／またはＩＦＮ−ω抗体あるいはそのＩＦＮ−α結合断片またはＩＦＮ−ω結合断片のカクテルを含む組成物またはキットであって、前記組成物が、
    （ｉ）医薬組成物であり、かつ、薬学的に許容され得る担体をさらに含み、また、必要な場合にはさらに、免疫媒介または自己免疫性の疾患または状態を処置することにおいて有用であるさらなる薬剤を含む；あるいは
    （ｉｉ）診断用の組成物またはキットであり、かつ、免疫または核酸に基づく診断方法において従来から使用される試薬をさらに含む、
    組成物またはキット。
  18. （ａ）免疫媒介もしくは自己免疫性の疾患もしくは状態を処置するか、または、免疫媒介もしくは自己免疫性の疾患もしくは状態の進行を妨げる方法；
    （ｂ）免疫媒介もしくは自己免疫性の疾患もしくは状態に伴う症状を改善する方法；ならびに／あるいは
    （ｃ）免疫媒介もしくは自己免疫性の疾患もしくは状態の存在について、または、免疫媒介もしくは自己免疫性の疾患もしくは状態を発症することについての被験体の危険性を明らかにするために被験体を診断するか、またはスクリーニングする方法
    において使用されるためのものであり、
    免疫媒介もしくは自己免疫性の疾患もしくは状態が、患者におけるＩＦＮ−αおよび／またはＩＦＮ−ωの発現に伴い、好ましくは、前記疾患が自己免疫疾患である、請求項１〜１２または１６のいずれか一項に記載の抗体またはＩＦＮ−α結合断片あるいは請求項１７に記載の組成物。
  19. ＩＦＮ−αおよび／またはＩＦＮ−ωの発現に伴う被験体における免疫媒介または自己免疫性の疾患または状態を診断するための方法であって、前記被験体の生物学的サンプルを請求項１〜１２または１６のいずれかに記載される抗ＩＦＮ−α抗体と接触させること、ならびに、ＩＦＮ−αおよび／またはＩＦＮ−ωの存在を検出することを含む、方法。
  20. 単離された生物学的サンプルにおいてＩＦＮ−αおよび／またはＩＦＮ−ωを検出するか、または測定する方法であって、前記サンプルを請求項１〜１２または１６のいずれか一項に記載される抗ＩＦＮ−α抗体と混合すること、前記抗体により、混合物に存在するいずれかのＩＦＮ−αサブタイプおよび／またはＩＦＮ−ωとの複合体を形成させること、ならびに、前記混合物に存在する前記複合体を検出することを含む、方法。
  21. ヒト由来の抗ＩＦＮＡモノクローナル抗体もしくは抗ＩＦＮＡ／ＩＦＮＷモノクローナル抗体をそれぞれ、または、そのＩＦＮ結合断片もしくは生物工学誘導体を製造するための、あるいは、前記抗ＩＦＮＡモノクローナル抗体もしくは抗ＩＦＮＡ／ＩＦＮＷモノクローナル抗体またはそのＩＦＮ結合断片もしくは生物工学誘導体を含む組成物を製造するためのプロセスであって、当該製造が、前記抗体またはそのＩＦＮ結合断片もしくは生物工学誘導体を、請求項１〜１２または１６のいずれか一項に記載される抗体、ＩＦＮ結合断片もしくは生物工学誘導体をコードする形質転換用ＤＮＡの組換え宿主生物における発現によって調製する工程を含む、プロセス。
  22. 前記組成物が医薬組成物であり、かつ、前記抗体、そのＩＦＮ結合断片もしくは生物工学誘導体を調製する前記工程の後には、前記抗体、そのＩＦＮ結合断片もしくは生物工学誘導体を医薬組成物の製造において薬学的に許容され得る担体と混合することが続く、請求項２１に記載のプロセス。
  23. 本明細書、添付された実施例および図において開示されるような抗ＩＦＮ−α抗体またはＩＦＮ−α結合断片かつ／またはＩＮＦ−ω結合断片、その合成誘導体または生物工学誘導体、ならびに、抗ＩＦＮ−α抗体またはＩＦＮ結合断片かつ／またはＩＮＦ−ω結合断片、その合成誘導体または生物工学誘導体を含有する組成物またはキット、及び任意のそれらの使用。
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