JP7183291B2

JP7183291B2 - 局部の筋肉増加を促進し、若しくは局部の筋萎縮を抑制又は防止する組成物及び当該組成物を使用して製造された薬物

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Description

本発明は、組成物、特に局部の筋肉増加を促進する組成物に関する。また、本発明は、組成物の使用、特に局部の筋肉増加を促進する薬物を製造するための使用を提供する。なお、本発明は、組成物、特に局部の筋萎縮を抑制又は防止する組成物に関する。本発明は、組成物の使用、特に局部の筋萎縮を抑制又は防止する薬物を製造するための使用を提供する。

ミオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）の配列は、トランスフォーミング増殖因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ β、ＴＧＦ－β）ファミリーの他のメンバーと非常に類似する。ミオスタチンの遺伝子構造は、（１）タンパク質分泌信号とするＮ端疎水性構造領域、（２）高度に保存されたタンパク質の切断位置ＲＸＲＲ、及び（３）システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）が豊富であるＣ端活性構造領域を有する。多くの研究報告において、脊椎動物のミオスタチンのアミノ酸配列は、Ｃ端活性構造領域中に高度な保存性を有すると報告されている。従来の研究において、ミオスタチンに対して高い特異性を有するモノクローナル抗体ＪＡ１６（Ｗｈｉｔｔｅｍｏｒｅｅｔａｌ．，２００３，ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ３００：９６５－９７１）が提出されている。ミオスタチンの結合位置を解析することで、結合位置がマウスミオスタチンＣ端の１５個のアミノ酸ＤＦＧＬＤＣＤＥＨＳＴＥＳＲＣにあることを解明する。よって、Ｃ端構造領域が抗原断片（ａｎｔｉｇｅｎｉｃｆｒａｇｍｅｎｔ）であることがわかる。

台湾発明特許Ｉ５４０９６８号

しかしながら、従来のミオスタチンの抗体を投与すると、全身性反応を引き起こす。例えば、Ｃａｍｐｏｒｅｚらの２０１６年の文献において、抗ミオスタチン抗体を局部注射した後、老いたマウスの全身の筋肉及び重量を増加させることが記載されている。また、筋形成抑制剤ＡＣＥ－０３１（ｍｙｏｓｔａｔｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）について、２０１０年の臨床試験の結果、全身の筋肉を増加し、筋肉の力を増加したが、被験者に特発性出血（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｂｌｅｅｄｉｎｇ）、鼻血（ｎｏｓｅｂｌｅｅｄｓ）、皮膚の毛細血管の拡張（ｓｍａｌｌｅｘｐａｎｓｉｏｎｏｆｂｌｏｏｄｖｅｓｓｅｌｓｉｎｓｋｉｎｓ）又は頭痛（ｈｅａｄａｃｈｅｓ）等の副作用が生じた。そのため、前記臨床試験は、有害事象（ｎｅｇａｔｉｖｅｐｈｅｎｏｍｅｎａ）、特に、抗体が免疫系の全身性の作用、例えば、アレルギー反応、悪寒、下痢、嘔吐、皮膚のかゆみ等の症状を引き起こすため、２０１１に試験を中止された。また、例えばＨ．Ｎ．Ｐｅｉｒｉｓが２０１２年の文献「Ｐｌａｃｅｎｔａ３３（２０１２９０２－９０７）」において、「ダブル筋肉」遺伝子型（ｄｏｕｂｌｅ－ｍｕｓｃｌｉｎｇ）のウシは、分娩（ｃａｌｖｉｎｇ）及び受胎能力（ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ）が不足となることが報告されている。それに対し、ミオスタチン遺伝子欠損のマウス（Ｍｓｔｎ－／－）が受胎能力（ｆｅｒｔｉｌｅ）を有する。そのため、ミオスタチンは、妊娠期間の胎盤生成及びその機能に関すると推測する。

台湾発明特許Ｉ５４０９６８（特許文献１）において、ミオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）は、緑膿菌外毒素領域Ｉａと融合し、ポリペプチド断片又は抗体を形成することが開示されている。緑膿菌外毒素断片は、誘導免疫応答を有効に増加できるが、当業者に公知の通り、緑膿菌が細菌生成途中に封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙ）を生じるため、断片又は抗体を抽出する時に、尿素（ｕｒｅａ）を添加して細胞を破壊する必要がある。よって、尿素の残留及びリフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）断片によってタンパク質の機能に影響する可能性がある。もっとも、前記特許に開示される効果は、依然として全身性反応であるため、従来技術のミオスタチン抗体を更に改善する余地がある。

また、現在の研究において、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）が分泌したエンテロトキシン（ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）は、Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｃ２、Ｄ、Ｅ、及びＦ等いくつのタイプに分けられる。そのうち、黄色ブドウ球菌エンテロトキシン（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、及びＳＥＣ２のエンテロトキシンの分子量が近く、高い構造的類似度があるため、全身性免疫反応を引き起こし、同じ臨床症状、例えば熱、高血圧等のより大きい副作用を引き起こす可能性がある。

上記に鑑みて、全身性の反応を引き起こすことなく局部の筋肉だけに作用する薬剤が求められている。

従来技術の欠点を解決するために、本発明の目的は、局部の筋肉の増加の効果を達成できる組成物を提供する。

１つの態様において、本発明は、少なくとも９０％のＳＥＱＩＤＮＯ：８と配列類似性を有する第１ポリペプチドと、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４で規定される配列の１から１０の繰返し単位（ｒｅｐｅａｔｕｎｉｔｓ）を含む第２ポリペプチドとを含む、局部の筋肉増加を促進し、若しくは局部の筋萎縮を抑制又は防止する組成物を提供する。

好ましくは、前記第２ポリペプチドは、タンデム繰返し単位（ｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔｅｄｕｎｉｔｓ）のリニアアレイエピトープ（ｌｉｎｅａｒａｒｒａｙｅｐｉｔｏｐｅ，ＬＡＥ）であり、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４で規定される配列の１から１０の繰返し単位を含む。

更に好ましくは、前記第２ポリペプチドは、タンデム繰返し単位のリニアアレイエピトープであり、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４で規定される配列の６の繰り返し単位を含む。

好ましくは、前記第１ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：８に対応して、７番目のアミノ酸にＴ又はＬを有し、９番目のアミノ酸にＧ又はＥを有し、１３番目のアミノ酸にＹ又はＶを有し、１０５番目のアミノ酸にＨ又はＹを有する。

好ましくは、前記第１ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２からなる群から選ばれる。

好ましくは、前記第１ポリペプチドと第２ポリペプチドの間にあるコネクソンをさらに有する。前記組成物の配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７である。

１つの好ましい製造例において、前記第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドは、下記例から選ばれる。

１つの態様において、本発明は、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンのポリペプチドと、ミオスタチンポリペプチドとを有する、局部の筋肉増加を促進し、若しくは局部の筋萎縮を抑制又は防止する組成物に関する。

好ましくは、前記黄色ブドウ球菌エンテロトキシンのポリペプチドは、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、Ｂ、Ｃ１、Ｃ２、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、及びＨからなる群から選ばれる。

S.aureus Enterotoxins C2（ＳＥＣ２）は、２７ｋＤａの分子量を有し、２３９個のアミノ酸を有する。転写されたＳＥＣ２は、２６６個のアミノ酸を有するタンパク質であり、分子量が３０ｋＤａである。アラニン２７の所にＳＥＣ２ポリペプチドを切断することで、成熟毒素を生成できる。前記成熟毒素は、２３９個のアミノ酸を有し、分子量が２７ｋＤａである。Ｎ端ポリペプチドのシークエンシングによって、ＳＥＣ２におけるシグナルポリペプチドの切断位置を確定し、成熟毒素のＮ端を確定できる。それによって、引き起こした免疫反応をＳＥＣ２によって有効に増加することを証明できる。好ましくは、前記黄色ブドウ球菌エンテロトキシンのＣ２配列のポリペプチド配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：８で規定される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：８で規定される配列に対応して、７番目のアミノ酸にＴ又はＬを有し、９番目のアミノ酸にＧ又はＥを有し、１３番目のアミノ酸にＹ又はＶを有し、又は１０５番目のアミノ酸にＨ又はＹを有する。

好ましくは、前記ミオスタチンポリペプチドは、増殖分化因子８（ｇｒｏｗｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ８、ＧＤＦ８）、フォリスタチン（ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）、又はＩＩ型アクチビン受容体（ａｃｔｉｖｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｐｅ－２Ｂ、ＡＣＴＲ－ＩＩＢ）が挙げられる。

好ましくは、前記ミオスタチンポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３で規定される配列を有する増殖分化因子８、ＳＥＱＩＤＮＯ：１５で規定される配列を有するフォリスタチン、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１６で規定される配列を有するＩＩ型アクチビン受容体からなる群から選ばれる。

好ましくは、前記ミオスタチンのエピトープポリペプチドは、タンデム繰返し単位（ｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔｅｄｕｎｉｔｓ）のリニアアレイエピトープ（ｌｉｎｅａｒａｒｒａｙｅｐｉｔｏｐｅ、ＬＡＥ）である。

他の態様において、本発明は、前記組成物及び薬学的に許容される担体を含む、局部の筋肉増加を促進し、若しくは局部の筋萎縮を抑制又は防止する医薬組成物を提供する。

本明細書において、前記「薬学的に許容される担体」は、例えば水、アルコール（ａｌｃｏｈｏｌｓ）、グリコール（ｇｌｙｃｏｌ）、炭化水素（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ）（例えば、黄色ワセリン（ｐｅｔｒｏｌｅｕｍｊｅｌｌｙ）及び白色ワセリン（ｗｈｉｔｅｐｅｔｒｏｌａｔｕｍ））、ワックス（ｗａｘ）（例えば、パラフィン（ｐａｒａｆｆｉｎ）及びイエローワックス（ｙｅｌｌｏｗｗａｘ））、保存剤（ｐｒｅｓｅｒｖｉｎｇａｇｅｎｔｓ）、酸化防止剤（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ）、溶剤（ｓｏｌｖｅｎｔ）、乳化剤（ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）、懸濁化剤（ｓｕｓｐｅｎｄｉｎｇａｇｅｎｔ）、分解剤（ｄｅｃｏｍｐｏｓｅｒ）、結合剤（ｂｉｎｄｉｎｇａｇｅｎｔ）、賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）、安定剤（ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇａｇｅｎｔ）、キレート剤（ｃｈｅｌａｔｉｎｇａｇｅｎｔ）、希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）、ゲル化剤（ｇｅｌｌｉｎｇａｇｅｎｔ）、防腐剤（ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ）、潤滑剤（ｌｕｂｒｉｃａｎｔ）、吸収促進剤（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｅｎｈａｎｃｅｒｓ）、活性剤（ａｃｔｉｖｅａｇｅｎｔｓ）、保湿剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔｓ）、消臭剤（ｏｄｏｒａｂｓｏｒｂｅｒｓ）、香料（ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ）、ｐＨ調整剤（ｐＨａｄｊｕｓｔｉｎｇａｇｅｎｔｓ）、閉塞剤（ｏｃｃｌｕｓｉｖｅａｇｅｎｔｓ）、軟化剤（ｅｍｏｌｌｉｅｎｔｓ）、増粘剤（ｔｈｉｃｋｅｎｅｒｓ）、可溶化剤（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇａｇｅｎｔｓ）、透過促進剤（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎｅｎｈａｎｃｅｒｓ）、抗刺激剤（ａｎｔｉ－ｉｒｒｉｔａｎｔｓ）、着色剤（ｃｏｌｏｒａｎｔｓ）、推進剤（ｐｒｏｐｅｌｌａｎｔｓ）、界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）、アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）、及びその他の本発明に適用できる担体が挙げられる。

本明細書において、前記「アジュバント」は、ミョウバン沈殿、完全フロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓｃｏｍｐｌｅｔｅａｄｊｕｖａｎｔ）、不完全フロイントアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅａｄｊｕｖａｎｔ）、及びモノホスホリルリピドＡ／トレハロースｄｉｃｏｒｙｎｏｍｙｃｏｌａｔｅアジュバントが挙げられる。

本発明の医薬組成物は、液体、半固体、及び固体薬剤が挙げられる。液体は、分散液又は懸濁液が挙げられる。半固体及び固体は、錠剤、丸剤、粉剤、リポソーム、又は坐剤が挙げられる。投与方法及び治療応用に応じて選択できる。好ましくは、前記医薬組成物は、経口又は輸液による投与できる。

他の態様において、本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７に示されるアミノ酸配列からなる組成物である、局部の筋肉増加を促進し、若しくは局部の筋萎縮を抑制又は防止する核酸を提供する。

他の態様において、本発明は、局部の筋肉増加を促進する薬物を製造するための、前記組成物の使用に関する。被投与者の局部に前記薬物を有効量で投与することで、局部の筋肉増加の効果を達成できる。

本発明の１つの実施例において、前述組成物を使用して哺乳類の局部の筋肉増加を促進し、ミオスタチン断片及びＳＥＣ２の融合タンパク質を提供することで、抗ミオスタチンの特異性の免疫細胞を得る。本発明の免疫細胞は、ミオスタチン断片のエピトープによって他の動物に導入できる。そして、純化、若しくは免疫細胞又はそのエピトープを哺乳動物の体内に導入することで、哺乳動物の身体自体の筋肉生長を促進できる。本発明の免疫細胞は、ポリクローナルＢリンパ球、又はＴ細胞クローンであってもよい。好ましくは、前述免疫細胞は制御性Ｔ細胞である。

他の態様において、本発明は、局部の筋萎縮を防止する薬物を製造するための、前記組成物の使用に関する。被投与者の局部に前記薬物を有効量で投与することで、局部の筋萎縮を抑制又は防止する効果を達成できる。１つの実施例において、片腿の神経を損傷した後、前述組成物を損傷した神経の一側の腿神経に投与することで、前記一側の腿の筋肉の大きさを維持し、神経損傷による筋萎縮を予防できる。１つの実施例において、片腿の神経を切断した後、組成物を切断した神経の一側の腿神経に投与することで、前記一側の腿の筋肉の大きさを維持し、神経切断による筋萎縮を予防できる。

前述組成物及びその使用は、動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくは人、豚、牛、羊、犬及び家禽、水禽等の動物に適用できる。前記動物のミオスタチンがクローニングされ、そのアミノ酸配列が高度の保存性を有する。そのため、前述動物のミオスタチンが同じ機能を有すると想定できる。より好ましくは、前述哺乳動物が人、猪、牛、羊又は犬である。

本発明の組成物は、各種類の筋萎縮の症状に適用できる。筋萎縮は、薬物、例えば、糖質コルチコイド（例えばコルチゾール（ｃｏｒｔｉｓｏｌ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、ベタメタゾン（ｂｅｔａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、プレドニゾン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、メチルプレドニゾロン（ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、又はプレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）の治療によって引き起こす場合がある。また、筋萎縮は、神経外傷による脱神経化、変形性又は神経壊死、代謝性又は炎症性神経病変（例えば、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｌｉａｎ－Ｂａｒｒｅｓｙｎｄｒｏｍｅ））、末梢神経病変、又は環境毒素への暴露によって引き起こす場合がある。

また、筋萎縮は、筋疾患、例えば、筋緊張性ジストロフィー（ｍｙｏｔｏｎｉｃｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、先天性筋症（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ）、家族性周期性麻痺（ｆａｍｉｌｉａｌｐｅｒｉｏｄｉｃｐａｒａｌｙｓｉｓ、ＦＰＰ）、代謝性筋症（ｍｅｔａｂｏｌｉｃｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ、例えばグリコーゲン又はリピドの蓄積症）、皮膚筋炎（ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ）、多発性筋炎（ｐｏｌｙｍｙｏｓｉｔｉｓ）、封入体筋炎（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙｍｙｏｓｉｔｉｓ、ＩＢＭ）、骨化性筋炎（ｍｙｏｓｉｔｉｓｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ）、又は横紋筋融解症（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｌｙｓｉｓ）によって引き起こす場合がある。

なお、筋萎縮は、例えば運動ニューロン病（ｍｏｔｏｒｎｅｕｒｏｎｄｉｓｅａｓｅｓ、ＭＮＤ）、脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌｍｕｓｃｕｌａｒａｔｒｏｐｈｙ、ＳＭＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、若年性脊髄性筋萎縮症（ｊｕｖｅｎｉｌｅｓｐｉｎａｌｍｕｓｃｕｌａｒａｔｒｏｐｈｙ、ＳＭＡ－IIIとも称する）、重症筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａＧｒａｖｉｓ、ＭＧ）、脳卒中又は脊髄損傷による麻痺、外傷による骨変形、長期臥床、自発的不活動（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｉｎａｃｔｉｖｉｔｙ）、非自発的不活動（ｆｏｒｃｅｄｉｎａｃｔｉｖｉｔｙ）、代謝ストレス又は栄養不足、癌、ＡＩＤＳ、絶食、甲状腺障害、糖尿病、セントラルコア病（ｃｅｎｔｒａｌｃｏｒｅｄｉｓｅａｓｅ、ＣＣＤ）、熱傷、慢性閉塞性肺疾患、肝疾患（例えば、肝線維化、肝硬変）、敗血症、腎不全、うっ血性心不全、老化、宇宙旅行、又は無重力環境で一定の時間を過ごすことによって引き起こす場合がある。

一方、本明細書において、「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」という用語は、免疫反応を引き起こし、タンパク質抗原の抗原断片を生成する。構造を予測し、又はタンパク質断片を選択することで、免疫動物の免疫反応を観察できる。

一方、本明細書において、「有効量」という用語は、使用量及び時間に基づいて、局部の筋肉増加を促進し、又は局部の筋萎縮を抑制又は防止できる量である。本明細書に示すように、局部の筋肉増加を促進する有効量は、局部の筋肉増加を促進する試験（実施例１）から得られる。また、局部の筋萎縮を抑制又は防止する有効量は、局部の筋萎縮を抑制又は防止する試験（実施例２、３））から得られる。

前記エピトープが小さなペプチド断片であるため、そのまま動物に免疫させると、理想な免疫反応が行われない可能性がある。好ましくは、タンデム繰返し単位を含有するリニアアレイエピトープ（ｌｉｎｅａｒａｒｒａｙｅｐｉｔｏｐｅ、ＬＡＥ）を形成することで、免疫反応を改善する。また、細菌毒素によって抗原を送達できる。活性を除去された毒素を輸送システムとし、毒素の性質によって全体的な免疫効果を向上できる。１つの態様において、本発明のミオスタチンＣ端のエピトープのリニアアレイエピトープは、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＣ２（ＳＥＣ２）と融合する。

上記核酸を含む宿主細胞を生産できる。実施例において、大腸菌、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌細胞、及び哺乳動物細胞を含む。前記核酸分子は、本明細書の前記ポリペプチド又は融合タンパク質を発現するために用いられる。前記核酸分子を適切なベクターであるマルチクローニングサイト（ｍｕｌｔｉｐｌｅｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅ、ＭＣＳ）に連結することで、前記ポリペプチド又は融合タンパク質を生成できる。

実施例において、ベクターがプラスミドを含む。前記ベクターは、好ましくはプロモーター、エンハンサー、マルチクローニングサイト等を含む。核酸分子が適切なベクターであるマルチクローニングサイトに連結した後、前記発現ベクターを宿主細胞に導入することで、本明細書の前記ポリペプチド又は融合タンパク質を生成できる。前記宿主細胞は、例えば、大腸菌、百日咳菌、バシラス菌、ベロ細胞、ヘモフィルス菌、真菌、又は酵母が挙げられる。

本発明の利点としては、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＣ２配列のポリペプチド、及びミオスタチンＣ端のエピトープポリペプチドを含む組成物によって、従来技術が達成できなかった局部の筋肉増加を促進する効果を達成できる。また、前記組成物を神経損傷又は神経切断の片側の腿神経に投与すると、予期せずに前記片側の腿神経によって筋肉の大きさを維持できる。それによって、臨床上、神経損傷又は神経切断がある場合、患者の局部の筋萎縮の現象を有効に防止できる。

以下、図面を開示しながら本発明を説明するが、本発明は、図面に限定されない。
低投薬量実験群及び低投薬量比較群の筋肉の断面積比率を示す折れ線グラフである。低投薬量実験群は、符号●の折れ線で示し、低投薬量比較群は、符号■の折れ線で示す。中投薬量実験群及び中投薬量比較群の筋肉の断面積比率を示す折れ線グラフである。中投薬量実験群は、符号●の折れ線で示し、中投薬量比較群は、符号■の折れ線で示す。高投薬量実験群及び高投薬量比較群の筋肉の断面積比率を示す折れ線グラフである。高投薬量実験群は、符号●の折れ線で示し、高投薬量比較群は、符号■の折れ線で示す。マウス後脚のコンピュータ断層撮影の縦断面画像及び横断面画像である。各横断面画像は、縦断面画像の線に対応する横断面である。図４（Ａ）は、低投薬量比較群の縦断面画像であり、上下の破線の間が筋肉体積の計算領域である。図４（Ｂ）は、中投薬量比較群の縦断面画像であり、上下の破線の間が筋肉体積の計算領域である。図４（Ｃ）は、高投薬量比較群の縦断面画像であり、上下の破線の間が筋肉体積の計算領域である。図４（Ｄ）は、低投薬量比較群の横断面画像である。図４（Ｅ）は、中投薬量比較群の横断面画像である。図４（Ｆ）は、高投薬量比較群の横断面画像である。図４（Ｇ）は、低投薬量実験群の縦断面画像であり、上下の破線の間が筋肉体積の計算領域である。図４（Ｈ）は、中投薬量実験群の縦断面画像であり、上下の破線の間が筋肉体積の計算領域である。図４（Ｉ）は、高投薬量実験群の縦断面画像であり、上下の破線の間が筋肉体積の計算領域である。図４（Ｊ）は、低投薬量実験群の横断面画像である。図４（Ｋ）は、中投薬量実験群の横断面画像である。図４（Ｌ）は、高投薬量実験群の横断面画像である。低投薬量比較群及び低投薬量実験群のマウス後脚の体積比率を示す棒グラフである。Ａ．Ｕ．は、ＡｒｂｉｔｒａｒｙＵｎｉｔ（任意単位）を示す。中投薬量比較群及び中投薬量実験群のマウス後脚の体積比率を示す棒グラフである。Ａ．Ｕ．は、ＡｒｂｉｔｒａｒｙＵｎｉｔ（任意単位）を示す。高投薬量比較群及び高投薬量実験群のマウス後脚の体積比率を示す棒グラフである。Ａ．Ｕ．は、ＡｒｂｉｔｒａｒｙＵｎｉｔ（任意単位）を示す。高投薬量比較群のマウスの後ふくらはぎの筋繊維組織のヘマトキシリン・エオシン染色（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－ｅｏｓｉｎ、Ｈ－Ｅ）図である。高投薬量実験群のマウスの後ふくらはぎの筋繊維組織のＨ－Ｅ染色図である。ミオスタチンに対するマウス後脚の筋繊維の免疫組織染色図である。図１０（Ａ）～（Ｃ）は、比較群である。図１０（Ｄ）～（Ｆ）は、それぞれ、５０ｎｇ（低投薬量）、５００ｎｇ（中投薬量）、及び５０００ｎｇ（高投薬量）の実験群である。低、中、高投薬量の実験群のマウスに本発明の組成物を投与した後の体重変化を示す折れ線グラフ。低投薬量実験群は、符号●の折れ線で示し、中投薬量実験群は、符号■の折れ線で示し、高投薬量実験群は、符号▲の折れ線で示す。制御群及び実験群のマウスの局部の筋肉に対して坐骨神経破壊手術を行った後、実験群において、本発明の組成物１０００ｎｇを投与し、その筋肉体積比率を示す棒グラフである。左脚が坐骨神経破壊手術を行って、右脚が坐骨神経破壊手術を行わない。図１２の制御群及び実験群の左脚筋肉体積比を右脚筋肉体積比で割る筋肉比率を示す棒グラフである。制御群、実験群Ａ及び実験群Ｂのマウスの局部の筋肉に対して坐骨神経切断手術を行った後、実験群Ａ、Ｂにおいて、それぞれ本発明の組成物１０００ｎｇ、５０００ｎｇを投与し、その筋肉体積比率を示す棒グラフである。左脚が坐骨神経破壊手術を行って、右脚が坐骨神経破壊手術を行わない。図１４の制御群であり、実験群Ａ及び実験群Ｂの左脚筋肉体積比を右脚筋肉体積比で割る筋肉比率を示す棒グラフである。

以下、図面及び本発明の実施例を開示しながら本発明を説明する。

［製造例１］ＳＥＣ２断片及びミオスタチン断片を含む組成物の製造

本実施例において、融合タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｐＥＴ発現系である発現ベクター、好ましくはｐＥＴ－２８ａを使用する。第１ポリペプチド「ＳＥＣ２ｍ」は、点突然変異（ｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎ）を有する黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＣ２であり、核酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１で示し、タンパク質配列がＳＥＱＩＤＮＯ：８（点突然変異は、７番目のアミノ酸にＬを有し、９番目のアミノ酸にＥを有し、１３番目のアミノ酸にＶを有し、１０５番目のアミノ酸にＹを有する）で示す。第２ポリペプチド「Ｍｙｏｅｐｉｔｏｐｅ」は、ミオスタチンのエピトープであり、ミオスタチンＣ端の１５個のアミノ酸（配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１４で示す。前記配列が高度の保存性を有するため、複数の種がこのような配列を有する）が６の繰り返し断片を有する。その単一断片の核酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：２で示す。ｐＥＴベクターマルチクローニングサイト（ｍｕｌｔｉｐｌｅｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅ、ＭＣＳ）内に位置する遺伝子配列は、核酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：３で示すように、Ｎ端から順に「ＳＥＣ２ｍ」、コネクソン（ｌｉｎｋｅｒ）、及び「Ｍｙｏｅｐｉｔｏｐｅ」である。

３５Ｌ発酵培地を作って、５０Ｌ発酵槽にＳＥＱＩＤＮＯ：３ｐＥＴベクターを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を培養する。４本の５ｍＬ菌株を３７℃でＬＢ／アンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）培地で一晩培養する。各菌株をそれぞれ０．２ＬのＬＢ／アンピシリン培地に接種し、全部で１Ｌとなる。３７℃で、ＯＤ６００が０．３になるまで揺れ続けて培養する。その後、３５μＬ培地に入れて培養する。２時間ごとにサンプリングし、ＯＤ６００を測定することで、増殖曲線の変化を監視する。増殖曲線に基づいて適切な時点を選択し、最終濃度が０．１ｍＭであるイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ＩＰＴＧ）誘導大腸菌を加え、融合タンパク質を高発現する。３７℃で３時間揺れ続けて培養すた後、菌株を遠心分離する。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動及びウェスタンブロッティングによって融合タンパク質の発現を測定する。それによって、３５Ｌの最適な発酵条件を確定できる。基本的には、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）発現融合ポリペプチドの細胞溶解後、前記融合ポリペプチドを抽出及び分離し、組成物（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７で示す）を得る。前記発現タンパク質の抽出及び離隔は従来技術であるため、ここで繰り返して説明しない。

［実施例１］局部の筋肉増加を促進する試験

本実施例の動物実験において、「Ｃ５７ＢＬ／６」系統の８週齢（１２ヵ月齢）の雌ラットを使用し、比較群及び実験群では全部で９匹のマウスを使用し、実験時間が６カ月である。マウスが１２ヵ月齢に成長した時に、高脂質飼料及び高果糖シロップを含む飲用水で飼育する。腐敗しないように飼料及び飲用水を２日ごとに交換し、飼料が－２０℃で保存され、高果糖シロップが４℃で保存される。２週ごとに体重を測定する。実験動物が６ヶ月の給餌を経た後、週１回に前記組成物を筋肉内注射する。製造例１の組成物（組成物を生理食塩水によって異なる濃度に希釈する）をそれぞれマウスの左後ふくらはぎの筋肉に注射し、異なる投薬量の実験群とする。右後ふくらはぎに対して生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）を注射する。その実験群を以下の表１に示す。

週１回にノギスによって筋肉の長径（ａ）及び短径（ｂ）を測定し、且つ体重を測ることで、実験データを収集する。測量位置は薬物注射位置である。得られた数値を楕円面積計算式「ａ×ｂ×３．１４」によって計算し、筋肉の凡その断面積を得る。計算範囲について、図４（Ａ）、図４（Ｂ）、図４（Ｃ）、図４（Ｇ）、図４（Ｈ）、図４（Ｉ）の上下の破線の間が筋肉体積の計算領域である。各実験群を比較する。

（１）実験群（左後ふくらはぎ）及び比較群（右後ふくらはぎ）の組成物注射後の筋肉断面積の比較

図１～図３に示すように、１９週目の時に各実験群と各比較群を比べると、高投薬量組成物を注射したふくらはぎの横断面積が高投薬量比較群より８．１９％増加し、中投薬量組成物を投与したふくらはぎの横断面積が中投薬量比較群より５．５％増加し、低投薬量組成物を投与した横断面積が低投薬量比較群より５．６７％増加する。

（２）実験群（左後ふくらはぎ）及び比較群（右後ふくらはぎ）の組成物注射後の筋肉体積の比較

図４は、マウス後脚のコンピュータ断層撮影の縦断面画像及び横断面画像である。各横断面画像は、縦断面画像の線に対応する横断面である。そのうち、図４（Ａ）、図４（Ｂ）、図４（Ｃ）、図４（Ｇ）、図４（Ｈ）、図４（Ｉ）の破線の間が筋肉体積の計算範囲である。各断面積を積分して筋肉体積を得る。投薬から１９週後、実験を終了し、マウスを犠牲死させ、２つのふくらはぎを取って１０％ホルマリンによって固定し、コンピュータ断層撮影を行う。

図５～図７に示すように、筋肉体積について、低投薬量実験群が低投薬量比較群より４．６％増加し、中投薬量実験群が中投薬量比較群より８．５％増加し、高投薬量実験群が高投薬量比較群より１９．２％増加する。本試験において、同一のマウスの左後ふくらはぎの筋肉が実験群であり、右後ふくらはぎが比較群である。結果、本発明の組成物を左側ふくらはぎに注射すると、前記片側のふくらはぎの筋肉を増加し、もう一側（右側）のふくらはぎの筋肉が増加しない。よって、本発明前記組成物を局部投与すると、前記局部のみに筋肉増加の効果を有し、全身性筋肉増加反応を生じない。

（３）実験群（左後ふくらはぎ）及び比較群（右後ふくらはぎ）の組成物注射後の筋繊維の太さの測定

１９週目に犠牲死させ、コンピュータ断層撮影した後、実験マウスのふくらはぎの骨を取って、筋肉部分に対してパラフィン包埋及び切片を行い、Ｈ－Ｅ組織染色によって筋繊維の太さを比較する。図８及び図９に示すように、図８は、高投薬量比較群のマウスの後ふくらはぎの筋繊維を示し、図９は、高投薬量実験群のマウスの後ふくらはぎ筋繊維を示す。図８及び図９から分かるように、高投薬量実験群のマウス筋繊維が比較群より大幅に増加する。

（４）実験群（左後ふくらはぎ）及び比較群（右後ふくらはぎ）の組成物注射後のミオスタチン含量分布の測定

１９週目に犠牲死させ、コンピュータ断層撮影した後、実験マウスのふくらはぎの骨を取って、筋肉部分に対してパラフィン包埋及び切片を行う。その後、ミオスタチン抗体によって免疫組織化学染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＩＨＣ）を行って、ミオスタチン含量分布を観察する。図１０に示すように、図１０（Ａ）、図１０（Ｂ）、図１０（Ｃ）において、異なる投薬量の比較群（左後ふくらはぎ）のミオスタチンが明らかに染色される。逆に、図１０（Ｄ）、図１０（Ｅ）、図１０（Ｆ）において、低投薬量、中投薬量、又は高投薬量にかかわらず、実験群（右後ふくらはぎ）のミオスタチン発現が明らかに抑制される。つまり、低投薬量、中投薬量、又は高投薬量に依存せず、同一のマウスの右ふくらはぎ（即ち、比較群）のミオスタチンの濃度が高く、右ふくらはぎの筋肉増加が見られなかった。しかしながら、同一のマウスの左ふくらはぎ（即ち、実験群）のミオスタチンが本発明の組成物によって抑制されるため、ミオスタチンの濃度が低く、左ふくらはぎの筋肉増加が見られる。即ち、本発明前記組成物は、局部の筋肉増加効果を有する（全身血液循環に影響されない）。

（５）低投薬量、中投薬量、又は高投薬量の組成物注射後の体重変化の比較

１９週目に体重を測量する。図１１に示すように、低投薬量、中投薬量、又は高投薬量にかかわらず、実験群において、組成物を投与した後、各組の間に明らかな体重差が見られなかった。そのため、本試験において、組成物を局部投与すると、投与部位である局部の筋肉を増加し、全身性の筋肉増加を生じない。

［実施例２］神経損傷による局部の筋萎縮を抑制又は防止する試験

１０匹のＩＣＲマウス（８週齢、ＢｉｏＬＡＳＣＯＴａｉｗａｎ株式会社から購入）を準備し、正常飼料で１～２週間給餌した後、２組（各組が５匹）に分ける。実験の１日目に坐骨神経破壊手術を行って、各組のマウスの左脚の坐骨神経に神経損傷を引き起こし（各組マウスの右脚が坐骨神経破壊手術を行わない）、２８日目に犠牲死させる。各組は、それぞれ、制御群（左脚が坐骨神経破壊手術を行い、投薬しない）、実験群（左脚が坐骨神経破壊手術を行い、第１、３、７、１４日目に各マウスに本発明の製造例１の組成物１０００ｎｇを筋肉内注射する）である。マウスの筋萎縮程度を観察し、本発明の組成物によって筋萎縮を抑制又は防止する効果を評価する。

坐骨神経破壊手術は、マウスに麻酔薬（腹部麻酔）を投与した後、マウスの手術側の膝から臀部の体毛を除去し、マウスの脚部を固定し、アルコール綿で手術部位を消毒する。大腿骨の位置を見つけた後、臀部付近に大腿骨に平行に切開する。筋肉層を剥離した後、大腿骨に平行する坐骨神経が見られる。坐骨神経を持ち上げて、特殊な道具で損傷を与えた後、元の位置に戻る。皮膚を縫合してから、毎日、マウスの創傷治癒状況、歩行変化、及び全体状態を観察する。前記手術の目的は、神経損傷の状態をシミュレートする。

２８日目に測定した結果、１匹の制御群マウスの左大腿の筋肉体積が約１３７３ｍｍ３であり、右大腿の筋肉体積が約１５９５ｍｍ３である。右脚が坐骨神経破壊手術を行わなかったため、右大腿の筋肉体積を基準比率１とし、左大腿の筋肉体積比率は、左大腿の筋肉体積を右大腿の筋肉体積で割った値である（図１２の制御群）。制御群マウスの右脚の筋肉に対して、その左脚の筋肉が萎縮状態となる。なお、測定した結果、１匹の実験群のマウスの左大腿の筋肉体積が約１８８８ｍｍ３であり、右大腿の筋肉体積が約１７０５ｍｍ３である。右大腿の筋肉体積を基準比率１とし、左大腿の筋肉体積比率は、左大腿の筋肉体積を右大腿の筋肉体積で割った値である（図１２の実験群）。マウスの左脚が坐骨神経破壊手術を行ったが、本発明の前記組成物を投与したため、左脚の筋萎縮現象が見られない。

図１３に示すように、制御群の左大腿／右大腿の筋肉体積比率が約０．８６であり（１未満は、萎縮状態を示す）、実験群の左大腿／右大腿の筋肉体積比率が約１．１１である。そのため、制御群に対して、本発明の前記組成物を投与する実験群が筋肉体積を維持できる。このことから、神経損傷の場合、本発明の前記組成物を投与することによって、局部の筋萎縮を減少又は抑制し、ひいては元の筋肉体積を維持できる。

［実施例３］神経切断による局部の筋萎縮を抑制又は防止する試験

１０匹のＩＣＲマウス（８週齢、ＢｉｏＬＡＳＣＯＴａｉｗａｎ株式会社から購入）を準備し、正常飼料で１～２週間給餌した後、２組（各組が５匹）に分ける。実験の１日目に坐骨神経切断手術を行って、２８日目に犠牲死させる。各組は、それぞれ制御群（左脚が坐骨神経切断手術を行い、投薬しない）、実験群Ａ（左脚が坐骨神経切断手術を行い、第１、３、７、１４日目に各マウスに本発明の製造例１の組成物１０００ｎｇを筋肉内注射する）、実験群Ｂ（左脚が坐骨神経切断手術を行い、第１、３、７、１４日目に各マウスに本発明の製造例１の組成物５０００ｎｇを筋肉内注射する）である。マウスの筋萎縮程度を観察し、筋萎縮に対する本発明の組成物の効果を評価する（各組マウスの右脚がいずれも坐骨神経切断手術を行わない）。坐骨神経切断手術は、大体実施例２と同じであるが、坐骨神経を持ち上げてそのまま切断する。

２８日目に測定した結果、制御群マウスの左大腿の筋肉体積が約１３７５ｍｍ３であり、右大腿の筋肉体積が約１５６０ｍｍ３である。右脚が坐骨神経切断手術を行わなかったため、右大腿の筋肉体積を基準比率１とし、左大腿の筋肉体積比率は、左大腿の筋肉体積を右大腿の筋肉体積で割った値である（図１４の制御群）。制御群マウスの右脚の筋肉（萎縮状態が見られなかった）に対して、その左脚の筋肉が萎縮状態となる。実験群Ａのマウス左大腿の筋肉体積が約１２８９ｍｍ３であり、右大腿の筋肉体積が約１３９４ｍｍ３である。右脚が坐骨神経切断手術を行わなかったため、右大腿の筋肉体積を基準比率１とし、左大腿の筋肉体積比率は、左大腿の筋肉体積を右大腿の筋肉体積で割った値である（図１４の実験群Ａ）。坐骨神経切断手術を行った後、左脚の筋萎縮が明らかに減少する。実験群Ｂのマウス左大腿の筋肉体積が約１９５８ｍｍ３であり、右大腿の筋肉体積が約１８６９ｍｍ３である。右脚が坐骨神経切断手術を行わなかったため、右大腿の筋肉体積を基準比率１とし、左大腿の筋肉体積比率は、左大腿の筋肉体積を右大腿の筋肉体積で割った値である（図１４の実験群Ｂ）。マウスの左脚が坐骨神経切断手術を行ったが、本発明の前記組成物５０００ｎｇを投与したため、筋萎縮現象が見られない。

図１５に示すように、制御群の左大腿／右大腿の筋肉体積比率が約０．８７であり（１未満は、萎縮状態を示す）、実験群Ａの左大腿／右大腿の筋肉体積比率が約０．９２であり、制御群に対して筋萎縮を減少できる。実験群Ｂの左大腿／右大腿の筋肉体積比率が約１．０４であり、制御群に対して筋肉体積を維持できる。このことから、坐骨神経切断の場合、本発明の前記組成物を投与することによって、実施例２のように局部の筋萎縮を減少又は抑制し、ひいては実施例３のように元の筋肉体積を維持できる。

本発明は、上記実施例に限定されない。当業者が本発明に基づいてなされた変更、改良又は均等の改変は、いずれも本発明の範囲に含まれるものとする。

Claims

ＳＥＱＩＤＮＯ：８と少なくとも９０％の配列同一性を有する第１ポリペプチドと、
ＳＥＱＩＤＮＯ：１４で規定される配列の６から１０の繰返し単位（ｒｅｐｅａｔｕｎｉｔｓ）を含む第２ポリペプチドと、
を含むことを特徴とする、局部に投与して局部の筋肉増加を促進し、若しくは局部の筋萎縮を抑制又は防止するための組成物。
前記第２ポリペプチドは、タンデム繰返し単位（ｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔｅｄｕｎｉｔｓ）のリニアアレイエピトープ（ｌｉｎｅａｒａｒｒａｙｅｐｉｔｏｐｅ，ＬＡＥ）であり、
前記第２ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４で規定される配列の６から１０の繰返し単位を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
前記第１ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：８に対応して、７番目のアミノ酸にＴ又はＬを有し、９番目のアミノ酸にＧ又はＥを有し、１３番目のアミノ酸にＹ又はＶを有し、１０５番目のアミノ酸にＨ又はＹを有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
前記第１ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、５、６、７、８、９、１０、１１及び１２からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
前記第１ポリペプチドと第２ポリペプチドの間にあるコネクソンをさらに有し、
前記第１ポリペプチドと前記コネクソンと前記第２ポリペプチドの配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７であることを特徴とする、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
ＳＥＱＩＤＮＯ：１７に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物であることを特徴とする、局部に投与して局部の筋肉増加を促進し、若しくは局部の筋萎縮を抑制又は防止するための組成物。
請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物及び薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする、局部に投与して局部の筋肉増加を促進し、若しくは局部の筋萎縮を抑制又は防止するための医薬組成物。
請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物を使用することによって製造された、局部に投与して局部の筋肉増加を促進するための薬物。
請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物を使用することによって製造された、局部に投与して局部の筋萎縮を抑制又は防止するための薬物。
前記組成物が、薬物による筋萎縮、神経外傷による筋萎縮、神経壊死による筋萎縮、自己免疫反応による筋萎縮、環境毒素による筋萎縮、又は外力による筋萎縮に適用される、請求項９に記載の薬物。
黄色ブドウ球菌エンテロトキシンのポリペプチドと、
増殖分化因子８（ｇｒｏｗｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ８，ＧＤＦ８）のＣ端の１５個のアミノ酸の６から１０の繰返し単位を含むミオスタチンポリペプチドと、
を有することを特徴とする、局部に投与して局部の筋肉増加を促進し、若しくは局部の筋萎縮を抑制又は防止するための組成物。
前記ミオスタチンポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４で規定されるアミノ酸配列を含むＣ端エピトープを含むことを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。