TWI540968B - 降低飼料轉換率之方法 - Google Patents

Description

降低飼料轉換率之方法

本發明係關於一種養殖方法，詳言之，係關於一種降低飼料轉換率之方法。

隨著世界人口快速成長，以及可耕地面積的減少，可利用的糧食資源漸趨短缺，提升單一面積生產量以及增加附加營養價值是世界糧食生產的趨勢。

針對漁業而言，因海上捕撈所得的漁獲量已幾近飽和，且動物蛋白市場對漁類產品之需求日益成長，由水產養殖業以彌補捕撈漁業產品供應量的不足已是勢在必行。

石斑魚(Epinephelus spp.)物種分類屬硬骨魚綱(Osteichthyes)、鱸行目(Perciforms)、鮨科(Serranidae)、石斑亞科(Epinephelinae)、石斑屬(Epinephelus)，為暖水性魚類，廣佈全世界熱帶與亞熱帶海域，為養殖界公認亞太地區最重要之經濟魚種。台灣主要養殖瑪拉巴石斑、點帶石斑、龍膽石斑和青點石斑。一般石斑魚養殖至少需八至十二個月才達上市體型，但最後的收成率都不高。除了早期稚魚易遭受病毒及細菌感染而死亡外，養殖期間的天候因素、水質污染問題、餌料生物的選擇與管理方面都會增加業者的風險。因此如何提高養殖魚類的養成速度，縮短上市的時間，降低飼料轉換率(飼料投餵重量/魚隻體重增加重量)及養殖期間可能發生的風險，是值得努力研究的方向。

富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)，又稱骨結合素(osteonectin)、BM40，其蛋白大小約35-45kDa，主要分佈於細胞外基質(extracellular matrix，ECM)之中，是一種細胞基質蛋白(matricelluar protein)，亦為一種具有與細胞外基質結合亦可與細胞結合之特性具多功能的醣蛋白(glycoprotein)。

雖然SPARC主要分布於細胞外基質之中，但其功用卻不同於一般基質中的結構性蛋白所負責的細胞結構組成、支持作用；相反的，SPARC專司細胞與細胞外基質之間的溝通橋樑，屬於調控性的蛋白質，能調節數種細胞基質蛋白的產生及儲存堆積(Bradshaw及Sage，2001，J Clin Invest 107；1049-1054；Lane及Sage，1994，FASEB J 8；163-173)。而SPARC主要表現於胚胎發育過程，對細胞分化、組織的鈣化生成、骨骼發育、型態及器官發育有極大影響，當於生物成體時此蛋白的表現量有降低的趨勢，主要是當皮膚或是組織受傷時的修復及重組過程會有較明顯的表現(Lane及Sage，1994)。

SPARC主要可以分成三個功能區(Hohenester等人，1997，EMBO J 16；3778-3786)：1、酸性區(Acidic domain)：於蛋白質N端，此區可與5~8個鈣離子形成弱親和力的結合，具有抑制細胞延展及調控細胞外基質生產的功能；2、類卵泡抑制素區(Follistatin like domain)：此區包含多個半胱胺酸，且有類似卵泡抑制素的功能，能夠抑制細胞增生，此區還包含另一個特別的序列-銅離子結合序列(K)GHK(Iruela-Arispe等人，1995，Mol Biol Cell 6；327-343)，具有促進血管的增生的功能；3、細胞外鈣離子結合區(EC domain)：為SPARC的C端，具有兩個EF-手型結構域(EF-hand motif)可與鈣離子形成高親和力的結合，能與細胞或某些膠原蛋白做結合，亦具有抑制細胞增生及延展的效果(Maurer等人，1995，J Mol Biol 253；347-357)。

目前對SPARC生物功能性的研究探討已有一些發現，於活體外的老鼠內皮細胞培養觀察中可以發現到幾個特性：(一)SPARC的表現可以抑制細胞型態的延展，使細胞趨於圓形(Murphy-Ullrich等人，1991，J Cell Biol 115；1127-1136)；調控細胞外基質的組成及其中某些細胞外基質蛋白質的表現，進而調節細胞與外基質之間的結合狀況於是改變細胞型態及遷徙的能力(Hasselaar等人，1991，J Biol Chem 266；13178-13184；Tremble等人，1993，J Cell Biol 121；1433-1444)；(二)抑制細胞週期的進行，主要使週期停於中G1期，故有抑制細胞生長的功能(Yan及Sage，1999，J Histochem Cytochem 47；1495-1506)；(三)於血管細胞培養的研究發現其具有促進血管增生之性質(Funk及Sage，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88；2648-2652)；而在活體內發現，去除SPARC基因的老鼠在出生不久後即有白內障的現象，推測SPARC對於眼睛水晶體的發育為必需的蛋白(Yan及Sage，1999)；而研究中也發現在sparc基因剔除的老鼠中，可以觀察到皮膚組成發生異常改變，脂肪層有增厚的現象，且其脂肪細胞有體積變大及數目增多的現象，血液中由脂肪細胞所分泌的瘦蛋白濃度也有上升的情形，因此推測SPARC蛋白可能和體內調控脂肪量變化有相關關係(Bradshaw等人，2003，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100；6045-6050)。

肌肉倍增基因(myostatin)，亦稱為第八號生長分化因子(growth and differentiation factor-8，GDF-8)，為轉化生長因子TGF-β家族中之成員。肌肉倍增基因可負向調控肌肉的生長分化。於牛及人體之研究中皆可發現當肌肉倍增基因失去功能時，因無法執行負向調控肌肉之生長分化，造成肌肉倍增的表現型出現(McPherron及Lee，1997，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94，12457-12461；Schuelke等人，2004，The New England Journal of Medicine 350，2682-2688)。在哺乳動物研究方面，將小鼠的肌肉倍增基因剔除(McPherron及Lee，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94；12457-12461)、在小鼠肌肉中大量表現肌肉倍增抑制蛋白(如Follistatin)或是讓其訊息傳遞所需的受器蛋白ActRIIB失去功能(Lee及McPherron，2001，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98；9306-9311)，都會導致肌肉倍增的結果出現。而在硬骨魚類研究方面，使用反義嗎啉剔除(Antisense morpholino knock-down)技術抑制斑馬魚胚胎中的肌肉倍增蛋白-1之mRNA，可使胚胎生長速度變快(Amali等人，2004，Developmental Dynamics 229；847-856)；或利用RNAi技術使斑馬魚肌肉倍增基因-1默化，出現巨大斑馬魚的特徵(Acosta等人，2005，Journal of Biotechnology 119；324-331)，進一步以組織切片去探討研究這些肌肉細胞，發現肌肉細胞體積變大(Hypertrophy)及肌肉細胞數目增生(Hyperplasia)，可能是導致肌肉倍增的原因。

另一方面，於體外細胞株研究結果指出，若在C₂C₁₂肌肉母細胞株內大量表現肌肉倍增蛋白質，可抑制肌肉母細胞的增生，使細胞停留在細胞週期當中的G₁至S期(Thomas等人，2000，The Journal of Biological Chemistry 275；40235-40243)。另一方面，若在肌肉星狀細胞內大量表現肌肉倍增蛋白質，發現其可抑制肌肉星狀細胞活化及自我更新(self-renewal)(McCroskery，2003，The Journal of Cell Biology 162；1135-1147)，亦證明肌肉倍增蛋白質在肌肉發育過程當中，的確扮演負向調控的角色。除了其本身會在肌肉細胞內進行調控之外，其他文獻指出其有抑制脂肪新生的功能存在(Rebbapragada等人，2003，Molecular and Cellular Biology 23；7230-7242)，也有研究指出其有抑制肌肉母細胞凋亡的功能(Ros等人，2001，Biochemical and Biophysical Research Communications 280；561-566)。

然而關於肌肉倍增蛋白質及SPARC之研究中，並無關於飼料轉換率(飼料投餵重量/體重增加重量)之報導，於養殖業中，除了肌肉增加外，飼料轉換率亦是成本控制之重要關鍵，業界仍需要開發可降低飼料轉換率之方法，以提高養殖的養成速度。

本發明關於一種於脊椎動物體中降低飼料轉換率之方法，其可提高養殖的養成速度，縮短上市的時間，降低飼料轉換率及養殖期間可能發生的風險。

本發明提供一種於脊椎動物體中降低飼料轉換率之方法，其包含抑制富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白之功能，其中飼料轉換率係定義為(飼料投餵重量)/(體重增加重量)。

較佳地，根據本發明之方法進一步包含施予該脊椎動物肌肉倍增蛋白質、肌肉倍增蛋白質之片段或抗肌肉倍增蛋白質或其片段之抗體。

本發明提供一種於脊椎動物體中降低飼料轉換率之方法，其包含抑制富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白之功能，其中飼料轉換率係定義為(飼料投餵重量)/(體重增加重量)。

較佳地，根據本發明之方法進一步包含施予該脊椎動物肌肉倍增蛋白質、肌肉倍增蛋白質之片段或抗肌肉倍增蛋白質或其片段之抗體。

根據本發明之方法可適用於各種脊椎動物體中；較佳地，根據本發明之方法適用於魚體；更佳地，該魚體係為硬骨魚綱(Osteichthyes)，目前包括斑馬魚、大西洋鮭魚、莫三比克吳郭魚、條紋鱸魚、金頭鯛魚、虹鱒、河鳟、河鯰、點帶石斑魚及日本真鱸的肌肉倍增基因已被選殖出，且其胺基酸序列具有高度保留性，推測應具有相同之功能；尤佳地，該魚體係為硬骨魚綱鱸行目(Perciforms)； 尤佳地，該魚體係為硬骨魚綱鱸行目鮨科(Serranidae)；尤佳地，該魚體係為硬骨魚綱鱸行目鮨科石斑亞科(Epinephelinae)；尤佳地，該魚體係為硬骨魚綱硬骨魚綱鱸行目鮨科石斑亞科石斑屬(Epinephelus)；最佳地，該魚體係為點帶石斑魚(Epinephelus coioides)。

根據本發明之方法係利用抑制富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白及/或肌肉倍增蛋白質之功能以提高脊椎動物之飼料轉換率，其可針對基因、轉錄反應、轉譯反應、蛋白質活性及訊息傳導路徑等各階段以抑制富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白及/或肌肉倍增蛋白質之功能，本發明所屬技術領域中具通常知識者可選擇適當之操作以抑制富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白及/或肌肉倍增蛋白質之功能，例如利用基因剔除方法去除基因體中之富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白及/或肌肉倍增基因、利用反義核苷酸或是RNA干擾抑制mRNA、抑制富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白及/或肌肉倍增蛋白質本身之活性或是抑制受器蛋白之作用。較佳地，富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白及/或肌肉倍增蛋白質之功能係藉由免疫抑制法而抑制，其係利用抑制蛋白質活性之方式抑制其功能，可對脊椎動物產生較小之系統性副作用。

於本發明之一較佳具體實施例中，免疫抑制法係給予脊椎動物富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白及/或肌肉倍增蛋白質、富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白及/或肌肉倍增蛋白質之片段或抗富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白及/或肌肉倍增 蛋白質或其片段之抗體。較佳地，該富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白及/或肌肉倍增蛋白質之片段係為抗原性片段。本發明所屬技術領域中具通常知識者可選殖得編碼富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白及/或肌肉倍增蛋白質之基因，表現該蛋白或其抗原性片段，並將其免疫至動物體內，而得到該抗富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白及/或肌肉倍增蛋白質之抗體或其抗原性片段之抗體。根據本發明之抗體可藉由將富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白及/或肌肉倍增蛋白質或其抗原性片段免疫其他動物，並純化出抗體而得，或是直接將富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白及/或肌肉倍增蛋白質或其抗原性片段免疫脊椎動物體，使該脊椎動物體本身產生抗體。根據本發明之抗體可為多株抗體或單株抗體，較佳地，該抗體係為多株抗體。

本發明所言之「抗原性片段」係指一蛋白質抗原中，可引起免疫反應產生抗原之片段，其可經由結構預測或是選取蛋白質片段觀察免疫動物之免疫反應而得該片段。

肌肉倍增蛋白質在序列上與其他TGF-β家族成員具高相似度，包括三個部分：(1)N端疏水區域，作為蛋白分泌釋出的訊息；(2)具高度保留性的蛋白切割位置RXRR(序列辨識編號2)；(3)半胱胺酸豐富的C端活性區域(Sharma等人，1999，Journal of cellular physiology 180；1-9)。許多報告證實，脊椎動物的肌肉倍增蛋白質之胺基酸序列在C端活性區域具有高度保留性(McPherror等人，1997，Nature 387；83-90)。目前針對肌肉倍增蛋白質之研究中(Whittemore等人，2003，Biochemical and Biophysical Research Communications 300；965-971)，發現一對肌肉倍增蛋白質具高度專一性的單株抗體JA16，分析與肌肉倍增蛋白質結合位置，發現其結合位是位在小鼠肌肉倍增蛋白質C端的15個胺基酸DFGLDCDEHSTESRC(SEQ ID No: 1)，可知該C端區域為抗原性片段，故較佳地，該肌肉倍增蛋白質之抗原性片段為肌肉倍增蛋白質之C端區域；更佳地，該肌肉倍增蛋白質之C端區域具有如SEQ ID NO: 1所示之序列。

另一方面，由於抗原性片段係為小片段胜肽，若直接將此小片段的抗原免疫動物時，免疫反應可能不令人滿意，較佳地，建構含有多個重複數之線性重複排列抗原(Linear array epitopes，LAE)，以提高免疫反應。此外，亦可利用細菌毒素以幫助輸送抗原，將已去除毒素活性之毒素作為運載系統，利用該毒素的特性，提升整體的免疫效果。較佳地，根據本發明之線性重複排列抗原係與綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas exotoxin A，PE)區域Ia融合。綠膿桿菌外毒素的分子量為66 kDa，含有613個胺基酸，其蛋白結構主要有三個區域，其中之區域Ia(胺基酸1-252)為受體結合區，負責和哺乳動物細胞膜上的α2-巨型球蛋白/低密度脂蛋白細胞受體(α2-macroglobulin/low density lipoprotein receptor，LDLR)結合後，再經由細胞內吞作用(Receptor-mediated endocytosis)進入細胞的內膜體中，利用綠膿桿菌外毒素已證實能有效增強誘導免疫反應(Donnelly等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90；3530-3534)。

於本發明之一較佳具體實施例中，該富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白及/或肌肉倍增蛋白質、富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白及/或肌肉倍增蛋白質之片段或抗富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白及/或肌肉倍增蛋白質或其片段之抗體係包含於一飼料組合物中。

於本發明之一較佳具體實施例中，該富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白及/或肌肉倍增蛋白質、富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白及/或肌肉倍增蛋白質之片段或抗富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白及/或肌肉倍增蛋白質或其片段之抗體係生物包埋於一豐年蝦體中。豐年蝦係經常作為飼料而容易施予至魚體中。較佳地，該豐年蝦係為豐年蝦幼蟲；更佳地，該豐年蝦幼蟲係冷凍乾燥為粉末。

於本發明之一較佳具體實施例中，該富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白及/或肌肉倍增蛋白質、富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白及/或肌肉倍增蛋白質之片段或抗富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白及/或肌肉倍增蛋白質或其片段之抗體係以注射方式施予。

於本發明之一較佳具體實施例中，與控制組比較，以免疫抑制富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白功能可有效降低飼料轉換率超過約5%；更佳係自約8%至約40%。

茲以下列實例予以詳細說明本發明，唯並不意味本發明僅侷限於此等實例所揭示之內容。

實例

實例1：免疫抑制富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白

動物實驗

控制組及實驗組共48隻點帶石斑魚，重量平均70±10g、長度平均五到六吋，實驗過程約五個月。設計的抗原主要是由使用引子1(SEQ ID NO: 3)及引子2(SEQ ID NO: 4)擴增sparc基因。其主要以一個單位(19個胺基酸長度)或六個單位的SPARC抗原，前端接有綠膿桿菌外毒素區域Ia，經由腹腔注射入石斑魚體內。將等量的抗原蛋白和弗氏完全佐劑均勻混合後，進行石斑魚免疫注射，每隻免疫注射抗原蛋白量為40μg，組別分別為注射PBS和PEIa(包含綠膿桿菌外毒素區域Ia)兩組對照組，以及PEIaS1E(包含綠膿桿菌外毒素區域Ia及一個單位的SPARC抗原)和PEIaS6E(包含綠膿桿菌外毒素區域Ia及六個單位的SPARC抗原)兩組實驗組。分別在第一次免疫注射後的第1、2、4、6、8及12週進行補強注射，另外在免疫前以及免疫的同時，蒐集魚血液，血液經過靜置20~40分鐘後凝固，利用離心法處理後取其血液上清液以進行酵素免疫分析，測驗血液中對抗內生性蛋白抗體之力價。

酵素免疫分析法

利用抗原抗體專一性結合之原理，首先將1 μg(100μL) SPARC-His重組蛋白片段與附著緩衝液混合均勻，並加入96孔Nunc-Immuno^TM盤(NUNC^TM)底部於4℃靜置隔夜，使蛋白結合至底盤，以PBST洗滌3次後，加入100 μL、含有5%脫脂牛奶的TBST溶液中於室溫下反應1小時，再以PBST洗滌至少3次，將以PBST稀釋的待測血清作為一級抗體，加入後於室溫靜置約2~3小時，以PBST洗滌至少3次，接著加入二級抗體的老鼠抗石斑魚血清100 μL靜置室溫下1小時，以PBST洗滌至少3次，最後加入100 μL後方接有鹼性磷酸酶的羊抗鼠血清作為三級抗體，於室溫靜置1小時後以PBST洗滌，最後每孔各加入50 μL受質溶液p-硝基苯磷酸鹽(p-Nitrophenyl phosphate)錠於室溫下靜置30分鐘(視呈色情況而定)，再以酵素細胞分析儀中讀取OD₄₀₅的吸光值。

分別於免疫石斑魚之前，以及免疫石斑魚之後一週、二週、四週、六週、八週、十週、十二週、十四週、十六週、二十一週，抽取石斑魚血液，分離出血清之後利用酵素免疫分析法，檢測注射含有SPARC抗原性片段之重組融合蛋白後，各時期的石斑魚血清對於抗重組石斑魚SPARC蛋白活性區域的抗體力價(圖1)，可發現其抗體力價自免疫後第二週開始被偵測到，至第六週時PEIaS1E、PEIaS6E的抗體力價都有明顯上升，而在第八週的補強注射後，在十二週時又補強注射一次，抗體力價再往上升，到第十四週的時候達到最高，實驗組PEIaS1E和PEIaS6E的抗體力價均較控制組PEIa為高，其中又以PEIa6E組的抗體力價上升最為明顯，抗體力價達到大約700。而另一個注射PBS的控制組，其石斑魚血清之抗體力價則從未被偵測到(圖1)。

飼料轉換率

計算五個月的動物實驗期間之總飼料消耗量以及飼料轉換率，統計結果PEIaS1E、PEIaS6E實驗組於五個月內消耗總飼料量為2750克、2867克，PBS以及PEIa兩控制組消耗總飼料為2639克、2806克，實驗組比PBS控制組消耗總飼料多，但和PEIa實驗組沒有明顯差別；進一步的統計飼料轉換率(FCR)，統計結果發現PEIaS1E、PEIaS6E實驗組平均飼料轉換率為2.75、1.7791，PBS以及PEIa兩控制組分別為3.0686以及2.806(如表1所示)，其結果顯示與PBS對照組相比，施予PEIaS1E有效降低約10%FCR，及施予PEIaS6E可有效降低約42% FCR。即施打SPARC抗原性片段之實驗組，在上市前之養成過程可花費較少的飼料。

實例2：免疫抑制肌肉倍增蛋白質

製備表現肌肉倍增蛋白質抗原性片段重組蛋白的大腸桿菌

建立35L發酵培養製程，將含有抗原性片段之大腸桿菌BL21(DE3)菌株培養於50L發酵槽。將4管5 mL經LB/氨芐青黴素(Ampicillin)培養基於37℃培養隔夜，並將培養菌株分別接種至0.2 L之LB/氨芐青黴素培養液中，共1L，於37℃震盪培養至OD₆₀₀約0.3，再加入35 L的培養液中培養，每隔1小時取樣測定其OD₆₀₀監測其生長曲線變化情形。進一步依其生長曲線變化選出適當的時間點，加入最终濃度0.1 mM IPTG以誘導大腸桿菌大量表現融合蛋白，並於37℃震盪培養3小時後離心收取菌體。融合蛋白的表現情形則經由SDS-PAGE及西方點墨法(western blotting)確認之，以確認較佳35 L發酵條件。

製備豐年蝦生物包埋口服疫苗

豐年蝦的孵化：稱取4克的豐年蝦乾燥卵，置入250 mL燒杯中，加入150 mL淡水浸泡約半小時。以網篩過濾豐年蝦耐久卵並以適量淡水沖洗乾淨。將豐年蝦耐久卵加入5公升孵化液中，均勻散佈。將打氣石置入並開始打氣，調節進氣體積約為每分鐘500立方公分(維持溶氧大於2 ppm)。打開照明設備，室溫及水溫保持在26至28℃之間。24小時後關掉打氣並將照明移至容器底部，將豐年蝦幼蟲利用趨光性誘引至容器底部，靜置5分鐘，此時未孵化卵及孵化之空卵殼會漂浮置水面，利用虹吸管原理或其他可吸水之器具將上浮卵殼吸除之。將孵化之一齡幼蟲以網篩(孔徑120微米μm)輕柔過濾，以海水輕輕沖洗後更換2公升新的孵化液。輕柔攪拌孵化液使豐年蝦幼蟲均勻散佈，吸取一毫升孵化液滴入1毫升方格計數盤中，為避免幼蟲的擾動，可以放置在50℃加熱盤上加熱十分鐘殺死幼蟲，方便計數。計數時將計數盤置於解剖顯微鏡下，放大倍率設為60~100倍觀察。此計數盤上有劃線1000小格，計算方式可隨機選取選取10×10小格(0.1毫升幼蟲數)計算幼蟲隻數，以同樣方法重覆計算盤上其他位置數量後取平均數，再乘以10倍即為每毫升幼蟲數，或是可以將盤上所有幼蟲全部計數亦可。根據計算結果，調整豐年蝦密度至每毫升約為500隻。將打氣石置入並開始打氣，調節進氣體積約為每分鐘300至400立方公分(維持溶氧大於2 ppm)。室溫及水溫保持在26~28℃之間，培養12至18小時後，豐年蝦將會進行第一次脫殼而長成二齡幼蟲，此時即可以進行生物包埋步驟。

生物包埋：將大腸桿菌以1000×g離心沉降。倒除多餘的培養基，並用等量的PBS將菌體重新懸浮，洗去菌體上多餘培養基。再以1000×g離心一次，用適量的PBS重新懸浮菌體，製備成濃度為1×10¹⁰ cfu/mL之菌液。殺菌方法為加熱殺菌法，將菌液置於65℃水浴槽中加熱10分鐘，殺菌完畢後置於冰上10分鐘。將豐年蝦二齡幼蟲分裝為所需要的體積，接著將準備好的菌液加入其中，使大腸桿菌終濃度約為1×10¹⁰ cfu/mL，適度打氣2小時。

包埋結果確認：採樣前先將打氣關掉，吸取2毫升豐年蝦包埋液至小網篩上並以大量清水沖洗。將豐年蝦幼蟲吸出移入離心管中。將微量離心管置於-20度冰箱10分鐘將豐年蝦幼蟲凍死後取出，倒在九公分培養皿中並加入少許無菌水將豐年蝦幼蟲均勻散佈，接著以微量吸管吸取500隻二齡幼蟲至微量離心管中，以3000 rpm離心使幼蟲集中在離心管底部並將離心管中的水分吸除，再吸取100 μL無菌水加入離心管中。以微量研磨棒將豐年蝦幼蟲於微量離心管中小心並仔細磨碎。並進行SDS-PAGE及西方點墨法分析。

動物實驗

實驗動物共分為四組：實驗組PEIa-抗原性片段組，控制組分別為：餵飼一般飼料、餵飼含豐年蝦飼料及餵飼含包埋PEIa片段豐年蝦飼料三組，共40隻點帶石斑魚，重量平均約157 g、長度平均五到六吋，實驗過程約四個月。每個星期一、二、三餵食含抗原飼料，四、五、六餵食一般飼料，星期日禁食，另外在免疫前以及免疫後每二個禮拜，蒐集魚血液，血液經過靜置20~40分鐘後凝固，利用離心法處理後取其血液上清液以進行酵素免疫分析，測驗血液中對抗內生性蛋白抗體之力價。

含豐年蝦飼料製作

將已經濾食或未濾食的二齡豐年蝦之水分盡量去除，利用冷凍乾燥機將之凍乾成粉末，豐年蝦粉末與一般粉碎飼料以1：1000比例進行混合再重新製粒。

飼料製作

將菌液濃縮，利用冷凍乾燥機將之凍乾成粉末，菌粉與一般粉碎飼料進行混合，混核比例為1g飼料混3.3×10⁹ cfu大腸桿菌粉，再重新製粒。

結果

豐年蝦組

首先抽取石斑魚血液，分離出血清之後利用酵素免疫分析法，檢測餵飼含有肌肉抑制素抗原性片段之重組融合蛋白後，各時期的石斑魚血清對於抗重組石斑魚肌肉倍增蛋白質C端抗原活性區域的抗體力價。抗體力價於免疫後第十週開始被偵測到，持續上升至第十六週，其中PEIa-抗原性片段組的抗體力價較三組控制組：餵飼一般飼料、餵飼含豐年蝦飼料及餵飼含包埋PEIa片段豐年蝦飼料為高，抗體力價達到大約920。(如圖2)

計算四個月的動物實驗期間之總飼料消耗量以及飼料轉換率，統計發現PEIa-抗原性片段組與其他三組控制組於四個月內消耗總飼料量大約相等，PEIa-抗原性片段組平均飼料轉換率為1.35，餵飼一般飼料、餵飼含豐年蝦飼料及餵飼含包埋PEIa片段豐年蝦飼料分別為1.72，1.76以及1.82，即餵飼肌肉倍增蛋白質抗原性片段之實驗組，在上市前之養成過程可花費較少的飼料得到肉質較豐腴的石斑魚(如表2所示)。

上述實施例僅為說明本發明之原理及其功效，而非限制本發明。習於此技術之人士對上述實施例所做之修改及變化仍不違背本發明之精神。本發明之權利範圍應如後述之申請專利範圍所列。

<110>　國立成功大學

<120>　降低飼料轉換率之方法

<130>　無

<160>　4

<170>　PatentIn version 3.3

<210>　1

<211>　15

<212>　PRT

<213>　小鼠

<400>　1

<210>　2

<211>　4

<212>　PRT

<213>　小鼠

<220>

<221>　X

<222>　(1)..(4)

<223>　X為任何之胺基酸殘基

<400>　2

<210>　3

<211>　34

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工引子

<400>　3

<210>　4

<211>　35

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工引子

<400>　4

圖1為石斑魚經免疫抑制富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白之血清抗體力價圖。

圖2為石斑魚經免疫抑制肌肉倍增蛋白質之血清抗體力價圖。

(無元件符號說明)

Claims (11)

1. 一種經口服於脊椎動物體中降低飼料轉換率之方法，其包含施予該脊椎動物富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白或富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白之片段，抑制富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)之功能，其中飼料轉換率係為(飼料投餵重量/體重增加重量)。
2. 根據請求項1之方法，其中脊椎動物係為魚。
3. 根據請求項1之方法，其包含免疫抑制富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白之功能。
4. 根據請求項1之方法，其進一步抑制肌肉倍增蛋白質之活性。
5. 根據請求項4之方法，進一步包含施予該脊椎動物肌肉倍增蛋白質、肌肉倍增蛋白質之片段或抗肌肉倍增蛋白質或其片段之抗體。
6. 根據請求項1或5之方法，其中該富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白之片段或肌肉倍增蛋白質之片段係融合至綠膿桿菌外毒素區域Ia。
7. 根據請求項1或5之方法，其中該富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白、富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白、肌肉倍增蛋白質、肌肉倍增蛋白質之片段或抗肌肉倍增蛋白質或其片段之抗體係生物包埋於一豐年蝦體中。
8. 一種組合物用於脊椎動物體中降低飼料轉換率之用途，該組合物包含富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白或富含半胱 胺酸的酸性分泌蛋白之片段。
9. 根據請求項8之用途，該組合物進一步包含該脊椎動物肌肉倍增蛋白質、肌肉倍增蛋白質之片段或抗肌肉倍增蛋白質或其片段之抗體。
10. 根據請求項8或9之用途，其中該富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白、富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白、肌肉倍增蛋白質、肌肉倍增蛋白質之片段或抗肌肉倍增蛋白質或其片段之抗體係生物包埋於一豐年蝦體中。
11. 根據請求項8或9之用途，其中該富含半胱胺酸的酸性分泌蛋白之片段或肌肉倍增蛋白質之片段係融合至綠膿桿菌外毒素區域Ia。