WO2019179361A1 - 改善括约肌闭锁不全的组合物及其医药组成物与用途 - Google Patents
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Abstract
提供一种改善括约肌闭锁不全的组合物,其由一基质添加物以及一重组蛋白所组成。通过该组合物,以达成减少括约肌萎缩、促进括约肌增长、括约肌恢复或维持括约肌的效果。
Description
本发明关于一种组合物,特别是指一种改善括约肌闭锁不全的组合物;本发明另关于一种组合物的用途,特别是指一种用于制造改善括约肌闭锁不全的药物的用途。本发明另关于一种医药组成物,特别是指一种改善括约肌闭锁不全的医药组成物。
大便失禁(fecal incontinence)是影响健康个体心理和社交能力的疾病之一。研究报告显示,一般人群中大便失禁的患病率约为2%至3%。Nelson及其同事发现威斯康星州小区居民的患病率为2.2%。在其研究中,总共调查了6959人,其中30%的人年龄超过65岁且63%是女性。在另一项研究中,Johanson和Lafferty在访问初级保健医生或胃肠病学家时观察到个体的总体患病率为18.4%,但只有三分之一的人曾与医生讨论过这个问题。在养老院环境中,大便失禁的患病率接近50%并且可能是入院的主要原因。
女性大便失禁率包括立即的产后失禁以及长期产后失禁。在阴道或剖腹产分娩后3至6个月,多达13%至25%的女性患有大便失禁。在一项针对6000名女性(年龄30至90岁)的产后调查中,大便失禁的患病率(定义为至少每月失去液体或实体粪便)为7.2%。老年人、严重抑郁症、尿失禁(urinary incontinence)、医学合并症和手术阴道分娩与大便失禁的机率显著相关。
大便失禁的经济成本很高,每年超过4亿美元花费在用于控制尿失禁和大便失禁的成人尿布上,这也是美国长期护理机构入院的第二大原因。对于需要治疗和矫正的年轻患者中,成本也惊人地高。在1996年针对63例因产科损伤继发大便失禁患者的研究中,每名患者的平均治疗费用为17,166美元。在1998年至2003年期间,约有21,000名妇女因大便失禁接受了住院手术(每年约3500名妇女),总费用从1998年的3400万美元逐渐增加到2003年的5750万美元。2003年每次手术入院的平均费用为16,847美元
2015年,国家糖尿病和消化和肾脏疾病研究所(National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases,NIDDK)研讨会上发表了2013 年大便失禁的流行病学、病理生理学、治疗和分类的摘要。
大便失禁是一种综合症,涉及无意中失去固体或液体粪便。而真正的肛门失禁是肛门括约肌丧失控制,导致粪便或气体不必要或不合时宜的释放。这必须与导致粪便通过肛门的其他条件区分开来。
大便渗漏(stool seepage)所造成的内衣污垢可能是痔疮、皮肤赘瘤增大(enlarged skin tags)、卫生条件差、肛门内廔(fistula-in-ano)和直肠粘膜脱垂(rectal mucosal prolapse)造成的。
其他导致肠道控制不良的病症像是发炎性肠病(inflammatory bowel disease)、泻药滥用(laxative abuse)、寄生虫感染和毒素。
大便急迫(fecal urgency)必须和大便失禁分开来看,因为急迫可能与肛门括约肌破坏(anal sphincter disruption)以外的医学问题有关。
该研究的重点将放在肛门失禁患者身上,其定义是至少4岁已能控制的个体中,大便或气体在至少1个月的持续时间内不受控制的通过肛门。
药物治疗:
1.大便失禁的保守治疗方案包括填充剂和生物回馈(biofeedback)。药物治疗的目标是减少大便次数和改善大便稠度。通过简单的保守措施,通常可以改善轻度失禁(mild incontinence)。对于罕见且低容量粪便的患者而言,填充剂是有帮助的,因为成形的粪便比液体粪便更容易控制。另外,对于软便或液体粪便失禁的患者来说,通过摄入填充剂来限制流体以使粪便固定成形可能是有用的治疗方法。
2.生物回馈是一种安全、微创技术,其使用听觉或视觉回馈来重新培养骨盆底肌肉组织。尽管已经使用了许多不同的疗法,但是一些研究表明通过生物回馈治疗显著改善了大便失禁。其他包括最近的Cochrane评论显示生物回馈没有提供治疗益处的明确证据。最常用的技术是直肠敏感性训练(rectal sensitivity training)以及肛门括约肌力量训练(anal sphincter strength training)。
3.生物回馈需要一些直肠感觉和自动收缩括约肌的能力,这似乎对神经源性(neurogenic)和特发性(idiopathic)肛门失禁以及与肛门括约肌破坏有关的尿失禁有效,但最近的Cochrane评论未显示出确定的治疗益处,且生物回馈的结果也会随着时间的推移而减少。
手术治疗:
1.注射用有机硅已被证明是有效的。在一项对82名患有严重大便失禁和肛门内括约肌功能障碍引起的肛门静息压低(low anal resting pressure)的患者研究中,患者被随机分配到A组(n=42)或B组(n=40),在A组的括约肌间隙和肛门内括约肌内通过肛门内超音波引导注射硅胶(B组也注射硅胶但未通过超音波引导)。结果显示,追踪12个月,两组患者的大便失禁均有显著改善,但在超音波引导下的A组注有更大程度改善,且没有发生严重的并发症。但临床上有病例显示若外注射物持续存在,有时可能造成穿孔或局部黏膜溃烂的病例。
2.碳包覆微珠(carbon-coated microbeads)的结果不太有希望。在一项对33名患者进行的初步研究中,可通过黏膜下注射碳包覆微珠以增加肛门压力改善了轻微的大便失禁,但没有显著改善生活质量。注射胶原蛋白的试验更加有限。
3.
(Oceana Therapeutics,Inc.)是一种填充剂,由玻尿酸稳定的葡萄聚糖(dextranomer)组成,2011年被FDA批准用于治疗其他保守治疗失败的患者的被动性大便失禁(passive fecal incontinence)在欧洲和加拿大,它被称为NASHA Dx或
葡萄聚糖/玻尿酸是一种可用于肛门黏膜下注射的生物兼容性填充剂。将四次1ml注射剂施予于肛管高压区近端部分的深层黏膜下层,在齿状线(dentate line)上方约5mm处。如果在至少4周后效果不显著,则可以第二次重复治疗。通过扩张肛门组织,使近端肛管变窄,从而防止粪便泄漏。葡萄聚糖/玻尿酸注射剂可以在门诊中给药而无需麻醉。
最近的研究显示,超过一半的患者在6个月时粪便失禁发作次数减少了约50%,且效果持续长达3年。此外,患者在使用葡萄聚糖/玻尿酸注射剂后,大便失禁生活质量量表(fecal incontinence quality of life scale)的大多数领域从基线(baseline)有显著改善。保守治疗失败后比较葡萄聚糖/玻尿酸注射剂和荐神经刺激(sacral nerve stimulation)的3年成本效益模型显示,葡萄聚糖/玻尿酸注射剂具有成本效益,比荐神经刺激更有效地用于治疗大便失禁。
4.2005年,
治疗大便失禁的程序包括:最终治疗或短期方案。肛门内括约肌射频(radiofrequency,RF)能量的应用。理论上,RF引起的肛门 内括约肌损伤应理想地导致胶原沉积(collagen deposition)和纤维化(fibrosis)并可能收紧受影响的区域。临床上是利用纤维化产生缩小肛门口的效果,其缺点是困难重复治疗至完全复原,病人必须忍受较长时间的痛苦。
肌生成抑制素(myostatin)的基因序列与转化生长因子(transforming growth factor β,TGF-β)家族其他成员高度相似。肌生成抑制素的基因结构包括有三部分︰(1)作为蛋白质分泌释放信号的N端疏水结构域;(2)高度保守的蛋白质切割位置RXRR;以及(3)富含半胱氨酸(cysteine)的C端活性结构域。许多研究报告指出,脊椎动物中肌生成抑制素的胺基酸序列在C端活性结构域具有高度的保守性。现有研究提出对肌生成抑制素具有高特异性的单株抗体JA16(Whittemore et al.,2003,Biochemical and Biophysical Research Communications300:965-971),通过分析肌生成抑制素的结合位置,发现结合位置位在小鼠肌生成抑制素C端15个胺基酸DFGLDCDEHSTESRC,从而可知C端结构域为抗原片段(antigenic fragment)。
然而,目前施予肌生成抑制素的抗体皆会产生全身性的反应,如Camporez等人于2016年的文献指出,局部注射抗肌生成抑制素抗体后,使年老的小鼠全身性的肌肉增长,进而使全身重量增加。此外,针对肌生成抑制剂ACE-031(myostatin inhibitor)于2010年的临床试验结果显示虽可用于增加全身肌肉及加强肌肉力量,但受试者分别出现自发性出血(spontaneous bleeding)、流鼻血(nosebleeds)、皮肤微血管扩张(small expansion of blood vesselsin skins)或头痛(headaches)等副作用,因此该临床试验不得不因负面现象(negative phenomena)而于2011年中止试验;尤其抗体会引起受体免疫系统的全身性作用,诸如过敏反应、寒颤、腹泻、恶心呕吐、皮肤瘙痒等症状。此外,如H.N.Peiris于2012年的文献[Placenta 33(2012 902-907)]指出,在“双重肌肉”基因型(double-muscling)的牛种中,产犊(calving)和生育(fertility)都存在困难;然而在myostatin基因缺乏的小鼠(Mstn
-/-)却是可生育的(fertile);由此推测,肌肉生长抑制素可能与妊娠期促成胎盘及其功能有关。
中国台湾发明专利I540968揭露含有肌肉倍增片段与绿脓杆菌外毒素区域Ia片段融合形成多肽片段或抗体,其中绿脓杆菌外毒素片段的目的在于有效增强诱导免疫反应;然而,就所属领域技术人员所知,绿脓杆菌在细菌生 产过程中可能会产生内涵体(inclusion body),因此萃取片段或抗体时需要额外添加尿素(urea)去破坏细胞而导致尿素残留,以及重新折迭(refolding)片段而可能影响蛋白质功能;更重要的是,该篇专利所揭露的效果仍是全身性的反应,因此,现有技术的肌生成抑制素抗体仍有改善的空间。
另外,目前研究显示,金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分泌的肠外蛋白(enterotoxin)可被分为A、B、C1、C2、D、E和F等几种类型,其中金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxin)SEA、SEB、SEC1及SEC2)的肠毒素蛋白分子量都相近似且在结构上有较高的类似性,故皆会引起全身性的免疫反应并具有相同的临床症状,如发烧、血压升高等较大的副作用。
发明内容
为了克服现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种组合物,以达成改善括约肌闭锁不全的效果。
本发明关于一种改善括约肌闭锁不全的组合物,其由一基质(matrix)添加物以及一重组蛋白所组成,其中该重组蛋白包含一第一多肽以及一第二多肽,其中该第一多肽如SEQ ID NO:8所示具有相似度至少90%以上的序列,该第二多肽,其包含如SEQ ID NO:14所示序列1至10个重复单元(repeat units)。
较佳的,所述的基质添加物具有生物兼容性(biocompatibility)或生物可分解性(biodegradable)。
更佳的,所述的基质添加物包含,但不限于蛋白质、多醣(polysaccharide)、醣蛋白(glycoprotein)或其任意组合;其中,蛋白质包含,但不限于胶原蛋白(collagen)或明胶(gelatin);多醣包含,但不限于几丁质(chitosan)、琼脂(agar)或糖胺聚醣(glycosaminoglycan)。
更佳的,所述的糖胺聚醣包含,但不限于硫酸软骨素、硫酸皮肤素(dermatan sulfate)、硫酸角质素(keratan sulfate)、肝素(heparin)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)或玻尿酸(hyaluronic acid)。
更佳的,所述的糖胺聚醣为玻尿酸。
其中,该重组蛋白可被上述的基质添加物(例如:玻尿酸)包裹(enclosed)或包覆(coated),而封入(enclosure)形成一聚合物(polymer)或球状物 (globular)。在括约肌施予部位中,玻尿酸除了能作为维持括约肌原有形状的填充物外、玻尿酸也能保持一特定量的药物及使得药物能缓慢释放于施予部位并发挥药效。
较佳的,所述的第二多肽为纵列重复单元(tandem repeated units)的线性排列重复抗原(linear array epitope,LAE),其中该第二多肽为如SEQ ID NO:14所示序列1至10个重复单元。
较佳的,所述的第一多肽在SEQ ID NO:8所示序列中包括四个胺基酸位点突变。
更佳的,所述的四个胺基酸位点突变对应于如SEQ ID NO:8所示序列的位点7、9、13及105的位置。
更佳的,所述的四个胺基酸位点突变对应于位点7具有T或L、位点9具有G或E、位点13具有Y或V及位点105具有H或Y。
较佳的,所述的第一多肽选自由如SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11及12所示序列所组成的群组。
在另一个态样中,所述的重组蛋白更包含一连接符,其介于该第一多肽以及该第二多肽之间;其中该重组蛋白的序列如SEQ ID NO:17所示。
在另一个态样中,所述的重组蛋白自N端至C端排列顺序包括,但不限于,一个第一多肽与一个第二多肽、一个第一多肽与多个第二多肽、一个第二多肽与一个第一多肽、或多个第二多肽与一个第一多肽。
在一个较佳的制备例中,该第一多肽与该第二多肽可选自以下例示:
本发明另关于一种改善括约肌闭锁不全的组合物,其由一基质(matrix)添加物以及一重组蛋白所组成,其中所述的重组蛋白包含一金黄色葡萄球菌肠毒素多肽以及一肌生成抑制素多肽。
较佳的,所述的金黄色葡萄球菌肠毒素的多肽选自于由金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C1、C2、D、E、F、G及H所组成的群组。
SEC2具有27kDa的分子量,含有239个胺基酸。甫经转录的SEC2为266个胺基酸的蛋白质,分子量计为30kDa;于丙氨酸27处切断SEC2多肽可产生成熟毒素,其含有239个胺基酸,分子量计为27kDa。通过N端多肽定序可确定SEC2中的讯息多肽切割位置并确认成熟毒素的N端,藉此可证明SEC2能够有效地增强所引发的免疫反应。更佳的,所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2序列的多肽序列与SEQ ID NO:8中所示序列具有至少90%以上的序列一致性,举例而言,对应于SEQ ID NO:8所示序列中选自由位点7具有T或L、位点9具有G或E、位点13具有Y或V及位点105具有H或Y所组成的群组。
较佳的,所述的肌生成抑制素多肽包含,但不限于生长分化因子8(growth differentiation factor 8,GDF8)、滤泡抑素(follistatin)或第二型活化素受体(activin receptor type-2B,ACTR-IIB)。
更佳的,所述的肌生成抑制素多肽包含,但不限于生长分化因子8如SEQ ID NO:13所示序列、滤泡抑素如SEQ ID NO:15所示序列或第二型活化素受体如SEQ ID NO:16所示序列。
较佳的,所述的肌生成抑制素的抗原决定位多肽为纵列重复单元(tandem repeated units)的线性排列重复抗原(linear array epitope,LAE)。
本发明所述的组合物具有缓慢释放的效果,可施予于括约肌周围,以改善括约肌闭锁不全的情形。
本发明更关于一种用于改善扩约肌闭锁不全的医药组成物,其包含如上 所述的组合物以及一药学上可接受的载剂。
在本文中,所述的“药学上可接受的载剂”包含,但不限于水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氢化合物(hydrocarbons)[诸如石油胶(petroleum jelly)以及白凡士林(white petrolatum)]、蜡(wax)[诸如石蜡(paraffin)以及黄蜡(yellow wax)]、保存剂(preserving agents)、抗氧化剂(antioxidants)、溶剂(solvent)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润滑剂(lubricant)、吸收增强剂(absorption enhancers)、活性剂(active agents)、保湿剂(humectants)、气味吸收剂(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH调整剂(pH adjusting agents)、闭塞剂(occlusive agents)、软化剂(emollients)、增稠剂(thickeners)、助溶剂(solubilizing agents)、渗透增强剂(penetration enhancers)、抗刺激剂(anti-irritants)、着色剂(colorants)、推进剂(propellants)、表面活性剂(surfactant)、佐剂(adjuvant)及其他类似或适用本发明的载剂。
在本文中,所述的“佐剂”包括,但不限于明矾沉淀、弗朗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant)、弗朗式不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant)或单磷氧基-脂质A/海藻糖(monophosphoryl-lipid A/trehalose dicorynomycolate)佐剂。
较佳的,所述的医药组成物的剂型包含,但不限于注射剂、胶凝剂(gelling agent)、填充剂或缝线。
本发明关于一种改善括约肌闭锁不全的用途,其将如上所述的组合物用于制造改善括约肌闭锁不全的药物,其将药物以有效剂量施予受体括约肌以达成改善括约肌闭锁不全的效果。
较佳的,所述的用途用于制造适用于幽门括约肌闭锁不全、贲门括约肌闭锁不全、回盲括约肌闭锁不全、口轮匝肌闭锁不全、阴道括约肌闭锁不全、尿道括约肌闭锁不全或肛门括约肌闭锁不全的药物。
在本发明的一个较佳实施例中,通过使用上述组合物或医药组成物以达成改善括约肌闭锁不全的效果,包括给予肌生成抑制素片段与SEC2的融合蛋 白,从而获得抗肌生成抑制素的特异性免疫细胞。本发明的免疫细胞可以由肌生成抑制素片段的抗原决定位引入其他动物中,并经过纯化或通过将免疫细胞或其抗原决定位加上基质添加物(诸如几丁质)引入哺乳动物体内,以使哺乳动物的局部能够改善括约肌闭锁不全。在本发明中,上述的免疫细胞可为多株B淋巴球或T细胞殖株;较佳的是,上述免疫细胞是调节型T细胞。
在本文中,用语“括约肌”是指动物体内管腔壁的一种环形肌肉,常见于消化道和泌尿系统,其包括,但不限于幽门括约肌(pyloric sphincter)、贲门括约肌(cardiac sphincter)、回盲括约肌(ileocecal sphincter)、口轮匝肌(musculus orbicularis oris)、阴道括约肌(vaginal sphincter)、尿道括约肌(urethral sphincter)或肛门括约肌(anal sphincter)。
在本文中,用语“括约肌闭锁不全”是指括约肌失去神经支配,无收缩功能,处于弛缓状态。
在本文中,用语“改善括约肌闭锁不全”是指减少括约肌萎缩、促进括约肌增长、括约肌恢复或维持括约肌。依据本案实施例所例示,是指通过施予特定浓度范围量的重组蛋白溶液与基质添加物能够促进肌纤维细胞生长速率以及肌纤维细胞分化,藉以达成减少括约肌萎缩、促进括约肌增长、括约肌恢复或维持括约肌的功效。
在本文中,用语“抗原决定位(epitope)”是指能够引发免疫反应以产生蛋白质抗原中的抗原的片段,其可以通过结构预测或通过选择蛋白片段来观察免疫动物的免疫反应。
在本文中,用语“有效剂量”指在剂量上及对于所需要的时间而言达成促进括约肌增长、减少括约肌萎缩、括约肌恢复或维持括约肌有效的量。
在本文中,用语“生物兼容性”指含有基质添加物的组合物或医药组成物接触受体后,组合物或医药组成物不会释放有毒物质,也不会造成局部或全身性细胞毒性、致癌性及生殖毒性,更不会引起发炎反应、免疫反应、毒性反应、血栓形成反应等危害。
在本文中,用语“生物可分解性”指含有基质添加物的组合物或医药组成物植入受体后,历经一段时间即会在受体内分解,且不会引起排斥现象。
由于该抗原决定位是小型多肽片段,如果以该小型多肽片段在动物中直接进行免疫,则免疫反应可能未尽理想。较佳的是,建构含有纵列重复单元 的线性排列重复抗原(LAE),以改善免疫反应。此外,可以使用细菌毒素来帮助抗原的传递,通过使用消除毒素活性的毒素作为运输系统,从而以毒素的性质来加强整体免疫效果。在一态样中,本发明的肌生成抑制素C端的抗原决定位的线性排列重复抗原与金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)融合。
一种宿主细胞包含该上述核酸是可被生产的。实施例包括大肠杆菌、昆虫细胞、植物细胞、酵母菌细胞及哺乳动物细胞。该核酸分子可以用于表达本说明书所述的多肽或融合蛋白,操作上可将该核酸分子连接至合适的载体的多种限制酶酵素切位(multiple cloning site,MCS)以产生所述的多肽或融合蛋白。
载体实施例包含一质体。该载体较佳的是包括启动子、增强子、多种限制酶酵素切位等,核酸分子连接至合适的载体的多种限制酶酵素切位后,该表达载体可以被导入该宿主细胞以产生本说明书所述的多肽或融合蛋白。该宿主细胞包括,但不限于大肠杆菌、百日咳杆菌、芽孢杆菌、非洲绿猴肾脏细胞、嗜血杆菌、真菌或酵母。
上述组合物或医药组成物适用的受体是脊椎动物。较佳的,脊椎动物是人、猪、牛、羊、犬、家禽或水禽等动物。由于肌生成抑制素已获选殖,且其胺基酸序列具有高度的保守性,因此可假定上述脊椎动物的肌生成抑制素具有相同的功能;更佳的,上述脊椎动物是人、猪、牛、羊或犬。
当本案所述的重组蛋白与基质添加物所形成的组合物或医药组成物施予受体局部括约肌部位,可通过组合物或医药组成物中的重组蛋白促进局部括约肌增长、减少括约肌萎缩,并通过组合物或医药组成物中的基质添加物达到填充萎缩空间,并促进括约肌恢复或维持括约肌的功效,进以使本发明所述的组合物及医药组成物达成改善括约肌闭锁不全的效果。
图1A为本发明以小鼠肌纤维细胞C2C12加入不同浓度几丁质的细胞生长曲线图。
图1B为本发明以小鼠肌纤维细胞C2C12加入不同浓度明胶的细胞生长曲线图。
图1C为本发明以小鼠肌纤维细胞C2C12加入不同浓度胶原蛋白的细胞生长曲线图。
图2A为本发明以不同浓度的JF101(3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、100ng/ml)及AICAR(0.5mM)处理已分化C2C12老鼠肌纤维细胞的电泳图。
图2B为本发明的图2A电泳图的量化柱状图。
图3为本发明以小鼠肌纤维细胞C2C12加入单独基质添加物(几丁质)或基质添加物(几丁质)与重组蛋白溶液(JF101)混合液的细胞生长曲线图。
图4为本发明以小鼠肌纤维细胞C2C12加入控制组、单独基质添加物(几丁质)、或基质添加物(几丁质)与重组蛋白溶液(JF101)混合液的细胞图,其中显微镜的放大倍率是40倍。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
制备例制备重组蛋白
对照组和实验组共使用8周龄的10只小鼠,实验时间为28天。本制备例所采用的融合蛋白是采用大肠杆菌(E.coli)的pET表现系统表现的载体;较佳的,选用pET-28a。其中第一多肽「SEC2m」所示是金黄色葡萄球菌肠毒素C2具有点突变(point mutation),核酸序列如SEQ ID NO:1所示、蛋白质序列如SEQ ID NO:8所示(突变点于位点7具有L、位点9具有E、位点13具有V及位点105具有Y);第二多肽「Myo epitope」所示则为肌生成抑制素的抗原决定位,其为肌生成抑制素C端15个胺基酸(如序列SEQ ID NO:14所示;该序列具有高度的保守性,因此多个物种皆具有此序列)具有6个重复片段,其单一片段的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。位于pET载体多种限制酶酵素切位(multiple cloning site,MCS)内的基因序列从N端依序为「SEC2m」、连接符(linker)与「Myo epitope」,如序列SEQ ID NO:3所示。
建立35L发酵培养程序以在50L发酵罐中培养含有SEQ ID NO:3所示 的pET载体的大肠杆菌BL21(DE3)菌株。4管5ml菌株在37℃下用LB/氨芐青霉素(Ampicillin)培养基培养过夜,各菌株分别接种到0.2公升的LB/氨芐青霉素培养基中,共1公升,于37℃持续摇动培养至OD600为0.3。其后加入至35μl培养基中进行培养,并以每两小时取样测定OD600为以监测生长曲线的变化,并根据生长曲线进一步选择合适的时间点,加入最终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导大肠杆菌以高度表现融合蛋白,于37℃持续摇动培养3小时,离心回收菌株。通过SDS-PAGE电泳和西方墨点法测定融合蛋白的表现,以确定最佳35L发酵条件。大致上,是将大肠杆菌BL21(DE3)表达的融合多肽在细胞裂解后,进行该融合多肽的萃取与分离,最终获得一重组蛋白(如SEQ ID NO:17所示);由于该表现蛋白的萃取与分离属公知技术,在此不再赘述。
实施例1基质添加物对肌纤维母细胞的影响
以不同浓度几丁质、胶原蛋白与明胶以灭菌后的生理食盐水分别配制成不同浓度(1000ng/ml、100ng/ml、10ng/ml以及1ng/ml)的基质添加物溶液。将不同浓度的基质添加物溶液分别制成总体积为2500μl的混合溶液并滴在6孔盘中,于-20℃冰箱冷冻一晚后,放进冻干机冷冻干燥18小时以分别形成生物多孔结构,其中以不含基质的生理食盐水做为控制组。将小鼠肌纤维细胞C2C12以1×10
4cells分别加入well中,每24小时以染料排除试验(dye exclusion assay)方式计算细胞数目。
dye exclusion assay步骤如下:
利用胰蛋白酶(trypsin)将细胞自培养盘(dish)中分离,加入含FBS的培养液中和trypsin,离心除去上清液。再加入PBS清除杂质,混匀后离心。重新加入PBS,混合均匀。取100μl细胞悬浮液与0.4%w/v、100μl台盼蓝(trypan blue)等体积混合均匀形成混合液。将少许混合液(约15μl)加入血球计数盘或是自动粒子计数器(coulter counter)容室(chamber)上方凹槽,盖上盖玻片,于100倍倒立显微镜下观察,其中活细胞因细胞膜完整,染料无法渗入而不会被染色,死细胞则为蓝色。chamber上方盖上盖玻片后,每个大正方形的体积为1mm
2×0.1mm=1.0x10
-4ml。使用时,计数每个大正方形内的细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以10
4,即为每ml中的细胞数目。
如图1A所示,当基质添加物是几丁质时,不同浓度的几丁质组别和控制组相比,细胞生长速率并无差异;如图1B所示,当基质添加物是明胶时,不同浓度的明胶组别和控制组相比,细胞生长速率并无差异;如图1C所示,当基质添加物是胶原蛋白时,不同浓度的胶原蛋白组别和控制组相比,细胞生长速率并无差异。总言之,基质添加物无论是几丁质、胶原蛋白或是明胶皆不影响细胞生长,也不影响细胞生长速率。
实施例2重组蛋白诱导肌纤维细胞代谢(metabolism)
将小鼠肌纤维细胞(C2C12 myotubes)培养于含10%胎牛血清(FBS)、100unit/ml penicillon G、100μg/ml streptomycin的10cm培养皿中,并置于37℃恒温且含5%CO
2的细胞培养箱中,待细胞长至八九分满时,进行继代培养。首先,将细胞培养液抽干,以PBS(137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na
2PHO
4、2mM KH
2PO
4于一公升distilled H
2O中,pH 7.4)冲洗一遍后,加入1ml trypsin-EDTA作用3分钟,将细胞自培养皿切下,再以10ml含有FBS的DMEM培养基终止反应,收集细胞液至15ml离心管,以3000rpm离心5分钟,移除上清液,加入1ml含有FBS的DMEM培养基均匀混合,取150μl加入含有10ml培养基的10cm培养皿中;剩余细胞液则培养新的6-well培养盘,每个well加入2ml培养液及15μl细胞,放入5%CO
2、37℃培养箱培养至细胞长满后,移除培养液,并以PBS清洗一次,加入2ml含2%的马血清(HRS)、100unit/ml penicillon G、100μg/ml streptomycin的DMEM培养液诱导细胞分化,每两天换一次培养液。当细胞分化为肌小管细胞时,换上新的含2%HRS的DMEM培养液后开始进行实验。
将不同浓度(3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、100ng/ml)的重组蛋白溶液(以下简称JF101),分别加入6-well培养盘中分化的C2C12细胞,24小时后,取细胞并以西方墨点法分析细胞活性。其中以等体积PBS溶液做为控制组,并以浓度为0.5mM的5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸(5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide,AICAR)做为对照组,其中AICAR是一种AMP-activatedproteinkinase(AMPK)活化剂。
西方墨点法:吸除6-well培养盘中的培养液并以PBS冲洗三次,以减缓细胞本身的生理作用,每孔加入30μl lysis buffer(50mM Tris-HCl、PH7.4、150mM NaCl、1mM EDTA、100μM PMSF、1%NP-40、0.1%SDS、0.5%DOS) 作用1分钟,用刮棒将细胞刮下并收集至1.5ml微量离心管中,置于冰上作用30分钟,以13000rpm于4℃离心30分钟,收集上清液,即蛋白质萃取液。
蛋白质定量:准备10个1.5ml微量离心管,将protein assay dye(购自于Bio-Rad)经去离子水以5倍稀释后,以Whatman No.1滤纸过滤,取1μl加入各个1.5ml微量离心管中,分别加入2μl、4μl、8μl的2mg/ml bovine serum albumin(BSA)做成4mg/ml、8mg/ml、16mg/ml标准溶液(standard)与各个蛋白质样品1μl,经vortex震荡于595nm测定吸光值,对照blank,计算标准曲线(standard curve),进一步推算各样品相同含量所需体积,于95℃下作用5分钟,保存在-20℃。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE):利用6%~10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳后将胶体转渍至聚偏二氟乙烯膜(PVDF,购自GE Healthcare,Fairfield,CT)上。转渍条件300mA、120分钟,转渍结束后将PVDF膜放至含5%脱脂牛奶的一倍TBST中清洗1小时,随后以一倍TBST清洗15分钟三次,加入初级抗体(1:1000)35rpm隔夜,隔天将PVDF用一倍TBST清洗15分钟三次,加入二级抗体(rabbit or mouse;1:2000)一小时,结束后以一倍TBST清洗15分钟三次,随即利用ECL(enhanced chemiluminescence)plus detection kit(购自Amersham Life Sciences,Piscataway,NJ)作用,再用high performance chemiluminescence film底片(购自GE healthcare Limited,UK)感光呈像。
如图2A及图2B所示,本发明所述的重组蛋白溶液(JF101)相较于控制组皆能活化肌纤维细胞代谢,且重组蛋白溶液(JF101)相较于AICAR(对照组)能够更有效率活化已分化的肌肉细胞,其中重组蛋白溶液(JF101)又以浓度为30ng/ml、100ng/ml活化肌纤维细胞代谢的效果较为明显。
实施例3重组蛋白诱导肌纤维细胞增殖(proliferation)
将100ng/ml几丁质与100ng/ml重组蛋白溶液(JF101)以灭菌后的生理食盐水配制成总体积为2500μl的混合溶液并分别滴在6孔盘中,于-20℃冰箱冷冻一晚后,放进冻干机冷冻干燥18小时,形成生物可分解性多孔结构。另以100ng/ml几丁质做为控制组。将小鼠肌纤维细胞C2C12以1×10
4cells分别加入well中,每24小时以dye exclusion assay方式计算细胞数目。
如图3所示,控制组(单独施予几丁质)并不影响小鼠肌纤维细胞生长, 但当几丁质(基质添加物)与重组蛋白溶液(JF101)混合后可以促进小鼠肌纤维细胞生长速率。
实施例4重组蛋白诱导肌纤维细胞分化(differentiation)
将100ng/ml几丁质与100ng/ml重组蛋白溶液(JF101)以灭菌后的生理食盐水配制成总体积为2500μl的混合溶液并分别滴在6孔盘中,于-20℃冰箱冷冻一晚后,放进冻干机冷冻干燥18小时,形成生物可分解性多孔结构。另以胎马血清做为正控制组并以单独100ng/ml几丁质作为对照组。将小鼠肌纤维细胞C2C12以1x10
4cells分别加入well中,每24小时观察细胞分化情形。
如图4所示,对照组(单独施予几丁质)并不影响小鼠肌纤维细胞分化,但当几丁质(基质添加物)与重组蛋白溶液(JF101)混合后所形成的组合物,相较于控制组可以促进小鼠肌纤维细胞分化。
Claims (25)
- 一种改善括约肌闭锁不全的组合物,其特征在于,其由一基质(matrix)添加物以及一重组蛋白所组成,其中该重组蛋白包含一第一多肽以及一第二多肽,其中该第一多肽如SEQ ID NO:8所示具有相似度至少90%以上的序列,该第二多肽,其包含如SEQ ID NO:14所示序列1至10个重复单元(repeat units)。
- 如权利要求1所述的组合物,其特征在于,其中该基质添加物包含蛋白质、多醣(polysaccharide)、醣蛋白(glycoprotein)或其任意组合。
- 如权利要求2所述的组合物,其特征在于,其中该蛋白质包含胶原蛋白(collagen)或明胶(gelatin)。
- 如权利要求2所述的组合物,其特征在于,其中该多醣包含几丁质(chitosan)、琼脂(agar)或糖胺聚醣(glycosaminoglycan)。
- 如权利要求4所述的组合物,其特征在于,其中该糖胺聚醣包含硫酸软骨素、硫酸皮肤素(dermatan sulfate)、硫酸角质素(keratan sulfate)、肝素(heparin)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)或玻尿酸(hyaluronic acid)。
- 如权利要求1所述的组合物,其特征在于,其中该第二多肽为纵列重复单元(tandem repeated units)的线性排列重复抗原(linear array epitope,LAE),其中该第二多肽为如SEQ ID NO:14所示序列1至10个重复单元。
- 如权利要求1所述的组合物,其特征在于,其中该第一多肽在如SEQ ID NO:8所示序列中包括四个胺基酸位点突变,对应于如SEQ ID NO:8所示序列的位点7、9、13及105的位置。
- 如权利要求7所述的组合物,其特征在于,其中该四个胺基酸位点突变对应于位点7具有T或L、位点9具有G或E、位点13具有Y或V及位点105具有H或Y。
- 如权利要求1所述的组合物,其特征在于,其中该第一多肽选自由如SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11及12所示序列所组成的群组。
- 如权利要求1至9中任一项所述的组合物,其特征在于,其中,该重组蛋白更包含:一连接符,其介于该第一多肽以及该第二多肽之间;其中该重组蛋白的 序列如SEQ ID NO:17所示。
- 一种改善括约肌闭锁不全的医药组成物,其特征在于,其包含如权利要求1至10中任一项所述的组合物以及一药学上可接受的载剂。
- 如权利要求11所述的医药组成物,其特征在于,其中医药组成物的剂型包含注射剂、胶凝剂、填充剂或缝线。
- 一种如权利要求1至10中任一项所述的组合物用于制造改善括约肌闭锁不全的药物的用途。
- 如权利要求13所述的用途,其特征在于,其用于制造适用于幽门括约肌闭锁不全、贲门括约肌闭锁不全、回盲括约肌闭锁不全、口轮匝肌闭锁不全、阴道括约肌闭锁不全、尿道括约肌闭锁不全或肛门括约肌闭锁不全的药物。
- 一种改善括约肌闭锁不全的组合物,其特征在于,其由一基质添加物以及一重组蛋白所组成,其中该重组蛋白包含一金黄色葡萄球菌肠毒素多肽以及一肌生成抑制多肽。
- 如权利要求15所述的组合物,其特征在于,其中该基质添加物包含蛋白质、多醣、醣蛋白或其任意组合。
- 如权利要求16所述的组合物,其特征在于,其中该蛋白质包含胶原蛋白或明胶。
- 如权利要求16所述的组合物,其特征在于,其中该多醣包含几丁质、琼脂或糖胺聚醣。
- 如权利要求18所述的组合物,其特征在于,其中该糖胺聚醣包含硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸乙酰肝素或玻尿酸。
- 如权利要求15所述的组合物,其特征在于,其中该肌生成抑制多肽包含生长分化因子8(growth differentiation factor 8,GDF8)、滤泡抑素(follistatin)或第二型活化素受体(activin receptor type-2B,ACTR-IIB)。
- 如权利要求15所述的组合物,其特征在于,其中该金黄色葡萄球菌肠毒素多肽选自于由金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C1、C2、D、E、F、G及H所组成的群组
- 一种改善括约肌闭锁不全的医药组成物,其特征在于,其包含如权利要求15至21中任一项所述的组合物以及一药学上可接受的载剂。
- 如权利要求22所述的医药组成物,其特征在于,其中该医药组成物的剂型包含注射剂、胶凝剂、填充剂或缝线。
- 一种如权利要求15至21中任一项所述的组合物用于制造改善括约肌闭锁不全的药物的用途。
- 如权利要求24所述的用途,其特征在于,其用于制造适用于幽门括约肌闭锁不全、贲门括约肌闭锁不全、回盲括约肌闭锁不全、口轮匝肌闭锁不全、阴道括约肌闭锁不全、尿道括约肌闭锁不全或肛门括约肌闭锁不全的药物。
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