TW201940500A - 改善括約肌閉鎖不全的組合物及其醫藥組成物與用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種改善括約肌閉鎖不全的組合物,其係由一基質添加物以及一重組蛋白所組成。藉由本發明之組合物,以達成減少括約肌萎縮、促進括約肌增長、括約肌恢復或維持括約肌的效果。
Description
本發明係關於一種組合物,特別是指一種改善括約肌閉鎖不全之組合物;本發明另關於一種組合物的用途,特別是指一種用於製造改善括約肌閉鎖不全的藥物的用途。本發明另關於一種醫藥組成物,特別是指一種改善括約肌閉鎖不全之醫藥組成物。
大便失禁(fecal incontinence)是影響健康個體心理和社交能力的疾病之一。研究報告顯示,一般人群中大便失禁的患病率約為2%至3%。Nelson及其同事發現威斯康辛州社區居民的患病率為2.2%。在其研究中,總共調查了6959人,其中30%的人年齡超過65歲且63%是女性。在另一項研究中,Johanson和Lafferty在訪問初級保健醫生或胃腸病學家時觀察到個體的總體患病率為18.4%,但只有三分之一的人曾與醫生討論過這個問題。在養老院環境中,大便失禁的患病率接近50%並且可能是入院的主要原因。
女性大便失禁率包括立即的產後失禁以及長期產後失禁。在陰道或剖腹產分娩後3至6個月,多達13%至25%的女性患有大便失禁。在一項針對6000名女性(年齡30至90歲)的產後調查中,大便失禁的患病率(定義為至少每月失去液體或實體糞便)為7.2%。老年人、嚴重抑鬱症、尿失禁(urinary incontinence)、醫學合併症和手術陰道分娩與大便失禁的機率顯著相關。
大便失禁的經濟成本很高,每年超過4億美元花費在用於控制尿失禁和大便失禁的成人尿布上,這也是美國長期護理機構入院的第二大原因。對於需要治療和矯正的年輕患者中,成本也驚人地高。在1996年針對63例因產科損傷繼發大便失禁患者的研究中,每名患者的平均治療費用為17,166美元。在1998年至2003年期間,約有21,000名婦女因大便失禁接受了住院手術(每年約3500名婦女),總費用從1998年的3400萬美元逐漸增加到2003年的5750萬美元。2003年每次手術入院的平均費用為16,847美元
2015年,國家糖尿病和消化和腎臟疾病研究所(National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases,NIDDK)研討會上發表了2013年大便失禁的流行病學、病理生理學、治療和分類的摘要。
大便失禁是一種綜合症,涉及無意中失去固體或液體糞便。而真正的肛門失禁是肛門括約肌喪失控制,導致糞便或氣體不必要或不合時宜的釋放。這必須與導致糞便通過肛門的其他條件區分開來。
大便滲漏(stool seepage)所造成的內衣污垢可能是痔瘡、皮膚贅瘤增大(enlarged skin tags)、衛生條件差、肛門內廔(fistula-in-ano)和直腸粘膜脫垂(rectal mucosal prolapse)造成的。
其他導致腸道控制不良的病症像是發炎性腸病(inflammatory bowel disease)、瀉藥濫用(laxative abuse)、寄生蟲感染和毒素。
大便急迫(fecal urgency)必須和大便失禁分開來看,因為急迫可能與肛門括約肌破壞(anal sphincter disruption)以外的醫學問題有關。
該研究的重點將放在肛門失禁患者身上,其定義是至少4歲已能控制的個體中,大便或氣體在至少1個月的持續時間內不受控制的通過肛門。
藥物治療:
1.大便失禁的保守治療方案包括填充劑和生物回饋(biofeedback)。藥物治療的目標是減少大便次數和改善大便稠度。通過簡單的保守措施,通常可以改善輕度失禁(mild incontinence)。對於罕見且低容量糞便的患者而言,填充劑是有幫助的,因為成形的糞便比液體糞便更容易控制。另外,對於軟便或液體糞便失禁的患者來說,透過攝入填充劑來限制流體以使糞便固定成形可能是有用的治療方法。
2.生物回饋是一種安全、微創技術,其係使用聽覺或視覺回饋來重新培養骨盆底肌肉組織。儘管已經使用了許多不同的療法,但是一些研究表明透過生物回饋治療顯著改善了大便失禁。其他包括最近的Cochrane評論顯示生物回饋沒有提供治療益處的明確證據。最常用的技術是直腸敏感性訓練(rectal sensitivity training)以及肛門括約肌力量訓練(anal sphincter strength training)。
3.生物回饋需要一些直腸感覺和自動收縮括約肌的能力,這似乎對神經源性(neurogenic)和特發性(idiopathic)肛門失禁以及與肛門括約肌破壞有關的尿失禁有效,但最近的Cochrane評論未顯示出確定的治療益處,且生物回饋的結果也會隨著時間的推移而減少。
手術治療:
1.注射用有機矽已被證明是有效的。在一項對82名患有嚴重大便失禁和肛門內括約肌功能障礙引起的肛門靜息壓低(low anal resting pressure)的患者研究中,患者被隨機分配到A組(n=42)或B組(n=40),在A組的括約肌間隙和肛門內括約肌內透過肛門內超音波引導注射矽膠(B組也注射矽膠但未透過超音波引導)。結果顯示,追蹤12個月,兩組患者的大便失禁均有顯著改善,但在超音波引導下的A組注有更大程度改善,且沒有發生嚴重的併發症。但臨床上有病例顯示若外注射物持續存在,有時可能造成穿孔或局部黏膜潰爛之病例。
2.碳包覆微珠(carbon-coated microbeads)的結果不太有希望。在一項對33名患者進行的初步研究中,可藉由黏膜下注射碳包覆微珠以增加肛門壓力改善了輕微的大便失禁,但沒有顯著改善生活質量。注射膠原蛋白的試驗更加有限。
3. Solesta®
(Oceana Therapeutics, Inc.)是一種填充劑,由玻尿酸穩定的葡萄聚糖(dextranomer)組成,2011年被FDA批准用於治療其他保守治療失敗的患者的被動性大便失禁(passive fecal incontinence) 在歐洲和加拿大,它被稱為NASHA Dx或Zuidex®
。葡萄聚糖/玻尿酸是一種可用於肛門黏膜下注射的生物相容性填充劑。將四次1 ml注射劑施予於肛管高壓區近端部分的深層黏膜下層,在齒狀線(dentate line)上方約5mm處。如果在至少4週後效果不顯著,則可以第二次重複治療。透過擴張肛門組織,使近端肛管變窄,從而防止糞便洩漏。葡萄聚糖/玻尿酸注射劑可以在門診中給藥而無需麻醉。
最近的研究顯示,超過一半的患者在6個月時糞便失禁發作次數減少了約50%,且效果持續長達3年。此外,患者在使用葡萄聚糖/玻尿酸注射劑後,大便失禁生活質量量表(fecal incontinence quality of life scale)的大多數領域從基線(baseline)有顯著改善。保守治療失敗後比較葡萄聚糖/玻尿酸注射劑和薦神經刺激(sacral nerve stimulation)的3年成本效益模型顯示,葡萄聚糖/玻尿酸注射劑具有成本效益,比薦神經刺激更有效地用於治療大便失禁。
4. 2005年,Secca®
治療大便失禁的程序包括:最終治療或短期方案。肛門內括約肌射頻(radiofrequency,RF)能量的應用。理論上,RF引起的肛門內括約肌損傷應理想地導致膠原沉積(collagen deposition)和纖維化(fibrosis)並可能收緊受影響的區域。臨床上是利用纖維化產生縮小肛門口的效果,其缺點是困難重複治療至完全復原,病人必須忍受較長時間的痛苦。
肌生成抑制素(myostatin)的基因序列與轉化生長因子(transforming growth factor β,TGF-β)家族其他成員高度相似。肌生成抑制素的基因結構包括有三部分︰(1) 作為蛋白質分泌釋放信號的N端疏水結構域;(2) 高度保守的蛋白質切割位置RXRR;以及(3) 富含半胱氨酸(cysteine)的C端活性結構域。許多研究報告指出,脊椎動物中肌生成抑制素的胺基酸序列在C端活性結構域具有高度的保守性。現有研究提出對肌生成抑制素具有高特異性的單株抗體JA16 (Whittemoreet al
., 2003,Biochemical and Biophysical Research Communications
300:965-971),藉由分析肌生成抑制素的結合位置,發現結合位置位在小鼠肌生成抑制素C端15個胺基酸DFGLDCDEHSTESRC,從而可知C端結構域為抗原片段(antigenic fragment)。
然而,目前施予肌生成抑制素之抗體皆會產生全身性的反應,如Camporez等人於2016年的文獻指出,局部注射抗肌生成抑制素抗體後,使年老的小鼠全身性的肌肉增長,進而使全身重量增加。此外,針對肌生成抑制劑ACE-031(myostatin inhibitor)於2010年之臨床試驗結果顯示雖可用於增加全身肌肉及加強肌肉力量,但受試者分別出現自發性出血(spontaneous bleeding)、流鼻血(nosebleeds)、皮膚微血管擴張(small expansion of blood vesselsin skins)或頭痛(headaches)等副作用,因此該臨床試驗不得不因負面現象(negative phenomena)而於2011年中止試驗;尤其抗體會引起受體免疫系統的全身性作用,諸如過敏反應、寒顫、腹瀉、噁心嘔吐、皮膚瘙癢等症狀。此外,如H.N. Peiris於2012年的文獻[Placenta 33(2012 902-907)]指出,在“雙重肌肉”基因型(double-muscling)的牛種中,產犢(calving)和生育(fertility)都存在困難;然而在myostatin基因缺乏的小鼠(Mstn-/-
)卻是可生育的(fertile);由此推測,肌肉生長抑制素可能與妊娠期促成胎盤及其功能有關。
中華民國發明專利I540968揭露含有肌肉倍增片段與綠膿桿菌外毒素區域Ia片段融合形成多肽片段或抗體,其中綠膿桿菌外毒素片段之目的在於有效增強誘導免疫反應;然而,就所屬領域技術人員所知,綠膿桿菌在細菌生產過程中可能會產生內涵體(inclusion body),因此萃取片段或抗體時需要額外添加尿素(urea)去破壞細胞而導致尿素殘留,以及重新摺疊(refolding)片段而可能影響蛋白質功能;更重要的是,該篇專利所揭露的效果仍是全身性的反應,因此,現有技術之肌生成抑制素抗體仍有改善之空間。
另外,目前研究顯示,金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
分泌的腸外蛋白(enterotoxin)可被分為A、B、C1、C2、D、E和F等幾種類型,其中金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal
enterotoxin)SEA、SEB、SEC1及SEC2)的腸毒素蛋白分子量都相近似且在結構上有較高的類似性,故皆會引起全身性的免疫反應並具有相同的臨床症狀,如發燒、血壓升高等較大的副作用。
為了克服現有技術之缺點,本發明的目的在於提供一種組合物,以達成改善括約肌閉鎖不全的效果。
本發明係關於一種改善括約肌閉鎖不全的組合物,其係由一基質(matrix)添加物以及一重組蛋白所組成,其中該重組蛋白包含一第一多肽以及一第二多肽,其中該第一多肽係如SEQ ID NO:8所示具有相似度至少90%以上的序列,該第二多肽,其係包含如SEQ ID NO:14所示序列1至10個重複單元(repeat units)。
較佳的,所述之基質添加物具有生物相容性(biocompatibility)或生物可分解性(biodegradable)。
更佳的,所述之基質添加物包含,但不限於蛋白質、多醣(polysaccharide)、醣蛋白(glycoprotein)或其任意組合;其中,蛋白質包含,但不限於膠原蛋白(collagen)或明膠(gelatin);多醣包含,但不限於幾丁質(chitosan)、瓊脂(agar)或糖胺聚醣(glycosaminoglycan)。更佳的,所述之糖胺聚醣包含,但不限於硫酸軟骨素、硫酸皮膚素(dermatan sulfate)、硫酸角質素(keratan sulfate)、肝素(heparin)、硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)或玻尿酸(hyaluronic acid)。更佳的,所述之糖胺聚醣係玻尿酸。
其中,該重組蛋白可被前述之基質添加物(例如:玻尿酸)包裹(enclosed)或包覆(coated),而封入(enclosure)形成一聚合物(polymer)或球狀物(globular)。在括約肌施予部位中,玻尿酸除了能作為維持括約肌原有形狀的填充物外、玻尿酸亦能保持一特定量之藥物及使得藥物能緩慢釋放於施予部位並發揮藥效。
較佳的,所述之第二多肽為縱列重複單元(tandem repeated units)的線性排列重複抗原(linear array epitope,LAE),其中該第二多肽為如SEQ ID NO:14所示序列1至10個重複單元。
較佳的,所述之第一多肽在SEQ ID NO:8所示序列中包括四個胺基酸位點突變。
更佳的,所述之四個胺基酸位點突變對應於如SEQ ID NO:8所示序列之位點7、9、13及105之位置。
更佳的,所述之四個胺基酸位點突變對應於位點7具有T或L、位點9具有G或E、位點13具有Y或V及位點105具有H或Y。
較佳的,所述之第一多肽係選自由如SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11及12所示序列所組成之群組。
在另一個態樣中,所述之重組蛋白更包含一連接子,其係介於該第一多肽以及該第二多肽之間;其中該重組蛋白之序列如SEQ ID NO:17所示。
在另一個態樣中,所述之重組蛋白自N端至C端排列順序包括,但不限於,一個第一多肽與一個第二多肽、一個第一多肽與多個第二多肽、一個第二多肽與一個第一多肽、或多個第二多肽與一個第一多肽。
在一個較佳的製備例中,該第一多肽與該第二多肽可選自以下例示:
本發明另關於一種改善括約肌閉鎖不全的組合物,其係由一基質(matrix)添加物以及一重組蛋白所組成,其中所述之重組蛋白包含一金黃色葡萄球菌腸毒素多肽以及一肌生成抑制素多肽。
較佳的,所述之金黃色葡萄球菌腸毒素的多肽係選自於由金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C1、C2、D、E、F、G及H所組成之群組。
SEC2具有27 kDa的分子量,含有239個胺基酸。甫經轉錄之SEC2為266個胺基酸的蛋白質,分子量計為30 kDa;於丙氨酸27處切斷SEC2多肽可產生成熟毒素,其含有239個胺基酸,分子量計為27 kDa。藉由N端多肽定序可確定SEC2中的訊息多肽切割位置並確認成熟毒素的N端,藉此可證明SEC2能夠有效地增強所引發之免疫反應。更佳的,所述之金黃色葡萄球菌腸毒素C2 序列的多肽序列與SEQ ID NO:8中所示序列具有至少90%以上的序列一致性,舉例而言,對應於SEQ ID NO:8所示序列中選自由位點7具有T或L、位點9具有G或E、位點13具有Y或V及位點105具有H或Y所組成的群組。
較佳的,所述之肌生成抑制素多肽包含,但不限於生長分化因子8 (growth differentiation factor 8,GDF8)、濾泡抑素(follistatin)或第二型活化素受體(activin receptor type-2B,ACTR-IIB)。
更佳的,所述之肌生成抑制素多肽包含,但不限於生長分化因子8如SEQ ID NO:13所示序列、濾泡抑素如SEQ ID NO:15所示序列或第二型活化素受體如SEQ ID NO:16所示序列。
較佳的,所述之肌生成抑制素的抗原決定位多肽為縱列重複單元(tandem repeated units)的線性排列重複抗原(linear array epitope,LAE)。
本發明所述之組合物具有緩慢釋放的效果,可施予於括約肌周圍,以改善括約肌閉鎖不全的情形。
本發明更關於一種用於改善擴約肌閉鎖不全的醫藥組成物,其包含如前所述之組合物以及一藥學上可接受之載劑。
在本文中,所述之「藥學上可接受之載劑」包含,但不限於水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氫化合物(hydrocarbons)[諸如石油膠(petroleum jelly)以及白凡士林(white petrolatum)]、蠟(wax)[諸如石蠟(paraffin)以及黃蠟(yellow wax)]、保存劑(preserving agents)、抗氧化劑(antioxidants)、溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、吸收增強劑(absorption enhancers)、活性劑(active agents)、保濕劑(humectants)、氣味吸收劑(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH調整劑(pH adjusting agents)、閉塞劑(occlusive agents)、軟化劑(emollients)、增稠劑(thickeners)、助溶劑(solubilizing agents)、滲透增強劑(penetration enhancers)、抗刺激劑(anti-irritants)、著色劑(colorants)、推進劑(propellants)、表面活性劑(surfactant)、佐劑(adjuvant)及其他類似或適用本發明之載劑。
在本文中,所述之「佐劑」包括,但不限於明礬沉澱、弗朗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant)、弗朗式不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant)或單磷氧基-脂質A/海藻糖(monophosphoryl-lipid A/trehalose dicorynomycolate)佐劑。
較佳的,所述之醫藥組成物之劑型包含,但不限於注射劑、膠凝劑(gelling agent)、填充劑或縫線。
本發明係關於一種改善括約肌閉鎖不全的用途,其係將如前所述之組合物用於製造改善括約肌閉鎖不全的藥物,其係將藥物以有效劑量施予受體括約肌以達成改善括約肌閉鎖不全之效果。
較佳的,所述之用途係用於製造適用於幽門括約肌閉鎖不全、賁門括約肌閉鎖不全、迴盲括約肌閉鎖不全、口輪匝肌閉鎖不全、陰道括約肌閉鎖不全、尿道括約肌閉鎖不全或肛門括約肌閉鎖不全之藥物。
在本發明的一個較佳實施例中,藉由使用前述組合物或醫藥組成物以達成改善括約肌閉鎖不全的效果,包括給予肌生成抑制素片段與SEC2的融合蛋白,從而獲得抗肌生成抑制素之特異性免疫細胞。本發明的免疫細胞可以由肌生成抑制素片段之抗原決定位引入其他動物中,並經過純化或藉由將免疫細胞或其抗原決定位加上基質添加物(諸如幾丁質)引入哺乳動物體內,以使哺乳動物之局部能夠改善括約肌閉鎖不全。在本發明中,前述之免疫細胞可為多株B淋巴球或T細胞殖株;較佳的是,前述免疫細胞是調節型T細胞。
在本文中,用語「括約肌」是指動物體內管腔壁的一種環形肌肉,常見於消化道和泌尿系統,其包括,但不限於幽門括約肌(pyloric sphincter)、賁門括約肌(cardiac sphincter)、迴盲括約肌(ileocecal sphincter)、口輪匝肌(musculus orbicularis oris)、陰道括約肌(vaginal sphincter)、尿道括約肌(urethral sphincter)或肛門括約肌(anal sphincter)。
在本文中,用語「括約肌閉鎖不全」是指括約肌失去神經支配,無收縮功能,處於弛緩狀態。
在本文中,用語「改善括約肌閉鎖不全」是指減少括約肌萎縮、促進括約肌增長、括約肌恢復或維持括約肌。依據本案實施例所例示,是指通過施予特定濃度範圍量的重組蛋白溶液與基質添加物能夠促進肌纖維細胞生長速率以及肌纖維細胞分化,藉以達成減少括約肌萎縮、促進括約肌增長、括約肌恢復或維持括約肌的功效。
在本文中,用語「抗原決定位(epitope)」是指能夠引發免疫反應以產生蛋白質抗原中的抗原的片段,其可以藉由結構預測或藉由選擇蛋白片段來觀察免疫動物的免疫反應。
在本文中,用語「有效劑量」係指在劑量上及對於所需要之時間而言達成促進括約肌增長、減少括約肌萎縮、括約肌恢復或維持括約肌有效之量。
在本文中,用語「生物相容性」係指含有基質添加物之組合物或醫藥組成物接觸受體後,組合物或醫藥組成物不會釋放有毒物質,也不會造成局部或全身性細胞毒性、致癌性及生殖毒性,更不會引起發炎反應、免疫反應、毒性反應、血栓形成反應等危害。
在本文中,用語「生物可分解性」係指含有基質添加物之組合物或醫藥組成物植入受體後,歷經一段時間即會在受體內分解,且不會引起排斥現象。
由於該抗原決定位是小型多肽片段,如果以該小型多肽片段在動物中直接進行免疫,則免疫反應可能未盡理想。較佳的是,建構含有縱列重複單元的線性排列重複抗原(LAE),以改善免疫反應。此外,可以使用細菌毒素來幫助抗原的傳遞,藉由使用消除毒素活性的毒素作為運輸系統,從而以毒素的性質來加強整體免疫效果。在一態樣中,本發明的肌生成抑制素C端的抗原決定位的線性排列重複抗原與金黃色葡萄球菌腸毒素C2 (SEC2)融合。
一種宿主細胞包含該上述核酸是可被生產的。實施例包括大腸桿菌、昆蟲細胞、植物細胞、酵母菌細胞及哺乳動物細胞。該核酸分子可以用於表達本說明書所述之多肽或融合蛋白,操作上可將該核酸分子連接至合適的載體的多種限制酶酵素切位(multiple cloning site,MCS)以產生所述之多肽或融合蛋白。
載體實施例包含一質體。該載體較佳的是包括啟動子、增強子、多種限制酶酵素切位等,核酸分子連接至合適的載體的多種限制酶酵素切位後,該表達載體可以被導入該宿主細胞以產生本說明書所述之多肽或融合蛋白。該宿主細胞包括,但不限於大腸桿菌、百日咳桿菌、芽孢桿菌、非洲綠猴腎臟細胞、嗜血桿菌、真菌或酵母。
前述組合物或醫藥組成物適用之受體是脊椎動物。較佳的,脊椎動物是人、豬、牛、羊、犬、家禽或水禽等動物。由於肌生成抑制素已獲選殖,且其胺基酸序列具有高度的保守性,因此可假定前述脊椎動物之肌生成抑制素具有相同的功能;更佳的,前述脊椎動物是人、豬、牛、羊或犬。
當本案所述之重組蛋白與基質添加物所形成的組合物或醫藥組成物施予受體局部括約肌部位,可藉由組合物或醫藥組成物中的重組蛋白促進局部括約肌增長、減少括約肌萎縮,並藉由組合物或醫藥組成物中的基質添加物達到填充萎縮空間,並促進括約肌恢復或維持括約肌之功效,進以使本發明所述之組合物及醫藥組成物達成改善括約肌閉鎖不全的效果。
以下配合圖式及本發明之實施例,進一步闡述本發明為達成預定發明目的所採取的技術手段。以下實施例僅係用以說明本發明,而非意圖限制本發明的範圍。
製備例 製備重組蛋白
對照組和實驗組共使用8週齡的10隻小鼠,實驗時間為28天。本製備例所採用之融合蛋白係採用大腸桿菌(E. coli)之pET表現系統表現之載體;較佳的,係選用pET-28a。其中第一多肽「SEC2m」所示係金黃色葡萄球菌腸毒素C2具有點突變(point mutation),核酸序列如SEQ ID NO:1所示、蛋白質序列如SEQ ID NO:8 所示(突變點於位點7具有L、位點9具有E、位點13具有V及位點105具有Y);第二多肽「Myo epitope」所示則為肌生成抑制素的抗原決定位,其係肌生成抑制素C端15個胺基酸(如序列SEQ ID NO:14所示;該序列具有高度的保守性,因此多個物種皆具有此序列)具有6個重覆片段,其單一片段之核酸序列如SEQ ID NO:2所示。位於pET載體多種限制酶酵素切位(multiple cloning site,MCS)內之基因序列從N端依序為「SEC2m」、連接子(linker)與「Myo epitope」,如序列SEQ ID NO:3所示。
建立35 L發酵培養程序以在50 L發酵罐中培養含有SEQ ID NO:3所示之pET載體的大腸桿菌BL21 (DE3)菌株。4管5 ml菌株在37ºC下用LB/氨芐青黴素(Ampicillin)培養基培養過夜,各菌株分別接種到0.2公升之LB/氨芐青黴素培養基中,共1公升,於37ºC持續搖動培養至OD600為0.3。其後加入至35 μl培養基中進行培養,並以每兩小時取樣測定OD600為以監測生長曲線的變化,並根據生長曲線進一步選擇合適的時間點,加入最終濃度為0.1 mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)誘導大腸桿菌以高度表現融合蛋白,於37ºC持續搖動培養3小時,離心回收菌株。藉由SDS-PAGE電泳和西方墨點法測定融合蛋白的表現,以確定最佳35 L發酵條件。大致上,係將大腸桿菌BL21 (DE3)表達的融合多肽在細胞裂解後,進行該融合多肽的萃取與分離,最終獲得一重組蛋白(如SEQ ID NO:17所示);由於該表現蛋白的萃取與分離係屬習知技術,在此不再贅述。
實施例1 基質添加物對肌纖維母細胞的影響
以不同濃度幾丁質、膠原蛋白與明膠以滅菌後的生理食鹽水分別配製成不同濃度(1000 ng/ml、100 ng/ml、10 ng/ml以及1 ng/ml)的基質添加物溶液。將不同濃度的基質添加物溶液分別製成總體積為2500 μl之混合溶液並滴在6孔盤中,於-20℃冰箱冷凍一晚後,放進凍乾機冷凍乾燥18小時以分別形成生物多孔結構,其中以不含基質之生理食鹽水做為控制組。將小鼠肌纖維細胞C2C12以1×104
cells分別加入well中,每24小時以染料排除試驗(dye exclusion assay)方式計算細胞數目。
dye exclusion assay步驟如下:
利用胰蛋白酶(trypsin)將細胞自培養盤(dish)中分離,加入含FBS的培養液中和trypsin,離心除去上清液。再加入PBS清除雜質,混勻後離心。重新加入PBS,混合均勻。取100 μl 細胞懸浮液與0.4% w/v、100 μl台盼藍(trypan blue)等體積混合均勻形成混合液。將少許混合液(約15 μl)加入血球計數盤或是自動粒子計數器(coulter counter)容室(chamber)上方凹槽,蓋上蓋玻片,於100倍倒立顯微鏡下觀察,其中活細胞因細胞膜完整,染料無法滲入而不會被染色,死細胞則為藍色。chamber上方蓋上蓋玻片後,每個大正方形之體積為1 mm2
× 0.1 mm=1.0 x10-4
ml。使用時,計數每個大正方形內之細胞數目,乘以稀釋倍數,再乘以104
,即為每ml中之細胞數目。
如圖1A所示,當基質添加物是幾丁質時,不同濃度的幾丁質組別和控制組相比,細胞生長速率並無差異;如圖1B所示,當基質添加物是明膠時,不同濃度的明膠組別和控制組相比,細胞生長速率並無差異;如圖1C所示,當基質添加物是膠原蛋白時,不同濃度的膠原蛋白組別和控制組相比,細胞生長速率並無差異。總言之,基質添加物無論是幾丁質、膠原蛋白或是明膠皆不影響細胞生長,也不影響細胞生長速率。
實施例2 重組蛋白誘導肌纖維細胞代謝(metabolism)
將小鼠肌纖維細胞(C2C12 myotubes)培養於含10%胎牛血清(FBS)、100 unit/ml penicillon G、100 μg/ml streptomycin的10 cm培養皿中,並置於37℃恆溫且含5% CO2
的細胞培養箱中,待細胞長至八九分滿時,進行繼代培養。首先,將細胞培養液抽乾,以PBS (137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2
PHO4
、2 mM KH2
PO4
於一公升distilled H2
O中,pH 7.4)沖洗一遍後,加入1 ml trypsin-EDTA作用3分鐘,將細胞自培養皿切下,再以10 ml含有FBS之DMEM培養基終止反應,收集細胞液至15 ml離心管,以3000 rpm離心5分鐘,移除上清液,加入1 ml含有FBS之DMEM培養基均勻混合,取150 μl加入含有10 ml培養基的10 cm培養皿中;剩餘細胞液則培養新的6-well培養盤,每個well加入2 ml培養液及15 μl細胞,放入5% CO2
、37℃培養箱培養至細胞長滿後,移除培養液,並以PBS清洗一次,加入2 ml含2%的馬血清(HRS)、100 unit/ml penicillon G、100 μg/ml streptomycin之DMEM培養液誘導細胞分化,每兩天換一次培養液。當細胞分化為肌小管細胞時,換上新的含2% HRS之DMEM培養液後開始進行實驗。
將不同濃度(3 ng/ml、10 ng/ml、30 ng/ml、100 ng/ml)之重組蛋白溶液(以下簡稱JF101),分別加入6-well培養盤中分化的C2C12細胞,24小時後,取細胞並以西方墨點法分析細胞活性。其中以等體積PBS溶液做為控制組,並以濃度為0.5 mM之5-氨基咪唑-4-甲醯胺核糖核苷酸(5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide,AICAR)做為對照組,其中AICAR是一種AMP-activatedproteinkinase(AMPK)活化劑。
西方墨點法:吸除6-well培養盤中的培養液並以PBS沖洗三次,以減緩細胞本身的生理作用,每孔加入30 μl lysis buffer (50 mM Tris-HCl、PH7.4、150 mM NaCl、1 mM EDTA、100 μM PMSF、1% NP-40、0.1% SDS、0.5% DOS)作用1分鐘,用刮棒將細胞刮下並收集至1.5 ml微量離心管中,置於冰上作用30分鐘,以13000 rpm於4℃離心30分鐘,收集上清液,即蛋白質萃取液。
蛋白質定量:準備10個1.5 ml微量離心管,將protein assay dye (購自於Bio-Rad)經去離子水以5倍稀釋後,以Whatman No.1濾紙過濾,取1 μl加入各個1.5 ml微量離心管中,分別加入2 μl、4 μl、8 μl之2 mg/ml bovine serum albumin (BSA)做成4 mg/ml、8 mg/ml、16 mg/ml 標準溶液(standard)與各個蛋白質樣品1 μl,經vortex震盪於595 nm測定吸光值,對照blank,計算標準曲線(standard curve),進一步推算各樣品相同含量所需體積,於95℃下作用5分鐘,保存在-20℃。
聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE):利用6%~10%的SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳,電泳後將膠體轉漬至聚偏二氟乙烯膜(PVDF,購自GE Healthcare,Fairfield,CT)上。轉漬條件300 mA、120分鐘,轉漬結束後將PVDF膜放至含5%脫脂牛奶的一倍TBST中清洗1小時,隨後以一倍TBST清洗15分鐘三次,加入初級抗體(1:1000) 35 rpm隔夜,隔天將PVDF用一倍TBST清洗15分鐘三次,加入二級抗體(rabbit or mouse;1:2000)一小時,結束後以一倍TBST清洗15分鐘三次,隨即利用ECL(enhanced chemiluminescence)plus detection kit (購自Amersham Life Sciences,Piscataway,NJ)作用,再用high performance chemiluminescence film底片(購自GE healthcare Limited,UK)感光呈像。
如圖2A及圖2B所示,本發明所述之重組蛋白溶液(JF101)相較於控制組皆能活化肌纖維細胞代謝,且重組蛋白溶液(JF101)相較於AICAR(對照組)能夠更有效率活化已分化的肌肉細胞,其中重組蛋白溶液(JF101)又以濃度為30 ng/ml、100 ng/ml活化肌纖維細胞代謝之效果較為明顯。
實施例3 重組蛋白誘導肌纖維細胞增殖(proliferation)
將100 ng/ml幾丁質與100 ng/ml重組蛋白溶液(JF101)以滅菌後的生理食鹽水配製成總體積為2500 μl之混合溶液並分別滴在6孔盤中,於-20℃冰箱冷凍一晚後,放進凍乾機冷凍乾燥18小時,形成生物可分解性多孔結構。另以100 ng/ml幾丁質做為控制組。將小鼠肌纖維細胞C2C12以1×104
cells分別加入well中,每24小時以dye exclusion assay方式計算細胞數目。
如圖3所示,控制組(單獨施予幾丁質)並不影響小鼠肌纖維細胞生長,但當幾丁質(基質添加物)與重組蛋白溶液(JF101)混合後可以促進小鼠肌纖維細胞生長速率。
實施例4 重組蛋白誘導肌纖維細胞分化(differentiation)
將100 ng/ml幾丁質與100 ng/ml重組蛋白溶液(JF101)以滅菌後的生理食鹽水配製成總體積為2500 μl之混合溶液並分別滴在6孔盤中,於-20℃冰箱冷凍一晚後,放進凍乾機冷凍乾燥18小時,形成生物可分解性多孔結構。另以胎馬血清做為正控制組並以單獨100 ng/ml幾丁質作為對照組。將小鼠肌纖維細胞C2C12以1x104
cells分別加入well中,每24小時觀察細胞分化情形。
如圖4所示,對照組(單獨施予幾丁質)並不影響小鼠肌纖維細胞分化,但當幾丁質(基質添加物)與重組蛋白溶液(JF101)混合後所形成之組合物,相較於控制組可以促進小鼠肌纖維細胞分化。
無
圖1A係本發明以小鼠肌纖維細胞C2C12加入不同濃度幾丁質之細胞生長曲線圖。
圖1B係本發明以小鼠肌纖維細胞C2C12加入不同濃度明膠之細胞生長曲線圖。
圖1C係本發明以小鼠肌纖維細胞C2C12加入不同濃度膠原蛋白之細胞生長曲線圖。
圖2A係本發明以不同濃度的JF101 (3 ng/ml、10 ng/ml、30 ng/ml、100 ng/ml)及AICAR(0.5 mM)處理已分化C2C12老鼠肌纖維細胞之電泳圖。
圖2B係本發明之圖2A電泳圖之量化柱狀圖。
圖3係本發明以小鼠肌纖維細胞C2C12加入單獨基質添加物(幾丁質)或基質添加物(幾丁質)與重組蛋白溶液(JF101)混合液之細胞生長曲線圖。
圖4係本發明以小鼠肌纖維細胞C2C12加入控制組、單獨基質添加物(幾丁質)、或基質添加物(幾丁質)與重組蛋白溶液(JF101)混合液之細胞圖,其中顯微鏡之放大倍率是40倍。
Claims (25)
- 一種改善括約肌閉鎖不全的組合物,其係由一基質(matrix)添加物以及一重組蛋白所組成,其中該重組蛋白包含一第一多肽以及一第二多肽,其中該第一多肽係如SEQ ID NO:8所示具有相似度至少90%以上的序列,該第二多肽,其係包含如SEQ ID NO:14所示序列1至10個重複單元(repeat units)。
- 如請求項1所述之組合物,其中該基質添加物包含蛋白質、多醣(polysaccharide)、醣蛋白(glycoprotein)或其任意組合。
- 如請求項2所述之組合物,其中該蛋白質包含膠原蛋白(collagen)或明膠(gelatin)。
- 如請求項2所述之組合物,其中該多醣包含幾丁質(chitosan)、瓊脂(agar)或糖胺聚醣(glycosaminoglycan)。
- 如請求項4所述之組合物,其中該糖胺聚醣包含硫酸軟骨素、硫酸皮膚素(dermatan sulfate)、硫酸角質素(keratan sulfate)、肝素(heparin)、硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)或玻尿酸(hyaluronic acid)。
- 如請求項1所述之組合物,其中該第二多肽為縱列重複單元(tandem repeated units)的線性排列重複抗原(linear array epitope,LAE),其中該第二多肽為如SEQ ID NO:14所示序列1至10個重複單元。
- 如請求項1所述之組合物,其中該第一多肽在如SEQ ID NO:8所示序列中包括四個胺基酸位點突變,對應於如SEQ ID NO:8所示序列之位點7、9、13及105之位置。
- 如請求項7所述之組合物,其中該四個胺基酸位點突變對應於位點7具有T或L、位點9具有G或E、位點13具有Y或V及位點105具有H或Y。
- 如請求項1所述之組合物,其中該第一多肽係選自由如SEQ ID NO:4、5、6、7、8、9、10、11及12所示序列所組成之群組。
- 如請求項1至9中任一項所述之組合物,其中,該重組蛋白更包含: 一連接子,其係介於該第一多肽以及該第二多肽之間;其中該重組蛋白之序列如SEQ ID NO:17所示。
- 一種改善括約肌閉鎖不全的醫藥組成物,其包含如請求項1至10中任一項所述之組合物以及一藥學上可接受之載劑。
- 如請求項11所述之醫藥組成物,其中醫藥組成物之劑型包含注射劑、膠凝劑、填充劑或縫線。
- 一種如請求項1至10中任一項所述之組合物用於製造改善括約肌閉鎖不全的藥物的用途。
- 如請求項13所述之用途,其係用於製造適用於幽門括約肌閉鎖不全、賁門括約肌閉鎖不全、迴盲括約肌閉鎖不全、口輪匝肌閉鎖不全、陰道括約肌閉鎖不全、尿道括約肌閉鎖不全或肛門括約肌閉鎖不全之藥物。
- 一種改善括約肌閉鎖不全的組合物,其係由一基質添加物以及一重組蛋白所組成,其中該重組蛋白包含一金黃色葡萄球菌腸毒素多肽以及一肌生成抑制多肽。
- 如請求項15所述之組合物,其中該基質添加物包含蛋白質、多醣、醣蛋白或其任意組合。
- 如請求項16所述之組合物,其中該蛋白質包含膠原蛋白或明膠。
- 如請求項16所述之組合物,其中該多醣包含幾丁質、瓊脂或糖胺聚醣。
- 如請求項18所述之組合物,其中該糖胺聚醣包含硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質素、肝素、硫酸乙醯肝素或玻尿酸。
- 如請求項15所述之組合物,其中該肌生成抑制多肽包含生長分化因子8 (growth differentiation factor 8,GDF8)、濾泡抑素(follistatin)或第二型活化素受體(activin receptor type-2B,ACTR-IIB)。
- 如請求項15所述之組合物,其中該金黃色葡萄球菌腸毒素多肽係選自於由金黃色葡萄球菌腸毒素A、B、C1、C2、D、E、F、G及H所組成之群組
- 一種改善括約肌閉鎖不全的醫藥組成物,其包含如請求項15至21中任一項所述之組合物以及一藥學上可接受之載劑。
- 如請求項22所述之醫藥組成物,其中該醫藥組成物之劑型包含注射劑、膠凝劑、填充劑或縫線。
- 一種如請求項15至21中任一項所述之組合物用於製造改善括約肌閉鎖不全的藥物的用途。
- 如請求項24所述之用途,其係用於製造適用於幽門括約肌閉鎖不全、賁門括約肌閉鎖不全、迴盲括約肌閉鎖不全、口輪匝肌閉鎖不全、陰道括約肌閉鎖不全、尿道括約肌閉鎖不全或肛門括約肌閉鎖不全之藥物。
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