KR20180117189A - 세포 배양 공정 - Google Patents
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Abstract
적어도 3 mM의 농도의 티로신 및 폴리비닐알콜 (PVA)을 포함하는 세포 배양 배지.
Description
본 발명은 적어도 3 mM의 농도의 티로신 및 폴리비닐알콜 (PVA)을 포함하는 세포 배양 배지에 관한 것이다. 본 발명은 또한 적어도 3 mM의 농도의 티로신 및 폴리비닐알콜 (PVA)을 포함하는 세포 배양 배지를 사용하는 세포 배양 방법에 관한 것이다.
단백질은 진단제 및 치료제로서 점점 더 중요해졌다. 대부분의 경우에, 상업적 용도를 위한 단백질은 비정상적으로 높은 수준의 특정한 관심 단백질을 생산하도록 조작되고/거나 선택된 세포로부터 세포 배양물에서 생산된다. 세포 배양 배지를 포함하는 세포 배양 조건의 최적화는 단백질의 성공적인 상업적 생산에 중요하다. 세포 배양 배지 중 대부분의 아미노산과 같이, 티로신 (Tyr)은 세포 매스 및 항체 또는 단백질 생산에 요구된다. 생산 배양에서의 티로신의 고갈은 세포 성장, 생존율 및/또는 단백질 생산의 감소로 이어질 수 있다. 세포 배양 공정 개선 및 고밀도 및 고역가 공정에 대한 필요성의 결과로서, 세포 배양 배지는 세포 성장 및 재조합 폴리펩티드의 생산을 보장하기 위해 고농도의 아미노산을 포함해야 한다. 그러나, 티로신은 최대 세포 성장 또는 단백질 생산을 위해 목적하는 농도에서 제한된 용해도를 갖고 저온 보관 동안 용액으로부터 침전되는 경향이 있다. 침전 문제를 피하는 하나의 방법은 진한 티로신 스톡을 개별적으로 공급하는 것이다. 그러나, 이러한 접근법은, 특히 대규모 제조 공정에 대해 작동상 복잡성을 추가한다. 또한, 진한 티로신 스톡은 pH가 높고 공급 동안 pH 변화를 유발할 것이다.
따라서, 티로신의 용해도가 고밀도에서의 포유동물 세포 배양 및 단백질의 최적 생산을 위해 증가된 개선된 세포 배양 배지의 개발에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명은 적어도 3 mM의 농도의 티로신 및 폴리비닐알콜 (PVA)을 포함하는 세포 배양 배지에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 티로신의 농도는 적어도 5 mM이다. 일부 실시양태에서, PVA의 농도는 적어도 0.5g/L이다. 일부 실시양태에서, 배지는 무혈청 및/또는 단백질 무함유 배지이다.
본 발명은 추가로 포유동물 세포, 바람직하게는 CHO 세포를 적어도 3 mM의 농도의 티로신 및 폴리비닐알콜 (PVA)을 포함하는 세포 배양 배지와 접촉시키는 것을 포함하는 세포 배양 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 세포 배양은 유가식 배양이고 본 발명의 세포 배양 배지는 기초 배지 및/또는 공급 배지로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 동안 최대 생존 세포 밀도는 1 x 106개 세포/mL 초과이다. 일부 실시양태에서, 세포는 재조합 단백질을 발현한다.
본 발명은 세포 배양 및 폴리펩티드 생산을 위한 방법 및 배지에 관한 것이다. 본 발명은 고농도의 티로신 및 폴리비닐 알콜 (PVA)을 포함하는 세포 배양 배지에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 배지 중 티로신의 농도는 적어도 3mM, 적어도 4mM, 적어도 5mM, 적어도 6mM, 적어도 7mM, 적어도 8mM, 적어도 9mM 또는 적어도 10mM이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 배지 중 티로신의 농도는 적어도 4.5mM이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 배지 중 티로신의 농도는 적어도 5mM이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 배지 중 티로신의 농도는 적어도 6mM이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 배지 중 티로신의 농도는 3mM 내지 50mM에 포함된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 배지 중 티로신의 농도는 5mM 내지 20mM에 포함된다.
일부 실시양태에서, 용어 티로신은 세포 배양, 바람직하게는 동물 세포 배양, 바람직하게는 포유동물 세포 배양에서 영양소로서 사용되는 데 적합한 티로신의 임의의 형태를 포함한다. 일부 실시양태에서, 티로신은 L-티로신이다. 일부 실시양태에서, 티로신은 티로신 유리 염기 또는 티로신 염이다. 일부 실시양태에서, 티로신은 디소듐 염 또는 디소듐 염 2수화물로부터 선택된 티로신 염이다. 바람직한 실시양태에서, 티로신은 L-티로신, L-티로신 디소듐 또는 L-티로신 디소듐 2수화물이다.
PVA는 n이 정수이고 중합도를 나타내는 화학식 [-CH2CH(OH)-]n의 중합체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 배지에 사용된 PVA는 n이 100 내지 10000, 300 내지 8000 또는 500 내지 5000에 포함되는 정수인 화학식 [-CH2CH(OH)-]n의 중합체이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 배지에 사용된 PVA는 약 85% 내지 약 89%의 가수분해도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 배지에 사용된 PVA는 10000 내지 100000 Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 배지에 사용된 PVA는 10000 내지 50000 Da, 바람직하게는 13000 내지 23000 Da의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 배지에 사용된 PVA는 1 내지 10 센티포아즈 (cp), 바람직하게는 3.0 내지 4.5 cp의 점도를 갖는다. PVA의 점도는 20℃의 온도에서의 폴리비닐 알콜의 4% 수용액의 점도의 관점에서 보고된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 배지에 사용된 PVA는 셀볼(Selvol)TM PVA 203 (세키스이(Sekisui))이다.
특정한 농도의 (적어도 3mM의) 티로신을 포함하는 세포 배양 배지의 침전을 방지하는 데 적합한 PVA의 농도는, 예를 들어 실시예 1에 개시된 것과 유사한 방법론을 사용하여 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 배지 중 PVA의 농도는 적어도 0.5g/L, 적어도 1g/L, 적어도 2g/L, 적어도 3g/L, 적어도 4g/L 또는 적어도 5g/L이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 배지 중 PVA의 농도는 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10 g/L이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 배지 중 PVA의 농도는 2.5 g/L이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 배지 중 PVA의 농도는 0.5g/L 내지 5 g/L에 포함된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 배지 중 PVA의 농도는 1g/L 내지 3g/L에 포함된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 배지는 빛의 부재 하에 4℃에서 1, 2, 3 또는 4주 보관 후 5NTU (비탁측정 탁도 단위) 미만의 탁도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 배지는 빛의 부재 하에 4℃에서 2주 보관 후 5NTU 미만의 탁도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 탁도는 실시예에 개시된 바와 같이 측정된다. 일부 실시양태에서, 탁도는 2100P 탁도계 (하크(HACH))를 사용하여 측정된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 배지는 빛의 부재 하에 4℃에서 1, 2, 3 또는 4주 보관 후 침전물을 본질적으로 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 배지는 빛의 부재 하에 4℃에서 2주 보관 후 침전물을 본질적으로 포함하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "배지", "세포 배양 배지" 및 "배양 배지"는 성장 중인 포유동물 세포에 영양을 공급하는 영양소를 함유하는 용액을 지칭한다. 전형적으로, 이러한 용액은 최소 성장 및/또는 생존을 위해 세포에 의해 요구되는 필수 및 비필수 아미노산, 비타민, 에너지원, 지질, 및 미량 원소를 제공한다. 한 실시양태에서, 배지는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val 및 시스틴 및/또는 Cys를 포함할 수 있다.
이러한 용액은 또한 호르몬 및/또는 다른 성장 인자, 특정한 이온 (예컨대 나트륨, 클로라이드, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충제, 비타민, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 미량 원소 (통상적으로 매우 낮은 최종 농도로 존재하는 무기 화합물), 높은 최종 농도로 존재하는 무기 화합물 (예를 들어, 철), 아미노산, 지질, 및/또는 글루코스 또는 다른 에너지원을 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 최소 비율을 초과하여 성장 및/또는 생존을 증진시키는 보충 성분을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 배지는 유리하게는 세포 생존 및 증식에 최적인 pH 및 염 농도로 제제화된다. 예를 들어, 배지는 대략 7.1 내지 7.3의 pH 및 대략 1000 내지 1300mOsm의 최종 오스몰랄농도로 제제화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 배지는 세포 배양의 시작 후 첨가되는 공급 배지이다. 한 실시양태에서, 배지는 4 내지 10mM Ala, 30 내지 60mM Arg, 50 내지 90mM Asn, 10 내지 30mM Asp, 2 내지 40mM Glu, 2 내지 15mM Gly, 8 내지 20mM His, 25 내지 32mM Ile, 35 내지 60mM Leu, 28 내지 60mM Lys, 9 내지 25mM Met, 10 내지 30mM Phe, 15 내지 40mM Pro, 44 내지 80mM Ser, 20 내지 45mM Thr, 2 내지 10mM Trp 및 20 내지 50mM Val을 포함하는 배지, 바람직하게는 공급 배지이다.
매우 다양한 포유동물 성장 배지는 본 발명에 따라 사용될 티로신 및 PVA 수준을 조정함으로써 변형될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 배지는 공지된 세포 배양 배지 예컨대 WO06026445, EP2243827, WO02066603 또는 WO06050050에 개시된 배지 중 티로신 및 PVA의 양을 변형시킴으로써 수득될 수 있다.
일부 실시양태에서, 배지는 배지의 성분이 모두 알려져 있을 뿐만 아니라 제어되는 화학적으로 한정된 배지이다. 일부 실시양태에서, 배지는 배지의 모든 성분이 알려져 있고/거나 제어되는 것이 아닌 복합 배지이다.
포유동물 세포 배양을 위한 화학적으로 한정된 성장 배지가 지난 수십 년에 걸쳐 광범위하게 개발되고 공개되었다. 한정 배지의 모든 성분은 잘 특징화되어 있고, 따라서 한정 배지는 복합 첨가제 예컨대 혈청 또는 가수분해물을 함유하지 않는다. 초기 배지 제제는 단백질 생산에 대한 관심이 거의 또는 전혀 없이 세포 성장을 허용하고 생존율을 유지하도록 개발되었다. 보다 최근에, 배지 제제는 명백히 고도로 생산적인 재조합 단백질 생산 세포 배양을 지지할 목적으로 개발되었다. 이러한 배지는 본 발명의 방법에 사용하기에 바람직하다. 이러한 배지는 일반적으로 고밀도에서의 세포의 성장 및/또는 유지를 지지하기 위한 많은 양의 영양소 및 특히 아미노산을 포함한다. 필요한 경우에, 이들 배지는 본 발명의 방법에 사용하기 위해 통상의 기술자에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 통상의 기술자는 본원에 개시된 바와 같은 방법에서 기초 배지 또는 공급 배지로서 그를 사용하기 위해 PVA를 첨가하고 이들 배지 중 티로신의 양을 증가시킬 수 있다.
복합 배지의 모든 성분이 잘 특징화되어 있는 것은 아니고, 따라서 복합 배지는 특히 첨가제 예컨대 단순 및/또는 복합 탄소 공급원, 단순 및/또는 복합 질소 공급원, 및 혈청을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 적합한 복합 배지는 본원에 기재된 바와 같은 한정 배지의 다른 성분에 더하여 첨가제 예컨대 가수분해물을 함유한다.
일부 실시양태에서, 한정 배지는 전형적으로 물 중 기지의 농도의 대략 50종의 화학 물질을 포함한다. 이들 대부분은 또한 1종 이상의 잘 특징화된 단백질 예컨대 인슐린, IGF-1, 트랜스페린 또는 BSA를 함유하지만, 다른 것은 단백질 성분을 필요로 하지 않고 따라서 이는 단백질-무함유 한정 배지로 지칭된다. 배지의 전형적인 화학적 성분은 5개의 넓은 카테고리에 속한다: 아미노산, 비타민, 무기 염, 미량 원소, 및 순수한 카테고리화를 허용하지 않는 기타 카테고리.
세포 배양 배지는 임의로 보충 성분으로 보충될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "보충 성분"은 최소 비율을 초과하여 성장 및/또는 생존을 증진시키는 성분을 지칭하고, 이는 호르몬 및/또는 다른 성장 인자, 특정한 이온 (예컨대 나트륨, 클로라이드, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충제, 비타민, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 미량 원소 (통상적으로 매우 낮은 최종 농도로 존재하는 무기 화합물), 아미노산, 지질, 및/또는 글루코스 또는 다른 에너지원을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 보충 성분은 초기 세포 배양에 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 보충 성분은 세포 배양의 시작 후 첨가될 수 있다.
전형적으로, 미량 원소는 마이크로몰 또는 보다 낮은 수준으로 포함되는 다양한 무기 염을 지칭한다. 예를 들어, 통상적으로 포함되는 미량 원소는 아연, 셀레늄, 구리, 및 다른 것이다. 일부 실시양태에서, 철 (제1철 또는 제2철 염)이 마이크로몰 농도로 초기 세포 배양 배지에 미량 원소로서 포함될 수 있다. 망가니즈가 또한 미량 원소 중에서 나노몰 내지 마이크로몰 농도의 범위에서 2가 양이온 (MnCl2 또는 MnSO4)으로서 빈번하게 포함된다. 수많은 덜 통상적인 미량 원소가 통상적으로 나노몰 농도로 첨가된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 배지는 세포 배양에서 높은 생존 세포 밀도, 예컨대 예를 들어 1 x 106개 세포/mL, 5 x 106개 세포/mL, 1 x 107개 세포/mL, 5 x 107개 세포/mL, 1X108개 세포/mL 또는 5X108개 세포/mL를 지지하는 데 적합한 배지이다. 일부 실시양태에서, 세포 배양은 포유동물 세포 유가식 배양, 바람직하게는 CHO 세포 유가식 배양이다.
본원에 사용된 용어 "생존 세포 밀도"는 주어진 부피의 배지에 존재하는 세포의 수를 지칭한다. 생존 세포 밀도는 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게는, 생존 세포 밀도는 자동화 세포 계수기 예컨대 바이오프로파일 플렉스(Bioprofile Flex)®를 사용하여 측정된다. 본원에 사용된 용어 최대 세포 밀도는 세포 배양 동안 달성된 최대 세포 밀도를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "세포 생존율"은 주어진 일련의 배양 조건 또는 실험 변수 하에 생존하는 배양물 중 세포의 능력을 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 세포 생존율을 결정하는 많은 방법 중 하나가 본 발명에 포괄된다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 하나는 세포 생존율을 결정하기 위해 살아있는 세포의 막을 통과하지 않지만, 사멸 또는 사멸 중인 세포의 파괴된 막을 통과할 수 있는 염료 (예를 들어, 트리판 블루)를 사용할 수 있다.
세포 배양 방법
본원에 사용된 용어 "배양물" 및 "세포 배양물"은 세포 집단의 생존 및/또는 성장에 적합한 조건 하에 배지 중에 현탁된 세포 집단을 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 바와 같이, 일부 실시양태에서, 본원에 사용된 이들 용어는 세포 집단 및 집단이 현탁되어 있는 배지를 포함하는 조합물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양물의 세포는 포유동물 세포이다.
본 발명의 배지는 목적하는 공정 (예를 들어, 재조합 단백질 (예를 들어, 항체)의 생산)에 적용가능한 임의의 세포 배양 방법과 함께 사용될 수 있다. 비제한적 예로서, 세포는 회분식 또는 유가식 배양으로 성장할 수 있으며, 여기서 배양은 재조합 단백질 (예를 들어, 항체)의 충분한 발현 후 종결되고, 그 후 발현된 단백질 (예를 들어, 항체)이 수거된다. 대안적으로, 또 다른 비제한적 예로서, 세포는 재유가식으로 성장할 수 있으며, 여기서 배양은 종결되지 않고 새로운 영양소 및 다른 성분이 주기적으로 또는 연속적으로 배양물에 첨가되고, 그 동안 발현된 재조합 단백질 (예를 들어, 항체)가 주기적으로 또는 연속적으로 수거된다. 다른 적합한 방법 (예를 들어, 스핀-튜브 배양)이 관련 기술분야에 공지되어 있고 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 배지와 함께 사용하는 데 적합한 세포 배양은 유가식 배양이다. 본원에 사용된 용어 "유가식 배양"은 배양 공정의 시작 후 일정한 시간(들)에 추가의 성분이 배양물에 제공되는, 세포를 배양하는 방법을 지칭한다. 이러한 제공된 성분은 전형적으로 배양 공정 동안 고갈된, 세포를 위한 영양 성분을 포함한다. 유가식 배양은 전형적으로 일정 시점에 정지되고 배지 중 세포 및/또는 성분이 수거되고 임의로 정제된다. 일부 실시양태에서, 유가식 배양은 공급 배지로 보충된 기초 배지를 포함한다. 본 발명의 배지는 기초 배지 및/또는 공급 배지로서 사용될 수 있다.
세포는 실시자에 의해 선택된 임의의 편리한 부피로 성장할 수 있다. 예를 들어, 세포는 부피가 수 밀리리터 내지 수 리터 범위인 소규모 반응 용기에서 성장할 수 있다. 대안적으로, 세포는 부피가 대략 적어도 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10,000, 12,000, 15000, 20000 또는 25000 리터 또는 그 초과의 범위이거나, 또는 그 사이의 임의의 부피인 대규모 상업용 생물반응기에서 성장할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지의 부피는 적어도 500L이다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 배지의 부피는 적어도 5000L이다.
세포 배양의 온도는 주로 세포 배양물이 생존 상태를 유지하는 온도의 범위 및 높은 수준의 목적 생성물 (예를 들어, 재조합 단백질)이 생산되는 범위에 기초하여 선택될 것이다. 일반적으로, 대부분의 포유동물 세포는 약 25℃ 내지 42℃의 범위 내에서 잘 성장하고 목적 생성물 (예를 들어, 재조합 단백질)을 생산할 수 있지만, 본 개시내용에 의해 교시된 방법이 이들 온도에 제한되지는 않는다. 특정 포유동물 세포는 약 35℃ 내지 40℃의 범위 내에서 잘 성장하고 목적 생성물 (예를 들어, 재조합 단백질 또는 항체)을 생산할 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 배양물은 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 또는 45℃의 온도에서 세포 배양 공정 동안 1 이상의 배수로 성장한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 세포의 특정한 필요 및 실시자의 특정한 생산 요건에 따라 세포를 성장시키는 데 적절한 온도(들)를 선택할 수 있을 것이다. 세포는 실시자의 필요 및 세포 그 자체의 요건에 따라 임의의 양의 시간 동안 성장할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 35℃ 내지 40℃의 온도에서 성장한다. 일부 실시양태에서, 세포는 37℃에서 성장한다. 일부 실시양태에서, 세포는 36.5℃에서 성장한다.
일부 실시양태에서, 세포는 초기 성장기 (성장기) 동안 실시자의 필요 및 세포 그 자체의 요건에 따라 보다 많거나 또는 보다 적은 양의 시간 동안 성장할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 미리 정해진 세포 밀도를 달성하기에 충분한 기간 동안 성장한다. 일부 실시양태에서, 세포는 약 1 x 106개 세포/mL, 약 5 x 106개 세포/mL, 약 1 x 107개 세포/mL, 약 5 x 107개 세포/mL, 약 1X108개 세포/mL 또는 약 5X108개 세포/mL의 미리 정해진 세포 밀도를 달성하기에 충분한 기간 동안 성장한다. 일부 실시양태에서, 세포는 방해 없이 성장하도록 허용될 경우 세포가 결과적으로 도달할 최대 세포 밀도의 주어진 백분율인 세포 밀도를 달성하기에 충분한 기간 동안 성장한다. 예를 들어, 세포는 최대 세포 밀도의 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99 퍼센트의 목적하는 생존 세포 밀도를 달성하기에 충분한 기간 동안 성장할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 세포 밀도가 배양의 1일에 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 초과만큼 증가하지 않을 때까지 성장한다. 일부 실시양태에서, 세포는 세포 밀도가 배양의 1일에 5% 초과만큼 증가하지 않을 때까지 성장한다.
일부 실시양태에서 세포는 정해진 기간 동안 성장하도록 허용된다. 예를 들어, 세포 배양물의 출발 농도, 세포가 성장하는 온도, 및 세포의 고유 성장 속도에 따라, 세포는 0일, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 또는 그 초과 동안, 바람직하게는 4 내지 10일 동안 성장할 수 있다. 일부 경우에, 세포는 1개월 이상 동안 성장하도록 허용될 수 있다. 본 발명의 실시자는 단백질 생산 요건 및 세포 그 자체의 필요에 따라 초기 성장기의 지속시간을 선택할 수 있을 것이다.
세포 배양물은 세포에 대한 산소화 및 영양소의 분산을 증가시키기 위해 초기 배양기 동안 교반되거나 또는 진탕될 수 있다. 본 발명에 따르면, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 초기 성장기 동안 pH, 온도, 산소화 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 생물반응기의 특정 내부 조건을 제어하거나 또는 조절하는 것이 유익할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
초기 성장기의 종료 시, 배양 조건 중 적어도 하나는 변경될 수 있고, 이에 따라 배양 조건의 제2 세트가 적용되고 대사 변경이 배양물에서 발생한다. 대사 변경은, 예를 들어, 세포 배양물의 온도, pH, 오스몰랄농도 또는 화학적 유도 수준의 변화에 의해 달성될 수 있다. 하나의 비제한적 실시양태에서, 배양 조건은 배양물의 온도를 감소시킴으로써 변경된다. 그러나, 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 온도를 변경하는 것은 그를 통해 적절한 대사 변경이 달성될 수 있는 유일한 메카니즘이 아니다. 예를 들어, 이러한 대사 변경은 또한 pH, 오스몰랄농도, 및 부티르산나트륨 수준을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다른 배양 조건을 변경함으로써 달성될 수 있다. 배양 변경의 시기는 단백질 생산 요건 또는 세포 그 자체의 필요에 기초하여, 본 발명의 실시자에 의해 결정될 것이다.
배양물의 온도를 변경하는 경우, 온도 변경은 비교적 점진적일 수 있다. 예를 들어, 온도 변화를 완료하기까지 수 시간 또는 수 일이 걸릴 수 있다. 대안적으로, 온도 변경은 비교적 갑작스러울 수 있다. 예를 들어, 온도 변화는 수 시간 미만으로 완료될 수 있다. 예컨대 폴리펩티드 또는 단백질의 상업용 대규모 생산에서 표준인 적절한 생산 및 제어 장비를 고려하면, 온도 변화는 심지어 1시간 미만 내에 완료될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포 배양의 조건이 상기 논의된 바와 같이 변경되면, 세포 배양은 세포 배양물의 생존 및 생존율에 도움이 되고 상업적으로 충분한 수준의 목적하는 폴리펩티드 또는 단백질의 발현에 적절한 배양 조건의 제2 세트 하에 후속 생산기 동안 유지된다.
상기 논의된 바와 같이, 배양물은 온도, pH, 오스몰랄농도, 및 부티르산나트륨 수준을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다수의 배양 조건 중 하나 이상을 변경함으로써 변경될 수 있다. 일부 실시양태에서, 배양물의 온도가 변경된다. 이러한 실시양태에 따르면, 후속 생산기 동안, 배양물은 초기 성장기의 온도 또는 온도 범위보다 더 낮은 온도 또는 온도 범위에서 유지된다. 상기 논의된 바와 같이, 다중 별개의 온도 변경이 세포 밀도 또는 생존율을 증가시키거나 또는 재조합 단백질의 발현을 증가시키는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포는 목적하는 세포 밀도 또는 생산 역가가 도달될 때까지 후속 생산기에서 유지될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 세포는 후속 생산기 동안 정해진 기간 동안 성장하도록 허용된다. 예를 들어, 후속 성장기의 시작 시 세포 배양물의 농도, 세포가 성장하는 온도, 및 세포의 고유 성장 속도에 따라, 세포는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일 또는 그 초과 동안 성장할 수 있다. 일부 경우에, 세포는 1개월 이상 동안 성장하도록 허용될 수 있다. 본 발명의 실시자는 폴리펩티드 또는 단백질 생산 요건 및 세포 그 자체의 필요에 따라 후속 생산기의 지속기간을 선택할 수 있을 것이다.
세포 배양물은 세포에 대한 산소화 및 영양소의 분산을 증가시키기 위해 후속 생산기 동안 교반되거나 또는 진탕될 수 있다. 본 발명에 따르면, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 후속 성장기 동안 pH, 온도, 산소화 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 생물반응기의 특정 내부 조건을 제어하거나 또는 조절하는 것이 유익할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
일부 실시양태에서, 세포는 재조합 단백질을 발현하고 본 발명의 세포 배양 방법은 성장기 및 생산기를 포함한다.
세포
세포 배양에 감수성인 임의의 포유동물 세포가 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 포유동물 세포의 비제한적 예는 BALB/c 마우스 골수종 세포주 (NSO/l, ECACC 번호 85110503); 인간 망막모세포 (PER.C6, 크루셀(CruCell) (네덜란드 라이덴)); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁 배양물 중에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol., 36:59,1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포 +/-DHFR (CHO, 문헌 [Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980]); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980]); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1 587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HeLa, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간세포암 세포주 (Hep G2)를 포함한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 세포는 CHO 세포이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 세포는 GS-CHO 세포이다.
추가적으로, 임의의 수의 상업적으로 및 비-상업적으로 입수가능한 하이브리도마 세포주가 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "하이브리도마"는 불멸화 세포 및 항체-생산 세포의 융합으로부터 생성된 세포 또는 세포의 자손을 지칭한다. 이러한 생성된 하이브리도마는 항체를 생산하는 불멸화 세포이다. 하이브리도마를 생성하는 데 사용되는 개별 세포는 래트, 돼지, 토끼, 양, 돼지, 염소, 및 인간을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 임의의 포유동물 공급원으로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 하이브리도마는 인간 세포와 뮤린 골수종 세포주 사이의 융합의 생성물인 헤테로하이브리드 골수종 융합의 자손이 후속적으로 형질 세포와 융합되는 경우에 생성되는 트리오마 세포주이다. 일부 실시양태에서, 하이브리도마는 예를 들어, 쿼드로마와 같은 항체를 생산하는 임의의 불멸화 하이브리드 세포주이다 (예를 들어, 문헌 [Milstein et al., Nature, 537:3053, 1983] 참조). 관련 기술분야의 통상의 기술자는 하이브리도마 세포주가 상이한 영양 요건을 가질 수 있고/거나 최적 성장을 위해 상이한 배양 조건을 필요로 할 수 있다는 것을 인지할 것이고, 필요한 경우 조건을 변형시킬 수 있을 것이다.
단백질의 발현
상기 나타낸 바와 같이, 많은 경우에 세포는 높은 수준의 목적 생성물 (예를 들어, 재조합 단백질 또는 항체)을 생산하도록 선택되거나 또는 조작될 것이다. 종종, 세포는 높은 수준의 재조합 단백질을 생산하도록 인간의 손에 의해, 예를 들어 관심 단백질을 코딩하는 유전자의 도입 및/또는 그러한 유전자 (내인성이거나 또는 도입됨)의 발현을 조절하는 유전자 제어 요소의 도입에 의해 조작될 것이다.
특정 단백질은 세포 성장, 세포 생존율 또는 일부 방식으로 관심 단백질의 생산을 궁극적으로 제한하는 세포의 일부 다른 특징에 대해 유해한 효과를 가질 수 있다. 심지어 특정한 단백질을 발현하도록 조작된 하나의 특정한 유형의 세포의 집단 중에서도, 세포 집단 내의 가변성이 존재하고, 이에 따라 특정 개별 세포가 보다 잘 성장하거나, 보다 많은 관심 단백질을 생산하거나, 또는 보다 높은 활성 수준 (예를 들어, 효소적 활성)을 갖는 단백질을 생산할 것이다. 특정 실시양태에서, 세포주는 실시자에 의해 세포를 배양하기 위해 선택된 특정한 조건 하의 강건한 성장에 대해 실험적으로 선택된다. 일부 실시양태에서, 특정한 단백질을 발현하도록 조작된 개별 세포가 세포 성장, 최종 세포 밀도, 퍼센트 세포 생존율, 발현된 단백질의 역가 또는 이들의 임의의 조합 또는 실시자에 의해 중요한 것으로 간주되는 임의의 다른 조건에 기초하여 대규모 생산을 위해 선택된다.
숙주 세포에서 발현가능한 임의의 단백질은 본 발명의 교시에 따라 생산될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 본원에 기재된 바와 같은 관심 단백질을 생산하도록 본 발명에 따라 조작된 세포를 지칭한다. 단백질은 세포에 내인성인 유전자, 또는 세포 내로 도입된 이종 유전자로부터 발현될 수 있다. 단백질은 자연에서 발생하는 것일 수 있거나, 또는 대안적으로 인간의 손에 의해 조작되거나 또는 선택된 서열을 가질 수 있다.
본 발명에 따라 바람직하게 발현될 수 있는 단백질은 종종 관심있는 또는 유용한 생물학적 또는 화학적 활성에 기초하여 선택될 것이다. 예를 들어, 본 발명은 임의의 제약적 또는 상업적으로 관련된 효소, 수용체, 항체, 호르몬, 조절 인자, 항원, 결합제 등을 발현하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 배양물 중 세포에 의해 발현된 단백질은 항체, 또는 그의 단편, 나노바디, 단일 도메인 항체, 당단백질, 치료 단백질, 성장 인자, 응고 인자, 시토카인, 융합 단백질, 제약 약물 물질, 백신, 효소, 또는 스몰 모듈라 이뮤노파마슈티칼(Small Modular ImmunoPharmaceutical)™ (SMIP)로부터 선택된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 임의의 단백질이 본 발명에 따라 발현될 수 있다는 것을 이해할 것이고 그 또는 그녀의 특정한 필요에 기초하여 생산될 특정한 단백질을 선택할 수 있을 것이다.
항체
제약 또는 다른 상업용 작용제로서 현재 사용 중이거나 또는 연구 중인 다수의 항체를 고려하면, 항체의 생산은 본 발명에 따른 특히 관심있는 것이다. 항체는 특정한 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 단백질이다. 숙주 세포에서 발현될 수 있는 임의의 항체는 본 발명에 따라 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현될 항체는 모노클로날 항체이다.
일부 실시양태에서, 모노클로날 항체는 키메라 항체이다. 키메라 항체는 1종 초과의 유기체로부터 유래된 아미노산 단편을 함유한다. 키메라 항체 분자는, 예를 들어, 마우스, 래트, 또는 다른 종의 항체로부터의 항원 결합 도메인을 인간 불변 영역과 함께 포함할 수 있다. 키메라 항체를 제조하는 다양한 접근법이 기재되었다. 예를 들어, 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851 (1985); Takeda et al., Nature 314, 452 (1985)], 미국 특허 번호 4,816,567 (Cabilly et al.); 미국 특허 번호 4,816,397 (Boss et al.); 유럽 특허 공개 EP171496 (Tanaguchi et al.); 유럽 특허 공개 0173494, 영국 특허 GB 2177096B를 참조한다.
일부 실시양태에서, 모노클로날 항체는, 예를 들어, 리보솜-디스플레이 또는 파지-디스플레이 라이브러리의 사용 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,291,159 (Winter et al.) 및 미국 특허 번호 5,658,754 (Kawasaki) 참조) 또는 천연 면역계의 다른 성분은 무손상으로 남겨두면서 천연 항체 유전자가 불활성화되고 인간 항체 유전자로 기능적으로 대체된 이종이식 종의 사용 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,657,103 (Kucherlapati et al.) 참조)을 통해 유래된 인간 항체이다.
일부 실시양태에서, 모노클로날 항체는 인간화 항체이다. 인간화 항체는 대다수의 아미노산 잔기가 인간 항체로부터 유래되어, 인간 대상체에 전달될 경우 임의의 잠재적 면역 반응을 최소화하는 키메라 항체이다. 인간화 항체에서, 상보성 결정 영역 내의 아미노산 잔기는, 적어도 부분적으로, 목적하는 항원 특이성 또는 친화도를 부여하는 비-인간 종으로부터의 잔기로 대체된다. 이러한 변경된 이뮤노글로불린 분자는 관련 기술분야에 공지된 여러 기술 중 임의의 것에 의해 제조될 수 있고 (예를 들어, 문헌 [Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today, 4, 7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol., 92, 3-16 (1982)]), 바람직하게는 PCT 공개 WO92/06193 또는 EP 0239400의 교시에 따라 제조되며, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다. 인간화 항체는, 예를 들어, 스코트젠 리미티드(Scotgen Limited) (영국 미들섹스 트위크넘 홀리 로드 2)에 의해 상업적으로 생산될 수 있다. 추가 참조를 위해, 모두 본원에 참조로 포함된 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 상기 기재된 모노클로날, 키메라, 또는 인간화 항체는 자연에서 임의의 종에서 임의의 항체에서 자연 발생하지 않는 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 이들 외래 잔기는, 예를 들어, 모노클로날, 키메라 또는 인간화 항체에 신규 또는 변형된 특이성, 친화도 또는 이펙터 기능을 부여하는 데 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 기재된 항체는 전신 약물요법을 위한 약물, 예컨대 독소, 저분자량 세포독성 약물, 생물학적 반응 조절제, 및 방사성핵종에 접합될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kunz et al., Calicheamicin derivative-carrier conjugates, US20040082764 A1] 참조).
일반적으로, 본 발명의 실시자는 관심 단백질을 선택할 것이고, 그의 정확한 아미노산 서열을 알 것이다. 본 발명에 따라 발현될 임의의 주어진 단백질은 그 자체의 특정한 특징을 가질 수 있고 배양된 세포의 세포 밀도 또는 생존율에 영향을 미칠 수 있고, 동일한 배양 조건 하에 성장한 또 다른 단백질보다 더 낮은 수준으로 발현될 수 있고, 수행된 정확한 배양 조건 및 단계에 따라 상이한 생물학적 활성을 가질 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 세포 성장 및 임의의 주어진 발현된 단백질의 생산 및/또는 활성 수준을 최적화하기 위해 본 발명의 교시에 따라 특정한 단백질을 생산하는 데 사용된 단계 및 조성물을 적절하게 변형시킬 수 있을 것이다.
숙주 세포 내로의 단백질의 발현을 위한 유전자의 도입
일반적으로, 세포 내로 도입된 핵산 분자는 본 발명에 따라 발현되도록 요구되는 단백질을 코딩한다. 대안적으로, 핵산 분자는 세포에 의한 목적하는 단백질의 발현을 유도하는 유전자 산물을 코딩할 수 있다. 예를 들어, 도입된 유전 물질은 내인성 또는 이종 단백질의 전사를 활성화시키는 전사 인자를 코딩할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 도입된 핵산 분자는 세포에 의해 발현된 단백질의 번역 또는 안정성을 증가시킬 수 있다.
포유동물 숙주 세포 내로의 관심 단백질의 발현을 달성하기에 충분한 핵산의 도입에 적합한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 각각 본원에 참조로 포함된 문헌 [Gething et al., Nature, 293:620-625, 1981; Mantei et al., Nature, 281:40-46, 1979]; EP 117,060 (Levinson et al.); 및 EP 117,058을 참조한다. 포유동물 세포의 경우, 포유동물 세포 내로 유전 물질을 도입하는 통상의 방법은 문헌 [Graham and van der Erb (Virology, 52:456-457, 1978)]의 인산칼슘 침전 방법 또는 문헌 [Hawley-Nelson (Focus 15:73, 1993)]의 리포펙타민(lipofectamine)™ (깁코(Gibco) BRL) 방법을 포함한다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질전환의 일반적 측면이 악셀(Axel)에 의해 1983년 8월 16일에 허여된 미국 특허 번호 4,399,216에 기재되었다. 포유동물 세포 내로 유전 물질을 도입하는 다양한 기술의 경우, 문헌 [Keown et al., Methods in Enzymology, 1989, Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537, 1990, 및 Mansour et al., Nature, 336:348-352, 1988]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 도입될 핵산은 네이키드 핵산 분자의 형태이다. 예를 들어, 세포 내로 도입된 핵산 분자는 단지 단백질을 코딩하는 핵산 및 필요한 유전자 제어 요소로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 단백질을 코딩하는 핵산 (필요한 조절 요소를 포함함)은 플라스미드 벡터 내에 함유될 수 있다. 포유동물 세포에서의 단백질의 발현에 적합한 벡터의 비제한적 대표적인 예는 pCDNA1; pCD (문헌 [Okayama, et al. Mol. Cell Biol. 5:1136-1142, 1985] 참조); pMClneo 폴리-A (문헌 [Thomas, et al. Cell 51:503-512, 1987] 참조); 바큘로바이러스 벡터 예컨대 pAC 373 또는 pAC 610; CDM8 (문헌 [Seed, B. Nature 329:840, 1987] 참조); 및 pMT2PC (문헌 [Kaufman, et al. EMBO J. 6:187-195, 1987] 참조)를 포함하며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 세포 내로 도입될 핵산 분자는 바이러스 벡터 내에 함유된다. 예를 들어, 단백질을 코딩하는 핵산은 바이러스 게놈 (또는 부분 바이러스 게놈) 내로 삽입될 수 있다. 단백질의 발현을 지시하는 조절 요소는 바이러스 게놈 내로 삽입된 핵산과 함께 포함될 (즉, 바이러스 게놈 내로 삽입된 유전자에 연결될) 수 있거나 또는 바이러스 게놈 그 자체에 의해 제공될 수 있다.
네이키드 DNA는 DNA 및 인산칼슘을 함유하는 침전물을 형성함으로써 세포 내로 도입될 수 있다. 대안적으로, 네이키드 DNA는 또한 DNA 및 DEAE-덱스트란의 혼합물을 형성하고 혼합물을 세포와 함께 인큐베이션함으로써 또는 세포 및 DNA를 함께 적절한 완충제 중에서 인큐베이션하고 세포를 고전압 전기 펄스에 적용함으로써 (예를 들어, 전기천공에 의해) 세포 내로 도입될 수 있다. 세포 내로 네이키드 DNA를 도입하는 추가의 방법은 DNA를 양이온성 지질을 함유하는 리포솜 현탁액과 혼합하는 것에 의한다. 이어서, DNA/리포솜 복합체를 세포와 함께 인큐베이션한다. 네이키드 DNA는 또한, 예를 들어, 미세주사에 의해 세포 내로 직접 주사될 수 있다.
대안적으로, 네이키드 DNA는 또한 DNA를 세포-표면 수용체에 대한 리간드에 커플링된 양이온, 예컨대 폴리리신에 복합체화시킴으로써 세포 내로 도입될 수 있다 (예를 들어 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함된 문헌 [Wu, G. and Wu, C.H. J. Biol. Chem. 263:14621, 1988; Wilson et al. J. Biol. Chem. 267:963-967, 1992]; 및 미국 특허 번호 5,166,320 참조). 수용체에 대한 DNA-리간드 복합체의 결합은 수용체-매개 세포내이입에 의한 DNA의 흡수를 용이하게 한다.
특정한 핵산 서열, 예를 들어, 단백질을 코딩하는 cDNA를 함유하는 바이러스 벡터의 사용은 세포 내로 핵산 서열을 도입하는 통상의 접근법이다. 세포를 바이러스 벡터로 감염시키는 것은 대부분의 세포가 핵산을 수용한다는 이점을 갖고, 이는 핵산을 수용한 세포의 선택에 대한 필요성을 제거할 수 있다. 추가적으로, 예를 들어, 바이러스 벡터에 함유된 cDNA에 의해 바이러스 벡터 내에 코딩된 분자는 일반적으로 바이러스 벡터 핵산을 취한 세포에서 효율적으로 발현된다.
결손 레트로바이러스는 유전자 요법 목적을 위한 유전자 전달에 있어서의 용도에 대해 잘 특징화되어 있다 (검토를 위해 문헌 [Miller, A.D. Blood 76:271, 1990] 참조). 레트로바이러스 게놈 내로 삽입된 관심 단백질을 코딩하는 핵산을 갖는 재조합 레트로바이러스가 구축될 수 있다. 추가적으로, 레트로바이러스 게놈의 부분을 제거하여 레트로바이러스 복제가 결손이 있도록 만들 수 있다. 이어서, 이러한 복제 결손 레트로바이러스를 표준 기술에 의해 헬퍼 바이러스의 사용을 통해 표적 세포를 감염시키는 데 사용될 수 있는 비리온 내로 패키징한다.
아데노바이러스의 게놈은, 관심 단백질을 코딩하고 발현하지만 정상 용해 바이러스 생활 주기에서 복제하는 그의 능력의 관점에서 불활성화되도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Berkner et al. BioTechniques 6:616, 1988; Rosenfeld et al. Science 252:431-434, 1991; 및 Rosenfeld et al. Cell 68:143-155, 1992]을 참조한다. 아데노바이러스 균주 Ad 유형 5 dl324 또는 아데노바이러스의 다른 균주 (예를 들어, Ad2, Ad3, Ad7 등)로부터 유래된 적합한 아데노바이러스 벡터는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 재조합 아데노바이러스는 이들이 효과적인 유전자 전달 비히클이 되기 위해 세포가 분할되는 것을 필요로 하지 않고 기도 상피 (상기 인용된 문헌 [Rosenfeld et al., 1992]), 내피 세포 (Lemarchand et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6482-6486, 1992), 간세포 (Herz and Gerard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2812-2816, 1993) 및 근육 세포 (Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584, 1992)를 포함하는 매우 다양한 세포 유형을 감염시키는 데 사용될 수 있다는 점에서 유리하다. 추가적으로, 도입된 아데노바이러스 DNA (및 그에 함유된 외래 DNA)는 숙주 세포의 게놈 내로 통합되지 않지만 에피솜으로 유지되고, 이에 따라 도입된 DNA가 숙주 게놈 내로 통합된 (예를 들어, 레트로바이러스 DNA) 상황에서 삽입 돌연변이유발의 결과로서 발생할 수 있는 잠재적 문제를 피한다. 더욱이, 외래 DNA에 대한 아데노바이러스 게놈의 운반 능력은 다른 유전자 전달 벡터에 비해 크다 (최대 8 킬로염기) (상기 인용된 문헌 [Berkner et al.]; 문헌 [Haj-Ahmand and Graham, J. Virol. 57:267, 1986]). 현재 사용 중인 대부분의 복제-결손 아데노바이러스 벡터는 바이러스 E1 및 E3 유전자의 모두 또는 일부에 대해 결실되어 있지만 아데노바이러스 유전 물질의 80%만큼 보유한다.
아데노-관련 바이러스 (AAV)는 효율적인 복제 및 생산적인 생활 주기를 위한 헬퍼 바이러스로서 또 다른 바이러스, 예컨대 아데노바이러스 또는 포진 바이러스를 필요로 하는 자연 발생 결손 바이러스이다. (검토를 위해 문헌 [Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro. and Immunol., 158:97-129, 1992] 참조). 이는 또한 비-분할 세포 내로 그의 DNA를 통합시킬 수 있고, 높은 빈도의 안정한 통합을 나타내는 소수의 바이러스 중 하나이다 (예를 들어 문헌 [Flotte et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356, 1992; Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3828, 1989; 및 McLaughlin et al., J. Virol. 62:1963-1973, 1989] 참조). 적게는 300 염기 쌍의 AAV를 함유하는 벡터는 패키징되고 통합될 수 있다. 외인성 DNA를 위한 공간은 약 4.5 kb로 제한된다. 예컨대 문헌 [Tratschin et al. (Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260, 1985)]에 기재된 AAV 벡터가 세포 내로 DNA를 도입하는 데 사용될 수 있다. 다양한 핵산이 AAV 벡터를 사용하여 상이한 세포 유형 내로 도입되었다 (예를 들어 문헌 [Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470, 1984; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081, 1985; Wondisford et al., Mol. Endocrinol. 2:32-39, 1988; Tratschin et al., J. Virol. 51:611-619, 1984; 및 Flotte et al., J. Biol. Chem. 268:3781-3790, 1993] 참조).
세포의 집단 내로 핵산 분자를 도입하는 데 사용된 방법이 대부분의 세포의 변형 및 세포에 의한 단백질의 효율적인 발현을 일으키는 경우에, 변형된 세포의 집단은 집단 내의 개별 세포의 추가의 단리 또는 서브클로닝 없이 사용될 수 있다. 즉, 세포의 집단에 의한 단백질의 충분한 생산이 존재할 수 있고, 이에 따라 추가의 세포 단리는 요구되지 않고 집단은 단백질의 생산을 위해 세포 배양물을 시딩하는 데 즉시 사용될 수 있다. 대안적으로, 단백질을 효율적으로 생산하는 몇몇 세포 또는 단일 세포로부터 세포의 동종 집단을 단리시키고 확장하는 것이 바람직할 수 있다.
관심 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 세포 내로 도입하는 것에 대한 대안으로, 도입된 핵산은 세포에 의해 내인성으로 생산된 단백질의 발현의 수준을 유도하거나 또는 증가시키는 또 다른 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩할 수 있다. 예를 들어, 세포는 특정한 단백질을 발현할 수 있지만 세포의 추가의 처리 없이는 실패할 수 있다. 유사하게, 세포는 원하는 목적에 불충분한 양의 단백질을 발현할 수 있다. 따라서, 관심 단백질의 발현을 자극시키는 작용제가 세포에 의한 그러한 단백질의 발현을 유도하거나 또는 증가시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 도입된 핵산 분자는 관심 단백질의 전사를 활성화시키거나 또는 상향조절하는 전사 인자를 코딩할 수 있다. 이러한 전사 인자의 발현은 다시 관심 단백질의 발현, 또는 보다 강건한 발현으로 이어진다.
특정 실시양태에서, 단백질의 발현을 지시하는 핵산은 숙주 세포 내로 안정하게 도입된다. 특정 실시양태에서, 단백질의 발현을 지시하는 핵산은 숙주 세포 내로 일시적으로 도입된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 그 또는 그녀의 실험적 필요에 기초하여 세포 내로 핵산을 안정하게 또는 일시적으로 도입할 것인지를 선택할 수 있을 것이다.
관심 단백질을 코딩하는 유전자는 임의로 하나 이상의 조절성 유전자 제어 요소에 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 유전자 제어 요소는 단백질의 구성적 발현을 지시한다. 특정 실시양태에서, 관심 단백질을 코딩하는 유전자의 유도성 발현을 제공하는 유전자 제어 요소가 사용될 수 있다. 유도성 유전자 제어 요소 (예를 들어, 유도성 프로모터)의 사용은 세포에서 단백질의 생산의 조정을 허용한다. 진핵 세포에서 사용하기 위한 잠재적으로 유용한 유도성 유전자 제어 요소의 비제한적 예는 호르몬-조절 요소 (예를 들어, 문헌 [Mader, S. and White, J.H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5603-5607, 1993] 참조), 합성 리간드-조절 요소 (예를 들어 문헌 [Spencer, D.M. et al., Science 262:1019-1024, 1993] 참조) 및 이온화 방사선-조절 요소 (예를 들어, 문헌 [Manome, Y. et al., Biochemistry 32:10607-10613, 1993; Datta, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10149-10153, 1992] 참조)를 포함한다. 추가의 세포-특이적 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 조절 시스템이 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 교시에 따라 세포가 관심 단백질을 발현하도록 하는 유전자를 도입하는 방법을 선택하고, 임의로, 적절하게 변형시킬 수 있을 것이다.
발현된 단백질의 단리
일반적으로, 본 발명에 따라 발현된 단백질을 단리시키고/거나 정제하는 것이 전형적으로 바람직할 것이다. 특정 실시양태에서, 발현된 단백질은 배지 내로 분비되고 따라서 세포 및 다른 고체는 예를 들어, 정제 공정의 제1 단계로서 원심분리 또는 여과에 의해 제거될 수 있다.
대안적으로, 발현된 단백질은 숙주 세포의 표면에 결합될 수 있다. 예를 들어, 배지는 제거될 수 있고 단백질을 발현하는 숙주 세포는 정제 공정의 제1 단계로서 용해된다. 포유동물 숙주 세포의 용해는 유리 비드에 의한 물리적 파괴 및 높은 pH 조건에 대한 노출을 포함하는, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 임의의 수의 수단에 의해 달성될 수 있다.
발현된 단백질은 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화성, 크기 배제, 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피), 겔 여과, 원심분리, 또는 분별 용해도, 에탄올 침전을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 표준 방법 및/또는 단백질의 정제를 위한 임의의 다른 이용가능한 기술에 의해 단리되고 정제될 수 있다 (예를 들어, 각각 본원에 참조로 포함된 문헌 [Scopes, Protein Purification Principles and Practice 2nd Edition, Springer-Verlag, New York, 1987; Higgins, S.J. and Hames, B.D. (eds.), Protein Expression : A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; 및 Deutscher, M.P., Simon, M.I., Abelson, J.N. (eds.), Guide to Protein Purification : Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol. 182), Academic Press, 1997] 참조). 특히 면역친화성 크로마토그래피의 경우, 단백질은 그러한 단백질에 대해 생성되고 고정 지지체에 부착된 항체를 포함하는 친화성 칼럼에 그를 결합시킴으로써 단리될 수 있다. 대안적으로, 친화성 태그 예컨대 인플루엔자 코트 서열, 폴리-히스티딘, 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 표준 재조합 기술에 의해 단백질에 부착되어 적절한 친화성 칼럼을 걸친 통과에 의한 용이한 정제를 허용할 수 있다. 프로테아제 억제제 예컨대 페닐 메틸 술포닐 플루오라이드 (PMSF), 류펩틴, 펩스타틴 또는 아프로티닌은 정제 공정 동안 단백질의 분해를 감소시키거나 또는 제거하기 위해 임의의 또는 모든 단계에서 첨가될 수 있다. 프로테아제 억제제는 세포가 발현된 단백질을 단리시키고 정제하기 위해 용해되어야 하는 경우에 특히 유리하다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 정확한 정제 기술이 정제될 단백질의 특징, 그로부터 단백질이 발현되는 세포의 특징, 및/또는 세포가 성장한 배지의 조성에 따라 달라질 것이라는 것을 인지할 것이다.
제약 제제
본 발명의 특정 실시양태에서, 생산된 폴리펩티드 또는 단백질은 약리학적 활성을 가질 것이고 제약의 제조에 유용할 것이다. 이러한 생산된 폴리펩티드 또는 단백질은 대상체에게 투여될 수 있거나 또는 비경구 (예를 들어, 정맥내), 피내, 피하, 경구, 비강, 기관지, 안구, 경피 (국소), 경점막, 직장, 및 질 경로를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 임의의 이용가능한 경로에 의한 전달을 위해 먼저 제제화될 수 있다. 제약 조성물은 전형적으로 포유동물 세포주로부터 발현된 정제된 폴리펩티드 또는 단백질, 전달 작용제 (즉, 상기 기재된 바와 같은 양이온성 중합체, 펩티드 분자 수송체, 계면활성제 등)를 제약상 허용되는 담체와 조합하여 포함한다. 본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 담체"는 제약 투여와 상용성인 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
제약 조성물은 그의 의도된 투여 경로와 상용성이도록 제제화된다. 비경구, 피내, 또는 피하 적용에 사용된 용액 또는 현탁액은 하기 성분을 포함할 수 있다: 멸균 희석제 예컨대 주사용수, 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트화제 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 장성 조정제 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨을 사용하여 조정될 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 일회용 시린지 또는 다중 용량 바이알에 봉입될 수 있다.
주사가능한 용도에 적합한 제약 조성물은 전형적으로 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리 염수, 정박테리아수, 크레모포르 EL(Cremophor EL)™ (바스프(BASF) (뉴저지주 파시파니)) 또는 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 포함한다. 모든 경우에, 조성물은 멸균되어야 하고 용이한 시린지성이 존재하는 정도로 유체이어야 한다. 바람직한 제약 제제는 제조 및 보관 조건 하에 안정하고 미생물 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 일반적으로, 적절한 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅 예컨대 레시틴의 사용, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알콜 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물 중에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 지속 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물 중에 포함함으로써 이루어질 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 요구량의 정제된 폴리펩티드 또는 단백질을 상기 열거된 성분 중 하나 또는 그의 조합과 함께 적절한 용매 중에 혼입시키고, 필요에 따라, 이어서 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 포유동물 세포주로부터 발현된 정제된 폴리펩티드 또는 단백질을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터의 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 플러스 그의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조이다.
경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 경구 치료적 투여의 목적을 위해, 정제된 폴리펩티드 또는 단백질은 부형제와 혼입될 수 있고 정제, 트로키, 또는 캡슐, 예를 들어, 젤라틴 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강세정제로서의 사용을 위해 유체 담체를 사용하여 제조될 수 있다. 제약상 상용성인 결합제, 및/또는 아주반트 물질이 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캡슐, 트로키 등은 하기 성분 중 임의의 것, 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제 예컨대 미세결정질 셀룰로스, 트라가칸트 검 또는 젤라틴; 부형제 예컨대 전분 또는 락토스, 붕해제 예컨대 알긴산, 프리모겔, 또는 옥수수 전분; 윤활제 예컨대 스테아르산마그네슘 또는 스테로테스; 활택제 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 향미제 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지 향미제. 경구 전달을 위한 제제는 유리하게는 위장관 내에서의 안정성을 개선시키고/거나 흡수를 증진시키는 작용제를 혼입시킬 수 있다.
흡입에 의한 투여의 경우, 포유동물 세포주로부터 발현된 정제된 폴리펩티드 또는 단백질 및 전달 작용제를 포함하는 본 발명의 조성물은 바람직하게는 적합한 추진제, 예를 들어, 기체 예컨대 이산화탄소를 함유하는 가압 용기 또는 분배기, 또는 네뷸라이저로부터의 에어로졸 스프레이의 형태로 전달된다. 본 발명은 특히 비강 스프레이, 흡입기, 또는 상기도 및/또는 하기도로의 다른 직접 전달을 사용하는 조성물의 전달을 고려한다. 인플루엔자 바이러스에 대해 지시된 DNA 백신의 비강내 투여는 CD8 T 세포 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌고, 이는 호흡기도의 적어도 일부 세포가 이 경로에 의해 전달된 경우 DNA를 흡수할 수 있고, 본 발명의 전달 작용제가 세포 흡수를 증진시킬 것이라는 것을 나타낸다. 본 발명의 특정 실시양태에 따르면 포유동물 세포주로부터 발현된 정제된 폴리펩티드 및 전달 작용제를 포함하는 조성물은 에어로졸 투여를 위한 큰 다공성 입자로서 제제화된다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의한 것일 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 투과될 장벽에 적절한 침투제가 제제에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 경점막 투여의 경우, 세제, 담즙 염, 및 푸시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌제의 사용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여의 경우, 정제된 폴리펩티드 또는 단백질 및 전달 작용제는 일반적으로 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 연고, 살브, 겔, 또는 크림으로 제제화된다.
조성물은 또한 좌제 (예를 들어, 통상적인 좌제 베이스 예컨대 코코아 버터 및 다른 글리세리드를 포함함) 또는 직장 전달을 위한 정체 관장제의 형태로 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 폴리펩티드 또는 단백질을 신체로부터의 신속한 제거로부터 보호할 담체와 함께, 예컨대 이식물 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함한 제어 방출 제제로 제조된다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 물질은 또한 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼스, 인크.(Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 상업적으로 입수될 수 있다. 리포솜 현탁액 (감염된 세포에 표적화된 리포솜을 바이러스 항원에 대한 모노클로날 항체와 함께 포함함)이 또한 제약상 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,522,811에 기재된 바와 같은 방법에 따라 제조될 수 있다.
경구 또는 비경구 조성물을 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 유리하다. 본원에 사용된 바와 같은 투여 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합화된 물리적 이산 단위를 지칭하고; 각각의 단위는 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 폴리펩티드 또는 단백질을 요구되는 제약 담체와 함께 함유한다.
본 발명에 따라 발현된 폴리펩티드 또는 단백질은 필요에 따라 다양한 간격으로 및 상이한 기간에 걸쳐, 예를 들어, 약 1 내지 10주, 2 내지 8주, 약 3 내지 7주, 약 4, 5, 또는 6주 등 동안 1주에 1회 투여될 수 있다. 통상의 기술자는 질환 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 대상체의 전반적 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 다른 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는 특정 인자가 대상체를 효과적으로 치료하는 데 요구되는 투여량 및 시기에 영향을 미칠 수 있다는 것을 인지할 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 또는 단백질을 사용한 대상체의 치료는 단일 치료를 포함할 수 있거나, 많은 경우에, 연속 치료를 포함할 수 있다. 적절한 용량은 폴리펩티드 또는 단백질의 효력에 따라 달라질 수 있고 임의로 특정한 수용자에 대해, 예를 들어, 사전 선택된 목적하는 반응이 달성될 때까지 증가하는 용량의 투여를 통해 조정될 수 있다는 것이 추가로 이해된다. 임의의 특정한 동물 대상체에 대한 구체적 용량 수준이 사용되는 구체적 폴리펩티드 또는 단백질의 활성, 대상체의 연령, 체중, 전반적 건강, 성별, 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 배출 속도, 임의의 약물 조합물, 및 조정될 발현 또는 활성의 정도를 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다는 것이 이해된다.
본 발명은 비인간 동물의 치료를 위한 조성물의 용도를 포함한다. 따라서, 투여 용량 및 방법은 수의학적 약리학 및 의약의 공지된 원리에 따라 선택될 수 있다. 안내는, 예를 들어, 문헌 [Adams, R. (ed.), Veterinary Pharmacology and Therapeutics, 8th edition, Iowa State University Press; ISBN: 0813817439; 2001]에서 찾아볼 수 있다.
제약 조성물은 투여 지침서와 함께 용기, 팩, 또는 분배기에 포함될 수 있다.
실시예
실시예 1
다양한 농도의 L-티로신 (티로신 2Na2H2O)), PVA (세키스이 케미칼 캄파니(Sekisui Chemical Co), 셀볼TM 203) 및 플루로닉(Pluronic) F68 (콜리포르(Kolliphor) P188, 시그마(Sigma)) 및 고정 농도의 Ala, Arg, Asn, Asp, 시스틴, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val을 포함하는 배지를 공급 배지 A를 출발 물질로서 사용하여 제조하였다. 배지를 5 g/L PVA 및 3 또는 12 mM Tyr을 포함하는 배지의 경우 표 1, PVA가 없고, 5 g/L 플루로닉 F68 및 3 또는 12 mM Tyr을 포함하는 배지의 경우 표 2 및 PVA, 플루로닉 F68이 없고 3 또는 12 mM Tyr을 포함하는 배지의 경우 표 3에 기재된 절차에 따라 제조하였다. 배지의 나머지는 상응하는 PVA, 플루로닉 F68 및 Tyr 농도를 얻기 위해 상기 6개의 배지를 혼합함으로써 제조하였다. 모든 배지는 1000-1300 mOsm의 최종 오스몰농도 및 7.1-7.3의 pH를 가졌다. 모든 배지를 0.2 μm 필터 단위를 통해 멸균 여과하고 0.2 μm 날젠(Nalgen) 필터 병에 저온 (2-8℃)에서 빛으로부터 보호하며 보관하였다.
표 1 - 5 g/L PVA, 3 mM 또는 12 mM Tyr을 포함하는 배지
표 2 5 g/L 플루로닉 F68, 3 mM Tyr 또는 12 mM Tyr을 포함하는 배지
표 3 PVA, 플루로닉 F68이 없고, 3 mM Tyr 또는 12 mM Tyr을 포함하는 배지
제조업체 지침서에 따른 2100P 탁도계 (하크)에 의한 탁도 측정을 위해 표 4에 제시된 날에 샘플을 취하였다. D0은 모든 조건에서의 배지 보관에 대한 시작일이다. 침전물을 갖는 배지는 침전 후 샘플링 시간의 나머지 동안 탁도 측정을 위해 샘플링되지 않았지만, 계속해서 저온 (2 내지 8℃) 및 어두운 곳에 보관하였다. 50 NTU 이상의 탁도를 갖는 배지에서 침전이 가시적이다.
표 4
T: 탁도 (NTU), P: 침전, >Lim: 한계치 초과
5 NTU 미만의 탁도가 정상이다.
PVA가 없고 6mM 초과의 농도의 티로신을 포함하는 배지는 4일 내에 침전물을 형성하였다 (샘플 3 및 4 참조). 플루로닉 F68을 포함하는 모든 배지는 보관 기간 (4주) 동안 침전물이 형성되었고, 보다 높은 티로신 농도를 갖는 배지는 보다 낮은 티로신 농도를 갖는 것보다 더 일찍 침전물이 형성되었다. PVA의 존재 하에, 탁도는 낮게 유지되었고 침전물은 심지어 보관 27일 후에도 관찰되지 않는다.
Claims (30)
- 적어도 4 mM의 농도의 티로신 및 폴리비닐알콜 (PVA)을 포함하는 세포 배양 배지.
- 제1항에 있어서, 티로신의 농도가 적어도 5 mM인 세포 배양 배지.
- 제1항에 있어서, 티로신의 농도가 적어도 10 mM인 세포 배양 배지.
- 제1항에 있어서, 티로신의 농도가 5 내지 20mM인 세포 배양 배지.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, PVA의 농도가 적어도 0.5g/L인 세포 배양 배지.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, PVA의 농도가 0.5 내지 5 g/L인 세포 배양 배지.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, PVA의 농도가 2.5 g/L인 세포 배양 배지.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지가 무혈청 배지인 세포 배양 배지.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배지가 단백질 무함유 배지인 세포 배양 배지.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 탁도가 빛의 부재 하에 4℃에서 2주 보관 후 5NTU 미만인 세포 배양 배지.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 침전물이 빛의 부재 하에 4℃에서 2주 보관 후 본질적으로 관찰되지 않는 것인 세포 배양 배지.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 4 내지 10mM Ala, 30 내지 60mM Arg, 50 내지 90mM Asn, 10 내지 30mM Asp, 2 내지 40mM Glu, 2 내지 15mM Gly, 8 내지 20mM His, 25 내지 32mM Ile, 35 내지 60mM Leu, 28 내지 60mM Lys, 9 내지 25mM Met, 10 내지 30mM Phe, 15 내지 40mM Pro, 44 내지 80mM Ser, 20 내지 45mM Thr, 2 내지 10mM Trp 및 20 내지 50mM Val을 포함하는 세포 배양 배지.
- 포유동물 세포를 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 세포 배양 배지와 접촉시키는 것을 포함하는 세포 배양 방법.
- 제13항에 있어서, 포유동물 세포가 BALB/c 마우스 골수종 세포주, 인간 망막모세포 (PER.C6), 원숭이 신장 세포, 인간 배아 신장 세포주 (293), 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK), 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO), 마우스 세르톨리 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76), 인간 자궁경부 암종 세포 (HeLa), 개 신장 세포, 버팔로 래트 간 세포, 인간 폐 세포, 인간 간 세포, 마우스 유방 종양 세포, TRI 세포, MRC 5 세포, FS4 세포, 또는 인간 간세포암 세포주 (Hep G2)로부터 선택된 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 포유동물 세포가 CHO 세포인 방법.
- 제15항에 있어서, 포유동물 세포가 GS-CHO 세포인 방법.
- 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양이 유가식 배양인 방법.
- 제17항에 있어서, 유가식 배양이 공급 배지로 보충된 기초 배지를 포함하는 것인 방법.
- 제18항에 있어서, 단지 기초 배지만이 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 배지인 방법.
- 제18항에 있어서, 단지 공급 배지만이 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 배지인 방법.
- 제18항에 있어서, 기초 배지 및 공급 배지가 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 배지인 방법.
- 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 동안 최대 생존 세포 밀도가 1 x 106개 세포/mL 초과인 방법.
- 제22항에 있어서, 최대 생존 세포 밀도가 5 x 106개 세포/mL, 1 x 107개 세포/mL, 5 x 107개 세포/mL, 1X108개 세포/mL 또는 5X108개 세포/mL 초과인 방법.
- 제13항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지의 부피가 적어도 500L인 방법.
- 제24항에 있어서, 세포 배양 배지의 부피가 적어도 5000L인 방법.
- 제13항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 재조합 단백질을 발현하는 것인 방법.
- 제26항에 있어서, 재조합 단백질이 항체 또는 그의 단편, 나노바디, 단일 도메인 항체, 스몰 모듈라 이뮤노파마슈티칼(Small Modular ImmunoPharmaceutical)™ (SMIP), VHH 항체, 낙타류 항체, 상어 단일 도메인 폴리펩티드 (IgNAR), 단일 도메인 스캐폴드 (예를 들어, 피브로넥틴 스캐폴드), 스콜피온(SCORPION)™ 치료제 (N-말단 결합 도메인, 이펙터 도메인, 및 C-말단 결합 도메인을 포함하는 단일 쇄 폴리펩티드), 성장 인자, 응고 인자, 시토카인, 융합 단백질, 제약 약물 물질, 백신, 효소 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
- 제26항 또는 제27항에 있어서, 세포에 의해 생산된 재조합 단백질을 수득하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제28항에 있어서, 재조합 단백질을 정제하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제29항에 따른 방법에 의해 수득된 정제된 재조합 단백질을 제약상 허용되는 담체와 조합하여 포함하는 제약 조성물.
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