WO2022060015A1 - 세포 배양용 마이크로-캐리어 및 그 제조방법 - Google Patents

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WO2022060015A1
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micro
particles
carrier
phase composition
particle
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PCT/KR2021/012358
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김민채
김예지
김지선
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주식회사 엘지화학
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    • C12M47/04—Cell isolation or sorting
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    • C12N2537/10—Cross-linking

Definitions

  • the present application relates to a micro-carrier and a method for manufacturing the same. Specifically, the present application relates to a micro-carrier that can be used for cell culture and a method for preparing the same.
  • micro-carrier-related cell culture technology cells with adherence are cultured using micro-carriers in a 3D bioreactor. Specifically, the cells, the culture medium, and the micro-carrier are put into the bioreactor, the cell and the micro-carrier are contacted while the culture solution is stirred, and the cells are attached to the surface of the micro-carrier and cultured. At this time, in order to be suitable for mass culture of cells, the micro-carrier must have a high surface area/volume to which cells can attach and proliferate.
  • micro-carriers currently used commercially have a size of 100 to 300 ⁇ m and a density of about 1.1 to 1.3 g/cm 3 . And, the density of cells cultured after attachment to the carrier is about 1.2 g/cm 3 . Due to the density of the carrier and cells, it is advantageous to attach the cells to the carrier at the initial stage of culturing the cells in the bioreactor, but it is difficult to apply centrifugation when separating and recovering the cells after culturing. Therefore, in addition to centrifugation, a separate filtering method capable of separating and recovering cells based on the micro-carrier and cell size should be used.
  • the filtering method based on the size of carriers and cells shows problems such as clogging the filter as the process is repeated, taking a long time, causing physical damage and contamination of cells, and loss of cells during the filtering process.
  • the density range of carriers that can be implemented is limited, so adhesion between the micro-carriers and cells is not sufficient, and the culture efficiency is also poor.
  • micro-carrier-related technology that can be evenly dispersed in the culture medium, which is advantageous for cell adhesion and culture, and can easily separate and recover cells after culture.
  • One object of the present application is to provide a micro-carrier used for cell culture.
  • Another object of the present application is to provide a micro-carrier having a high degree of uniformity in shape or shape.
  • Another object of the present application is to provide porous micro-carrier particles having the properties described below.
  • Another object of the present application is to provide a micro-carrier, which is advantageous for cell adhesion and culture, and enables the micro-carrier and cells to be more easily separated after culture.
  • Another object of the present application is to provide a composition comprising a cell and the micro-carrier.
  • the present application relates to a method for manufacturing a porous micro-carrier particle.
  • the method may include mixing the continuous phase composition (A) and the dispersed phase composition (B), and performing suspension polymerization.
  • micro-carrier particle means a particle having a micro-level size (diameter), a particle group including the particle, or a particle group consisting of such particle.
  • a particle population comprising individual particles having a length in the longest dimension of their shape in the range of 50 to 400 ⁇ m can be provided. The size may be measured in the same way as described below.
  • the particle diameter is less than 50 ⁇ m, the culture efficiency may be lowered because the surface area for cell culture is small.
  • the particle diameter exceeds 400 ⁇ m the density of the adhered cells is low, and the interaction between the adhered cells is insufficient, so that the culture efficiency may be lowered.
  • porosity may mean at least a characteristic of particles having voids therein.
  • dispersed phase composition means a composition capable of forming a dispersed phase (or droplets) after mixing with the continuous phase composition.
  • continuous phase composition refers to a composition capable of forming a continuous phase after mixing with the dispersed phase composition.
  • the temperature at which the manufacturing process is performed (or each manufacturing step) or the temperature at which the numerical properties of the manufactured particles are calculated or measured may be room temperature.
  • room temperature is a temperature in a state that is not particularly heated or reduced, and may mean, for example, a temperature in the range of 15 to 30 °C.
  • the inventor of the present application when a continuous phase (composition) satisfying predetermined conditions is used for the production of micro-carrier particles, has high uniformity of shape and uniformity of size, has lower density characteristics than normally cultured cells, and has surface flatness It was confirmed through an experiment that excellent and porous carrier particles could be secured with a high recovery rate.
  • the manufacturing method according to the present application includes a continuous phase composition (A) that simultaneously satisfies the following conditions 1 and 2; and after mixing the polymerizable monomer-containing dispersed phase composition (B), performing suspension polymerization.
  • the suspension polymerization may be performed at the interface between the continuous phase and the dispersed phase (ie, the surface of the dispersed phase droplets) and/or inside the dispersed phase formed after mixing the dispersed phase composition and the continuous phase composition.
  • the surface tension related to condition 1 may be measured at room temperature according to a ring method.
  • the viscosity related to Condition 2 may be measured according to the shear rate. Specifically, the viscosity may be measured in the range of 66 to 264 1 / s shear rate and room temperature conditions.
  • the upper limit of the viscosity of the continuous phase composition may be, for example, 5.0 cp or less, 4.5 cp or less, 4.0 cp or less, 3.5 cp or less, 3.0 cp or less, or 2.5 cp or less.
  • the continuous phase composition (A) may include water and poly(vinyl alcohol) (PVA).
  • PVA poly(vinyl alcohol)
  • the water may be distilled water or deionized water.
  • the continuous phase composition (A) may be a mixture of water and polyvinyl alcohol. That is, the continuous phase composition (A) may consist of only water and polyvinyl alcohol.
  • the polyvinyl alcohol (PVA) may have an average weight molecular weight (MW) in a predetermined range and a hydrolyzed degree in a predetermined range.
  • the weight average molecular weight of the polyvinyl alcohol may be in the range of 80,000 to 190,000. More specifically, the lower limit of the weight average molecular weight is, for example, 85,000 or more, and the upper limit is, for example, 180,000 or less, 175,000 or less, 170,000 or less, 165,000 or less, 160,000 or less, 155,000 or less, 150,000 or less, 145,000 or less , 140,000 or less, 135,000 or less, 130,000 or less, or 125,000 or less.
  • the degree of hydration of the polyvinyl alcohol may be in the range of 80 to 99%. More specifically, the lower limit of the degree of hydration may be, for example, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, or 85% or more, and the upper limit thereof is, for example, 98% or less, 97% or less. , 96% or less, 95% or less, 94% or less, 93% or less, 92% or less, 91% or less, or 90% or less.
  • the weight average molecular weight may be measured using GPC, and the hydration degree may be measured using 1H-NMR.
  • Polyvinyl alcohol satisfying the above molecular weight and hydration degree enables the continuous phase composition (A) to satisfy conditions 1 and 2.
  • the weight average molecular weight of PVA satisfies the above range
  • entanglement or aggregation of the molecular chain also increases at an appropriate level, which is advantageous in securing the viscosity (condition 2) of the continuous phase.
  • the PVA satisfies the weight average molecular weight in the above range, it is considered advantageous in securing the surface tension (condition 1) of the continuous phase described above while the surface tension increases due to an increase in intermolecular force.
  • the degree of hydration affects the degree of solubility or hydrophilicity (or hydrophobicity) in water.
  • PVA satisfying the above weight average molecular weight and degree of hydration secures the above-mentioned conditions 1 and 2, and the dispersed phase is It is thought that it acts advantageously to form stably.
  • the concentration of polyvinyl alcohol in the continuous phase composition (A) may be 1.0% or more.
  • the content of polyvinyl alcohol may be 1.0% by weight or more based on the total weight (100% by weight) of the continuous phase composition.
  • the upper limit of the polyvinyl alcohol concentration may be, for example, less than 5.0%, more specifically 4.5% or less, 4.0% or less, 3.5% or less, 3.0% or less, 2.5% or less, or 2.0% or less. there is.
  • the polymerizable monomer (b1) included in the dispersed phase composition (B) may be a styrene monomer.
  • Polystyrene or a polystyrene-based polymer (polymer) is produced by suspension polymerization with respect to a styrene monomer. That is, the carrier particles prepared according to the method of the present application may be polystyrene particles or polystyrene-based particles.
  • the styrene (b1) is included in the dispersed phase as much as the amount excluding the total content of other components (eg, oil, initiator, and/or crosslinking agent) of the dispersed phase composition described below among the total dispersed phase composition content (100% by weight). may be included in the composition.
  • the dispersed phase composition may contain the styrene (b1) in an amount of 60% by weight or more, 65% by weight or more, 70% by weight or more, or 75% by weight or more in the total content of the dispersed phase composition (100% by weight). there is.
  • the upper limit of the content of styrene (b1) may be, for example, less than 90 wt%, 85 wt% or less, or 80 wt% or less.
  • the dispersed phase composition (B) may further include a crosslinking agent in addition to the styrene monomer.
  • a crosslinking agent for example, an ethylenically unsaturated crosslinking agent (b2) containing a vinyl functional group may be used.
  • the ethylenically unsaturated crosslinking agent (b2) is divinylbenzene, N-vinyl pyrrolidone, N,N-dimethyl acrylamide, (meth)acrylic acid, acrylamide, N-octyl acrylamide, vinyl acetate and It may include a mixture of two or more of these. Considering the density of the prepared carrier and the cell culture process, it may be preferable to use divinylbenzene as the ethylenically unsaturated crosslinking agent.
  • the dispersed phase composition (B) may include 3 to 300 parts by weight of an ethylenically unsaturated crosslinking agent based on 100 parts by weight of the styrene monomer.
  • an ethylenically unsaturated crosslinking agent based on 100 parts by weight of the styrene monomer.
  • the content of the ethylenically unsaturated crosslinking agent is less than 3 parts by weight, the crosslinking density of the styrene particles is excessively reduced, so that it is difficult to stably maintain the spherical shape of the particles.
  • the content exceeds 300 parts by weight, the crosslinking density is excessively increased, so that it is difficult to secure a density level of particles suitable for cell culture and centrifugation.
  • the content of the styrene monomer may be excessive relative to the content of the ethylenically unsaturated crosslinking agent in the dispersed phase composition.
  • the ethylenically unsaturated crosslinking agent may be used in an amount of 80 parts by weight or less, 70 parts by weight or less, 60 parts by weight or less, 50 parts by weight or less, or 40 parts by weight or less.
  • the lower limit of the content of the ethylenically unsaturated crosslinking agent may be, for example, 3 parts by weight or more, specifically, for example, 5 parts by weight or more, 10 parts by weight or more, 15 parts by weight or more, 20 parts by weight or more, or It may be 25 parts by weight or more.
  • the dispersed phase composition (B) may include a hydrocarbon oil (b3).
  • a hydrocarbon oil (b3) expanded styrene particles were prepared using a foaming agent to lower the density of micro-carrier particles.
  • the foaming agent when used, the particle diameter and density distribution range is too wide, so it has a diameter and density suitable for cell culture. It was not easy to obtain carrier particles in sufficient yield.
  • the hydrocarbon oil (b3) in the dispersed phase composition (B) there is no need to perform a foaming process in relation to lowering the density of the carrier particles. That is, the particles of the present application are non-foaming particles.
  • the hydrocarbon oil may exit the dispersed phase during the suspension polymerization process performed while stirring the mixture of the dispersed phase and the continuous phase.
  • the micro-carrier particles can have porosity and at the same time have low density properties.
  • the density of the micro particles may be lowered because the hydrocarbon oil has a low density and does not participate in the suspension polymerization as described below. That is, the present application performed without foaming can more precisely control the diameter and density distribution range of the carrier particles.
  • the low-density carrier particles obtained using the hydrocarbon oil do not sink to the bottom of the culture medium or float to the surface of the culture solution, and can maintain a state evenly dispersed in the culture solution.
  • the particles of the present application can improve the degree of suspension of carrier particles in the culture medium, increase the adhesion of the carrier particles and cells, and increase the culture efficiency.
  • the type of hydrocarbon oil that can be used in the dispersion phase is not particularly limited, but may be selected in consideration of the ease of carrying out the manufacturing method or securing the characteristics of carrier particles to be described later.
  • a low-density hydrocarbon oil having an upper limit of density of 0.800 g/cm 3 or less or 0.790 g/cm 3 or less may be used.
  • the lower limit of the density of the low-density hydrocarbon oil is not particularly limited, but may be, for example, 0.750 g/cm 3 or more or 0.760 g/cm 3 or more.
  • the hydrocarbon oil may include one or more linear or branched saturated hydrocarbon compounds having 12 or more carbon atoms and 50 or less carbon atoms.
  • the hydrocarbon oil may include, for example, normal alkane having 12 to 16 carbon atoms, isoalkane having 12 to 16 carbon atoms, or a mixture thereof.
  • dodecane having 12 carbon atoms, hexadecane having 16 carbon atoms, or Isopar M (a mixture of isoalkane having 12 or more and 14 or less carbon atoms and isoalkane having 13 or more and 16 carbon atoms) is used as a hydrocarbon oil.
  • Isopar M a mixture of isoalkane having 12 or more and 14 or less carbon atoms and isoalkane having 13 or more and 16 carbon atoms
  • the dispersed phase composition (B) may include 10 to 30% by weight of the hydrocarbon oil based on the total weight (100% by weight) of the dispersed phase composition.
  • the lower limit of the content of the hydrocarbon oil is 11% by weight or more, 12% by weight or more, 13% by weight or more, 14% by weight or more, or 15% by weight or more
  • the upper limit is, for example, 25% by weight or less or 20% by weight or more. % or less.
  • the hydrocarbon oil is used below the content range, it is difficult to secure carrier particles with low density characteristics, and if the hydrocarbon oil is used in excess of the content range, it is difficult to obtain spherical particles and the uniformity of the particle shape is not good. .
  • the dispersed phase composition (B) may further include an initiator (b4).
  • the type of initiator is not particularly limited as long as it does not interfere with securing particle properties according to the manufacturing method of the present application.
  • an initiator such as an organic peroxide initiator or an azo initiator may be used.
  • the content of the initiator is not particularly limited. An appropriate amount of the initiator may be used at a level that does not interfere with securing the desired properties of the particles.
  • the dispersed phase composition (B) may contain the initiator in an amount ranging from 0.10 to 5.00% by weight, 0.50 to 4.00% by weight, or 1.00 to 3.00% by weight. there is.
  • the styrene and the crosslinking agent may be included in the dispersed phase composition by the amount remaining after excluding the total content of other components (eg, oil, initiator, etc.) described above among the total dispersed phase composition content (100% by weight).
  • the total content of the styrene (b1) and the crosslinking agent may be 60% by weight or more, 65% by weight or more, 70% by weight or more, or 75% by weight or more, and the sum
  • the upper limit of the content may be, for example, less than 90 wt%, 85 wt% or less, or 80 wt% or less.
  • the content of the continuous-phase composition (A) and the powder-phase composition (B) can be adjusted at a level that is suitable for forming droplets of a uniform dispersed phase, performing suspension polymerization, and not hindering the securing of properties of the following particles.
  • the ratio (W B /W A ) between the weight of the continuous phase composition (W A ) and the weight of the dispersed phase composition (W B ) can be in the range of 0.05 to 0.30. More specifically, the ratio may range from 0.10 to 0.25.
  • the suspension polymerization may be performed under conditions that do not hinder the securing of particle properties according to the manufacturing method of the present application.
  • the suspension polymerization may be performed at a temperature of 80 to 95 °C and a speed of 300 to 900 rpm.
  • the suspension polymerization may be performed under nitrogen purging conditions.
  • the time for which the suspension polymerization is performed is not particularly limited.
  • suspension polymerization may be carried out for several hours, specifically, about 3 to 10 hours.
  • the method comprises the steps of mixing the continuous phase composition (A) and the dispersed phase composition (B) and then applying a shear force to homogenize the dispersed phase composition (B) in the form of droplets in the continuous phase composition (A); and suspension polymerization of the dispersed phase composition.
  • Descriptions related to suspension polymerization are the same as described above.
  • the homogenizing of the dispersed phase composition (B) in the form of droplets may be performed through stirring at room temperature.
  • the stirring speed made at room temperature is not particularly limited, but, for example, may be in the range of 300 rpm to 900 rpm.
  • the method may further include adding the continuous phase composition (A) during suspension polymerization.
  • a mixture of polyvinyl alcohol and water may be additionally added during suspension polymerization.
  • the suspension polymerization in progress may mean after the above-described suspension polymerization conditions (temperature and speed) are formed, or the polymerization rate related to suspension polymerization is in the range of at least 5% to 70%. You may.
  • polyvinyl alcohol was additionally added, it was confirmed that the flatness of the prepared particles was improved, and the ratio of single-shaped particles among the entire prepared particles was increased (see the contents of Example 3 in Tables 1 and 2).
  • Improved flatness means fewer defects on the particle surface caused by particle agglomeration and segregation. This is considered to be because the aggregation between particles is suppressed by the continuous phase composition additionally added during suspension polymerization related to the dispersed phase.
  • Components constituting the additionally added continuous phase composition (A) and other properties are the same as described above.
  • the method may further include forming a primer layer and/or a cell adhesion inducing layer on the surface of the suspension polymerization reactant (carrier particle) after the suspension polymerization reaction is completed.
  • the primer layer enables the introduction of a functional polymer to the surface of the micro-carrier particle having no functional group, and serves as a so-called adhesive layer.
  • the cell adhesion inducing layer or cells can be stably maintained on the particle via the primer layer.
  • a catechol derivative capable of inducing water-phase adhesion may be used.
  • any one selected from the group consisting of L-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), dopamine, norepinephrine, epinephrine, epigallocatechin and derivatives thereof One or more may be used to form the primer layer.
  • L-DOPA L-dihydroxyphenylalanine
  • the primer layer formed including the compound imparts hydrophilicity to the surface of the particles, thereby further enhancing the dispersibility of the particles in the aqueous dispersion, which is a continuous phase.
  • the ratio of the radius of the polystyrene-based particles to the thickness between the primer layer may be 1: 0.00001 to 1: 0.01, or 1: 0.0001 to 1: 0.001.
  • the ratio of the radius of the polystyrene-based particles to the thickness of the surface coating layer is too low, the effect of modifying the microcarrier surface to hydrophilicity is insignificant because the primer layer is too thin compared to the polystyrene-based particles.
  • the adhesion efficiency of cells and microcarriers may be reduced.
  • the cell adhesion inducing layer is composed of cell adhesion substances, which serve to provide a site where transmembrane proteins of cells can bind. Thereby, adherent cells can be stably adhered, spread, and cultured.
  • cell adhesion substances which serve to provide a site where transmembrane proteins of cells can bind.
  • adherent cells can be stably adhered, spread, and cultured.
  • the cell adhesion-inducing layer formed including the compound may improve the water dispersibility of the carrier by modifying the surface of the (polystyrene) particle to be hydrophilic.
  • the method may further include a washing step after the suspension polymerization reaction is completed. Impurities irrelevant to carrier particles that are suspension polymers can be removed by washing.
  • the washing method is not particularly limited, and a known washing method may be used.
  • the washing may be performed while adding a suspension polymer to alcohol such as ethanol and stirring. Although not particularly limited, such washing may be repeated, for example, three or more times.
  • the washing may be performed after forming a primer layer and/or a cell adhesion inducing layer on the surface of the carrier particle.
  • the method may further include a drying step after the washing.
  • the solvent residue and the like can be removed by drying.
  • the drying method is not particularly limited, and a known drying method may be used.
  • the drying may be performed using an oven or at room temperature conditions.
  • the drying may be performed in a vacuum.
  • the method may further include washing and drying the suspension polymerization after completion of the suspension polymerization reaction.
  • washing and drying is the same as described above.
  • Particles prepared according to the method described above may have properties suitable for cell culture.
  • the method can provide particles with high shape or shape uniformity.
  • the particles prepared according to the method of the present application may have a single shape at least 80% of the total number of manufactured particles. That is, according to the method, the ratio of single-shaped particles among all the manufactured particles may satisfy 80% or more.
  • single shape means a particle having no satellite particles on its surface. Compared to particles with satellite particles on their surface, single-shaped particles can have a larger surface area, which is advantageous for cell adhesion.
  • the method may provide spherical particles.
  • the spherical shape generally means having a shape close to a spherical shape, and can be confirmed with the naked eye.
  • the particles have a spherical shape, a large surface area can be secured and the cell adhesion performance of the carrier can be improved.
  • the particles produced according to the present application may have a spherical shape, or at least the single-shaped particle may have a spherical shape.
  • V p is the volume of the particle
  • a P is the surface area of the particle.
  • the method may provide porous particles having one or more pores having a size of 0.5 ⁇ m or more or 1 ⁇ m or more therein.
  • the pores may be identified through particle analysis using a scanning electron microscope (SEM).
  • SEM scanning electron microscope
  • the size of the void may be the longest (imaginary) straight line distance connecting both ends of the void visible from the cross-section of the particle (eg, when looking at the particle from the outside of the particle).
  • the shape or distribution of pores may vary depending on the movement of hydrocarbon oil during suspension polymerization with respect to the dispersed phase droplets.
  • one or more voids may be present within the particle in various shapes.
  • the upper limit of the pore size may vary depending on the size of the entire particle, but may be, for example, 5 ⁇ m or less, 4.5 ⁇ m or less, 4.0 ⁇ m or less, 3.5 ⁇ m or less, 3.0 ⁇ m or less, 2.5 ⁇ m or less, or 2.0 ⁇ m or less.
  • the porous particles obtained according to the embodiment of the present application may be particles having a porosity or porosity calculated by Equation 2 below about 15.0% or less.
  • the lower limit of the porosity of the particles may be, for example, greater than 0%, greater than 1%, greater than 2%, greater than 3%, greater than 4%, or greater than 5%. This porosity is related to the density properties of the particles.
  • porosity ⁇ 1-(apparent density/true density) ⁇ x 100
  • the apparent density is the density obtained using the volume of the particle(s) including the particles and the inter-particle space
  • the true density is the density obtained using the volume of only the particles excluding the space.
  • the density can be measured with a Helium pycnometer (Micromeritics), and the apparent density can be measured through an ethanol flotation method as described in the experimental example below.)
  • the method comprises particles having a size on the micrometer level (in the range of about 50 to 400 ⁇ m), specifically particles having a diameter in the range of 90 to 250 ⁇ m, more specifically particles in the range of 110 to 210 ⁇ m.
  • the method may provide single-shaped spherical particles having a diameter in the range of 90 to 250 ⁇ m.
  • the diameter may be measured using a particle size analyzer (PSA).
  • PSD particle size analyzer
  • the diameter may be an arithmetic average of values calculated for at least 100 particles.
  • the diameter may be a diameter of a single-shaped particle.
  • the method may provide particles having a density within the range of 0.95 g/cm 3 to 1.00 g/cm 3 .
  • a method of confirming the density of the particles is not particularly limited.
  • the density of the particles can be checked by checking whether the particles float or settle after the particles are added to a solution having a predetermined density.
  • the carrier particles prepared according to the present application exhibit low density characteristics.
  • the difference in sedimentation rate due to gravity may be greater than using conventional carrier particles, and therefore, it is better to separate micro-carriers and cells more easily.
  • the lower limit of the density of the micro-carrier particles may be 0.95 g/cm 3 or greater, and the upper limit thereof may be 0.995 g/cm 3 or less.
  • the size of the micro-carrier particles exceeds 0.995 g/cm 3 and approaches 1.00 g/cm 3 or becomes larger than that, the difference in density between the cells and the micro-carriers is small.
  • micro-carrier particles becomes smaller than 0.95 g/cm 3 and approaches 0.90 g/cm 3 , it is difficult to attach cells to the micro-carrier particles at the beginning of the culture, and it is not suitable for culture.
  • the method of the present application can provide particles of the above characteristics with a recovery in the range of 70 to 95%.
  • the recovery rate of particles can be calculated as described in the experimental examples below.
  • the carrier particles prepared according to the present application as described above may be used for cell culture.
  • micro-carrier particles As another example related to the present application, the present application relates to micro-carrier particles.
  • the micro-carrier particles may be prepared by the method described above.
  • the porous micro-carrier particles may include polystyrene, that is, the micro-carrier particles obtained by suspension polymerization of a styrene monomer may be polystyrene particles or polystyrene-based particles.
  • the polystyrene may be a polymer of a styrene monomer and an ethylenically unsaturated crosslinking agent.
  • the polystyrene may be a suspension polymerization reaction product (poly(styrene-co-divinylbenzene)) of a styrene monomer and a divinylbenzene crosslinking agent.
  • the micro-carrier particle may further include a primer layer and/or a cell adhesion inducing layer on its surface. The description regarding this is the same as that described above.
  • the micro-carrier particles may be particles satisfying a single shape in 80% or more of the total particles, based on the number.
  • the description of the single shape is the same as described above.
  • the micro-carrier particle may have a spherical shape.
  • the description of the spherical shape is the same as described above.
  • the micro-carrier particle may be porous.
  • the description of porosity and voids is the same as described above.
  • the micro-carrier particles may have pores of 5 ⁇ m or less.
  • the pores may be formed inside the particles.
  • the lower limit of the void may be, for example, 0.5 ⁇ m or more or 1 ⁇ m or more.
  • the upper limit may be, for example, 4.5 ⁇ m or less, 4.0 ⁇ m or less, 3.5 ⁇ m or less, 3.0 ⁇ m or less, 2.5 ⁇ m or less, or 2.0 ⁇ m or less.
  • the micro-carrier particles may have a diameter in the range of 90 to 250 ⁇ m. Specifically, the diameter of the particles having a single shape among the micro-carrier particles may satisfy the range of 90 to 250 ⁇ m. Description of the carrier-particle diameter is the same as described above.
  • the micro-carrier particles may have a density in the range of 0.95 g/cm 3 to 1.00 g/cm 3 . Description of the carrier-particle density is the same as described above.
  • the micro-carrier particle may simultaneously satisfy two or more of the above-described shape, porosity, density and/or size characteristics.
  • the present application may relate to a cell culture composition comprising the above-described carrier particles and cells.
  • the type of the cell is not particularly limited.
  • the cells included in the culture composition may be adherent animal cells, specifically fibroblasts, chondrocytes, mesenchymal stem cells, CHO, HEK 293, vero cells, BHK21 or MDCK cells.
  • the cell culture composition may further include a medium solution.
  • the medium solution may contain various additives to sufficiently satisfy environmental conditions such as nutrients and pH, temperature, and osmotic pressure close to the conditions of the living body based on body fluids such as plasma or lymph.
  • various additives to sufficiently satisfy environmental conditions such as nutrients and pH, temperature, and osmotic pressure close to the conditions of the living body based on body fluids such as plasma or lymph.
  • various materials widely known in the art of cell culture may be used without limitation.
  • the micro-carriers and cells may have a smaller density than the medium solution.
  • the carrier particles may have a density within the range of 0.95 g/cm 3 to 1.00 g/cm 3
  • the cells are 1.10 to 1.25 g/cm 3 (about 1.2 g/cm 3 ) ) can have a range of densities.
  • the low-density carrier particles injected into the medium solution can be suspended in the medium solution, and as the number of cells adhering to the surface of the suspended carrier particles gradually increases, the density of the micro-carriers to which the cells are attached also gradually increases, so that the medium solution It can sink to the bottom of the container it contains.
  • the cultured cells can be secured by separating the cells from the micro-carrier-cell complex through centrifugation.
  • the present application may relate to a method for producing a cell culture composition.
  • the method for preparing the cell culture composition may include mixing micro-carrier particles, cells, and a medium solution.
  • the method for preparing the cell culture composition includes the steps of preparing the above-described micro-carrier particles; and mixing the micro-carrier particles, cells and medium solution.
  • the description of the micro-carrier particles, cells, and medium solution is the same as described above.
  • a micro-carrier with a high degree of uniformity in shape or shape, porosity, and advantageous for cell culture and centrifugation; And a composition comprising the same is provided.
  • Example 1 is an SEM image of some of the particles prepared in Examples 1-3.
  • a white bar indicated in the lower right corner of each image means 150 ⁇ m in size.
  • FIG. 2 is an SEM image of some of the particles prepared in Comparative Examples 1 to 5.
  • a white bar indicated in the lower right corner of each image means 150 ⁇ m in size.
  • Comparative Example 4 since particles of 1 mm or larger were obtained as in Table 2, the particles were not compared through the image in which 150 ⁇ m-sized white bars were shown.
  • FIG. 3 is a view showing the internal structure of the particles prepared according to Example 1. Specifically, it is confirmed that pores having a size of about 1 to 3 ⁇ m are formed inside the particles prepared according to the embodiment.
  • the prepared particles were recovered through a 100 ⁇ m sieve, washed with ethanol 5 times, and dried at room temperature.
  • the surface tension was measured according to the ring method. Specifically, the surface tension was measured at room temperature using a platinum ring and a surface tension meter (Surface Electro Optics).
  • Viscosity was measured according to the shear rate. Specifically, the viscosity was measured in the range of 66 to 264 1/s shear rate and room temperature (about 25° C.) conditions using a rotational viscometer LVDV2T instrument (Brookfield Corporation).
  • the degree of hydration of the measured PVA was measured using 1H-NMR.
  • a hydrogen peak in ethylene decreases, and a hydrogen peak in a hydroxyl group increases.
  • the dispersed phase When the dispersed phase is regarded as the oil phase and the continuous phase is regarded as the water phase, it refers to the weight (W B ) ratio of the dispersed phase based on the weight of the continuous phase (W A ).
  • Example 1 Example 2 Example 3 Comparative Example 1 Comparative Example 2 Comparative Example 3 Comparative Example 4 Comparative Example 5 Oil/Water fraction (WB/WA) 0.20 0.15 0.14 0.10 0.10 0.15 0.15 0.15 dispersed phase St: DVB (weight ratio)1) 1: 0.33 1: 0.33 1: 0.33 1: 0.33 1: 0.33 1: 0.33 1: 0.33 1: 0.33 1: 0.33 Oil content (wt%) 2) 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 BPO content (wt%)3) 2.06 2.06 2.06 2.06 2.06 2.06 2.06 2.06 2.06 t-BP content (wt%)4) 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 continuous phase Water content (g) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Concentration of PVA(or PVP)(%)5) PVA 1.01% PVA 2% PVA 2% (1% + 1% 6)) PVA 0.6% PVA 0.8% PVA 1.01% PVP 1.01% PVP 1.01% of PVA (
  • reference numerals 1) to 10) are as follows.
  • PVA is added at a concentration of 1% in the continuous phase, and a continuous phase composition with a concentration of PVA of 1% is additionally added during suspension polymerization (when the polymerization rate is about 10%)
  • the ratio of the solid content (recovered polystyrene particles) to the substances (styrene and divinylbenzene) that actually participated in the polymerization of polystyrene particles was calculated as in Equation 3 below.
  • the recovery rate of particles is related to the stability of the dispersed phase in the suspension polymerization system. Specifically, when the stability of the dispersed phase is ensured, the dispersed phase is not broken during polymerization and can be polymerized into particles. Such stability may vary depending on the components forming the dispersed phase and the continuous phase and whether conditions 1 and 2 are satisfied.
  • the carrier particles obtained in Examples and Comparative Examples were added to the aqueous ethanol solution having a density of 0.95 g/cm 3 and an aqueous ethanol solution having a density of 0.99 g/cm 3 to each. Then, after confirming whether the carrier particles floated or settled, the density was evaluated based on the following criteria.
  • the density of the particles may be determined according to the presence or absence of the use of hydrocarbon oil, its content, and the residual in the dispersed phase of the hydrocarbon oil according to the satisfaction of conditions 1 and 2.
  • the surface tension of the continuous phase affects the interfacial tension between the dispersed phase and the continuous phase and the shape or size of the dispersed phase.
  • the viscosity of the continuous phase affects the movement of the dispersed phase during agitation related to suspension polymerization. As in condition 2, an appropriate level of viscosity reduces collisions and cracks between droplets or particles, and the shape of particles (flatness or single-shaped particles) ) also has a positive effect.
  • SEM scanning electron microscopy
  • the high ratio of single-shaped particles is related to less aggregation of particles due to particle collision during suspension polymerization.
  • the viscosity of the continuous phase under condition 2 is related to the movement of the dispersed phase.
  • Example 1 With respect to the cell culture microcarrier obtained in Example 1, the internal structure of the particle was confirmed through SEM. Specifically, after embedding the particles in epoxy, a cross section was prepared through ion milling, and the shape of the particle cross section was confirmed through SEM.
  • Example 1 Example 2 Example 3 Comparative Example 1 Comparative Example 2 Comparative Example 3 Comparative Example 4 Comparative Example 5 Particle recovery (%) 75.3 74.2 88.0 48.5 50.0 66.8 N.A. 94.8 Particle Density (g/cm 3 ) 0.95 - 0.99 range 0.95 - 0.99 range 0.95 - 0.99 range 0.95 - 0.99 range 0.95 - 0.99 range 0.95 - 0.99 range N.A.
  • Comparative Examples 4 and 5 comparing Comparative Examples 4 and 5 with Examples, it can be seen that when PVP is used, the particle size of the particles made by suspension polymerization is excessively large or the particle size distribution is excessively wide.
  • the high recovery rate of Comparative Example 5 is because the weight of the particles is considered when calculating the recovery rate, and the weight of the large particles (size greater than 300 ⁇ m) prepared in Comparative Example 5 is relatively large.
  • the molecular weight of the PVP used in Comparative Example 4 is quite small compared to the molecular weight of the PVP used in Comparative Example 5. Therefore, in Comparative Example 4, the steric effect between the PVPs is weak, and the aggregation between particles is excessive. As a result, the particle size was very large, and it was difficult to confirm the individual particle density or recovery rate.
  • the present application can provide porous carrier particles having a single shape, spherical shape, low density characteristics, and excellent flatness at a high recovery rate.

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Abstract

본 출원은 세포 배양용 마이크로-캐리어 입자, 입자의 제조방법 및 입자를 포함하는 세포 배양액 조성물에 관한 것이다. 본 출원에 따르면, 형상 또는 형태의 균일한 정도가 높고, 다공성이며, 세포 부착과 배양된 세포 분리에 유리한 마이크로-캐리어가 제공된다.

Description

세포 배양용 마이크로-캐리어 및 그 제조방법
관련출원(들)과의 상호인용
본 출원은 2020년 09월 15일 자 한국 특허 출원 제10-2020-0118532호 및 2021년 09월 09일 자 한국 특허 출원 제10-2021-0120325호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
기술분야
본 출원은 마이크로-캐리어 및 그 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 출원은 세포 배양에 사용될 수 있는 마이크로-캐리어 및 그 제조방법에 관한 것이다.
바이오 의약품 및 재생 의료 분야가 확장됨에 따라, 세포, 조직, 미생물 등을 효율적으로 생산할 수 있는 세포 대량 배양 기술에 대한 요구가 증대하고 있다. 예를 들어, 마이크로-캐리어를 이용하여 세포를 배양하는 기술에 대한 개발이 활발해지고 있다.
마이크로-캐리어 관련 세포 배양 기술에서는, 부착성을 갖는 세포가 3D 바이오리액터(bioreactor) 내에서 마이크로-캐리어를 이용하여 배양된다. 구체적으로, 바이오리액터 내에 세포, 배양액 및 마이크로-캐리어를 넣어 배양액을 교반하면서 세포와 마이크로-캐리어를 접촉시키고, 세포를 마이크로-캐리어의 표면에 부착시켜 배양한다. 이때, 세포의 대량 배양에 적합하도록, 마이크로-캐리어는 세포가 부착하여 증식할 수 있는 높은 표면적 비율(surface area/volume)을 가져야 한다.
한편, 현재 상업적으로 이용되는 마이크로-캐리어는 그 크기가 100 내지 300 μm 이고, 밀도가 약 1.1 내지 1.3 g/cm3 이다. 그리고, 캐리어에 부착 후 배양되는 세포의 밀도는 약 1.2 g/cm3 정도이다. 이러한 캐리어와 세포의 밀도로 인해 바이오리액터 내에서 세포를 배양하는 초기에는 세포를 캐리어에 부착하는 것이 유리하지만, 배양 후 세포를 분리 및 회수할 시에는 원심분리를 적용하는 것이 어렵다. 따라서, 원심분리 외에, 마이크로-캐리어와 세포의 크기에 근거하여 세포를 분리 및 회수할 수 있는 별도의 필터링 방법을 이용해야 한다. 그러나 캐리어와 세포의 크기에 근거한 필터링 방법은 공정을 반복할수록 필터가 막히고, 공정 시간이 오래 걸리며, 세포의 물리적 손상과 오염을 유발하고, 필터링 과정에서 세포가 손실되는 문제를 보인다. 이러한 문제를 해결하기 위해 밀도가 1.0 g/cm3 보다 작거나 1.3 g/cm3 보다 큰 재료(마이크로-캐리어 골격을 형성하는 중합체 또는 중합 성분)의 특성을 이용하여 마이크로-캐리어를 제조하는 것이 고려될 수 있다. 그러나, 이러한 경우에도 구현할 수 있는 캐리어의 밀도 범위가 제한적이어서 마이크로-캐리어와 세포 간 부착이 충분치 못하고, 배양 효율도 좋지 못하다. 예를 들어, 캐리어와 세포를 포함하는 배양액을 교반할 시에, 캐리어의 밀도가 너무 낮으면 교반에도 불구하고 대부분의 캐리어가 배양액 표면으로 뜨고, 캐리어의 밀도가 너무 높으면 교반에도 불구하고 대부분의 캐리어가 배양액 바닥으로 가라앉기 때문에, 캐리어에 대한 세포 부착이 좋지 못하고 배양 효율이 저하된다.
따라서, 배양액 중에 고르게 분산될 수 있어 세포 부착과 배양에 유리하면서도, 배양후에는 세포에 대한 분리 회수를 쉽게 할 수 있도록 하는 마이크로-캐리어 관련 기술을 개발하는 것이 필요하다.
본 출원의 일 목적은, 세포 배양에 사용되는 마이크로-캐리어를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 형상 또는 형태의 균일한 정도가 높은 마이크로-캐리어를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은, 후술하는 특성의 다공성의 마이크로-캐리어 입자를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은, 세포 부착과 배양에 유리하고, 배양 후 마이크로-캐리어와 세포를 보다 손쉽게 분리할 수 있게 하는 마이크로-캐리어를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은, 세포 및 상기 마이크로-캐리어를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 상기 목적 및 기타 그 밖의 목적은 하기 상세히 설명되는 본 출원에 의해 모두 해결될 수 있다.
본 출원에 관한 일례에서, 본 출원은 다공성 마이크로-캐리어 입자의 제조방법에 관한 것이다. 상기 방법은 연속상 조성물(A) 및 분산상 조성물(B)을 혼합하고, 현탁중합을 진행하는 단계를 포함할 수 있다.
본 출원에서 「마이크로-캐리어 입자」란, 마이크로 수준의 크기(직경)를 갖는 입자, 그러한 입자를 포함하는 입자 군 또는 그러한 입자로 이루어진 입자 군을 의미한다. 예를 들어, 본 출원에 따르면, 그 형상에서 가장 긴 차원의 길이가 50 내지 400 μm 범위 내에 있는 개별 입자를 포함하는 입자 군이 제공될 수 있다. 상기 크기는 후술하는 것과 동일한 방법으로 측정될 수 있다. 입자 직경이 50 μm 미만인 경우에는 세포 배양에 관한 표면적이 작기 때문에 배양 효율이 낮아질 수 있다. 또한, 상기 입자 직경이 400 μm를 초과하는 경우에는 부착된 세포의 밀도가 낮고, 부착된 세포 간 상호 작용이 충분치 못하기 때문에 배양 효율이 낮아질 수 있다.
본 출원에서 「다공성」이란, 적어도 그 내부에 공극을 갖는 입자의 특성을 의미할 수 있다.
본 출원에서 「분산상 조성물」은, 연속상 조성물과 혼합된 후에 분산상(또는 액적)을 형성할 수 있는 조성물을 의미한다.
본 출원에서 「연속상 조성물」은, 분산상 조성물과 혼합된 후에 연속상을 형성할 수 있는 조성물을 의미한다.
본 출원에서, 특별히 달리 정의하거나 설명하지 않는 이상, 제조 과정이 수행되는 온도(또는 각 제조 단계)나 제조된 입자가 갖는 수치 특성이 계산 또는 측정되는 온도는 상온일 수 있다. 구체적으로, 본 출원에서 「상온」이란, 특별히 가온 또는 감온되지 않은 상태의 온도로서, 예를 들어, 15 내지 30 ℃ 범위의 온도를 의미할 수 있다.
본 출원의 발명자는, 소정 조건을 만족하는 연속상(조성물)을 마이크로-캐리어 입자 제조에 사용하는 경우, 형태의 균일성과 크기의 균일성이 높고, 통상 배양되는 세포 보다 저밀도 특성을 가지며, 표면 평탄성이 우수하고, 다공성인 캐리어 입자를 높은 회수율로 확보할 수 있음을 실험을 통해 확인하였다.
이하, 구체적으로 본 출원의 제조방법을 설명한다.
본 출원에 따른 제조방법은, 하기 조건 1 및 조건 2를 동시에 만족하는 연속상 조성물(A); 및 중합성 단량체 함유 분산상 조성물(B)을 혼합한 후, 현탁중합을 진행하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 현탁중합은 분산상 조성물과 연속상 조성물을 혼합한 후 형성된 연속상과 분산상의 계면(즉, 분산상 액적의 표면) 및/또는 분산상 내부에서 이루어질 수 있다.
[조건 1]
45 mN/m < 연속상 조성물의 표면 장력(surface tension) ≤ 54 mN/m
[조건 2]
연속상 조성물의 점도(viscosity) ≥ 2.0 cp
본 출원의 구체예에 따르면, 상기 조건 1과 관련된 표면 장력은 링 메소드(ring method)에 따라 상온에서 측정될 수 있다.
본 출원의 구체예에 따르면, 상기 조건 2와 관련된 점도는 전단속도에 따라 측정될 수 있다. 구체적으로, 상기 점도는 66 내지 264 1/s 전단 속도 범위 및 상온 조건에서 측정될 수 있다. 특별히 제한되지는 않으나, 상기 연속상 조성물의 점도 상한은 예를 들어, 5.0 cp 이하, 4.5 cp 이하, 4.0 cp 이하, 3.5 cp 이하, 3.0 cp 이하 또는 2.5 cp 이하일 수 있다.
상기 조건 1과 조건 2를 동시에 만족하는 경우, 아래 설명되는 본 출원의 목적에 적합한 입자를 높은 수율로 제공할 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 연속상 조성물(A)은 물(water)과 폴리비닐알코올(poly(vinyl alchol))(PVA)을 포함할 수 있다. 특별히 제한되는 것은 아니나, 물은 증류수 또는 탈이온수일 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 연속상 조성물(A)은 물과 폴리비닐알코올의 혼합물일 수 있다. 즉, 상기 연속상 조성물(A)은 물과 폴리비닐알코올만으로 이루어질 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 폴리비닐알코올(PVA)은 소정 범위의 중량평균분자량(average weight molecular weight: MW) 및 소정 범위의 수화도(hydrolyzed degree)를 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 폴리비닐알코올의 중량평균분자량은 80,000 내지 190,000 범위 일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 중량평균분자량의 하한은, 예를 들어, 85,000 이상이고, 그 상한은 예를 들어, 180,000 이하, 175,000 이하, 170,000 이하, 165,000 이하, 160,000 이하, 155,000 이하, 150,000 이하, 145,000 이하, 140,000 이하, 135,000 이하, 130,000 이하 또는 125,000 이하일 수 있다. 그리고, 상기 폴리비닐알코올의 수화도는 80 내지 99 % 범위일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 수화도의 하한은 예를 들어, 81 % 이상, 82 % 이상, 83 % 이상, 84 % 이상 또는 85 % 이상일 수 있고, 그 상한은 예를 들어, 98 % 이하, 97 % 이하, 96 % 이하, 95 % 이하, 94 % 이하, 93 % 이하, 92 % 이하, 91 % 이하 또는 90 % 이하일 수 있다. 상기 중량평균분자량은 GPC를 이용하여 측정될 수 있고, 상기 수화도는 1H-NMR을 이용하여 측정될 수 있다.
상기 분자량과 수화도를 만족하는 폴리비닐알코올은 연속상 조성물(A)이 조건 1과 조건 2를 만족할 수 있게 한다. 구체적으로, PVA의 중량평균분자량이 상기 범위를 만족하는 경우 고분자 사슬의 길이가 증가하면서 분자사슬의 엉킴이나 뭉침 역시 적정 수준에서 증가하여 상술한 연속상의 점도(조건 2)를 확보하는데 유리하다. 또한, PVA가 상기 범위의 중량평균분자량을 만족하는 경우 분자간 힘이 증가하여 표면 장력이 증가하면서 상술한 연속상의 표면 장력(조건 1)을 확보하는데 유리한 것으로 생각된다. 또한, 수화도(검화도)는 물에 대한 용해도나 친수성(또는 소수성) 정도에 영향을 주는데, 상기 중량평균분자량과 수화도를 만족하는 PVA는 상술한 조건 1과 조건 2를 확보하고, 분산상이 안정적으로 형성되는데 유리하게 작용하는 것으로 생각된다.
하나의 예시에서, 상기 연속상 조성물(A) 중에서, 폴리비닐알코올의 농도는 1.0 % 이상일 수 있다. 예를 들어, 물과 폴리비닐알코올의 혼합물인 연속상 조성물이 사용되는 경우, 연속상 조성물 전체 중량(100 중량%)을 기준으로, 폴리비닐알코올의 함량은 1.0 중량% 이상일 수 있다. 특별히 제한되지는 않으나, 폴리비닐알코올 농도의 상한은, 예를 들어, 5.0 % 미만, 보다 구체적으로는 4.5 % 이하, 4.0 % 이하, 3.5 % 이하, 3.0 % 이하, 2.5 % 이하 또는 2.0 % 이하일 수 있다. 상기 범위를 만족하는 폴리비닐알코올을 사용하는 경우, 상기 조건 1과 조건 2를 동시에 만족하는 연속상 조성물을 얻는데 유리하다.
하나의 예시에서, 상기 분산상 조성물(B)이 포함하는 중합성 단량체(b1)는 스티렌 단량체일 수 있다. 스티렌 단량체에 대한 현탁중합에 의해, 폴리스티렌 또는 폴리스티렌계 중합체(고분자)가 생성된다. 즉, 본 출원의 방법에 따라 제조된 캐리어 입자는 폴리스티렌 입자 또는 폴리스티렌계 입자일 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 스티렌(b1)은, 전체 분산상 조성물 함량(100 중량%) 중에서 아래 설명되는 분산상 조성물의 다른 성분(예: 오일, 개시제, 및/또는 가교제) 합계 함량을 제외한 나머지 함량만큼 분산상 조성물에 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 분산상 조성물은, 전체 분산상 조성물 함량(100 중량%) 중에서, 상기 스티렌(b1)을 60 중량% 이상, 65 중량% 이상, 70 중량% 이상 또는 75 중량% 이상 함량으로 포함할 수 있다. 그리고, 상기 스티렌(b1)의 함량 상한은, 예를 들어, 90 중량% 미만, 85 중량% 이하 또는 80 중량% 이하일 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 분산상 조성물(B)은, 스티렌 단량체 외에, 가교제를 더 포함할 수 있다. 스티렌 단량체만을 중합 성분으로 사용할 경우, 입자를 형성하는 폴리스티렌 고분자의 가교 밀도가 감소하고, 그 결과 캐리어 입자가 구형상을 유지하는 것이 어려울 수 있다. 제조된 입자가 구형상을 갖는 경우 넓은 표면적을 확보할 수 있고, 비구형 대비 캐리어에 대한 세포 부착 성능이 높다. 가교제로는 예를 들어, 비닐 작용기를 포함하는 에틸렌계 불포화 가교제(b2)가 사용될 수 있다.
하나의 예시에서, 에틸렌계 불포화 가교제(b2)는 디비닐벤젠, N-비닐 피롤리돈, N,N-다이메틸 아크릴아미드, (메트)아크릴산, 아크릴아미드, N-옥틸 아크릴아미드, 비닐 아세테이트 및 이들 중 2 이상의 혼합물을 포함할 수 있다. 제조된 캐리어의 밀도와 세포 배양 공정 등을 고려할 때, 에틸렌계 불포화 가교제로는 디비닐벤젠이 사용되는 것이 바람직할 수 있다.
하나의 예시에서 상기 분산상 조성물(B)은, 스티렌 단량체 100 중량부 대비, 3 내지 300 중량부의 에틸렌계 불포화 가교제를 포함할 수 있다. 에틸렌계 불포화 가교제의 함량이 3 중량부 미만인 경우에는 스티렌 입자의 가교 밀도가 지나치게 감소하여 입자의 형태가 구형상을 안정적으로 유지하기 어렵다. 또한, 그 함량이 300 중량부를 초과하는 경우에는 가교 밀도가 지나치게 증가하여 세포 배양 및 원심분리에 적합한 입자의 밀도 수준을 확보하기 어렵다.
하나의 예시에서, 상기 분산상 조성물에서 에틸렌계 불포화 가교제 함량 대비 스티렌 단량체의 함량이 과량일 수 있다. 예를 들어, 스티렌 단량체 100 중량부 대비, 에틸렌게 불포화 가교제는 80 중량부 이하, 70 중량부 이하, 60 중량부 이하, 50 중량부 이하 또는 40 중량부 이하로 사용될 수 있다. 이 경우, 상기 에틸렌게 불포화 가교제의 함량 하한은 예를 들어, 3 중량부 이상일 수 있고, 구체적으로는 예를 들어, 5 중량부 이상, 10 중량부 이상, 15 중량부 이상, 20 중량부 이상 또는 25 중량부 이상일 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 분산상 조성물(B)은 탄화수소 오일(b3)을 포함할 수 있다. 종래 기술에서는 마이크로-캐리어 입자의 밀도를 낮추고자 발포제를 사용하여 발포 스티렌 입자를 제조하였으나, 발포제 사용시에는 입자의 직경과 밀도의 분포 범위가 지나치게 넓어지기 때문에, 세포 배양용도에 적합한 직경과 밀도를 갖는 캐리어 입자를 충분한 수율로 얻는 것이 쉽지 않았다. 그러나, 분산상 조성물(B)에 탄화수소 오일(b3)을 사용하는 본 출원에서는, 캐리어 입자의 밀도를 낮추는 것과 관련하여 발포 공정을 수행할 필요가 없다. 즉, 본 출원의 입자는 비발포 입자이다.
구체적으로, 상기 탄화수소 오일은, 분산상과 연속상의 혼합물을 교반하면서 이루어지는 현탁중합 과정 중에, 분산상을 빠져나올 수 있다. 그 결과, 마이크로-캐리어 입자는 다공성을 가질 수 있고, 동시에 낮은 밀도 특성을 가질 수 있다. 또한, 현탁중합 중 탄화수소 오일이 분산상 내에 잔류하더라도, 탄화수소 오일은 아래 설명하는 것과 같이 그 밀도가 낮고 현탁중합에 참여하지 않기 때문에, 마이크로 입자의 밀도가 낮아질 수 있다. 즉, 발포처리 없이 수행되는 본 출원은 캐리어 입자의 직경과 밀도 분포 범위를 보다 정밀하게 조절할 수 있다. 나아가, 본 출원의 구체예에 따라, 탄화수소 오일을 사용하여 얻어진 저밀도 캐리어 입자는 배양액 바닥에 가라앉거나 배양액 표면으로 부유하지 않고, 배양액 중에 고르게 분산된 상태를 유지할 수 있다. 결과적으로, 본 출원의 입자는, 배양액 내 캐리어 입자의 부유 정도를 개선하여, 캐리어 입자와 세포의 부착을 증가시키고, 배양효율도 높일 수 있다.
분산상에 사용 가능한 상기 탄화수소 오일의 종류는 특별히 제한되지 않으나, 제조방법 수행의 용이성이나 후술하는 캐리어 입자의 특성 확보를 고려하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 밀도의 상한이 0.800 g/cm3 이하 또는 0.790 g/cm3 이하인 저밀도 탄화수소 오일이 사용될 수 있다. 이때, 상기 저밀도 탄화수소 오일의 밀도 하한은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어, 0.750 g/cm3 이상 또는 0.760 g/cm3 이상일 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 탄화수소 오일은 탄소수 12 이상 50 이하인 직쇄 또는 분지쇄의 포화탄화수소 화합물을 1 이상 포함할 수 있다. 구체적으로, 탄화수소 오일은, 예를 들어, 탄소수 12 내지 16 의 노말알케인이나 탄소수 12 내지 16 의 이소알케인, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 본 출원의 구체예에 따르면, 탄소수 12의 도데칸, 탄소수 16의 헥사데칸, 또는 Isopar M(탄소수 12 이상 14 이하의 이소알케인과 탄소수 13 이상 16 이하의 이소알케인의 혼합물)이 탄화수소 오일로 사용될 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 분산상 조성물(B)은, 분산상 조성물 전체 중량(100 중량%)을 기준으로, 상기 탄화수소 오일을 10 내지 30 중량% 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 탄화수소 오일의 함량 하한은 11 중량% 이상, 12 중량% 이상, 13 중량% 이상, 14 중량% 이상 또는 15 중량% 이상이고, 그 상한은 예를 들어, 25 중량% 이하 또는 20 중량% 이하일 수 있다. 상기 함량 범위로 오일을 사용함으로써, 세포 배양과 원심분리에 적합한 밀도의 입자를 얻는 것과 같이, 오일 사용에 따른 효과를 확보할 수 있다. 예를 들어, 탄화수소 오일이 상기 함량 범위 미만으로 사용되면 저밀도 특성의 캐리어 입자를 확보하기 어렵고, 상기 함량 범위를 초과하여 탄화수소 오일이 사용되면 구형상 입자를 얻기 어려워지고 입자 형상의 균일성이 좋지 못하다.
하나의 예시에서, 상기 분산상 조성물(B)은 개시제(b4)를 더 포함할 수 있다. 본 출원의 제조방법에 따른 입자 특성 확보에 장애가 되지 않는다면 개시제의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 유기 퍼옥사이드 개시제나 아조기 개시제와 같은 개시제가 사용될 수 있다. 구체적으로는, 벤조일 퍼옥사이드, 다이-t-아밀 퍼옥사이드, t-부틸 퍼옥시벤조에이트, 2,5-다이메틸-2,5 다이-(t-부틸퍼옥시)헥산, 2,5-다이메틸-2,5-다이-(t-부틸퍼옥시)헥신-3 또는 다이-쿠밀 퍼옥사이드와 같은 화합물, 및 이들의 혼합물이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개시제의 함량은 특별히 제한되지 않는다. 목적하는 입자의 특성 확보에 장애가 되지 않는 수준에서 적절한 함량만큼 개시제가 사용될 수 있다. 예를 들어, 분산상 조성물 전체 중량(100 중량%)을 기준으로, 상기 분산상 조성물(B)은 0.10 내지 5.00 중량%, 0.50 내지 4.00 중량%, 또는 1.00 내지 3.00 중량% 범위로 상기 개시제를 포함할 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 스티렌과 가교제는, 전체 분산상 조성물 함량(100 중량%) 중에서 상기 설명된 다른 성분(예: 오일, 개시제 등)의 합계 함량을 제외한 나머지 함량만큼 분산상 조성물에 포함될 수 있다. 예를 들어, 전체 분산상 조성물 함량(100 중량%) 중에서, 상기 스티렌(b1)과 가교제의 합계 함량은 60 중량% 이상, 65 중량% 이상, 70 중량% 이상 또는 75 중량% 이상일 수 있고, 상기 합계 함량의 상한은, 예를 들어, 90 중량% 미만, 85 중량% 이하 또는 80 중량% 이하일 수 있다. 이러한 경우, 스티렌과 가교제 간 상대적인 함량 비율은 앞서 설명한 비율(스티렌 단량체 : 에틸렌계 불포화 가교제 = 100 중량부 : 3 내지 300 중량부) 범위를 만족할 수 있다.
상기 연속상 조성물(A)과 분상상 조성물(B)의 함량은, 균일한 분산상의 액적을 형성하고, 현탁 중합을 수행하는데 적절하며, 하기 입자의 특성 확보에 장애가 되지 않는 수준에서 조절될 수 있다. 예를 들어, 연속상 조성물의 중량(WA)과 분산상 조성물의 중량(WB) 간 비율(WB/WA)은 0.05 내지 0.30 범위일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 비율은 0.10 이상 0.25 범위일 수 있다.
상기 현탁중합은 본 출원의 제조방법에 따른 입자 특성 확보에 장애가 되지 않는 조건에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상기 현탁중합은 80 내지 95 ℃ 온도 및 300 내지 900 rpm 속도 조건하에서 수행될 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 현탁중합은, 질소 퍼징 조건하에서 이루어질 수 있다.
현탁중합이 이루어지는 시간은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 수 시간, 구체적으로는 약 3 시간 내지 10 시간 동안 현탁중합이 이루어질 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 방법은 연속상 조성물(A)과 분산상 조성물(B)을 혼합한 후 전단력을 가하여 연속상 조성물(A) 내에서 분산상 조성물(B)을 액적 형태로 균질화하는 단계; 및 상기 분산상 조성물을 현탁중합하는 단계를 포함할 수 있다. 현탁중합과 관련된 설명은 상술한 것과 동일하다.
상기 분산상 조성물(B)을 액적 형태로 균질화하는 단계는, 상온에서의 교반을 통해 수행될 수 있다. 상온에서 이루어지는 교반 속도는 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어, 300 rpm 내지 900 rpm 범위일 수있다.
하나의 예시에서, 상기 방법은, 현탁중합 진행 중에 연속상 조성물(A)을 추가 투입하는 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 폴리비닐알코올과 물의 혼합물이 현탁중합 진행 중에 추가로 투입될 수 있다. 이와 관련하여, 현탁중합이 진행 중이라는 것은 상기 설명된 현탁중합 조건(온도와 속도)이 형성된 후를 의미할 수 있고, 또는 현탁중합과 관련된 중합율이 적어도 5% 내지 70 % 범위 내인 시점을 의미할 수도 있다. 폴리비닐알코올을 추가로 투입하는 경우, 제조된 입자의 평탄성이 개선되고, 전체 제조된 입자 중 단일 형상 입자 비율이 증가하는 것으로 확인되었다(표 1 및 표 2의 실시예 3 관련 내용 참조). 평탄성이 개선된다는 것은 입자 뭉침과 분리에 의해 발생하는, 입자 표면에서의 결함이 줄어든다는 것을 의미한다. 이는, 분산상 관련한 현탁 중합 중 추가 투입되는 연속상 조성물에 의해, 입자 간 뭉침이 억제되기 때문인 것으로 생각된다. 추가 투입되는 연속상 조성물(A)을 구성하는 성분이나 그 외 특성은 앞서 설명한 것과 동일하다.
또 하나의 예시에서, 상기 방법은 현탁중합 반응 완료 이후에, 상기 현탁중합 반응물(캐리어 입자)의 표면에 프라이머층 및/또는 세포부착 유도층을 형성하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 프라이머층은 관능기가 없는 마이크로-캐리어 입자의 표면에 기능성 고분자를 도입할 수 있게 하는 것으로, 소위 점착층 역할을 한다. 예를 들어, 프라이머층을 매개로 세포부착 유도층 또는 세포가 입자 상에서 안정적으로 유지될 수 있다.
특별히 제한되지는 않으나, 프라이머층을 형성할 수 있는 화합물로는, 수상 접착을 유도할 수 있는 카테콜 유도체 등이 사용될 수 있다. 예를 들어, L-디하이드록시 페닐알라닌(L-DOPA), 도파민(dopamine), 노레피네프린(norepinephrine), 에피네프린(epinephrine), 에피갈로카테킨(epigallocatechin) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상이 프라이머층 형성에 사용될 수 있다. 상기 화합물을 포함하여 형성된 프라이머층은 입자 표면에 친수성을 부여하여, 연속상인 수성 분산액 내에서 입자의 분산성을 보다 높일 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 폴리스티렌계 입자의 반경과 프라이머층 간 두께의 비율은 1 : 0.00001 내지 1 : 0.01, 또는 1 : 0.0001 내지 1 : 0.001 일 수 있다. 폴리스티렌계 입자의 반경과 표면 코팅층의 두께 비율이 지나치게 낮을 경우, 폴리스티렌계 입자 대비 프라이머층이 너무 얇아 마이크로 캐리어 표면이 친수성으로 개질되는 효가가 미미하고, 지나치게 높을 경우 폴리스티렌계 입자 대비 프라이머층이 두꺼워져 세포 배양 시 세포와 마이크로 캐리어의 부착 효율이 감소될 수 있다.
상기 세포부착 유도층은 세포 부착성 물질들로 구성되며, 이들은 세포의 막관통 단백질(transmembrane protein)들이 결합할 수 있는 장소를 제공하는 역할을 한다. 그로 인해, 부착성 세포들이 안정적으로 부착, 스프레딩(spreading) 및 배양될 수 있다. 특별히 제한되지는 않으나, 젤라틴, 콜라겐, 피브로넥틴(fibronectin) 키토산, 폴리도파민, 탄닌산, 폴리페놀, 폴리 L-라이신, 비트로넥틴(vitronectin), RGD를 포함한 펩타이드, 리그닌(lignin), 양이온성 덱스트란 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상이 세포 부착 유도층 형성 화합물로 사용될 수 있다. 또한, 상기 화합물을 포함하여 형성된 세포 부착 유도층은, (폴리스티렌) 입자 표면을 친수성으로 개질하여 캐리어의 수분산성을 향상시킬 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 방법은, 현탁중합 반응 완료 이후에, 세척 단계를 더 포함할 수 있다. 세척에 의해 현탁중합물인 캐리어 입자와 무관한 불순물을 제거할 수 있다. 세척 방식은 특별히 제한되지 않으며, 공지된 세척 방식이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 세척은, 에탄올과 같은 알코올에 현탁중합물을 투입하고, 교반하면서 수행될 수 있다. 특별히 제한되지는 않으나 이러한 세척은, 예를 들어 3 회 이상 반복될 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 세척은, 캐리어 입자의 표면에 프라이머층 및/또는 세포부착 유도층을 형성한 이후에 이루어질 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 방법은, 상기 세척 이후에, 건조 단계를 더 포함할 수 있다. 건조를 통해 용매 잔류물 등을 제거할 수 있다. 건조 방식은 특별히 제한되지 않으며, 공지된 건조 방식이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 건조는 오븐을 이용하거나 상온 조건에서 이루어질 수 있다. 또한, 특별히 제한되지 않으나, 상기 건조는 진공에서 이루어질 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 방법은, 현탁중합 반응 완료 이후에, 현탁중합물을 세척 및 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 세척과 건조에 관한 설명은 상술한 것과 동일하다.
상기 설명된 방법에 따라 제조된 입자는, 세포 배양에 적합한 특성을 가질 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 방법은 형상 또는 형태 균일성이 높은 입자를 제공할 수 있다. 구체적으로, 아래 실시예를 통해 확인되는 것과 같이, 본 출원 방법에 따라 제조된 입자는 제조된 전체 입자 개수 중 80% 이상이 단일 형상을 가질 수 있다. 즉, 상기 방법에 따르면, 제조된 전체 입자 중 단일 형상 입자의 비율이 80% 이상을 만족할 수 있다. 이때, 「단일 형상」이란, 그 표면에 위성 입자(satellite particle)가 존재하지 않는 입자를 의미한다. 표면에 위성 입자를 갖고 있는 입자와 비교할 때, 단일 형상 입자는 더 큰 표면적을 가질 수 있기 때문에, 세포 부착에 유리하다.
하나의 예시에서, 상기 방법은 구형상의 입자를 제공할 수 있다. 구형상은 대체적으로 구형에 가까운 형상을 가진 것을 의미하는 것으로, 육안을 통해서도 확인할 수 있지만, 예를 들어, 아래 식 1에 의해 계산되는 구형도(sphericity) 값이 약 0.80 이상인 경우를 의미할 수 있다. 입자가 구형상을 갖는 경우 넓은 표면적을 확보할 수 있고, 캐리어의 세포 부착 성능을 높일 수 있다. 본 출원의 구체예에서, 본 출원에 따라 제조된 입자는 구형상을 가질 수 있고, 또는 적어도 상기 단일 형상 입자는 구형상을 가질 수 있다.
[식 1]
구형도 =
Figure PCTKR2021012358-appb-img-000001
(상기 식 1에서, Vp는 입자의 부피이고, AP는 입자의 표면적이다.)
하나의 예시에서, 상기 방법은, 그 내부에 0.5 μm 이상 또는 1 μm 이상 크기의 공극이 하나 이상 형성된 다공성 입자를 제공할 수 있다. 상기 공극은 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM)을 이용한 입자 분석을 통해 확인할 수 있다. 이때 공극의 크기는, (예를 들어, 입자 외부에서 입자를 바라 볼 때) 입자의 단면에서 시인되는 공극의 양쪽 끝을 연결한 가장 긴 (가상의) 직선 거리일 수 있다. 분산상 액적에 관한 현탁중합 중 발생하는 탄화수소 오일의 움직임에 따라 공극의 형상이나 분포가 달라질 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 공극이 다양한 형상으로 입자 내부에 존재할 수 있다. 상기 공극 크기의 상한은 전체 입자의 크기에 따라 달라질 수 있으나, 예를 들어, 5 μm 이하, 4.5 μm 이하, 4.0 μm 이하, 3.5 μm 이하, 3.0 μm 이하, 2.5 μm 이하 또는 2.0 μm 이하일 수 있다.
이와 관련하여, 본 출원의 구체예에 따라 얻어지는 다공성 입자는, 아래 식 2에 의해 계산되는 다공도 또는 공극율이 약 15.0 % 이하인 입자일 수 있다. 상기 입자의 다공도 하한은, 예를 들어, 0% 초과, 1 % 이상, 2 % 이상, 3 % 이상, 4 % 이상 또는 5 % 이상일 수 있다. 이러한 다공성은 입자의 밀도 특성과 관련이 있다.
[식 2]
다공도(porosity) = {1-(겉보기 밀도/진밀도)} x 100
(상기 식 2에서, 상기 겉보기 밀도는 입자 및 입자 간 공간을 포함한 입자(들)의 부피를 이용하여 구한 밀도이고, 진밀도는 공간을 제외한 입자들만의 부피를 이용하여 구한 밀도이다. 이때, 진밀도는 헬륨 피크노미터(Helium pycnometer)(Micromeritics 社) 장비로 측정할 수 있고, 겉보기 밀도는 아래 실험예에서 설명되는 것과 같은 에탄올 부유법을 통해 측정될 수 있다.)
하나의 예시에서, 상기 방법은, 마이크로미터 수준의 크기(약 50 내지 400 μm 범위)인 입자, 구체적으로는 그 직경이 90 내지 250 μm 범위인 입자, 보다 구체적으로는 110 내지 210 μm 범위인 입자를 제공할 수 있다. 구체적으로, 상기 방법은 90 내지 250 μm 범위의 직경을 갖는 단일 형상의 구형 입자를 제공할 수 있다. 상기 직경은 PSA(particle size analyzer)를 이용하여 측정할 수 있다. 또는, 광학현미경을 통해 입자의 이차원(2D) 평면 넓이를 구하고, 평면 넓이에 관한 식(S= πr2)을 역산하여 상기 직경을 계산할 수 있다. 이때, 상기 직경은 적어도 100개 이상 입자에 계산된 값에 대한 산술평균일 수 있다. 입자의 직경이 상기 범위 미만인 경우에는 세포 부착 성능이 좋지 못하고, 상기 범위를 초과하는 경우에는 동일 부피를 기준 표면적이 작아지는 효과가 있기 때문에 마찬가지로 우수한 세포 부착 성능을 기대하기 어렵다. 본 출원의 구체예에 따를 때, 상기 직경은, 단일 형상 입자가 갖는 직경일 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 방법은 0.95 g/cm3 내지 1.00 g/cm3 범위 내의 밀도를 갖는 입자를 제공할 수 있다. 입자의 밀도를 확인하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 아래 실험예에서 설명되는 것과 같이, 소정 밀도의 용액에 입자를 투입한 후, 입자가 부유 또는 침강하는지를 확인하는 방식으로 입자의 밀도를 확인할 수 있다. 밀도가 약 1.2 g/cm3 수준인 세포 배양에 사용되는 통상적인 상업용 캐리어 입자의 밀도가 약 1.1 내지 1.3 g/cm3 수준인 점을 고려할 때, 본 출원에 따라 제조된 캐리어 입자는 저밀도 특성을 갖는다. 따라서, 배양된 세포를 마이크로-캐리어 입자로부터 분리 및 회수할 시에, 종래 캐리어 입자를 사용하는 것 보다 중력에 의한 침강 속도 차이가 커질 수 있고, 따라서, 마이크로-캐리어와 세포를 보다 손쉽게 분리하는 것이 가능해진다. 하나의 예시에서, 상기 마이크로-캐리어 입자의 밀도 하한은 0.95 g/cm3 또는 그 보다 클 수 있고, 그 상한은 0.995 g/cm3 또는 그 보다 작을 수 있다. 마이크로-캐리어 입자의 크기가 0.995 g/cm3 를 초과하여 1.00 g/cm3에 가까워지거나 그 보다 커질 경우, 세포와 마이크로-캐리어 간 밀도 차이가 작기 때문에 배양 후 세포를 분리 회수할 시에 원심 분리가 어렵다. 또한, 마이크로-캐리어 입자의 밀도가 0.95 g/cm3 보다 작아져 0.90 g/cm3에 가까워지는 경우, 배양 초기에 마이크로-캐리어 입자에 세포를 부착하는 것이 어렵고, 배양에 부적합하다.
하나의 예시에서, 본 출원의 방법은 70 내지 95% 범위의 회수율로 상기 특성의 입자를 제공할 수 있다. 입자의 회수율은 아래 실험예에 설명된 것과 같이 계산될 수 있다.
상기와 같이 본 출원에 따라 제조된 상기 캐리어 입자는 세포 배양에 사용될 수 있다.
본 출원에 관한 다른 일례예서, 본 출원은 마이크로-캐리어 입자에 관한 것이다. 상기 마이크로-캐리어 입자는, 상술한 방법에 의해 제조될 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 다공성 마이크로-캐리어 입자는 폴리스티렌을 포함할 수 있다, 즉, 스티렌 단량체를 현탁중합하여 얻어진 상기 마이크로-캐리어 입자는 폴리스티렌 입자 또는 폴리스티렌계 입자일 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 폴리스티렌은 스티렌 모노머와 에틸렌 불포화 가교제의 중합물일 수 있다. 구체적으로, 상기 폴리스티렌은 스티렌 모노머와 디비닐벤젠 가교제의 현탁 중합 반응물(poly(styrene-co-divinylbenzene))일 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 마이크로-캐리어 입자는 그 표면에 프라이머층 및/또는 세포부착 유도층을 더 포함할 수 있다. 이에 관한 설명은, 앞서 설명한 것과 동일하다.
하나의 예시에서, 상기 마이크로-캐리어 입자는, 개수 기준, 전체 입자 중 80% 이상이 단일 형상을 만족하는 입자일 수 있다. 단일 형상에 관한 설명은 상술한 것과 같다.
하나의 예시에서, 상기 마이크로-캐리어 입자는 구형상을 가질 수 있다. 구형에 관한 설명은 상술한 것과 같다.
하나의 예시에서, 상기 마이크로-캐리어 입자는 다공성일 수 있다. 다공성과 공극에 관한 설명은 상술한 것과 같다. 예를 들어, 상기 마이크로-캐리어 입자는 5 μm 이하의 공극을 가질 수 있다. 이때, 상기 공극은 입자 내부에 형성될 수 있다. 본 출원의 구체예에 따르면, 상기 공극의 하한은 예를 들어, 0.5 μm 이상 또는 1 μm 이상일 수 있다. 또한, 그 상한은 예를 들어, 4.5 μm 이하, 4.0 μm 이하, 3.5 μm 이하, 3.0 μm 이하, 2.5 μm 이하 또는 2.0 μm 이하일 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 마이크로-캐리어 입자는 90 내지 250 μm 범위의 직경을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 마이크로-캐리어 입자 중 단일 형상을 갖는 입자의 직경이 90 내지 250 μm 범위를 만족할 수 있다. 캐리어-입자 직경에 관한 설명은 상술한 것과 같다.
하나의 예시에서, 상기 마이크로-캐리어 입자는, 0.95 g/cm3 내지 1.00 g/cm3 범위의 밀도를 가질 수 있다. 캐리어-입자의 밀도에 관한 설명은 상술한 것과 같다.
하나의 예시에서, 상기 마이크로-캐리어 입자는 상술한 형상, 다공성, 밀도 및/또는 크기 특성 중 2 이상을 동시에 만족할 수 있다.
그 외 제조된 입자가 갖는 특성은 상술한 바와 동일하다.
본 출원에 관한 또 다른 일례에서, 본 출원은 상기 설명된 캐리어 입자 및 세포를 포함하는 세포 배양 조성물에 관한 것일 수 있다.
이와 관련하여, 상기 세포의 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 배양 조성물에 포함되는 세포는 부착성 동물 세포일 수 있고, 구체적으로는 fibroblasts, chondrocyte, mesenchymal stem cell, CHO, HEK 293, vero cell, BHK21 또는 MDCK 등과 같은 세포일 수 있다.
상기 세포 배양 조성물은 배지 용액을 더 포함할 수 있다. 배지 용액은 혈장이나 림프액과 같은 체액을 근거한 생체의 조건에 가까운 영양분과 pH, 온도, 삼투압 등의 환경 조건을 충분히 만족시켜 주기 위한 각종 첨가제들을 포함할 수 있다. 이러한 첨가제로는, 세포 배양 관련 기술분야에서 널리 알려진 다양한 물질이 제한 없이 사용될 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 마이크로-캐리어와 세포는 배지 용액보다 작은 밀도를 가질 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 일 구체예에 따르면, 캐리어 입자는 0.95 g/cm3 내지 1.00 g/cm3 범위 내의 밀도를 가질 수 있고, 세포는 1.10 내지 1.25 g/cm3 (약 1.2 g/cm3) 범위의 밀도를 가질 수 있다. 그에 따라 배지 용액 내에 주입된 저밀도 캐리어 입자는 배지 용액에서 부유할 수 있고, 부유중인 캐리어 입자의 표면에 부착되는 세포의 수가 점점 증가함에 따라 세포가 부착된 마이크로-캐리어의 밀도도 점차 증가하여 배지 용액이 담긴 용기의 아래로 가라앉을 수 있다. 그리고, 세포 배양 이후에는, 원심분리를 통해 마이크로-캐리어-세포 결합체로부터 세포를 분리시킴으로서 배양된 세포를 확보할 수 있다.
본 출원에 관한 또 다른 일례에서, 본 출원은 세포 배양 조성물의 제조방법에 관한 것일 수 있다. 상기 세포 배양 조성물의 제조방법은, 마이크로-캐리어 입자, 세포 및 배지 용액을 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 세포 배양 조성물의 제조방법은 상술한 마이크로-캐리어 입자를 제조하는 단계; 및 마이크로-캐리어 입자, 세포 및 배지 용액을 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 마이크로-캐리어 입자, 세포 및 배지 용액에 관한 설명은 상술한 바와 동일하다.
본 출원에 따르면, 형상 또는 형태의 균일한 정도가 높고, 다공성이며, 세포 배양과 원심분리에 유리한 마이크로-캐리어; 및 이를 포함하는 조성물이 제공된다.
도 1은 실시예 1 내지 3에서 제조된 입자의 일부에 관한 SEM 이미지이다. 각 이미지 우측 하단에 표시된 흰색 바(bar)는 150 μm 크기를 의미한다.
도 2는 비교예 1 내지 5에서 제조된 입자의 일부에 관한 SEM 이미지이다. 각 이미지 우측 하단에 표시된 흰색 바(bar)는 150 μm 크기를 의미한다. 비교예 4의 경우, 표 2에서와 같이 1 mm 이상의 입자가 수득되었기 때문에, 150 μm 크기 흰색 바(bar)가 도시된 이미지를 통해 입자를 비교하지 않았다.
도 3은 실시예 1에 따라 제조된 입자의 내부 구조를 보여주는 도면이다. 구체적으로, 실시예에 따라 제조된 입자 내부에는 약 1 내지 3 μm 크기의 포어(pore)가 형성되어 있음이 확인된다.
이하 발명의 구체적인 실시예를 통해 발명의 작용, 효과를 보다 구체적으로 설명하기로 한다. 다만, 이는 발명의 예시로서 제시된 것으로 이에 의해 발명의 권리범위가 어떠한 의미로든 한정되는 것은 아니다.
실시예 및 비교예
실시예 1
(1) 분산상(dispersive phase)의 제조
하기 표 1에 기재된 함량 비율로 스티렌 모노머(styrene monomer, st), 가교제인 디비닐벤젠(divinylbezene, DVB) 및 저밀도 탄화수소 오일(밀도가 0.750 내지 0.800 g/cm3 의 범위)의 혼합물 8 g을, 100 ml 바이알에서 교반하였다. 이후, 열 개시제인 벤조일퍼옥사이드(benzoyl peroxide, BPO)와 터트-부틸 퍼옥시 벤조에이트(tert-butyl peroxybenzoate, t-BP)를 바이알에 추가 투입하고, 5분 정도 상온에서 교반하였다. 각 성분간 함량은 표 1에 기재하였다.
(2) 연속상(continuous phase)의 제조
중량평균분자량이 85,000 내지 125,000 범위 내이고, 가수분해율이 87 내지 89 % 인 PVA 2.5 g을 증류수 250 g에 용해하였다. 자세한 함량은 표 1과 같다.
(3) 현탁중합에 의한 입자 제조
50 g의 1% PVA 수용액을 분산상과 혼합하여 균일 분산액이 될 때까지 오일배스(oil bath) 내에서 교반하였다. 구체적으로, 상온에서 800 rpm으로 교반하면서 오일배스를 점차 승온시키고, 85 내지 88 ℃ 온도 및 600 내지 800 rpm 속도 조건하에서 현탁중합을 수행하였다. 상기 중합은 질소 퍼징 하에서 실시하였다.
(4) 입자 수득
반응 6시간 후, 100 μm의 시이브(sieve)를 통해 제조된 입자를 회수하고, 에탄올로 5회 세척한 후 상온에서 건조하였다.
실시예 2 내지 3 및 비교예 1 내지 6
아래 표 1 과 같이 분산상과 연속상의 조성을 조절한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 과정을 거쳐 입자를 수득하였다.
측정 방법
(1) 연속상의 표면 장력(단위: mN/m)
링 메쏘드(ring method)에 따라 표면 장력을 측정하였다. 구체적으로, 백금 링(pt ring)과 표면 장력 측정기(Surface Electro Optics)를 이용하여 상온에서 표면 장력을 측정하였다.
(2) 연속상의 점도(단위: cp)
전단속도(shear rate)에 따라 점도를 측정하였다. 구체적으로, 회전점도계인 LVDV2T 기기(Brookfield社)를 이용하여, 66 내지 264 1/s 전단 속도 범위 및 상온(약 25℃) 조건에서 점도를 측정하였다.
(3) 중량평균분자량
겔투과크로마토그래피(Gel permeation chromatography: GPC)를 이용하여 PVA(또는 PVP)의 중량평균분자량(표준 폴리스티렌 환산함)을 측정하였다.
(4) 수화도
1H-NMR을 이용하여 측정 PVA의 수화도를 측정하였다. 참고로, 수화(hydrolysis)가 진행되면서 에틸렌(ethylene)에 있는 수소 피크(H peak)가 감소하고, 수산기(hydroxyl group)에 있는 수소 피크가 증가한다.
(5) Oil/Water fraction
분산상을 Oil phase로 보고, 연속상을 water phase로 볼 때, 연속상의 중량(WA) 기준 분산상의 중량(WB) 비율을 의미한다.
실시예1 실시예2 실시예3 비교예1 비교예2 비교예3 비교예4 비교예5
Oil/Water fraction(WB/WA) 0.20 0.15 0.14 0.10 0.10 0.15 0.15 0.15
분산상
St : DVB
(중량비)1)		 1 : 0.33 1 : 0.33 1 : 0.33 1 : 0.33 1 : 0.33 1 : 0.33 1 : 0.33 1 : 0.33
오일함량(wt%)
2)		 20 20 20 20 20 20 20 20
BPO 함량(wt%)3) 2.06 2.06 2.06 2.06 2.06 2.06 2.06 2.06
t-BP 함량(wt%)4) 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
연속상
Water 함량(g) 50 50 50 50 50 50 50 50
PVA(or PVP)의농도(%)5) PVA
1.01%		 PVA
2%		 PVA 2%
(1% + 1% 6))		 PVA 0.6% PVA 0.8% PVA 1.01% PVP
1.01%		 PVP
1.01%
PVA(or PVP)의
분자량/ 수화도		 7) 8) 9) 10)
표면에너지
(mN/m)		 54 54 50 55 54.5 49 65 66
점도(cp) ≥ 2.0 4.0 4.0 ≤ 1 ≤ 1.5 1.6 1.5 3.0
상기 표 1에서, 참조부호 1) 내지 10)은 아래와 같다.
1) St(스티렌)의 중량과 DVB(디비닐벤젠)의 중량비율
2) 분산상 전체 조성물의 중량을 100으로 할 때, 오일이 차지하는 중량%
3) 분산상 전체 조성물의 중량을 100으로 할 때, BPO가 차지하는 중량%
4) 분산상 전체 조성물의 중량을 100으로 할 때, t-BP가 차지하는 중량%
5) 연속상 전체 조성물의 중량을 100으로 할 때, PVA(폴리비닐알코올) 또는 PVP(폴리비닐피롤리돈)이 차지하는 중량%
6) 연속상 중에 PVA를 1% 농도로 첨가하고, 현탁중합 진행 중(중합율이 약 10%인 시점)에 PVA 1% 농도의 연속상 조성물을 추가 투입
7) 중량평균분자량이 85,000 내지 125,000 범위 내를 만족하고, 수화도가 87 - 89% 범위 내를 만족하는 PVA 사용
8) 중량평균분자량이 13,000 내지 50,000 범위 내를 만족하고, 수화도가 87 - 89% 범위 내를 만족하는 PVA 사용
9) 중량평균분자량이 약 55,000인 PVP의 사용
10) 중량평균분자량이 약 360,000인 PVP의 사용
현탁중합물에 대한 실험 결과
실시예와 비교예에서 얻어진 입자에 대하여 표 2에 기재된 항목을 측정하였다. 각 항목의 측정 방식은 아래와 같다.
1. 입자 회수율(%)
실시예에서 실제 폴리스티렌 입자 중합에 참여한 물질(스티렌 및 디비닐벤젠) 대비 고형분(회수한 폴리스티렌 입자)의 비율을 아래 식 3과 같이 계산하였다.
[식 3]
{(회수한 폴리스티렌 입자의 무게(g))/(스티렌 및 디비닐벤젠의 무게(g))} x 100
입자의 회수율은 현탁중합반응 시스템에서 분산상의 안정성과 관련이 있다. 구체적으로, 분산상의 안정성이 확보되는 경우에는 중합 중에도 분산상이 깨지지 않고, 입자로 중합될 수 있는데, 이러한 안정성은 분산상과 연속상을 형성하는 성분과 조건 1 및 2의 만족 여부에 따라 달라질 수 있다.
2. 입자 밀도(g/cm3)의 확인
상온(약 25 ℃) 및 상압(1 atm) 조건에서, 밀도가 0.95 g/cm3 인 에탄올 수용액 및 밀도가 0.99 g/cm3 인 에탄올 수용액 각각에, 상기 실시예 및 비교예에서 얻어진 캐리어 입자를 첨가하였다 그리고, 캐리어 입자가 부유 또는 침강하는지 확인한 후, 아래 기준으로 밀도를 평가하였다. 입자의 밀도는 탄화수소 오일의 사용 유무, 그 함량 및 조건 1과 2 만족에 따른 탄화수소 오일의 분산상 내 잔류 등에 따라 결정될 수 있다.
1) 밀도가 0.95 g/cm3인 에탄올 수용액에서 부유: 캐리어의 밀도가 0.95 g/cm3 미만
2) 밀도가 0.99 g/cm3인 에탄올 수용액에서 침강: 캐리어의 밀도가 0.99 g/cm3 초과
3) 밀도가 0.95 g/cm3인 에탄올 수용액에서 침강하고, 밀도가 0.99 g/cm3인 에탄올 수용액에서 부유: 캐리어의 밀도가 0.95 g/cm3 이상 0.99 g/cm3 이하
3. 입자 크기
상기 실시예 및 비교예에서 얻어진 마이크로-캐리어 입자를 준비한 후, 광학현미경을 통해 100개의 입자 직경을 측정하고, 측정된 직경에 대한 산술평균값을 구하였다. 구체적으로, 개별 입자의 직경은, 광학현미경을 통해 입자의 이차원(2D) 평면 넓이를 구한 후 평면 넓이에 관한 식(S= πr2)을 역산하여 계산했다.
연속상의 표면 장력은 분산상과 연속상 간 계면 장력과 분산상의 형태나 크기에 영향을 주는데, 상술한 조건 1의 표면 장력은 분상상의 깨짐이나 분상상 크기의 지나친 감소나 증가를 방지할 수 있다. 또한, 연속상의 점도는 현탁 중합과 관련한 교반시 분산상의 움직임에 영향을 주는데, 상술한 조건 2와 같이 적정 수준의 점도는 액적 또는 입자 간 충돌과 깨짐을 줄이고, 입자의 형상(평탄성이나 단일 형상 입자)에도 긍정적인 영향을 미친다.
4. 단일 형상 입자의 비율
상기 실시예 및 비교예에서 얻어진 마이크로-캐리어 입자를 준비한 후, 주자전자현미경(Scanning Electron Microscopy, SEM) 이미지를 촬영하였다(x 250 배율을 사용함). 촬영된 이미지에서 30개 이상의 입자가 시인되는 복수의 이미지를 무작위로 선택하고, 각 이미지에서 관찰되는 입자 전체의 개수 대비, 표면에 위성 입자(satellite particle)가 없는 단일 형상 입자의 개수 비율을 계산하였다.
단일 형상 입자의 비율이 높다는 것은, 현탁중합시에 입자의 충돌에 의한 입자 뭉침이 적었다는 것과 관련이 있다. 특히, 조건 2의 연속상 점도는 분산상의 움직임과 관련이 있는데, 조건 2를 만족하는 점도를 가질 경우에는 분산상 입자의 움직임이 줄어들면서 입자 충돌로 인한 입자 응집과 뭉침이 줄어들면서 단일 형상의 입자 비율이 높아질 수 있다. 이때, 조건 1을 만족하는 경우에는, 낮은 표면 장력과 그에 따른 계면 장력 감소로 인한 입자 사이즈의 지나친 감소가 억제되기 때문에, 조건 1과 조건 2를 만족하는 경우에는 적정 크기를 갖는 단일 형상 입자의 비율을 높일 수 있다.
5. 입자 내부 구조
상기 실시예 1에서 얻어진 세포 배양용 마이크로 캐리어에 대하여, SEM을 통해 입자 내부 구조를 확인하였다. 구체적으로 입자를 에폭시에 embedding한 후 ion milling을 통해 단면을 제조한 후 입자 단면의 형상을 SEM을 통해 확인하였다.
실시예1 실시예2 실시예3 비교예1 비교예2 비교예3 비교예4 비교예5
입자 회수율(%) 75.3 74.2 88.0 48.5 50.0 66.8 N.A. 94.8
입자 밀도(g/cm3) 0.95 - 0.99 범위 내 0.95 - 0.99 범위 내 0.95 - 0.99 범위 내 0.95 - 0.99 범위 내 0.95 - 0.99 범위 내 0.95 - 0.99 범위 내 N.A. 0.95 - 0.99 범위 내
입자크기(μm)(단일 형상 입자 기준) 130 ± 33 197 ± 28 182 ± 27 115 ± 16 114 ± 16 84 ± 16 1 mm 이상 100 μm 미만,
300 μm 초과
단일 형상입자의 비율(%) 93.55 80.65 100.0 86.11 93.55 69.49 87.69 80.65
표 1과 표 2를 통해 비교예 1 내지 3과 실시예를 비교해보면, 본 출원에 따른 실시예의 입자 회수율이 비교예의 그것 보다 우수하다는 것을 알 수 있다. 이는 본 출원 방법이 안정적인 분산상의 형성과 중합을 유도하고, 그 결과 저밀도 및 표면적이 넓은 특성의 캐리어 입자를 다량 제공할 수 있다는 것을 의미한다(공정 효율 또는 수득률 개선).
또한, 표 1과 표 2를 통해 비교예 4 및 5와 실시예를 비교해보면, 본 출원에 따른 실시예가 비교예 4 및 5 대비 마이크로 크기의 입자를 적정 크기에서 좁은 입도 분포로 제공한다는 것을 알 수 있다. 또한, 비교예 4 및 5 에서 보다 실시예의 경우에서, (적정 크기인) 단일 형상 입자의 비율이 대체적으로 높다는 것이 확인된다. 이는, 본 출원의 방법이 세포 배양에 적합한 넓은 표면적을 제공할 수 있다는 것을 의미한다.
그리고, 비교예 4 및 5와 실시예를 비교해보면, PVP를 사용하는 경우에는 현탁중합에 의해 만들어진 입자의 입도가 지나치게 커지거나 또는 입도 분포가 지나치게 넓어지는 것을 알 수 있다. 비교예 5의 회수율이 높은 것은, 회수율 계산시 입자의 무게가 고려되는데, 비교예 5에서 제조된 거대 입자(300 μm 초과 크기)의 무게가 상대적으로 크기 때문이다. 한편, 비교예 5에 사용된 PVP의 분자량 대비 비교예 4에 사용된 PVP의 분자량이 상당히 작은데, 그로 인해 비교예 4에서는 PVP끼리 스테릭 효과(steric effect)가 약하여 입자들간 응집(aggregation)이 과다 발생하여 입자의 크기가 매우 크게 나타나고, 개별 입자 밀도나 회수율에 대한 확인이 어려웠다.
정리하면, 본 출원은, 단일 형상이고, 구형이며, 저밀도 특성을 갖고, 평탄성도 우수한 다공성 캐리어 입자를 높은 회수 비율로 제공할 수 있다.

Claims (30)

  1. 하기 조건 1 및 조건 2를 동시에 만족하는 연속상 조성물(A); 및 중합성 단량체(b1) 함유 분산상 조성물(B)을 혼합하고, 현탁중합반응을 진행하는 단계;
    를 포함하는, 세포 배양용 마이크로-캐리어 입자의 제조방법:
    [조건 1]
    45 mN/m < 연속상 조성물의 표면 장력(surface tension) ≤ 54 mN/m
    [조건 2]
    연속상 조성물의 점도(viscosity) ≥ 2.0 cp
    (단, 상기 [조건 1]에서 표면 장력은 링 메쏘드(ring method)에 따라 상온에서 측정되고, 상기 [조건 2]에서 점도는 66 내지 264 1/s 전단 속도 범위 및 상온 조건에서 측정된다.)
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 연속상 조성물(A)은 물(water)과 폴리비닐알코올(poly(vinyl alchol))(PVA)을 포함하는, 세포 배양용 마이크로-캐리어 입자의 제조방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 폴리비닐알코올(PVA)은 80,000 범위 내지 190,000 범위의 중량평균분자량 및 80 내지 99 % 범위의 수화도를 갖는, 세포 배양용 마이크로-캐리어 입자의 제조방법.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 연속상 조성물(A)은, 연속상 조성물 전체 중량을 기준으로, 상기 폴리비닐알코올을 1.0 중량% 이상 포함하는, 세포 배양용 마이크로-캐리어 입자의 제조방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 분산상 조성물(B)은 중합성 단량체(b1)로서 스티렌 단량체를 포함하는, 세포 배양용 마이크로-캐리어 입자의 제조방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 분산상 조성물(B)은 가교제(b2)를 더 포함하는, 세포 배양용 마이크로-캐리어 입자의 제조방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 분산상 조성물(B)은, 상기 스티렌 단량체 100 중량부 대비, 3 내지 300 중량부 범위로 상기 가교제를 포함하는, 세포 배양용 마이크로-캐리어 입자의 제조방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 분산상 조성물(B)은 탄화수소 오일(b3)을 더 포함하는, 세포 배양용 마이크로-캐리어 입자의 제조방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 탄화수소 오일은 0.750 g/cm3 내지 0.800 g/cm3 범위의 밀도를 갖는, 세포 배양용 마이크로-캐리어 입자의 제조방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 분산상 조성물(B)은, 분산상 조성물의 전체 함량을 기준으로, 10 내지 30 중량% 범위로 상기 탄화수소 오일을 포함하는, 세포 배양용 마이크로-캐리어 입자의 제조방법.
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 탄화수소 오일은 탄소수가 12 내지 50 인 직쇄 또는 분지쇄의 포화탄화수소 화합물을 포함하는, 세포 배양용 마이크로-캐리어 입자의 제조방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 80 내지 95 ℃ 온도 및 300 내지 900 rpm 속도 조건하에서 현탁중합을 수행하는, 세포 배양용 마이크로-캐리어 입자의 제조방법.
  13. 제 1 항에 있어서,
    연속상 조성물(A)과 분산상 조성물(B)을 혼합한 후 전단력을 가하여 연속상 조성물(A) 내에서 분산상 조성물(B)을 액적 형태로 균질화하는 단계; 및 상기 분산상 조성물을 현탁중합하는 단계를 포함하는, 세포 배양용 마이크로-캐리어 입자의 제조방법.
  14. 제 1 항에 있어서,
    현탁중합 진행 중에 연속상 조성물(A)을 추가 투입하는 단계를 더 포함하는, 세포 배양용 마이크로-캐리어 입자의 제조방법.
  15. 제 1 항에 있어서,
    제조된 마이크로-캐리어 입자 중 80% 이상이 단일 형상인 마이크로-캐리어 입자를 제공하는, 세포 배양용 마이크로-캐리어 입자의 제조방법(단, 단일 형상이란 위성 입자(satellite particle)가 표면에 존재하지 않는 입자를 의미한다.)
  16. 제 1 항에 있어서,
    구형상이고, 5 μm 이하의 공극을 내부에 갖는 다공성 마이크로 캐리어 입자를 제공하는, 세포 배양용 마이크로-캐리어 입자의 제조방법.
  17. 제 1 항에 있어서,
    직경이 90 내지 250 μm 범위인 마이크로-캐리어 입자를 제공하는, 세포 배양용 마이크로-캐리어 입자의 제조방법.
  18. 제 1 항에 있어서,
    밀도가 0.95 g/cm3 내지 1.00 g/cm3 범위인 마이크로-캐리어 입자를 제공하는, 세포 배양용 마이크로-캐리어 입자의 제조방법.
  19. 5 μm 이하의 공극을 내부에 갖는 다공성이고,
    폴리스티렌을 포함하는 비발포 구형 마이크로-캐리어 입자.
  20. 제 19 항에 있어서, 직경이 90 내지 250 μm 범위인,
    폴리스티렌을 포함하는 비발포 구형 마이크로-캐리어 입자.
  21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 밀도가 0.95 g/cm3 내지 1.00 g/cm3 범위인,
    폴리스티렌을 포함하는 비발포 구형 마이크로-캐리어 입자.
  22. 전체 입자 중 80% 이상이 단일 형상을 갖고,
    폴리스티렌을 포함하는 비발포 구형 마이크로-캐리어 입자(단, 단일 형상이란 위성 입자(satellite particle)가 표면에 존재하지 않는 입자를 의미한다).
  23. 제 22 항에 있어서, 직경이 90 내지 250 μm 범위인,
    폴리스티렌을 포함하는 비발포 구형 마이크로-캐리어 입자(단, 단일 형상이란 위성 입자(satellite particle)가 표면에 존재하지 않는 입자를 의미한다).
  24. 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, 밀도가 0.95 g/cm3 내지 1.00 g/cm3 범위인,
    폴리스티렌을 포함하는 비발포 구형 마이크로-캐리어 입자(단, 단일 형상이란 위성 입자(satellite particle)가 표면에 존재하지 않는 입자를 의미한다).
  25. 전체 입자 중 80% 이상이 단일 형상을 갖고,
    5 μm 이하의 공극을 내부에 갖는 다공성이며,
    폴리스티렌을 포함하는 비발포 구형 마이크로-캐리어 입자(단, 단일 형상이란 위성 입자(satellite particle)가 표면에 존재하지 않는 입자를 의미한다).
  26. 제 25 항에 있어서, 직경이 90 내지 250 μm 범위인,
    폴리스티렌을 포함하는 비발포 구형 마이크로-캐리어 입자(단, 단일 형상이란 위성 입자(satellite particle)가 표면에 존재하지 않는 입자를 의미한다).
  27. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 밀도가 0.95 g/cm3 내지 1.00 g/cm3 범위인,
    폴리스티렌을 포함하는 비발포 구형 마이크로-캐리어 입자(단, 단일 형상이란 위성 입자(satellite particle)가 표면에 존재하지 않는 입자를 의미한다).
  28. 제 19 항에 따라 제조된 마이크로-캐리어 입자; 세포; 및 배양액을 포함하는 세포 배양 조성물.
  29. 제 22 항에 따라 제조된 마이크로-캐리어 입자; 세포; 및 배양액을 포함하는 세포 배양 조성물.
  30. 제 25 항에 따라 제조된 마이크로-캐리어 입자; 세포; 및 배양액을 포함하는 세포 배양 조성물.
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