CN114761533A - 细胞培养用微载体和用于制备其的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及细胞培养用微载体颗粒、用于制备所述颗粒的方法以及包含所述颗粒的细胞培养基组合物。根据本申请，提供了具有形状或形式的高度均匀性、具有孔隙率并且有利于所培养细胞的细胞附着和分离的微载体。

Description

细胞培养用微载体和用于制备其的方法
技术领域
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年9月15日在韩国知识产权局提交的韩国专利申请第10-2020-0118532号和于2021年9月9日在韩国知识产权局提交的韩国专利申请第10-2021-0120325号的权益，其公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本申请涉及微载体和用于制备其的方法。更特别地，本申请涉及可以用于细胞培养的微载体和用于制备其的方法。
背景技术
随着生物制药和再生医学领域的扩展，对能够有效制备细胞、组织、微生物等的大规模培养技术的需求正在增长。例如，使用微载体来培养细胞的技术已经得到积极开发。
在微载体相关的细胞培养技术中，在3D生物反应器内使用微载体来培养黏附细胞。具体地，将细胞、培养基和微载体放入生物反应器中，并且在搅拌培养基的同时使细胞与微载体接触，使得细胞附着至微载体表面以进行培养。此时使用的微载体应具有细胞可以附着并生长的高表面积/体积，以便适合于细胞的大规模培养。
同时，目前商业上使用的微载体具有100μm至300μm的尺寸和约1.1g/cm3至1.3g/cm3的密度。此外，在黏附于载体之后培养的细胞的密度为约1.2g/cm3。由于这些载体和细胞的密度，有利于在生物反应器内在培养细胞的早期阶段使细胞黏附于载体，但是在培养之后分离和回收细胞时，难以应用离心分离。因此，除了离心分离之外，应利用能够基于微载体和细胞的尺寸来分离和回收细胞的单独过滤方法。然而，基于载体尺寸和细胞尺寸的过滤方法显示出这样的问题：随着过程重复，过滤器被堵塞、过程时间长、发生细胞的物理损坏和污染，这可能导致过滤过程期间的细胞损失。为了解决以上问题，可以考虑利用密度小于1.0g/cm3或大于1.3g/cm3的材料(形成微载体的骨架的聚合物或可聚合组分)的特性来制备微载体。然而，在这样的情况下，可以实现的载体的密度范围是有限的，因此微载体与细胞之间的黏附不够，并且培养效率也差。例如，在搅拌包含载体和细胞的培养基时，如果载体的密度太低，则大多数载体漂浮在培养基的表面上而与搅拌无关，而如果载体的密度太高，则大多数载体下沉到培养基的底部而与搅拌无关。因此，细胞对载体的黏附差，并且培养效率降低。
因此，需要开发一种有利于细胞黏附和培养并在培养之后促进细胞的分离和回收的可以均匀分散在培养基中的微载体相关的技术。
发明内容
技术问题
本申请的一个目的是提供用于细胞培养的微载体。
本申请的另一个目的是提供具有形状或形式的高度均匀性的微载体。
本申请的另一个目的是提供具有下述特性的多孔微载体颗粒。
本申请的又一个目的是提供这样的微载体：其有利于细胞黏附和培养，并且在培养之后更容易将微载体与细胞分离。
本申请的再一个目的是提供包含细胞和所述微载体的组合物。
本申请的以上和其他目的可以完全通过下面详细描述的本申请实现。
技术方案
在一个实施方案中，本申请涉及用于制备多孔微载体颗粒的方法。以上方法可以包括将连续相组合物(A)和分散相组合物(B)混合并进行悬浮聚合的步骤。
如本文所用，术语“微载体颗粒”意指具有微米水平尺寸(直径)的颗粒、包含这样的颗粒的颗粒群、或由这样的颗粒组成的颗粒群。例如，根据本申请，可以提供包含在其形状上具有50μm至400μm范围内的最长尺寸长度的单个颗粒的颗粒群。尺寸可以通过与下述相同的方法来测量。如果粒径小于50μm，则用于细胞培养的表面积小，并因此，培养效率可能降低。此外，当粒径超过400μm时，黏附的细胞的密度低，且黏附的细胞之间的相互作用不充分，并因此培养效率可能降低。
如本文所用，术语“孔隙率”可以意指在其中至少具有空隙的颗粒的特性。
如本文所用，术语“分散相组合物”意指在与连续相组合物混合之后能够形成分散相(或液滴)的组合物。
如本文所用，术语“连续相组合物”意指在与分散相组合物混合之后能够形成连续相的组合物。
在本申请中，除非另有定义或说明，否则进行制备过程(或每个制备步骤)的温度或者计算或测量所制备的颗粒所具有的数值特性的温度可以是常温(或室温)。具体地，在本申请中，“常温”是温度没有特别升高或降低的状态下的温度，其可以意指例如在15℃至30℃的范围内的温度。
本发明人通过实验发现，当使用满足预定条件的连续相(组合物)制备微载体颗粒时，微载体颗粒具有高的形状均匀性和尺寸均匀性，具有比通常培养的细胞更低的密度特性，表面平坦度优异，并且可以确保多孔载体颗粒具有高回收率。
下面，将详细描述本申请的制备方法。
根据本申请的制备方法包括将同时满足以下条件1和条件2的连续相组合物(A)和包含可聚合单体(b1)的分散相组合物(B)混合然后进行悬浮聚合的步骤。此时，悬浮聚合可以在将分散相组合物和连续相组合物混合之后在所形成的连续相与分散相之间的界面(即，分散相液滴的表面)处和/或在分散相内部进行。
[条件1]
45mN/m<连续相组合物的表面张力≤54mN/m
[条件2]
连续相组合物的粘度≥2.0cp
根据本申请的具体实施方案，与条件1相关的表面张力可以根据环法在常温下测量。
根据本申请的具体实施方案，与条件2相关的粘度可以根据剪切速率来测量。具体地，粘度可以在66 1/秒至264 1/秒范围内的剪切速率和常温的条件下测量。连续相组合物的粘度的上限可以为例如5.0cp或更小、4.5cp或更小、4.0cp或更小、3.5cp或更小、3.0cp或更小、或者2.5cp或更小，但不特别限制于此。
当同时满足条件1和条件2二者时，可以以高产率提供下述适合于本申请的目的的颗粒。
在一个实施方案中，连续相组合物(A)可以包含水和聚(乙烯醇)(PVA)。虽然没有特别限制，但水可以是蒸馏水或去离子水。
在一个实施方案中，连续相组合物(A)可以是水和聚乙烯醇的混合物。即，连续相组合物(A)可以仅由水和聚乙烯醇组成。
在一个实施方案中，聚乙烯醇(PVA)可以具有在预定范围内的重均分子量(MW)和在预定范围内的水解度。具体地，聚乙烯醇的重均分子量可以在80,000至190,000的范围内。更具体地，重均分子量的下限可以为例如85,000或更大，且上限可以为例如180,000或更小、175,000或更小、170,000或更小、165,000或更小、160,000或更小、155,000或更小、150,000或更小、145,000或更小、140,000或更小、135,000或更小、130,000或更小、或者125,000或更小。此外，聚乙烯醇的水解度可以在80％至99％的范围内。更具体地，水解度的下限可以为例如81％或更大、82％或更大、83％或更大、84％或更大、或者85％或更大，且上限可以为例如98％或更小、97％或更小、96％或更小、95％或更小、94％或更小、93％或更小、92％或更小、91％或更小、或者90％或更小。重均分子量可以使用GPC来测量，水解度可以使用1H-NMR来测量。
满足所述分子量和所述水解度的聚乙烯醇使得连续相组合物(A)能够满足条件1和条件2。具体地，当PVA的重均分子量满足以上范围时，聚合物链的长度增加，并且分子链的缠结和聚集也以适当水平增加，这有利于确保连续相的粘度(条件2)。此外，当PVA满足以上范围内的重均分子量时，认为分子间作用力增加并且表面张力增加，这有利于确保连续相的上述表面张力(条件1)。此外，水解度(或皂化度)影响在水中的溶解度和亲水性(或疏水性)。认为满足所述重均分子量和所述水解度的PVA有利于确保条件1和条件2，并且稳定地形成分散相。
在一个实施方案中，在连续相组合物(A)中，聚乙烯醇的浓度可以为1.0％或更大。例如，当使用为水和聚乙烯醇的混合物的连续相组合物时，基于连续相组合物的总重量(100重量％)，聚乙烯醇的含量可以为1.0重量％或更多。虽然没有特别限制，但聚乙烯醇浓度的上限可以为例如小于5.0％，更具体地，4.5％或更小、4.0％或更小、3.5％或更小、3.0％或更小、2.5％或更小、或者2.0％或更小。当使用满足以上范围的聚乙烯醇时，有利于获得同时满足条件1和条件2的连续相组合物。
在一个实施方案中，分散相组合物(B)中包含的可聚合单体(b1)可以是苯乙烯单体。可以使苯乙烯单体经受悬浮聚合以生产聚苯乙烯或基于聚苯乙烯的聚合物。即，根据本申请的方法制备的载体颗粒可以是聚苯乙烯颗粒或基于聚苯乙烯的颗粒。
在一个实施方案中，苯乙烯(b1)可以仅以在分散相组合物的总含量(100重量％)中排除下述分散相组合物的其他组分(例如，油、引发剂和/或交联剂)的总含量的剩余量包含在分散相中。例如，基于分散相组合物含量的总含量(100重量％)，分散相组合物可以以60重量％或更大、65重量％或更大、70重量％或更大、或者75重量％或更大的量包含苯乙烯(b1)。此外，苯乙烯(b1)的含量的上限可以为例如小于90重量％、85重量％或更小、或者80重量％或更小。
在一个实施方案中，除了苯乙烯单体之外，分散相组合物(B)还可以包含交联剂。当仅使用苯乙烯单体作为聚合组分时，形成颗粒的聚苯乙烯聚合物的交联密度降低，这可能使得载体颗粒难以保持球形形状。当制备的颗粒具有球形形状时，可以确保大的表面积，并且与非球形形状相比，细胞对载体的黏附性能高。作为交联剂，例如可以使用包含乙烯基官能团的烯键式不饱和交联剂(b2)。
在一个实施方案中，烯键式不饱和交联剂(b2)可以包括二乙烯基苯、N-乙烯基吡咯烷酮、N,N-二甲基丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸、丙烯酰胺、N-辛基丙烯酰胺、乙酸乙烯酯、以及其两者或更多者的混合物。考虑到制备的载体的密度、细胞培养过程等，可以优选使用二乙烯基苯作为烯键式不饱和交联剂。
在一个实施方案中，基于100重量份的苯乙烯单体，分散相组合物(B)可以包含3重量份至300重量份的烯键式不饱和交联剂。当烯键式不饱和交联剂的含量小于3重量份时，苯乙烯颗粒的交联密度过度降低，这使得颗粒的形式难以保持稳定的球形形状。此外，当含量超过300重量份时，交联密度过度增加，这使得难以确保适合于细胞培养和离心分离的颗粒密度水平。
在一个实施方案中，分散相组合物中的苯乙烯单体的含量相对于烯键式不饱和交联剂的含量可以过量。例如，基于100重量份的苯乙烯单体，烯键式不饱和交联剂可以以80重量份或更小、70重量份或更小、60重量份或更小、50重量份或更小、或者40重量份或更小的量使用。在这种情况下，烯键式不饱和交联剂的含量的下限可以为例如3重量份或更大，具体地，例如，其可以为5重量份或更大、10重量份或更大、15重量份或更大、20重量份或更大、或者25重量份或更大。
在一个实施方案中，分散相组合物(B)可以包含烃油(b3)。在常规技术中，使用发泡剂制备发泡苯乙烯颗粒来试图降低微载体颗粒的密度，但在使用发泡剂时，粒径和密度的分布范围变得过宽，并因此，不容易以足够的产率获得具有适合于细胞培养应用的直径和密度的载体颗粒。然而，在分散相组合物(B)中使用烃油(b3)的本申请中，不需要进行与降低载体颗粒密度相关的发泡过程。即，本申请的颗粒为非发泡颗粒。
具体地，在搅拌分散相和连续相的混合物的同时进行的悬浮聚合过程期间，烃油可能从分散相中出来。因此，微载体颗粒可以具有孔隙率并且同时具有低密度特性。此外，即使烃油在悬浮聚合期间保留在分散相中，烃油也具有如下所述的低密度并且不参与悬浮聚合，因此，微颗粒的密度可能降低。即，在无需发泡处理的情况下进行的本申请可以更精确地调节载体颗粒的直径和密度分布范围。此外，根据本申请的具体实施方案，使用烃油获得的低密度载体颗粒不会下沉到培养基的底部，也没有漂浮在培养基的表面上，而是可以以均匀分散在培养基中的状态保持。因此，本申请的颗粒可以改善载体颗粒在培养基中的漂浮程度，从而提高载体颗粒与细胞之间的黏附，并提高培养效率。
可以用于分散相的烃油的类型没有特别限制，但是可以考虑下文所述的进行制备方法的容易性或者载体颗粒的特性的确保来选择。例如，可以使用密度的上限为0.800g/cm3或更小或者0.790g/cm3或更小的低密度烃油。此时，低密度烃油的密度的下限没有特别限制，但是可以为例如0.750g/cm3或更大或者0.760g/cm3或更大。
在一个实施方案中，烃油可以包括一种或更多种具有12或更多个且50或更少个碳原子的线性或支化的饱和烃化合物。具体地，烃油可以包括例如具有12至16个碳原子的正烷烃、具有12至16个碳原子的异烷烃、或其混合物。根据本申请的具体实施方案，可以使用具有12个碳原子的十二烷、具有16个碳原子的十六烷、或Isopar M(具有12或更多个且14或更少个碳原子的异烷烃与具有13或更多个且16或更少个碳原子的异烷烃的混合物)作为烃油。
在一个实施方案中，基于分散相组合物的总重量(100重量％)，分散相组合物(B)可以包含10重量％至30重量％的烃油。具体地，烃油的含量的下限可以为11重量％或更大、12重量％或更大、13重量％或更大、14重量％或更大、或者15重量％或更大，并且上限可以为例如25重量％或更小或者20重量％或更小。通过使用以上含量范围内的油，可以确保由于使用油而产生的效果，例如获得适合于细胞培养和离心分离的密度的颗粒。例如，如果低于所述含量范围使用烃油，则难以确保具有低密度特性的载体颗粒，而如果超出以上含量范围使用烃油，则变得难以获得球形颗粒，并且颗粒形状的均匀性差。
在一个实施方案中，分散相组合物(B)还可以包含引发剂(b4)。引发剂的类型没有特别限制，只要其根据本申请的制备方法不干扰确保颗粒的特性即可。例如，可以使用诸如有机过氧化物引发剂或偶氮基引发剂的引发剂。具体地，可以使用诸如以下的化合物：过氧化苯甲酰、二叔戊基过氧化物、过氧苯甲酸叔丁酯、2,5-二甲基-2,5-二-(叔丁基过氧基)己烷、2,5-二甲基-2,5-二-(叔丁基过氧基)己炔-3或二枯基过氧化物、及其混合物，但本申请不限于此。
引发剂的含量没有特别限制。引发剂可以在不干扰确保颗粒的期望特性的水平下以合适量使用。例如，基于分散相组合物的总重量(100重量％)，分散相组合物(B)可以以0.10重量％至5.00重量％、0.50重量％至4.00重量％、或1.00重量％至3.00重量％范围内的量包含引发剂。
在一个实施方案中，苯乙烯和交联剂可以仅以在分散相组合物的总含量(100重量％)中排除上述其他组分(例如，油、引发剂等)的总含量的剩余量包含在分散相组合物中。例如，基于分散相组合物的总含量(100重量％)，苯乙烯(b1)和交联剂的总含量可以为60重量％或更大、65重量％或更大、70重量％或更大、或者75重量％或更大，并且总含量的上限可以为例如小于90重量％、85重量％或更小、或者80重量％或更小。在这样的情况下，苯乙烯与交联剂之间的相对含量比可以满足上述比率范围(苯乙烯单体:烯键式不饱和交联剂＝100重量份:3重量份至100重量份:300重量份)。
连续相组合物(A)和分散相组合物(B)的含量适合于形成均匀分散相的液滴以及进行悬浮聚合，并且可以在不干扰确保下述颗粒的特性的水平下调整。例如，连续相组合物的重量(WA)与分散相组合物的重量(WB)之间的比率(WB/WA)可以在0.05至0.30的范围内。更具体地，该比率可以在0.10至0.25的范围内。
根据本申请的制备方法，悬浮聚合可以在根据本申请的制备方法不干扰确保颗粒特性的条件下进行。例如，悬浮聚合可以在80℃至95℃的温度和300rpm至900rpm的速度的条件下进行。
在一个实施方案中，悬浮聚合可以在氮气吹扫条件下进行。
进行悬浮聚合的时间没有特别限制。例如，悬浮聚合可以进行数小时，具体地约3小时至10小时。
在一个实施方案中，该方法可以包括将连续相组合物(A)和分散相组合物(B)混合，然后施加剪切力以使分散相组合物(B)以液滴的形式在连续相组合物(A)中均化的步骤；以及使分散相组合物经受悬浮聚合的步骤。关于悬浮聚合的细节与上述那些相同。
使分散相组合物(B)以液滴的形式均化的步骤可以通过在常温下搅拌来进行。在常温下进行的搅拌速度没有特别限制，但是例如，其可以在300rpm至900rpm的范围内。
在一个实施方案中，该方法还可以包括在进行悬浮聚合期间另外添加连续相组合物(A)的步骤。具体地，在悬浮聚合期间可以另外添加聚乙烯醇和水的混合物。在这方面，“进行悬浮聚合期间”可以意指在已经形成上述悬浮聚合条件(温度和速度)之后，或者替代性地，其可以意指与悬浮聚合相关的聚合速率在至少5％至70％的范围内的时间点。当另外添加聚乙烯醇时，确定所制备的颗粒的平坦度得到改善，总制备的颗粒中的单一形状颗粒的比例增加(参见表1和表2中与实施例3相关的内容)。“平坦度得到改善”在本文中意指由颗粒聚集和分离引起的颗粒表面上的缺陷较少。这被认为是因为颗粒之间的聚集由于在分散相相关的悬浮聚合期间另外添加的连续相组合物而被抑制。构成另外添加的连续相组合物(A)的组分和其他特性与上述那些相同。
在另一个实施方案中，该方法还可以包括在完成悬浮聚合反应之后在悬浮聚合反应产物(载体颗粒)的表面上形成引物层(primer layer)和/或细胞黏附诱导层的步骤。
引物层能够将功能性聚合物引入到不具有官能团的微载体颗粒的表面，并用作所谓的黏附层。例如，细胞黏附诱导层或细胞可以经由引物层稳定地保持在颗粒上。
虽然没有特别限制，但作为能够形成引物层的化合物，可以使用能够诱导水相黏附的儿茶酚衍生物。例如，在形成引物层时可以使用选自以下的任一者或更多者：L-二羟基苯丙氨酸(L-dihydroxyphenylalanine，L-DOPA)、多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、表没食子儿茶素及其衍生物。通过包含所述化合物形成的引物层可以赋予颗粒表面亲水性以进一步提高颗粒在作为连续相的水性分散体中的分散性。
在一个实施方案中，基于聚苯乙烯的颗粒的半径与引物层之间的厚度的比率可以为1:0.00001至1:0.01、或1:0.0001至1:0.001。当基于聚苯乙烯的颗粒的半径与表面涂覆层的厚度的比率太低时，引物层与基于聚苯乙烯的颗粒相比太薄，并且将微载体的表面修饰为亲水性的效果是微不足道的。当引物层太高时，引物层与基于聚苯乙烯的颗粒相比变得更厚，并且在细胞培养期间细胞与微载体之间的黏附效率可能降低。
细胞黏附诱导层由用于为细胞跨膜蛋白提供附着位点的细胞黏附物质构成。由此，黏附细胞可以稳定地黏附、扩散和培养。虽然没有特别限制，但可以使用选自以下的任一者或更多者作为用于形成细胞黏附诱导层的化合物：明胶、胶原蛋白、纤连蛋白、壳聚糖、聚多巴胺、单宁酸、多酚、聚L-赖氨酸、玻连蛋白、含RGD的肽、木质素、阳离子葡聚糖、及其衍生物。此外，通过包含所述化合物形成的细胞黏附诱导层可以将(聚苯乙烯)颗粒的表面修饰为亲水性的，从而改善载体的水分散性。
在一个实施方案中，该方法还可以包括在完成悬浮聚合反应之后的洗涤步骤。通过洗涤可以除去与作为悬浮聚合产物的载体颗粒无关的杂质。洗涤方法没有特别限制，并且可以使用已知的洗涤方法。例如，洗涤可以通过将悬浮聚合产物添加到醇例如乙醇中并搅拌混合物来进行。虽然没有特别限制，但可以将这样的洗涤重复例如三次或更多次。
在一个实施方案中，可以在载体颗粒的表面上形成引物层和/或细胞黏附诱导层之后进行洗涤。
在一个实施方案中，该方法还可以包括在洗涤之后的干燥步骤。通过干燥可以除去溶剂残留物等。干燥方法没有特别限制，并且可以使用已知的干燥方法。例如，可以使用烘箱或在常温条件下进行干燥。此外，虽然没有特别限制，但干燥可以在真空中进行。
在一个实施方案中，该方法还可以包括在完成悬浮聚合反应之后洗涤和干燥悬浮聚合产物的步骤。关于洗涤和干燥的细节与上述那些相同。
根据上述方法制备的颗粒可以具有适合于细胞培养的特性。
在一个实施方案中，该方法可以提供具有高的形状或形式均匀性的颗粒。具体地，如通过下述实施例确定的，对于根据本申请的方法制备的颗粒，所制备的颗粒的总数的至少80％可以具有单一形状。即，根据该方法，全部所制备的颗粒中的单一形状颗粒的比率可以满足80％或更大。在此，“单一形状”意指在其表面上不存在伴生颗粒的颗粒。与在其表面具有伴生颗粒的颗粒相比，单一形状颗粒可以具有更大的表面积，这有利于细胞黏附。
在一个实施方案中，该方法可以提供球形颗粒。球形形状通常意指其具有接近于球形形状的形式，并且可以用肉眼确定，但是例如，其可以意指通过以下等式1计算的球形度值为约0.80或更大的情况。当颗粒具有球形形状时，可以确保大的表面积并且可以改善载体的细胞黏附性能。在本申请的具体实施方案中，根据本申请制备的颗粒可以具有球形形状，或者至少单一形状颗粒可以具有球形形状。
[等式1]
Figure BDA0003673002960000101
(在等式1中，Vp为颗粒的体积，AP为颗粒的表面积。)
在一个实施方案中，该方法可以提供在其中形成有一个或更多个尺寸为0.5μm或更大或者1μm或更大的孔的多孔颗粒。孔可以使用扫描电子显微镜(SEM)通过颗粒分析来确定。此时，孔的尺寸可以是连接由颗粒的截面目视确定的(例如，当从颗粒的外部观察颗粒时)孔的两端的最长(虚拟)直线距离。孔的形状或分布可以根据在分散相液滴的悬浮聚合期间产生的烃油的移动而变化。例如，一个或更多个孔可以以各种形状存在于颗粒内。孔尺寸的上限可以根据整个颗粒的尺寸而变化，但可以为例如5μm或更小、4.5μm或更小、4.0μm或更小、3.5μm或更小、3.0μm或更小、2.5μm或更小、或者2.0μm或更小。
在这方面，根据本申请的具体实施方案获得的多孔颗粒可以是通过以下等式2计算的孔隙度或孔隙率为约15.0％或更小的颗粒。颗粒的孔隙率的下限可以为例如大于0％、1％或更大、2％或更大、3％或更大、4％或更大、或者5％或更大。该孔隙率与颗粒的密度特性相关。
[等式2]
孔隙率＝{1-(表观密度/真密度)}×100
(在等式2中，表观密度是通过使用包括颗粒之间的空间的颗粒的体积获得的密度，真密度是通过使用排除所述空间的仅颗粒的体积获得的密度。此时，真密度可以用氦比重计(Micromeritics Corp.)设备来测量，表观密度可以通过如以下实验例中所述的乙醇浮选法来测量。)
在一个实施方案中，该方法可以提供具有微米水平尺寸(在约50μm至400μm的范围内)的颗粒，具体地，直径在90μm至250μm的范围内的颗粒，更具体地，直径在110μm至210μm的范围内的颗粒。具体地，该方法可以提供直径在90μm至250μm的范围内的单一形状球形颗粒。直径可以使用颗粒尺寸分析仪(particle size analyzer，PSA)来测量。或者，可以通过光学显微镜确定颗粒的二维(2D)平面面积，并且对于平面面积可以通过反向计算等式(S＝πr2)来计算直径。此时，直径可以是对于至少100个颗粒计算的值的算术平均值。当粒径小于以上范围时，细胞黏附性能差，而当其超过以上范围时，其对于相同体积具有减小参考表面积的效果，因此，类似地，难以预期优异的细胞黏附性能。根据本申请的具体实施方案，直径可以为单一形状颗粒的直径。
在一个实施方案中，该方法可以提供密度在0.95g/cm3至1.00g/cm3的范围内的颗粒。确定颗粒的密度的方法没有特别限制。例如，如以下实验例中所描述的，颗粒的密度可以通过将颗粒装填到具有预定密度的溶液中，然后确定颗粒是漂浮还是沉降的方法来确定。考虑到用于细胞(其密度为约1.2g/cm3水平)培养的常规市售载体颗粒的密度为约1.1g/cm3至1.3g/cm3，根据本申请制备的载体颗粒具有低密度特性。因此，当从微载体颗粒中分离和回收培养的细胞时，由于重力引起的沉降速率差异可能比使用常规载体颗粒时更大，并因此，微载体和细胞可以被更容易地分离。在一个实施方案中，微载体颗粒的密度下限可以为0.95g/cm3或更高，且上限可以为0.995g/cm3或更低。当微载体颗粒的密度超过0.995g/cm3并接近1.00g/cm3或变得比这更大时，细胞与微载体之间的密度差异小，当在培养之后分离和回收细胞时离心分离困难。此外，当微载体颗粒的密度变得小于0.95g/cm3并接近0.90g/cm3时，难以在培养细胞的早期使细胞附着到微载体颗粒，并且不适合于培养。
在一个实施方案中，本申请的方法可以提供具有以上特性的颗粒，其中回收率在70％至95％的范围内。颗粒的回收率可以如以下实验例中所描述的进行计算。
如上所述根据本申请制备的载体颗粒可以用于细胞培养。
在本申请的另一个实施方案中，本申请涉及微载体颗粒。微载体颗粒可以通过上述方法来制备。
在一个实施方案中，多孔微载体颗粒可以包含聚苯乙烯。即，通过苯乙烯单体的悬浮聚合获得的微载体颗粒可以是聚苯乙烯颗粒或基于聚苯乙烯的颗粒。
在一个实施方案中，聚苯乙烯颗粒或基于聚苯乙烯的颗粒可以是苯乙烯单体和烯键式不饱和交联剂的聚合产物。具体地，聚苯乙烯可以是苯乙烯单体和二乙烯基苯交联剂的悬浮聚合反应产物(聚(苯乙烯-共聚-二乙烯基苯))。
在一个实施方案中，微载体颗粒还可以包括在其表面上的引物层和/或细胞黏附诱导层。关于这一点的细节与上述那些相同。
在一个实施方案中，微载体颗粒可以是其中基于数量的总颗粒的80％或更多满足单一形状的颗粒。关于单一形状的细节与上述那些相同。
在一个实施方案中，微载体颗粒可以具有球形形状。关于球形形状的细节与上述那些相同。
在一个实施方案中，微载体颗粒可以是多孔的。关于孔隙率和孔的细节与上述那些相同。例如，微载体颗粒的孔尺寸可以为5μm或更小。此时，孔可以形成在颗粒内。根据本申请的具体实施方案，孔尺寸的下限可以为例如0.5μm或更大或者1μm或更大。此外，上限可以为例如4.5μm或更小、4.0μm或更小、3.5μm或更小、3.0μm或更小、2.5μm或更小、或者2.0μm或更小。
在一个实施方案中，微载体颗粒的直径可以在90μm至250μm的范围内。具体地，微载体颗粒中具有单一形状的颗粒的直径可以满足90μm至250μm的范围。关于载体粒径的细节与上述那些相同。
在一个实施方案中，微载体颗粒的密度可以在0.95g/cm3至1.00g/cm3的范围内。关于载体颗粒的密度的细节与上述那些相同。
在一个实施方案中，微载体颗粒可以同时满足上述形状、孔隙率、密度和/或尺寸特性中的两者或更多者。
所制备的颗粒的其他特性与上述相同。
在另一个实施方案中，本申请可以涉及包含上述载体颗粒和细胞的细胞培养组合物。
在这方面，细胞的类型没有特别限制。例如，培养组合物中包含的细胞可以是黏附动物细胞，具体地，可以是诸如纤维母细胞、软骨细胞、间充质干细胞、CHO、HEK 293、vero细胞、BHK21或MDCK的细胞。
细胞培养组合物还可以包含培养基溶液。培养基溶液可以包含：基于体液例如血浆或淋巴液的接近活体条件的营养物，和用于充分满足环境条件例如pH、温度和渗透压的各种添加剂。作为这些添加剂，可以没有限制地使用在细胞培养相关技术领域中广泛已知的各种物质。
在一个实施方案中，微载体和细胞可以具有比培养基溶液更低的密度。具体地，根据本申请的一个实施方案，载体颗粒的密度可以在0.95g/cm3至1.00g/cm3的范围内，细胞的密度可以在1.10g/cm3至1.25g/cm3的范围内(约1.2g/cm3)。因此，注入到培养基溶液中的低密度载体颗粒可以漂浮在培养基溶液中。随着黏附至漂浮载体颗粒的表面的细胞的数量逐渐增加，黏附有细胞的微载体的密度也逐渐增加，并且可以下沉到容纳培养基溶液的容器的底部。此外，在细胞培养之后，可以通过经由离心分离将细胞从微载体-细胞复合物中分离出来来确保所培养的细胞。
在另一个实施方案中，本申请可以涉及用于制备细胞培养组合物的方法。用于制备细胞培养组合物的方法可以包括将微载体颗粒、细胞和培养基溶液混合的步骤。
具体地，用于制备细胞培养组合物的方法可以包括制备上述微载体颗粒的步骤；和将微载体颗粒、细胞和培养基溶液混合的步骤。此时，关于微载体颗粒、细胞和培养基溶液的细节与上述那些相同。
有益效果
根据本申请，提供了具有形状或形式的高度均匀性、是多孔的、有利于细胞培养和离心分离的微载体；和包含其的组合物。
附图说明
图1是实施例1至3中制备的部分颗粒的SEM图像。每个图像右侧下端处显示的白条意指150μm的尺寸。
图2是比较例1至5中制备的部分颗粒的SEM图像。每个图像右侧下端处显示的白条意指150μm的尺寸。在比较例4的情况下，由于如表2获得了1mm或更大的颗粒，因此没有通过显示150μm尺寸的白条的图像来比较颗粒。
图3是示出根据实施例1制备的颗粒的内部结构的图。具体地，确定在根据实施例制备的颗粒内形成了尺寸为约1μm至3μm的孔。
具体实施方式
在下文中，将参照具体实施例更详细地描述本发明的作用和效果。然而，这些实施例仅用于说明目的，并不旨在以任何方式限制本发明的权利范围。
实施例和比较例
实施例1
(1)分散相的制备
将8g的以下表1所示的含量比的苯乙烯单体(st)、作为交联剂的二乙烯基苯(DVB)和低密度烃油(密度在0.750g/cm3至0.800g/cm3的范围内)的混合物在100ml小瓶中搅拌。之后，向小瓶中另外添加作为热引发剂的过氧化苯甲酰(BPO)和过氧苯甲酸叔丁酯(t-BP)，并将混合物在常温下搅拌约5分钟。每种组分之间的含量示于下表1中。
(2)连续相的制备
将2.5g的重均分子量在85,000至125,000的范围内且水解率为87％至89％的PVA溶解在250g蒸馏水中。详细含量示于表1中。
(3)通过悬浮聚合制备颗粒
将50g的1％PVA水溶液与分散相混合并在油浴中搅拌直至获得均匀分散体。具体地，将油浴在以800rpm搅拌的同时在常温下逐渐加热，并在85℃至88℃的温度和600rpm至800rpm的速度的条件下进行悬浮聚合。聚合在氮气吹扫下进行。
(4)获得颗粒
在反应6小时之后，将所制备的颗粒通过100μm筛回收，并用乙醇洗涤5次，然后在常温下干燥。
实施例2至3和比较例1至6
通过与实施例1中相同的过程获得颗粒，不同之处在于分散相和连续相的组成如下表1所示调节。
测量方法
(1)连续相的表面张力(单位：mN/m)
表面张力根据环法来测量。具体地，使用铂环和表面张力计(Surface ElectroOptics)在常温下测量表面张力。
(2)连续相的粘度(单位：cp)
粘度根据剪切速率来测量。具体地，在66 1/秒至264 1/秒的剪切速率范围和常温(约25℃)的条件下，使用LVDV2T仪器(Brookfield)(其为旋转粘度计)测量粘度。
(3)重均分子量
使用凝胶渗透色谱法(GPC)测量PVA(或PVP)的重均分子量(以标准聚苯乙烯换算)。
(4)水解度
测量的PVA的水解度使用1H-NMR来测量。作为参照，随着水解进行，乙烯处的氢峰(H峰)减少，而羟基处的氢峰增加。
(5)油/水比
当将分散相视为油相且将连续相视为水相时，意指分散相的重量(WB)相对于连续相的重量(WA)的比率。
[表1]
Figure BDA0003673002960000161
在表1中，参考标记1)至10)如下。
1)St(苯乙烯)的重量与DVB(二乙烯基苯)的重量的比率
2)当分散相的全部组成的重量为100时油所占的重量％，
3)当分散相的全部组成的重量为100时BPO所占的重量％，
4)当分散相的全部组成的重量为100时t-BP所占的重量％，
5)当连续相的全部组成的重量为100时PVA(聚乙烯醇)或PVP(聚乙烯吡咯烷酮)所占的重量％，
6)将PVA以1％的浓度添加到连续相中，并且在进行悬浮聚合期间(当聚合率为约10％的时间点)另外添加PVA的浓度为1％的连续相组合物
7)使用满足85,000至125,000范围内的重均分子量和87％至89％范围内的水解度的PVA
8)使用满足13,000至50,000范围内的重均分子量和87％至89％范围内的水解度的PVA
9)使用重均分子量为约55,000的PVP
10)使用重均分子量为约360,000的PVP
悬浮聚合产物的实验的结果
对于实施例和比较例中获得的颗粒，测量表2中所示的项目。每个项目的测量方法如下。
1.颗粒的回收率(％)
在实施例中，根据下面的等式3计算固体含量(回收的聚苯乙烯颗粒)与实际参与聚苯乙烯颗粒的聚合的物质(苯乙烯和二乙烯基苯)的比率。
[等式3]
{(回收的聚苯乙烯颗粒的重量(g))/(苯乙烯和二乙烯基苯的重量(g))}×100
颗粒的回收率与悬浮聚合反应体系中的分散相的稳定性有关。具体地，当分散相的稳定性得到确保时，分散相在聚合期间不破裂并且可以聚合成颗粒。这样的稳定性可以根据形成分散相和连续相的组分以及是否满足条件1和条件2而变化。
2.确定颗粒密度(g/cm3)
在常温(约25℃)和大气压(1个大气压)的条件下，将实施例和比较例中获得的载体颗粒分别添加到密度为0.95g/cm3的乙醇水溶液和密度为0.99g/cm3的乙醇水溶液中。然后，确定载体颗粒是漂浮还是沉降，然后基于以下标准评估密度。颗粒的密度可以根据是否使用烃油、其含量、以及因满足条件1和条件2而在分散相中的烃油的残留量来确定。
1)在密度为0.95g/cm3的乙醇水溶液中漂浮：载体的密度小于0.95g/cm3。
2)在密度为0.99g/cm3的乙醇水溶液中沉降：载体的密度超过0.99g/cm3。
3)在密度为0.95g/cm3的乙醇水溶液中沉降且在密度为0.99g/cm3的乙醇水溶液中漂浮：载体的密度为0.95g/cm3或更大且0.99g/cm3或更小。
3.颗粒尺寸
准备实施例和比较例中获得的微载体颗粒，然后通过光学显微镜测量100个颗粒的粒径。计算所测量的直径的算术平均值。具体地，通过经由光学显微镜计算颗粒的二维(2D)平面面积然后对于平面面积反向计算等式(S＝πr2)来计算单个颗粒的直径。
连续相的表面张力影响分散相与连续相之间的界面张力以及分散相的形状或尺寸。在上述条件1下的表面张力可以防止分散相的破裂或者分散相的尺寸过度减小或增大。此外，在与悬浮聚合相关的搅拌下，连续相的粘度影响分散相的移动。适当的粘度水平(例如上述条件2)减少液滴或颗粒之间的碰撞和破裂，并且对颗粒的形状(平坦度或单一形状颗粒)也具有积极影响。
4.单一形状颗粒的百分比
准备实施例和比较例中获得的微载体颗粒，拍摄扫描电子显微镜(SEM)图像(使用×250的放大倍数)。随机选择其中从所拍摄的图像中目视确定30或更多个颗粒的多个图像，计算每幅图像中所观察到的表面上没有伴生颗粒的单一形状颗粒数与颗粒总数的比率。
单一形状颗粒的比例高是与悬浮聚合期间由于颗粒碰撞导致的颗粒聚集较少相关。特别地，连续相2的条件2的粘度与分散相颗粒的移动相关。
在具有满足条件2的粘度的情况下，分散相颗粒的移动减少，由于颗粒碰撞引起的颗粒聚集和团聚减少，并且单一形状颗粒的比例可以增加。此时，当满足条件1时，由于低表面张力引起的颗粒尺寸过度减小以及由此引起的界面张力降低得到抑制。因此，当满足条件1和条件2时，具有适当尺寸的单一形状颗粒的比例可以增加。
5.颗粒的内部结构
对于实施例1中获得的细胞培养微载体，通过SEM确定颗粒的内部结构。具体地，在将颗粒嵌入环氧树脂中之后，通过离子研磨准备截面，并通过SEM确定颗粒截面的形状。
[表2]
Figure BDA0003673002960000191
通过表1和表2对比较例1至3与实施例进行比较，可以看出根据本申请的实施例的颗粒回收率优于比较例的颗粒回收率。这意味着本申请的方法诱导稳定分散相的形成和聚合，因此，可以改善大量具有低密度和大表面积特性的载体颗粒。(过程效率或产率得到改善)。
此外，通过表1和表2对比较例4和5与实施例进行比较，可以看出，与比较例4和5相比，根据本申请的实施例提供了具有窄的颗粒尺寸分布和合适的尺寸的微尺寸颗粒。此外，确定在实施例的情况下，(合适尺寸的)单一形状颗粒的比例通常高于比较例4和5中的。这意味着本申请的方法可以提供适合于细胞培养的大表面积。
此外，对比较例4和5与实施例进行比较，可以看出在使用PVP的情况下，通过悬浮聚合制备的颗粒的颗粒尺寸变得过大或颗粒尺寸分布变得过宽。在计算回收率时考虑了颗粒的重量，并且比较例5的回收率高是因为比较例5中制备的大颗粒(大于300μm的尺寸)的重量相对大。另一方面，比较例4中使用的PVP的分子量与比较例5中使用的PVP的分子量相比非常小，由此在比较例4中，PVP之间的空间效应弱，并且过度发生颗粒之间的聚集，使得颗粒的尺寸非常大，并难以确定单个颗粒密度或回收率。
总之，本申请可以以高回收率提供具有单一形状、球形形状、低密度特性和优异平坦度的多孔载体颗粒。

Claims (30)

1.一种用于制备细胞培养用微载体颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：
将同时满足以下条件1和条件2的连续相组合物(A)和包含可聚合单体(b1)的分散相组合物(B)混合，然后进行悬浮聚合：
[条件1]
45mN/m<连续相组合物的表面张力≤54mN/m
[条件2]
连续相组合物的粘度≥2.0cp
(其中，在所述[条件1]中，所述表面张力根据环法在常温下测量，以及在所述[条件2]中，所述粘度在66 1/秒至264 1/秒范围内的剪切速率和常温的条件下测量。)
2.根据权利要求1所述的用于制备细胞培养用微载体颗粒的方法，其中所述连续相组合物(A)包含水和聚(乙烯醇)(PVA)。
3.根据权利要求2所述的用于制备细胞培养用微载体颗粒的方法，其中所述聚乙烯醇(PVA)具有80,000至190,000范围内的重均分子量和80％至99％范围内的水解度。
4.根据权利要求2所述的用于制备细胞培养用微载体颗粒的方法，其中基于所述连续相组合物的总重量，所述连续相组合物(A)包含1.0重量％或更多的所述聚乙烯醇。
5.根据权利要求1所述的用于制备细胞培养用微载体颗粒的方法，其中所述分散相组合物(B)包含苯乙烯单体作为可聚合单体(b1)。
6.根据权利要求5所述的用于制备细胞培养用微载体颗粒的方法，其中所述分散相组合物(B)还包含交联剂(b2)。
7.根据权利要求6所述的用于制备细胞培养用微载体颗粒的方法，其中基于100重量份的所述苯乙烯单体，所述分散相组合物(B)以3重量份至300重量份的量包含所述交联剂。
8.根据权利要求6所述的用于制备细胞培养用微载体颗粒的方法，其中所述分散相组合物(B)还包含烃油(b3)。
9.根据权利要求8所述的用于制备细胞培养用微载体颗粒的方法，其中所述烃油的密度在0.750g/cm3至0.800g/cm3的范围内。
10.根据权利要求8所述的用于制备细胞培养用微载体颗粒的方法，其中基于所述分散相组合物的总含量，所述分散相组合物(B)以10重量％至30重量％的量包含所述烃油。
11.根据权利要求8所述的用于制备细胞培养用微载体颗粒的方法，其中所述烃油包括具有12至50个碳原子的线性或支化的饱和烃化合物。
12.根据权利要求1所述的用于制备细胞培养用微载体颗粒的方法，其中所述悬浮聚合在80℃至95℃的温度和300rpm至900rpm的速度的条件下进行。
13.根据权利要求1所述的用于制备细胞培养用微载体颗粒的方法，所述方法包括
将所述连续相组合物(A)和所述分散相组合物(B)混合，然后施加剪切力以使所述分散相组合物(B)在所述连续相组合物(A)中以液滴的形式均化的步骤；和
使所述分散相组合物经受悬浮聚合的步骤。
14.根据权利要求1所述的用于制备细胞培养用微载体颗粒的方法，所述方法还包括
在进行悬浮聚合期间另外添加所述连续相组合物(A)的步骤。
15.根据权利要求1所述的用于制备细胞培养用微载体颗粒的方法，
所述方法提供了微载体颗粒，其中所制备的微载体颗粒的至少80％具有单一形状(其中所述单一形状意指表面上不存在伴生颗粒的颗粒。)
16.根据权利要求1所述的用于制备细胞培养用微载体颗粒的方法，
所述方法提供了多孔微载体颗粒，所述多孔微载体颗粒为球形且在其中具有5μm或更小的孔。
17.根据权利要求1所述的用于制备细胞培养用微载体颗粒的方法，
所述方法提供了直径在90μm至250μm范围内的微载体颗粒。
18.根据权利要求1所述的用于制备细胞培养用微载体颗粒的方法，
所述方法提供了密度在0.95g/cm3至1.00g/cm3范围内的微载体颗粒。
19.一种包含聚苯乙烯的非发泡球形微载体颗粒，
所述非发泡球形微载体颗粒为多孔的，其中其内部的孔尺寸为5μm或更小。
20.根据权利要求19所述的包含聚苯乙烯的非发泡球形微载体颗粒，
所述非发泡球形微载体颗粒的直径在90μm至250μm的范围内。
21.根据权利要求19或20所述的包含聚苯乙烯的非发泡球形微载体颗粒，
所述非发泡球形微载体颗粒的密度在0.95g/cm3至1.00g/cm3的范围内。
22.一种包含聚苯乙烯的非发泡球形微载体颗粒，
其中总颗粒的至少80％具有单一形状，并且
(其中所述单一形状意指表面上不存在伴生颗粒的颗粒。)
23.根据权利要求22所述的包含聚苯乙烯的非发泡球形微载体颗粒，
所述非发泡球形微载体颗粒的直径为90μm至250μm(其中所述单一形状意指表面上不存在伴生颗粒的颗粒。)
24.根据权利要求22或23所述的包含聚苯乙烯的非发泡球形微载体颗粒，
所述非发泡球形微载体颗粒的密度为0.95g/cm3至1.00g/cm3(其中所述单一形状意指表面上不存在伴生颗粒的颗粒。)
25.一种包含聚苯乙烯的非发泡球形微载体颗粒，其中：
总颗粒的至少80％具有单一形状，
所述微载体颗粒为多孔的，其中其内部的孔尺寸为5μm或更小，并且(其中所述单一形状意指表面上不存在伴生颗粒的颗粒。)
26.根据权利要求25所述的包含聚苯乙烯的非发泡球形微载体颗粒，
所述非发泡球形微载体颗粒的直径为90μm至250μm(其中所述单一形状意指表面上不存在伴生颗粒的颗粒。)
27.根据权利要求25或26所述的包含聚苯乙烯的非发泡球形微载体颗粒，所述非发泡球形微载体颗粒的密度在0.95g/cm3至1.00g/cm3的范围内(其中所述单一形状意指表面上不存在伴生颗粒的颗粒。)
28.一种细胞培养组合物，包含根据权利要求19制备的微载体颗粒；细胞；和培养基。
29.一种细胞培养组合物，包含根据权利要求22制备的微载体颗粒；细胞；和培养基。
30.一种细胞培养组合物，包含根据权利要求25制备的微载体颗粒；细胞；和培养基。
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