WO2023055068A1 - 세포 배양용 마이크로 캐리어, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 배양 조성물 - Google Patents

세포 배양용 마이크로 캐리어, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 배양 조성물 Download PDF

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WO2023055068A1
WO2023055068A1 PCT/KR2022/014551 KR2022014551W WO2023055068A1 WO 2023055068 A1 WO2023055068 A1 WO 2023055068A1 KR 2022014551 W KR2022014551 W KR 2022014551W WO 2023055068 A1 WO2023055068 A1 WO 2023055068A1
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cell culture
microcarrier
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김민채
김지선
김윤섭
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주식회사 엘지화학
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/12—Apparatus for enzymology or microbiology with sterilisation, filtration or dialysis means

Definitions

  • the present invention relates to providing a microcarrier for cell culture that can be more easily separated during separation and recovery of the microcarrier and the cells after cell culture, while having a low density so as to enable cell culture.
  • the present invention is to provide a method for manufacturing the microcarrier for cell culture.
  • the cell culture microcarrier includes at least one of hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms or pores derived therefrom;
  • magnetic particles may include polystyrene-based particles including. That is, the polystyrene-based particles may include one kind of hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms, one kind of pores derived from hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms, or a mixture of the two.
  • the fact that the polystyrene-based particles contain only one kind of hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms means that the hydrocarbon oil is completely phase-separated during the polymerization process, but is not lost to the outside of the particles during the polymerization and washing process, and the polystyrene-based particles having 12 or more carbon atoms Including only one type of void derived from hydrocarbon oil means a state in which the hydrocarbon oil is completely phase-separated during the polymerization process but is lost to the outside of the particles during the polymerization and washing process.
  • the method of measuring the diameter of the pore is not particularly limited, but, for example, after embedding the microcarrier for cell culture in epoxy, preparing a cross section through ion milling, and then confirming the shape of the particle cross section with SEM to determine the size of the void inside the particle. diameter can be measured.
  • the pores are derived from hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms, the pores may have a small size of 0.1 ⁇ m or more and 5 ⁇ m or less in diameter, thereby easily increasing the density of the microcarriers. can be adjusted
  • the hydrocarbon oil may include a straight-chain or branched-chain saturated hydrocarbon compound having 12 or more and 50 or less carbon atoms.
  • the linear or branched saturated hydrocarbon compound having 12 or more and 50 or less carbon atoms may be used alone or in combination, and examples of the straight-chain or branched saturated hydrocarbon compound having 12 or more and 50 or less carbon atoms include normal alkanes having 12 or more and 16 or less carbon atoms, isoalkanes having 12 or more and 16 or less carbon atoms, or mixtures thereof.
  • cells and microcarriers can be easily separated through a difference in sedimentation speed due to gravity when microcarriers and cells are separated and recovered after cell culture.
  • the magnetic particle may include a hydrophobic ligand having a hydrophobic functional group on the surface of the magnetic particle. That is, the surface-treated magnetic particle with the hydrophobic functional group may include a hydrophobic ligand having a hydrophobic functional group on the surface of the magnetic particle.
  • the ligand refers to a molecule or ion bonded to the periphery of a central metal ion of a coordinated compound, and may refer to an atom or group of atoms forming a coordination bond while donating an electron pair to a central metal atom in a complex compound.
  • the bent hydrocarbon chain of the unsaturated fatty acid may form a hydrophobic channel while being oriented outward of the magnetic particle.
  • the magnetic particles surface-treated with the hydrophobic functional group may have a bonding structure as shown in FIG. 1 .
  • the diameter of the magnetic particles surface-treated with the hydrophobic functional group may be 100 nm or more and 2000 nm or less.
  • a method for measuring the diameter of the magnetic particle is not particularly limited, but may be measured using, for example, dynamic light scattering (DLS).
  • the polystyrene-based particles may include at least one of hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms, or pores derived therefrom; and magnetic particles; may include a polystyrene-based polymer dispersed therein.
  • the polystyrene-based particles may include at least one or more of a polystyrene-based polymer matrix, a hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms dispersed in the polystyrene-based polymer matrix, or pores derived therefrom;
  • magnetic particles may include.
  • the microcarrier for cell culture includes a suspension polymerization reaction product of a monomer composition containing hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms, magnetic particles, and styrene monomer, and the hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms is phase separated from polystyrene during suspension polymerization.
  • a void which is a formed space, may be included.
  • the magnetic particles may exist in a dispersed state in at least one of the hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms or pores derived therefrom.
  • the amount of magnetic particles is excessively reduced to less than 0.01 part by weight with respect to 100 parts by weight of hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms, the magnetic properties of the microcarriers are not sufficiently realized, and thus separation and purification of microcarriers and cells after cell culture are not easy.
  • the recovery process is additionally involved and the process becomes complicated.
  • the amount of the ethylenically unsaturated crosslinking agent is excessively increased to 3 parts by weight or more based on 1 part by weight of the styrene monomer, the crosslinking density of the polystyrene-based polymer increases, and the overall density of the polystyrene-based particles is difficult to lower to the target level. there is.
  • the content of the hydrocarbon oil may be 10 wt% or more and 30 wt% or less, or 14 wt% or more and 21 wt% or less with respect to the total weight of the monomer composition.
  • the content of the hydrocarbon oil is excessively reduced, the amount of the hydrocarbon oil impregnated into the particles is reduced, making it difficult to sufficiently lower the density of the polystyrene-based particles.
  • the content of the hydrocarbon oil is excessively increased, it is difficult for the polystyrene-based particles to have a spherical shape, resulting in reduced uniformity of the particles.
  • Examples of the ethylenically unsaturated crosslinking agent include divinylbenzene.
  • the ratio of the surface area of the polystyrene-based particles contacting micropores present on the surface of the polystyrene-based particles may be less than 0.01%.
  • the total surface area of the polystyrene-based particles means the sum of the surface areas exposed to the air at the outermost part of the polystyrene-based particles, and the surface area of the polystyrene-based particles in contact with micropores present on the surface of the polystyrene-based particles is the polystyrene-based particles. It means the sum of the surface areas where the micropores present on the surface contact the outermost surface of the polystyrene-based particles.
  • the micropore is a pore having a maximum diameter of micrometer size, and means a pore having a maximum diameter of 1 ⁇ m or more and 500 ⁇ m or less, for example.
  • the ratio of the surface area of the polystyrene-based particles contacting the micropores present on the surface of the polystyrene-based particles can be obtained through Equation 1 below.
  • the ratio (%) of the surface area of the polystyrene-based particles in contact with micropores present on the surface of the polystyrene-based particles [(contact with micropores present on the surface of the polystyrene-based particles surface area of the polystyrene-based particles) / (total surface area of the polystyrene-based particles)] * 100
  • the ratio of the surface area of the polystyrene-based particles in contact with the micropores present on the surface of the polystyrene-based particles is less than 0.01%, it means that the micropores present on the surface of the polystyrene-based particles It means that there is no size pore at all, or it is extremely small enough to be regarded as almost non-existent. That is, micropores may not exist on the surface of the polystyrene-based particle.
  • expanded styrene has been prepared by adding a foaming agent to lower the density of polystyrene particles, but in this case, as the distribution of diameter and density ranges of polystyrene particles is excessively widened, the yield within the range applicable as microcarriers for cell culture is secured. I had difficulty doing it.
  • the ratio of the surface area of the polystyrene-based particles in contact with the micropores present on the surface of the polystyrene-based particles is less than 0.01% based on the total surface area of the polystyrene-based particles, it is different from conventional expanded styrene. Otherwise, since the foaming process by the foaming agent does not proceed at all, there is an advantage in that the distribution of the diameter range and density range of the polystyrene particles can be more precisely controlled.
  • An average diameter of the microcarriers may be greater than or equal to 50 ⁇ m and less than or equal to 400 ⁇ m.
  • the average diameter of the microcarriers is 50 ⁇ m or more, 75 ⁇ m or more, 100 ⁇ m or more, 120 ⁇ m or more, or 400 ⁇ m or less, 300 ⁇ m or less, 250 ⁇ m or less, 200 ⁇ m or less, or 50 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less.
  • the average diameter of the microcarriers When the average diameter of the microcarriers satisfies the aforementioned range, cell attachment and culture performance are excellent. On the other hand, when the average diameter of the microcarriers is less than 50 ⁇ m, there is a concern that the culture efficiency may be lowered due to a small surface area capable of culturing cells, and when the average diameter is greater than 400 ⁇ m, the interaction between adherent cells is deteriorated, and in the incubator Cell density may be lowered, resulting in lower cell culture efficiency.
  • the diameter of the micro-carrier means the distance between two points where a straight line passing through the center of gravity of the micro-carrier meets the outermost surface of the micro-carrier, and the average diameter of the micro-carrier is determined by looking at the micro-carrier for cell culture through an optical microscope. It can be obtained by checking the diameter of all included particles. In addition, the average particle diameter of the microcarriers can be confirmed through the diameters of all microcarriers obtained in the manufacturing process of the microcarriers or their average diameters.
  • the microcarrier may have a specific surface area of 200 cm 2 /g or more and 1000 cm 2 /g or less.
  • the microcarrier may have a specific surface area of 200 cm 2 /g or more, 300 cm 2 /g or more, 330 cm 2 /g or more, or 350 cm 2 /g or more, 1000 cm 2 /g or less, 500 cm 2 /g or less, 450 cm 2 /g or less, 200 cm 2 /g or more and 1000 cm 2 /g or less, 300 cm 2 /g or more and 1000 cm 2 /g or less, 300 cm 2 / g or more 500 cm 2 /g g or less, 300 cm 2 /g or more and 450 cm 2 /g or less, 330 cm 2 /g or more and 450 cm 2 /g or less, or 350 cm 2 /g or more and 450 cm 2 /g or less.
  • the method for measuring the specific surface area is not particularly limited, but the specific surface area of the microcarriers can be calculated from, for example, an apparent density using the following equation.
  • the primer polymer layer serves as an adhesive layer capable of introducing functional polymers to the surface of polystyrene-based particles without functional groups, thereby effectively introducing a polymer layer for cell attachment to the microcarrier surface and stably maintaining it during culture.
  • primer polymer layer examples include L-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), dopamine, polydopamine, and norepinephrine. , epinephrine, epigallocatechin, and any one or more selected from the group consisting of derivatives thereof.
  • L-DOPA L-dihydroxyphenylalanine
  • dopamine dopamine
  • polydopamine polydopamine
  • norepinephrine norepinephrine
  • epinephrine epigallocatechin
  • epigallocatechin any one or more selected from the group consisting of derivatives thereof.
  • polymer forming the cell adhesion inducing layer examples include gelatin, collagen, fibronectin, chitosan, polydopamine, poly-L-lysine, vitronectin, peptides including RGD, and RGD. It may include at least one selected from the group consisting of acrylic polymer, lignin, cationic dextran, and derivatives thereof.
  • the primer polymer layer is too thin compared to the polystyrene-based particles, so the effect of modifying the microcarrier surface to be hydrophilic is insignificant, and exceeds 1:0.01, Since the polymer layer of the primer is thicker than the polystyrene-based particles, there is a concern that the degree of adhesion between cells and microcarriers may be reduced during cell culture.
  • the surface-treated magnetic particle with the hydrophobic functional group may refer to a magnetic particle in which a hydrophobic functional group is bound to the surface of the magnetic particle.
  • the magnetic particles refer to particles exhibiting magnetic properties. All materials interact with magnetic fields to generate attractive or repulsive forces. That is, when a magnetic field is applied to a material, it is magnetized, and the material is classified into a ferromagnetic material, a paramagnetic material, a diamagnetic material, a ferrimagnetic material, and the like, depending on how the material is magnetized.
  • the magnetic particles may be prepared by solution synthesis, co-precipitation, sol-gel method, high energy grinding, hydrothermal synthesis, microemulsion synthesis, synthesis by thermal decomposition, or sonochemical synthesis, but are not limited thereto.
  • the diameter of the magnetic particles surface-treated with the hydrophobic functional group may be 0.1 nm or more and 1000 nm or less. That is, the magnetic particles surface-treated with a hydrophobic functional group may be magnetic nanoparticles surface-treated with a hydrophobic functional group.
  • the ligand refers to a molecule or ion bonded to the periphery of a central metal ion of a coordinated compound, and may refer to an atom or group of atoms forming a coordination bond while donating an electron pair to a central metal atom in a complex compound.
  • the hydrophobic ligand may include a fatty acid having 2 to 20 carbon atoms or a derivative thereof, or a fatty acid amine having 2 to 20 carbon atoms or a derivative thereof.
  • the fatty acid derivative may include a fatty acid ion
  • the fatty acid amine derivative may include a fatty acid amine ion
  • the hydrophobic ligand may include -COOH or -COO- bonded to the hydrophobic functional group and its terminal.
  • the type of the fatty acid having 2 to 20 carbon atoms is not particularly limited, but may include, for example, any one of oleic acid, caproic acid, and stearic acid.
  • fatty acids having 2 to 20 carbon atoms are added to a basic aqueous solution to form fatty acid ions having 2 to 20 carbon atoms and then reacted with magnetic nanoparticles to form fatty acids having 2 to 20 carbon atoms.
  • a coordination bond between -COO- included at the terminal and the magnetic nanoparticles may be formed as shown in FIG. 1 .
  • 5.3 g/cm 3 or less or 5 g/cm 3 or more and 6 g/cm 3 or less, 5 g/cm 3 or more and 5.8 g/cm 3 or less, 5.1 g/cm 3 or more and 5.8 g/cm 3 or less, 5.1 g /cm 3 or more and 5.5 g/cm 3 or less, 5.1 g/cm 3 or more and 5.3 g/cm 3 or less, or 5.15 g/cm 3 or more and 5.3 g/cm 3 or less.
  • the amount of magnetic particles is excessively reduced to less than 0.01 part by weight with respect to 100 parts by weight of hydrocarbon oil having 12 or more carbon atoms, the magnetic properties of the microcarriers are not sufficiently realized, and thus separation and purification of microcarriers and cells after cell culture are not easy.
  • the recovery process is additionally involved and the process becomes complicated.
  • the amount of the ethylenically unsaturated crosslinking agent is excessively increased to 3 parts by weight or more based on 1 part by weight of the styrene monomer, the crosslinking density of the polystyrene-based polymer increases, and the overall density of the polystyrene-based particles is difficult to lower to the target level. there is.
  • the method for preparing the microcarrier for cell culture may further include washing and drying the suspension polymerization product after the suspension polymerization.
  • the step of washing the suspension polymerization reaction product is after filtering the suspension polymerization reaction product through a sieve of 10 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less, 100% ethanol and / or 5-7 times in distilled water at a high temperature of 50 °C or more and 80 °C or less Room temperature stirring may be included.
  • the contents of the primer polymer layer and the cell adhesion inducing layer include all of the above-described contents in the embodiment.

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Abstract

본 발명은 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일, 또는 이로부터 유도된 공극 중 적어도 하나 이상; 및 자성 입자;를 포함한 폴리스티렌계 입자를 포함하는, 세포 배양용 마이크로 캐리어, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 배양 조성물에 관한 것이다.

Description

세포 배양용 마이크로 캐리어, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 배양 조성물
관련 출원(들)과의 상호 인용
본 출원은 2021년 9월 28일자 한국특허출원 제10-2021-0128333호, 및 2022년 9월 6일자 한국특허출원 제10-2022-0112921호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원들의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함된다.
본 발명은 세포 배양용 마이크로 캐리어, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 배양 조성물에 관한 것이다.
바이오 의약품 및 재생 의료 분야가 확장됨에 따라, 세포, 조직, 미생물 등을 효율적으로 생산할 수 있는 세포 대량 배양 기술에 대한 요구가 증대하고 있다.
부착성을 갖는 세포는 3D 바이오리액터(bioreactor) 내에서 마이크로 캐리어를 이용하여 배양된다. 바이오리액터 내에 세포, 배양액 및 마이크로 캐리어를 넣고, 배양액을 교반하여 세포 및 마이크로 캐리어를 접촉시킴으로써, 세포를 마이크로 캐리어의 표면에 부착시켜 배양하게 된다. 이 때 사용하는 마이크로 캐리어는 세포가 부착하여 증식할 수 있는 높은 표면적 비율(surface area/volume)을 제공하기 때문에, 세포의 대량 배양에 적합하다.
현재 상업적으로 이용되는 마이크로 캐리어는 밀도가 약 1.1 내지 1.3 g/cm3이며, 세포의 밀도는 약 1.2 g/cm3 정도이다. 이 경우, 바이오리액터 내 배양 초기 세포를 부착하기에는 유리하지만, 배양 후 세포 분리 회수 시 원심분리가 어렵고, 마이크로 캐리어와 세포의 크기에 근거한 필터링 방법을 이용하여야 한다. 그러나 이러한 경우 필터가 막히거나 공정 시간이 오래 걸리고, 세포의 물리적 손상 및 오염이 쉽게 발생할 수 있으며, 세포의 손실이 발생할 수 있는 문제가 있다.
따라서, 세포 배양이 가능하도록 저밀도를 가지면서, 세포 배양 후 마이크로 캐리어와 세포의 분리 회수 시 보다 손쉽게 분리할 수 있는 새로운 마이크로 캐리어의 개발이 요구되고 있다.
본 발명은 세포 배양이 가능하도록 저밀도를 가지면서, 세포 배양 후 마이크로 캐리어와 세포의 분리 회수 시 보다 손쉽게 분리할 수 있는 세포 배양용 마이크로 캐리어를 제공하기 위한 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어를 이용한 세포 배양 조성물에 관한 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 명세서에서는, 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일, 또는 이로부터 유도된 공극 중 적어도 하나 이상; 및 자성 입자;를 포함한 폴리스티렌계 입자를 포함하는, 세포 배양용 마이크로 캐리어를 제공한다.
본 명세서에서는 또한, 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 존재하에, 자성 입자 및 스티렌 단량체가 함유된 단량체 조성물의 현탁 중합 반응을 진행하는 단계를 포함하는, 세포 배양용 마이크로 캐리어 제조방법이 제공된다.
본 명세서에서는 또한, 세포 및 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어를 포함하는 세포 배양 조성물이 제공된다.
이하 발명의 구체적인 구현예에 따른 세포 배양용 마이크로 캐리어, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 배양 조성물에 대하여 보다 상세하게 설명하기로 한다.
본 명세서에서 명시적인 언급이 없는 한, 전문용어는 단지 특정 실시예를 언급하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것을 의도하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 단수 형태들은 문구들이 이와 명백히 반대의 의미를 나타내지 않는 한 복수 형태들도 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 '포함'의 의미는 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 및/또는 성분을 구체화하며, 다른 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소, 성분 및/또는 군의 존재나 부가를 제외시키는 것은 아니다.
그리고, 본 명세서에서 '제 1' 및 '제 2'와 같이 서수를 포함하는 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로 사용되며, 상기 서수에 의해 한정되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위 내에서 제 1 구성요소는 제 2 구성요소로도 명명될 수 있고, 유사하게 제 2 구성요소는 제 1 구성요소로 명명될 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
발명의 일 구현예에 따르면, 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일, 또는 이로부터 유도된 공극 중 적어도 하나 이상; 및 자성 입자;를 포함한 폴리스티렌계 입자를 포함하는, 세포 배양용 마이크로 캐리어가 제공될 수 있다.
본 발명자들은 상기 일 구현예의 세포 배양용 마이크로 캐리어의 경우, 폴리스티렌계 입자 내부에 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일, 또는 이로부터 유도된 공극 중 적어도 하나 이상이 포함되어, 세포 배양용 마이크로 캐리어의 밀도를 낮출 수 있을 뿐 아니라, 균질한 구형 형상의 마이크로 캐리어를 높은 수율로 확보할 수 있다는 점을 실험을 통해 확인하고 발명을 완성하였다.
또한, 본 발명자들은 상기 일 구현예의 세포 배양용 마이크로 캐리어의 경우, 자성 입자가 포함되어, 세포 배양 후 마이크로 캐리어와 세포의 분리 회수 시 자성을 이용하여 보다 손쉽게 분리 정제할 수 있다는 점을 실험을 통해 확인하고 발명을 완성하였다.
구체적으로, 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어는 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일, 또는 이로부터 유도된 공극 중 적어도 하나 이상; 및 자성 입자;를 포함한 폴리스티렌계 입자를 포함할 수 있다. 즉, 상기 폴리스티렌계 입자는 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 1종, 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일로부터 유도된 공극 1종, 혹은 이들 2종 의 혼합물을 포함할 수 있다.
상기 폴리스티렌계 입자가 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일로부터 유도된 공극 1종을 포함하거나, 혹은 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 및 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일로부터 유도된 공극을 모두 포함하는 경우, 상기 폴리스티렌계 입자는 다공성 폴리스티렌계 입자에 해당할 수 있다.
상기 폴리스티렌계 입자는 후술하는 다른 구현예의 제조방법과 같이 탄화수소 오일 존재 하에서 현탁중합에 의해 폴리스티렌 입자 합성을 진행하여 탄화수소 오일이 폴리스티렌 입자 내부에 갇힌 상태로 계속 잔류하거나, 고속의 현탁중합 교반조건에 의해 갇혀있던 탄화수소 오일 일부 혹은 전체가 빠져나와 폴리스티렌 입자 내부에 공극이 형성될 수 있다.
상기 공극이란 폴리스티렌계 입자 내부의 빈 공간을 의미하며, 기공, 할로우(hollow), 구멍, 보이드(void) 등과 같은 의미로 사용될 수 있다.
상기 공극은 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일로부터 유도된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 공극은 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일이 현탁 중합 도중 폴리스티렌과 상분리되면서 형성된 공간에 해당한다.
따라서, 상기 폴리스티렌계 입자가 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 1종만을 포함하는 것은 중합 과정에서 탄화수소 오일이 완전히 상분리되었으나 중합 및 세척 공정 중 입자 외부로 소실되지 않은 것을 의미하며, 상기 폴리스티렌계 입자가 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일로부터 유도된 공극 1종만을 포함하는 것은 중합 과정에서 탄화수소 오일이 완전히 상분리되었으나 중합 및 세척 공정 중 입자 외부로 소실된 상태를 의미한다. 또한, 상기 폴리스티렌계 입자가 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 및 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일로부터 유도된 공극을 모두 포함하는 것은 탄화수소 오일이 중합 과정에서 일부 상분리되어 소실되고 일부는 잔류하는 상태를 의미한다.
구체적으로, 상기 공극의 직경은 0.1 ㎛ 이상 5 ㎛ 이하일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 공극의 직경은 0.1 ㎛ 이상, 0.5 ㎛ 이상, 1 ㎛ 이상일 수 있고, 5㎛ 이하, 4㎛ 이하, 3㎛ 이하일 수 있고, 0.1 ㎛ 이상 5㎛ 이하, 0.5 ㎛ 이상 5 ㎛ 이하, 1 ㎛ 이상 5 ㎛ 이하, 0.1 ㎛ 이상 4 ㎛ 이하, 0.5 ㎛ 이상 4 ㎛ 이하, 1 ㎛ 이상 4 ㎛ 이하, 0.1 ㎛ 이상 3 ㎛ 이하, 0.5 ㎛ 이상 3 ㎛ 이하, 1 ㎛ 이상 3㎛ 이하 일 수 있다.
상기 공극의 직경을 측정하는 방법은 크게 제한되지 않으나, 예를 들어 세포 배양용 마이크로 캐리어를 에폭시에 embedding한 후 ion milling을 통해 단면을 제조한 후 입자 단면의 형상을 SEM으로 확인하여 입자 내부 공극의 직경을 측정할 수 있다.
상술한 바와 같이, 상기 공극은 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일로부터 유도된 것임에 따라, 상기 공극의 직경은 0.1 ㎛ 이상 5㎛ 이하로 작은 크기의 공극을 구현할 수 있으며, 이에 따라 마이크로 캐리어의 밀도를 용이하게 조절할 수 있다.
종래 폴리스티렌 입자의 밀도를 낮추기 위해 폴리스티렌 중합 과정 중 저비점의 발포제를 투입한 후 추가 발포 공정을 통해 발포 스티렌을 제조해 왔으나, 이와 같은 경우 수십 ㎛ 크기의 큰 공극이 형성되어, 마이크로 캐리어의 밀도 조절이 어렵다.
상기 탄화수소 오일의 탄소수는 12이상, 또는 12 이상 50 이하, 또는 12 이상 16 이하일 수 있다. 상기 탄화수소 오일의 탄소수가 12 미만으로 지나치게 감소하게 되면, 현탁 중합 중 탄화수소 오일과 폴리스티렌의 상분리 속도의 감소로 인해 입자 표면이 균일하지 않고 움푹 패인 형상의 입자가 다수 제조되는 한계가 있다.
구체적으로, 상기 탄화수소 오일은 탄소수 12 이상 50 이하인 직쇄 또는 분지쇄의 포화탄화수소 화합물을 포함할 수 있다. 상기 탄소수 12 이상 50 이하인 직쇄 또는 분지쇄의 포화탄화수소 화합물은 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있으며, 상기 탄소수 12 이상 50 이하인 직쇄 또는 분지쇄의 포화탄화수소 화합물의 예로는 탄소수 12 이상 16 이하의 노말알케인, 탄소수 12 이상 16 이하의 이소알케인, 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 탄화수소 오일로는 탄소수 12의 도데칸, 탄소수 16의 헥사데칸, 또는 Isopar M(탄소수 12 이상 14 이하의 이소알케인과 탄소수 13 이상 16 이하의 이소알케인의 혼합물)을 사용할 수 있다.
상기 탄화수소 오일은 스티렌 모노머를 포함하는 분산상 조성물 전체 중량 (100% 중량)을 기준으로 30 중량% 이하, 또는 10 중량% 이상 30 중량% 이하로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 탄화수소 오일의 함량 하한은 10 중량% 이상, 또는 11 중량% 이상, 또는 12 중량% 이상, 또는 13 중량% 이상, 또는 14 중량% 이상이고, 그 상한은 예를 들어, 30 중량% 이하, 또는 25 중량% 이하, 또는 21 중량% 이하일 수 있다.
보다 구체적으로 상기 탄화수소 오일은 스티렌 모노머를 포함하는 분산상 조성물 전체 중량 (100% 중량)을 기준으로 10 중량% 이상 30 중량% 이하, 11 중량% 이상 30 중량% 이하, 12 중량% 이상 30 중량% 이하, 13 중량% 이상 30 중량% 이하, 14 중량% 이상 30 중량% 이하, 10 중량% 이상 25 중량% 이하, 11 중량% 이상 25 중량% 이하, 12 중량% 이상 25 중량% 이하, 13 중량% 이상 25 중량% 이하, 14 중량% 이상 25 중량% 이하, 10 중량% 이상 20 중량% 이하, 11 중량% 이상 20 중량% 이하, 12 중량% 이상 20 중량% 이하, 13 중량% 이상 20 중량% 이하, 14 중량% 이상 20 중량% 이하로 포함될 수 있다.
상기 탄화수소 오일의 함량이 상기 함량 범위 미만으로 사용될 경우, 저밀도 특성의 캐리어 입자를 확보하기 어렵고, 상기 함량 범위를 지나치게 초과할 경우, 폴리스티렌계 입자의 형상이 구형을 갖기 어려워져 제조되는 입자의 균일성이 감소하게 된다.
상기 탄화수소 오일의 밀도는 0.75 g/cm3 이상 0.80 g/cm3 이하, 0.75 g/cm3 이상 0.795 g/cm3 이하, 또는 0.75 g/cm3 이상 0.791 g/cm3 이하일 수 있다. 상기 탄화수소 오일의 밀도가 상술한 범위로 매우 낮기 때문에, 이를 통해 폴리스티렌계 입자의 밀도를 현저히 낮출 수 있다.
다만, 상기 탄화수소 오일의 밀도가 0.75 g/cm3 미만으로 지나치게 감소하게 되면, 현탁 중합 중 탄화수소 오일과 폴리스티렌의 상분리 속도의 감소로 인해 입자 표면이 균일하지 않고 움푹 패인 형상의 입자가 다수 제조되는 한계가 있다.
상기 마이크로 캐리어의 겉보기 밀도는 0.95 g/cm3 이상 1.05 g/cm3 미만일 수 있다. 구체적으로, 상기 마이크로 캐리어의 겉보기 밀도는 0.95 g/cm3 이상, 0.99 g/cm3 이상, 0.995 g/cm3 이상, 0.996 g/cm3 이상일 수 있고, 1.05 g/cm3 미만, 1.049 g/cm3 이하, 1.04 g/cm3 이하, 1.03 g/cm3 이하일 수 있으며, 0.95 g/cm3 이상 1.05 g/cm3 미만, 0.99 g/cm3 이상 1.05 g/cm3 미만, 0.995 g/cm3 이상 1.05 g/cm3 미만, 0.996 g/cm3 이상 1.05 g/cm3 미만, 0.95 g/cm3 이상 1.049 g/cm3 이하, 0.99 g/cm3 이상 1.049 g/cm3 이하, 0.995 g/cm3 이상 1.049 g/cm3 이하, 0.996 g/cm3 이상 1.049 g/cm3 이하, 0.95 g/cm3 이상 1.04 g/cm3 이하, 0.99 g/cm3 이상 1.04 g/cm3 이하, 0.995 g/cm3 이상 1.04 g/cm3 이하, 0.996 g/cm3 이상 1.04 g/cm3 이하, 0.95 g/cm3 이상 1.03 g/cm3 이하, 0.99 g/cm3 이상 1.03 g/cm3 이하, 0.995 g/cm3 이상 1.03 g/cm3 이하, 0.996 g/cm3 이상 1.03 g/cm3 이하일 수 있다.
상술한 저밀도 범위를 가짐에 따라, 세포 배양 후 마이크로 캐리어와 세포를 분리 회수 시 중력에 의한 침강 속도 차이를 통하여 세포와 마이크로 캐리어를 손쉽게 분리할 수 있다.
상기 마이크로 캐리어의 겉보기 밀도를 측정하는 방법은 크게 제한되지 않으나, 예를 들어 건조 과정이 완료된 조건의 마이크로 캐리어 시료를 밀도를 조절한 에탄올 수용액과 증류수에 각각 첨가하여 입자가 부유 또는 침강하는지 확인하여 겉보기 밀도를 측정할 수 있다.
보다 구체적으로, 상온(25 ℃) 및 상압(1 atm) 조건에서 건조 과정이 완료된 조건의 마이크로 캐리어 시료를 밀도가 0.95 g/cm3, 0.97 g/cm3, 0.98 g/cm3 또는 0.995 g/cm3인 에탄올 수용액과, 밀도가 1 g/cm3인 증류수(DIW)에 각각 첨가하여 입자가 부유 또는 침강하는지 확인하여 겉보기 밀도를 평가할 수 있다.
예를 들어 밀도가 0.95 g/cm3인 에탄올 수용액에서 부유하는 경우 마이크로 캐리어의 겉보기 밀도가 0.95 g/cm3 미만이고, 밀도가 1 g/cm3인 증류수(DIW)에서 침강하는 경우 마이크로 캐리어의 겉보기 밀도가 1 g/cm3 초과이고, 밀도가 0.95 g/cm3인 에탄올 수용액에서 침강하고, 밀도가 1 g/cm3인 증류수(DIW)에서 부유하는 경우 마이크로 캐리어의 겉보기 밀도가 0.95 g/cm3 이상 1 g/cm3 미만이고, 밀도가 0.95 g/cm3인 에탄올 수용액에서 침강하고, 밀도가 0.97 g/cm3인 에탄올 수용액에서 부유하는 경우 마이크로 캐리어의 겉보기 밀도가 0.95 g/cm3 이상 0.97 g/cm3 미만이고, 밀도가 0.98 g/cm3인 에탄올 수용액에서 침강하고, 밀도가 0.995 g/cm3 인 에탄올 수용액에서 부유하는 경우 마이크로 캐리어의 겉보기 밀도가 0.98 g/cm3 이상 0.995 g/cm3 미만인 것으로 평가할 수 있다.
상기 마이크로 캐리어의 밀도가 1.05 g/cm3 를 초과하는 경우, 세포와 마이크로 캐리어의 밀도 차이가 적어 배양 후 세포 분리 회수 시 원심 분리가 어려울 수 있고, 0.95 g/cm3 미만인 경우, 배양 초기에 마이크로 캐리어가 배양액 표면에서만 부유하여 세포를 부착하기 어려운 문제가 발생할 수 있다.
상기 구현예의 세포 배양용 마이크로 캐리어가 적용되는 세포는 부착성 동물 세포로 그 예가 크게 한정되는 것은 아니나, 예를 들어 섬유아세포 (fibroblasts), 상피세포 (epithelial cell), 골아세포 (osteoblast), 연골세포 (chondrocyte), 간세포, 인간 유래 제대혈 세포, 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell), CHO(Chinese hamster ovary) 세포, 신장세포 (HEK293, BHK21, MDCK, vero cell 등), 또는 이들의 2종 이상 혼합물일 수 있다.
상기 세포의 밀도는 1.02 g/cm3 이상 1.1 g/cm3 미만일 수 있다.
또한, 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어와 상기 세포의 밀도 차이가 0.02 g/cm3 이상 0.20 g/cm3 이하일 수 있다. 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어와 상기 세포의 밀도 차이가 0.02 g/cm3 이상 0.20 g/cm3 이하로 밀도 차이가 크게 나지 않더라도, 상기 자성 입자를 포함함에 따라 세포와 마이크로 캐리어를 손쉽게 분리할 수 있다.
한편 상기 자성 입자는 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자를 포함할 수 있다. 상기 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자는 자성 입자의 표면에 소수성 작용기가 결합된 자성 입자를 의미할 수 있다.
구체적으로, 표면 처리란 자성 입자의 응집을 방지하고 분산성을 향상시키기 위하여, 자성입자와 소수성 작용기를 포함하는 화합물을 반응시켜 자성 입자의 표면에 소수성 작용기를 결합시키는 것을 의미한다.
상기 구현예에서, 상기 자성 입자란 자기적인 성질을 나타내는 입자를 의미한다. 모든 물질은 자기장 (magnetic field)과 상호작용하여 인력(attractive force) 또는 척력(repulsive force)이 발생된다. 즉, 물질에 자기장을 가하면 자화(magnetization)되고, 상기 물체가 자화되는 양상에 따라 강자성체, 상자성체, 반자성 체, 페리자성체 등으로 구분된다.
상기 자성 입자는 용액 합성, 공동 침전, 졸-겔 방법, 고 에너지 분쇄, 수열 합성, 마이크로에멀젼 합성, 열분해에 의한 합성 또는 음파화학적 합성에 의해 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자의 직경은 0.1 nm 이상 1000 nm 이하일 수 있다. 즉, 상기 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자는 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 나노 입자일 수 있다.
상기 나노 입자는 나노미터(nm)의 크기를 갖는 입자를 의미한다. 나노미터의 크기란 마이크론 미터(10-6) 크기를 1,000 분의 1로 축소한 것으로, 물질의 크기가 나노미터 수준으로 작아지면 다양하고 특이한 물리적, 화학적, 기계적 및 전자적 특성을 나타내게 된다.
자성 물질의 크기가 나노미터로 작아지면 각각의 입자가 자기적 단일구역을 형성하게 되고, 이러한 입자들의 콜로이드 용액은 각 입자들의 열적 요동(thermal fluctuation)에 의해서 자기 쌍극자의 방향이 제각각 불특정한 방향으로 배향하게 되어 외형적으로 나타나는 순자기력(net magnetic force)은 "0"으로 나타나게 된다. 그러나, 외부로부터 내부의 열적 에너지 보다 큰 자기장을 가해주면 입자들의 자기 쌍극자는 한 방향으로 정렬하게 되어 자성체로 변하게 된다.
상기 자성 입자의 종류는 크게 제한 되지 않으며 금속 나노입자를 사용할 수 있다. 예를 들면 금(Au), 은(Ag), 코발트(Co), 구리(Cu), 철(Fe), 크롬(Cr), 니켈(Ni), 팔라듐(Pd), 백금(Pt) 및 주석(Sn)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 금속 또는 그 산화물을 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 자성 입자는 철(Fe) 입자를 포함할 수 있다.
상기 자성 입자는 자성 입자표면에 소수성 작용기를 함유한 소수성 리간드를 포함할 수 있다. 즉, 상기 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자는 자성 입자 표면에 소수성 작용기를 함유한 소수성 리간드를 포함할 수 있다.
상기 마이크로 캐리어가 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자를 포함함에 따라 표면 처리되지 않은 자성 입자를 포함하는 마이크로 캐리어와 비교하여, 금속 입자가 독립 분산되어 입자의 뭉침이 방지될 뿐만 아니라 산화 안정성이 향상될 수 있다.
상기 리간드는 배위 결합하고 있는 화합물의 중심 금속 이온의 주위에 결합하고 있는 분자나 이온을 의미하며, 착화합물에서 중심 금속 원자에 전자쌍을 제공하면서 배위 결합을 형성하는 원자 또는 원자단을 의미할 수 있다.
즉, 상기 소수성 리간드는 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자의 중심 자성 입자 이온 주위에 결합하고 있는 소수성 분자 또는 소수성 이온을 의미할 수 있다.
구체적으로, 상기 소수성 리간드는 탄소수 2 내지 20의 지방산 또는 이의 유도체 및 탄소수 2 내지 20의 지방산 아민 또는 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 리간드를 포함할 수 있다.
상기 지방산 유도체는 지방산 이온을 포함할 수 있으며, 지방산 아민 유도체는 지방산 아민 이온을 포함할 수 있다.
상기 지방산은 탄화수소 사슬 및 이의 말단에는 카르복실기(-COOH)를 포함하는 화합물로 탄화수소 사슬은 소수성을 보유하나 말단의 카르복실기를 통해 친수성인 물질과 상호작용할 수 있다. 상기 지방산은 불포화 지방산 또는 포화 지방산일 수 있다.
상기 불포화 지방산은 이중결합을 1개 이상 가지고 있는 지방산으로 말단에 있는 -COOH 또는 -COO- 는 자성 입자 표면에 노출되어 있는 친수성기 및/또는 자성 입자의 불포화 배위자리 등과 수소결합, 이온결합, 공유결합 등을 형성할 수 있다.
상기 불포화 지방산이 이중결합을 포함함에 따라, 불포화 지방산의 구부러진 탄화수소 사슬이 자성 입자의 바깥 쪽으로 배향되면서, 소수성 채널을 형성할 수 있다.
즉, 상술한 상기 소수성 작용기는 탄소수 2 내지 20의 지방산 또는 이의 유도체, 또는 탄소수 2 내지 20의 지방산 아민, 또는 이의 유도체로부터 유래된 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 소수성 작용기는 탄소수 2 내지 50의 알킬기, 또는 탄소수 2 내지 50의 알케닐기를 포함할 수 있다.
이에 따라, 상기 소수성 리간드는 상기 소수성 작용기와 그 말단에 결합한 -COOH 또는 -COO-를 포함할 수 있다.
상기 탄소수 2 내지 20의 지방산의 종류는 크게 제한 되지 않으나, 예를 들어 올레인산, 카프로인산, 스테아린산 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
또한, 상기 탄소수 2 내지 20의 지방산 아민의 종류는 크게 제한 되지 않으나, 예를 들어 올레일 아민, 부틸 아민, 옥틸 아민 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자는 도 1 에 나타난 바와 같은 결합 구조를 가질 수 있다.
상기 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자 제조시, 탄소수 2 내지 20의 지방산을 염기성 수용액에 첨가하여, 탄소수 2 내지 20의 지방산 이온을 형성한 후 자성 나노 입자와 반응 시킴에 따라 탄소수 2 내지 20의 지방산 말단에 포함된 -COO- 와 자성 나노 입자 사이의 배위 결합이 도 1 과 같이 형성될 수 있다.
한편 상기 자성 입자의 밀도가 5 g/cm3 이상 6 g/cm3 이하일 수 있다. 즉, 상기 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자의 밀도가 5 g/cm3 이상 6 g/cm3 이하일 수 있다.
구체적으로, 상기 자성 입자의 밀도가 5 g/cm3 이상, 5.1 g/cm3 이상, 5.15 g/cm3 이상 또는 6 g/cm3 이하, 5.8 g/cm3 이하, 5.5 g/cm3 이하, 5.3 g/cm3 이하, 또는 5 g/cm3 이상 6 g/cm3 이하, 5 g/cm3 이상 5.8 g/cm3 이하, 5 g/cm3 이상 5.5 g/cm3 이하, 5 g/cm3 이상 5.3g/cm3 이하, 5.1 g/cm3 이상 6 g/cm3 이하, 5.1 g/cm3 이상 5.8 g/cm3 이하, 5.1 g/cm3 이상 5.5 g/cm3 이하, 5.1 g/cm3 이상 5.3 g/cm3 이하, 5.15 g/cm3 이상 5.8 g/cm3 이하, 5.15 g/cm3 이상 5.5 g/cm3 이하, 5.15 g/cm3 이상 5.3 g/cm3 이하 일 수 있다.
상술한 바와 같이, 상기 자성 입자의 밀도가 5 g/cm3 이상 6 g/cm3 이하임에 따라, 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 100 중량부에 대하여, 자성 입자를 5 중량부 초과로 지나치게 첨가할 경우, 밀도가 큰 자성 입자를 과량 포함함에 따라 입자의 전체적인 밀도가 높아져 배양기 내에서 입자가 원활하게 부유하지 못할 뿐만 아니라 세포 독성을 나타낼 수 있다.
또한 상기 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자의 직경이 100 nm 이상 2000 nm 이하일 수 있다. 상기 자성 입자의 직경 측정 방법은 크게 제한되지 않으나 예를 들어 Dynamic light scattering (DLS) 등을 이용하여 측정할 수 있다.
구체적으로, 상기 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자의 직경이 100 nm 이상, 300 nm 이상, 500 nm 이상, 또는 2000 nm 이하, 1500 nm 이하, 1000 nm 이하, 800 nm 이하, 600 nm 이하, 또는 100 nm 이상 2000 nm 이하, 100 nm 이상 1500 nm 이하, 100 nm 이상 1000 nm 이하, 100 nm 이상 800 nm 이하, 100 nm 이상 600 nm 이하, 300 nm 이상 2000 nm 이하, 300 nm 이상 1500 nm 이하, 300 nm 이상 1000 nm 이하, 300 nm 이상 800 nm 이하, 300 nm 이상 600 nm 이하, 또는 500 nm 이상 2000 nm 이하, 500 nm 이상 1500 nm 이하, 500 nm 이상 1000 nm 이하, 500 nm 이상 800 nm 이하, 500 nm 이상 600 nm 이하일 수 있다.
상기 폴리스티렌계 입자는 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일, 또는 이로부터 유도된 공극 중 적어도 하나 이상; 및 자성 입자;가 내부에 분산된 폴리스티렌계 고분자를 포함할 수 있다.
즉, 상기 폴리스티렌계 입자는 폴리스티렌계 고분자 매트릭스와, 상기 폴리스티렌계 고분자 매트릭스 내부에 분산된 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일, 또는 이로부터 유도된 공극 중 적어도 하나 이상; 및 자성 입자;를 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어는 상기 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일, 또는 이로부터 유도된 공극 중 적어도 하나 이상의 내부에 자성 입자가 분산된 상태로 존재할 수 있다.
상술한 바와 같이, 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어는 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일, 자성 입자 및 스티렌 단량체가 함유된 단량체 조성물의 현탁 중합 반응 결과물을 포함하며, 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일이 현탁 중합 도중 폴리스티렌과 상분리되면서 형성된 공간인 공극을 포함할 수 있다.
따라서, 단량체 조성물에 자성 입자가 포함됨에 따라, 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일, 또는 이로부터 유도된 공극 중 적어도 하나 이상의 내부에 자성 입자가 분산된 상태로 존재할 수 있다.
구체적으로, 상기 폴리스티렌계 입자는, 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일, 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자 및 스티렌 단량체가 함유된 단량체 조성물의 현탁 중합 반응 결과물을 포함할 수 있다.
상기 단량체 조성물은 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 100 중량부에 대하여, 자성 입자를 0.01 중량부 이상 5 중량부 이하로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 단량체 조성물은 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 100 중량부에 대하여, 자성 입자를 0.01 중량부 이상, 입자를 0.01 중량부 이상, 0.02 중량부 이상, 0.04 중량부 이상으로 포함할 수 있고, 5 중량부 이하, 4 중량부 이하로 포함할 수 있고, 0.01 중량부 이상 5 중량부 이하, 0.02 중량부 이상 5 중량부 이하, 0.02 중량부 이상 4 중량부 이하, 0.04 중량부 이상 4 중량부 이하 로 포함할 수 있다.
탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 100 중량부에 대하여, 자성 입자를 0.01 중량부 미만으로 지나치게 감소할 경우, 상기 마이크로 캐리어의 자성이 충분히 구현되지 않아 세포 배양 후 마이크로 캐리어와 세포의 분리 회수 시 분리 정제가 쉽지 않을 뿐만 아니라, 회수 공정이 추가적으로 수반되어 공정이 복잡해지는 한계가 있다.
반면, 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 100 중량부에 대하여, 자성 입자를 5 중량부 초과로 지나치게 첨가할 경우, 밀도가 큰 자성 입자를 과량 포함함에 따라 입자의 전체적인 밀도가 높아져 배양기 내에서 입자가 원활하게 부유하지 못할 뿐만 아니라 세포 독성을 나타낼 수 있다.
또한, 상기 단량체 조성물은 스티렌 단량체 1 중량부에 대하여 에틸렌계 불포화 가교제를 0.033 중량부 초과 3 중량부 미만으로 포함할 수 있다.
구체적으로, 스티렌 단량체 1 중량부에 대하여, 에틸렌계 불포화 가교제 0.033 중량부 미만으로 지나치게 감소할 경우, 상기 폴리스티렌계 고분자의 가교 밀도가 감소함에 따라 탄화수소 오일로 인해 생성된 공극이 안정적으로 제조되기 어려워 폴리스티렌계 입자의 밀도를 충분히 낮추기 어려운 한계가 있다.
반면, 스티렌 단량체 1 중량부에 대하여, 에틸렌계 불포화 가교제 3 중량부 이상으로 지나치게 증가할 경우, 상기 폴리스티렌계 고분자의 가교밀도가 증가하면서, 폴리스티렌계 입자의 전체적인 밀도가 목표한 수준까지 낮아지기 어려운 한계가 있다.
또한, 상기 단량체 조성물 전체 중량에 대하여 상기 탄화수소 오일의 함량이 10 중량% 이상 30 중량% 이하, 또는 14 중량% 이상 21 중량% 이하일 수 있다. 상기 탄화수소 오일의 함량이 지나치게 감소할 경우, 탄화수소 오일이 입자 내부로 함침되는 양이 감소하여 폴리스티렌계 입자의 밀도가 충분히 낮아지기 어렵다. 또한, 상기 탄화수소 오일의 함량이 지나치게 증가할 경우, 폴리스티렌계 입자의 형상이 구형을 갖기 어려워져 제조되는 입자의 균일성이 감소하게 된다.
상기 에틸렌계 불포화 가교제의 예로는 디비닐벤젠을 들 수 있다.
상기 폴리스티렌계 입자의 전체 표면적을 기준으로, 상기 폴리스티렌계 입자 표면에 존재하는 마이크로포어와 접촉하는 상기 폴리스티렌계 입자의 표면적의 비율이 0.01% 미만일 수 있다. 상기 폴리스티렌계 입자의 전체 표면적은 폴리스티렌계 입자의 최외각에서 공기중에 노출된 표면적의 합계를 의미하며, 상기 폴리스티렌계 입자 표면에 존재하는 마이크로포어와 접촉하는 상기 폴리스티렌계 입자의 표면적은 상기 폴리스티렌계 입자 표면에 존재하는 마이크로포어가 폴리스티렌계 입자의 최외각 표면과 접촉하는 표면적의 합계를 의미한다. 또한, 상기 마이크로포어란 최대 직경이 마이크로미터 사이즈인 공극으로서, 예를 들어 1 ㎛ 이상 500 ㎛ 이하의 최대 직경을 갖는 공극을 의미한다.
보다 구체적으로, 상기 폴리스티렌계 입자의 전체 표면적을 기준으로, 상기 폴리스티렌계 입자 표면에 존재하는 마이크로포어와 접촉하는 상기 폴리스티렌계 입자의 표면적의 비율은 하기 수학식 1을 통해 구할 수 있다.
[수학식1]
상기 폴리스티렌계 입자의 전체 표면적을 기준으로, 상기 폴리스티렌계 입자 표면에 존재하는 마이크로포어와 접촉하는 상기 폴리스티렌계 입자의 표면적의 비율(%) = [(상기 폴리스티렌계 입자 표면에 존재하는 마이크로포어와 접촉하는 상기 폴리스티렌계 입자의 표면적) / (상기 폴리스티렌계 입자의 전체 표면적)] * 100
상기 폴리스티렌계 입자의 전체 표면적을 기준으로, 상기 폴리스티렌계 입자 표면에 존재하는 마이크로포어와 접촉하는 상기 폴리스티렌계 입자의 표면적의 비율이 0.01% 미만이라 함은, 상기 폴리스티렌계 입자의 표면에 존재하는 마이크로 크기 포어가 아예 없거나, 거의 없다고 볼 수 있을 정도로 극히 적다는 것을 의미한다. 즉, 상기 폴리스티렌계 입자 표면에는 마이크로포어가 존재하지 않을 수 있다.
종래 폴리스티렌 입자의 밀도를 낮추기 위해 발포제를 투입하여 발포 스티렌을 제조해 왔으나, 이 경우 폴리스티렌 입자의 직경범위와 밀도범위의 분포가 지나치게 넓어짐에 따라 세포 배양용 마이크로 캐리어로서 적용 가능한 범위로의 수율을 확보하는데 어려움이 있었다.
반면, 상기 폴리스티렌계 입자는 상기 폴리스티렌계 입자의 전체 표면적을 기준으로, 상기 폴리스티렌계 입자 표면에 존재하는 마이크로포어와 접촉하는 상기 폴리스티렌계 입자의 표면적의 비율이 0.01% 미만이므로, 종래의 발포 스티렌과 달리 발포제에 의한 발포공정이 전혀 진행되지 않아, 폴리스티렌 입자의 직경범위와 밀도범위의 분포를 보다 정밀하게 조절할 수 있는 장점이 있다.
상기 마이크로 캐리어의 평균 직경이 50 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하일 수 있다.
구체적으로, 상기 마이크로 캐리어의 평균 직경은 50 ㎛ 이상, 75 ㎛ 이상, 100 ㎛ 이상, 120 ㎛ 이상, 또는 400 ㎛ 이하, 300 ㎛ 이하, 250 ㎛ 이하, 200 ㎛ 이하, 또는 50 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하, 50 ㎛ 이상 300 ㎛ 이하, 50 ㎛ 이상 250 ㎛ 이하¸50 ㎛ 이상 200 ㎛ 이하, 50 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하, 75 ㎛ 이상 300 ㎛ 이하, 75 ㎛ 이상 250 ㎛ 이하¸75 ㎛ 이상 200 ㎛ 이하, 100 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하, 100 ㎛ 이상 300 ㎛ 이하, 100 ㎛ 이상 250 ㎛ 이하¸100 ㎛ 이상 200 ㎛ 이하, 120 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하, 120 ㎛ 이상 300 ㎛ 이하, 50 ㎛ 이상 120 ㎛ 이하¸50 ㎛ 이상 120 ㎛ 이하일 수 있다. 상기 마이크로 캐리어의 평균 직경이 상술한 범위를 만족하는 경우 세포 부착 및 배양 성능이 우수하다. 한편, 상기 마이크로 캐리어의 평균 직경이 50 ㎛ 미만인 경우, 세포 배양이 가능한 표면적이 작아 배양 효율이 낮아지는 문제점이 발생할 우려가 있고, 400 ㎛ 초과인 경우, 부착 세포간 상호 작용이 저하되고, 배양기 내 세포 밀도가 낮아져, 세포 배양 효율이 낮아지는 문제가 발생할 수 있다.
상기 마이크로 캐리어의 직경은 상기 마이크로 캐리어의 무게 중심점을 지나는 직선이 마이크로 캐리어의 최외각 표면과 만나는 두 지점 간의 거리를 의미하며, 상기 마이크로 캐리어의 평균 직경은 광학현미경을 통해 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어에 포함되는 전체 입자의 직경을 확인하여 구할 수 있다. 또한 상기 마이크로 캐리어의 평균 입경은 상기 마이크로 캐리어의 제조과정에서 얻어지는 전체 마이크로 캐리어의 직경이나 이들의 평균 직경을 통하여도 확인 가능하다.
상기 마이크로 캐리어는 50 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하의 평균 직경을 갖는 개별 입자의 군(group)일 수 있으며, 이러한 군(group)에 포함되는 개별 미립자는 평균적으로 50 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하의 직경을 가질 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 군(group)에 포함되는 개별 미립자의 95%, 또는 99%가 50 ㎛ 이상 400 ㎛ 이하의 직경을 가질 수 있다.
또한 상기 마이크로 캐리어는 비표면적이 200 cm2/g 이상 1000 cm2/g 이하일 수 있다. 구체적으로, 상기 마이크로 캐리어는 비표면적이 200 cm2/g 이상, 300 cm2/g 이상, 330 cm2/g 이상, 350 cm2/g 이상 일 수 있고, 1000 cm2/g 이하, 500 cm2/g 이하, 450 cm2/g 이하일 수 있으며, 200 cm2/g 이상 1000 cm2/g 이하, 300 cm2/g 이상 1000 cm2/g 이하, 300 cm2/g 이상 500 cm2/g 이하, 300 cm2/g 이상 450 cm2/g 이하, 330 cm2/g 이상 450 cm2/g 이하, 350 cm2/g 이상 450 cm2/g 이하 일 수 있다.
상기 비표면적의 측정 방법은 크게 제한되지 않으나, 예를 들어 겉보기 밀도로부터, 하기 수학식을 이용하여 마이크로 캐리어의 비표면적을 계산할 수 있다.
[수학식]
마이크로 캐리어의 비표면적(cm2/g) = 3 /(r* ρ)
상기 수학식에서, r은 마이크로 캐리어의 평균 반지름을 의미하고, ρ는 마이크로 캐리어의 겉보기 밀도를 의미한다.
상기 폴리스티렌계 입자 표면에, 프라이머 고분자층, 세포부착 유도층, 또는 이들의 조합층이 더 포함될 수 있다. 즉, 상기 폴리스티렌계 입자 표면에, 프라이머 고분자층 1종, 세포부착 유도층 1종, 또는 프라이머 고분자층 1종과 세포부착 유도층 1종의 혼합층이 더 포함될 수 있다. 프라이머 고분자층 1종과 세포부착 유도층 1종의 혼합층에서 이들의 적층 순서는 특별히 한정되지 않으며 프라이머 고분자층상에 세포부착 유도층이 적층된 구조, 혹은 세포부착 유도층상에 프라이머 고분자층이 적층된 구조를 모두 적용가능하다.
한편, 상기 프라이머 고분자층은 관능기가 없는 폴리스티렌계 입자 표면에 기능성 고분자를 도입할 수 있는 점착층 역할을 하며, 이로 인해 마이크로 캐리어 표면에 세포 부착을 위한 고분자 층이 효과적으로 도입되고 배양 중에도 안정적으로 유지될 수 있도록 한다.
상기 프라이머 고분자층은 그 예가 크게 한정되는 것은 아니나, 수상 접착을 유도할 수 있는 카테콜 유도체로서 L-디하이드록시 페닐알라닌(L-DOPA), 도파민(dopamine), 폴리도파민, 노레피네프린(norepinephrine), 에피네프린(epinephrine), 에피갈로카테킨(epigallocatechin) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
한편, 상기 세포 부착 유도층은 세포 부착성 물질들로 구성되며, 이들은 세포의 막관통 단백질(transmembrane protein)들이 결합할 수 있는 장소를 제공하는 역할을 하여, 부착성 세포들이 안정적으로 부착, spreading 및 배양될 수 있도록 한다.
상기 세포 부착 유도층을 형성하는 고분자는 그 예가 크게 한정되는 것은 아니나, 젤라틴, 콜라겐, 피브로넥틴(fibronectin) 키토산, 폴리도파민, 폴리 L-라이신, 비트로넥틴(vitronectin), RGD를 포함한 펩타이드, RGD를 포함한 아크릴계 고분자, 리그닌(lignin), 양이온성 덱스트란 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
일례로, 상기 마이크로 캐리어는 폴리스티렌계 입자의 표면에 형성되는 프라이머 고분자층을 포함하여, 마이크로 캐리어의 표면을 친수성으로 개질하는 것을 통해 수분산 되고, 상기 프라이머 고분자층 표면에 세포 부착 유도층을 도입하여 배양액 내에서 마이크로 캐리어의 부유도가 조절될 수 있으며, 세포를 안정적으로 부착 배양하는 효과를 가질 수 있다.
한편, 상기 폴리스티렌계 입자의 반경과 프라이머 고분자층의 두께의 비율은 1:0.00001 내지 1:0.01, 또는 1:0.0001 내지 1:0.001일 수 있다.
폴리스티렌계 입자의 반경과 표면 코팅층의 두께의 비율이 1:0.00001 미만인 경우, 폴리스티렌계 입자 대비 프라이머 고분자층이 너무 얇아 마이크로 캐리어 표면이 친수성으로 개질하는 효과가 미미하며, 1:0.01를 초과하는 경우, 폴리스티렌계 입자 대비 프라이머 고분자층이 두꺼워져, 세포 배양 시 세포와 마이크로 캐리어의 부착도가 감소될 우려가 있다.
발명의 다른 구현예에 따르면, 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 존재하에, 자성 입자및 스티렌 단량체가 함유된 단량체 조성물의 현탁 중합 반응을 진행하는 단계를 포함하는, 세포 배양용 마이크로 캐리어 제조방법 이 제공될 수 있다.
상기 탄화수소 오일, 자성 입자, 스티렌 단량체에 대한 내용은 상기 일 구현예에서 상술한 내용을 모두 포함한다. 즉, 상기 자성 입자는 소수성 작용기로 표면 처리된 자성입자를 포함할 수 있다.
상기 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자는 자성 입자의 표면에 소수성 작용기가 결합된 자성 입자를 의미할 수 있다.
구체적으로, 표면 처리란 자성 입자의 응집을 방지하고 분산성을 향상시키기 위하여, 자성입자와 소수성 작용기를 포함하는 화합물을 반응시켜 자성 입자의 표면에 소수성 작용기를 결합시키는 것을 의미한다.
상기 구현예에서, 상기 자성 입자란 자기적인 성질을 나타내는 입자를 의미한다. 모든 물질은 자기장 (magnetic field)과 상호작용하여 인력(attractive force) 또는 척력(repulsive force)이 발생된다. 즉, 물질에 자기장을 가하면 자화(magnetization)되고, 상기 물체가 자화되는 양상에 따라 강자성체, 상자성체, 반자성 체, 페리자성체 등으로 구분된다.
상기 자성 입자는 용액 합성, 공동 침전, 졸-겔 방법, 고 에너지 분쇄, 수열 합성, 마이크로에멀젼 합성, 열분해에 의한 합성 또는 음파화학적 합성에 의해 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자의 직경은 0.1 nm 이상 1000 nm 이하일 수 있다. 즉, 상기 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자는 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 나노 입자일 수 있다.
상기 나노 입자는 나노미터(nm)의 크기를 갖는 입자를 의미한다. 나노미터의 크기란 마이크론 미터(10-6) 크기를 1,000 분의 1로 축소한 것으로, 물질의 크기가 나노미터 수준으로 작아지면 다양하고 특이한 물리적, 화학적, 기계적 및 전자적 특성을 나타내게 된다.
자성 물질의 크기가 나노미터로 작아지면 각각의 입자가 자기적 단일구역을 형성하게 되고, 이러한 입자들의 콜로이드 용액은 각 입자들의 열적 요동(thermal fluctuation)에 의해서 자기 쌍극자의 방향이 제각각 불특정한 방향으로 배향하게 되어 외형적으로 나타나는 순자기력(net magnetic force)은 "0"으로 나타나게 된다. 그러나, 외부로부터 내부의 열적 에너지 보다 큰 자기장을 가해주면 입자들의 자기 쌍극자는 한 방향으로 정렬하게 되어 자성체로 변하게 된다.
상기 자성 입자의 종류는 크게 제한 되지 않으며 금속 나노입자를 사용할 수 있다. 예를 들면 금(Au), 은(Ag), 코발트(Co), 구리(Cu), 철(Fe), 크롬(Cr), 니켈(Ni), 팔라듐(Pd), 백금(Pt) 및 주석(Sn)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 금속 또는 그 산화물을 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 자성 입자는 철(Fe) 입자를 포함할 수 있다.
상기 자성 입자는 자성 입자 표면에 소수성 작용기를 함유한 소수성 리간드를 포함할 수 있다. 즉, 상기 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자는 자성 입자 표면에 소수성 작용기를 함유한 소수성 리간드를 포함할 수 있다.
상기 마이크로 캐리어의 제조 방법이 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자를 포함함에 따라 표면 처리되지 않은 자성 입자를 포함하는 경우와 비교하여, 최종 제조되는 마이크로 캐리어 상에서 금속 입자가 독립 분산되어 입자의 뭉침이 방지될 뿐만 아니라 산화 안정성이 향상될 수 있다.
상기 리간드는 배위 결합하고 있는 화합물의 중심 금속 이온의 주위에 결합하고 있는 분자나 이온을 의미하며, 착화합물에서 중심 금속 원자에 전자쌍을 제공하면서 배위 결합을 형성하는 원자 또는 원자단을 의미할 수 있다.
즉, 상기 소수성 리간드는 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자의 중심 자성 입자 이온 주위에 결합하고 있는 소수성 분자 또는 소수성 이온을 의미할 수 있다.
구체적으로, 상기 소수성 리간드는 탄소수 2 내지 20의 지방산 또는 이의 유도체, 또는 탄소수 2 내지 20의 지방산 아민, 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다.
상기 지방산 유도체는 지방산 이온을 포함할 수 있으며, 지방산 아민 유도체는 지방산 아민 이온을 포함할 수 있다.
상기 지방산은 탄화수소 사슬 및 이의 말단에는 카르복실기(-COOH)를 포함하는 화합물로 탄화수소 사슬은 소수성을 보유하나 말단의 카르복실기를 통해 친수성인 물질과 상호작용할 수 있다. 상기 지방산은 불포화 지방산 또는 포화 지방산일 수 있다.
상기 불포화 지방산은 이중결합을 1개 이상 가지고 있는 지방산으로 말단에 있는 -COOH 또는 -COO- 는 자성 입자 표면에 노출되어 있는 친수성기 및/또는 자성 입자의 불포화 배위자리 등과 수소결합, 이온결합, 공유결합 등을 형성할 수 있다.
상기 불포화 지방산이 이중결합을 포함함에 따라, 불포화 지방산의 구부러진 탄화수소 사슬이 자성 입자의 바깥 쪽으로 배향되면서, 소수성 채널을 형성할 수 있다.
즉, 상술한 상기 소수성 작용기는 탄소수 2 내지 20의 지방산 또는 이의 유도체, 또는 탄소수 2 내지 20의 지방산 아민, 또는 이의 유도체로부터 유래된 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 소수성 작용기는 탄소수 2 내지 50의 알킬기, 또는 탄소수 2 내지 50의 알케닐기를 포함할 수 있다.
이에 따라, 상기 소수성 리간드는 상기 소수성 작용기와 그 말단에 결합한 -COOH 또는 -COO-를 포함할 수 있다.
상기 탄소수 2 내지 20의 지방산의 종류는 크게 제한 되지 않으나, 예를 들어 올레인산, 카프로인산, 스테아린산 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
또한, 상기 탄소수 2 내지 20의 지방산 아민의 종류는 크게 제한 되지 않으나, 예를 들어 올레일 아민, 부틸 아민, 옥틸 아민 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자는 도 1 에 나타난 바와 같은 결합 구조를 가질 수 있다.
상기 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자 제조시, 탄소수 2 내지 20의 지방산을 염기성 수용액에 첨가하여, 탄소수 2 내지 20의 지방산 이온을 형성한 후 자성 나노 입자와 반응 시킴에 따라 탄소수 2 내지 20의 지방산 말단에 포함된 -COO- 와 자성 나노 입자 사이의 배위 결합이 도 1 과 같이 형성될 수 있다.
한편 상기 자성 입자의 밀도가 5 g/cm3 이상 6 g/cm3 이하일 수 있다. 즉, 상기 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자의 밀도가 5 g/cm3 이상 6 g/cm3 이하일 수 있다.
구체적으로, 상기 자성 입자의 밀도가 5 g/cm3 이상, 5.1 g/cm3 이상, 5.15 g/cm3 이상 또는 6 g/cm3 이하, 5.8 g/cm3 이하, 5.5 g/cm3 이하, 5.3 g/cm3 이하, 또는 5 g/cm3 이상 6 g/cm3 이하, 5 g/cm3 이상 5.8 g/cm3 이하, 5.1 g/cm3 이상 5.8 g/cm3 이하, 5.1 g/cm3 이상 5.5 g/cm3 이하, 5.1 g/cm3 이상 5.3 g/cm3 이하, 5.15 g/cm3 이상 5.3 g/cm3 이하 일 수 있다.
상술한 바와 같이, 상기 자성 입자의 밀도가 5 g/cm3 이상 6 g/cm3 이하임에 따라, 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 100 중량부에 대하여, 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자를 5 중량부 초과로 지나치게 첨가할 경우, 밀도가 큰 자성 입자를 과량 포함함에 따라 입자의 전체적인 밀도가 높아져 배양기 내에서 입자가 원활하게 부유하지 못할 뿐만 아니라 세포 독성을 나타낼 수 있다.
또한 상기 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자의 직경이 100 nm 이상 2000 nm 이하일 수 있다.
구체적으로, 상기 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자의 직경이 100 nm 이상, 300 nm 이상, 500 nm 이상, 또는 2000 nm 이하, 1500 nm 이하, 1000 nm 이하, 800 nm 이하, 600 nm 이하, 또는 100 nm 이상 2000 nm 이하, 100 nm 이상 1500 nm 이하, 100 nm 이상 1000 nm 이하, 100 nm 이상 800 nm 이하, 100 nm 이상 600 nm 이하, 300 nm 이상 2000 nm 이하, 300 nm 이상 1500 nm 이하, 300 nm 이상 1000 nm 이하, 300 nm 이상 800 nm 이하, 300 nm 이상 600 nm 이하, 또는 500 nm 이상 2000 nm 이하, 500 nm 이상 1500 nm 이하, 500 nm 이상 1000 nm 이하, 500 nm 이상 800 nm 이하, 500 nm 이상 600 nm 이하일 수 있다.
상기 단량체 조성물은 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 100 중량부에 대하여, 자성 입자를 0.01 중량부 이상 5 중량부 이하로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 단량체 조성물은 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 100 중량부에 대하여, 자성 입자를 0.01 중량부 이상, 입자를 0.01 중량부 이상, 0.02 중량부 이상, 0.04 중량부 이상으로 포함할 수 있고, 5 중량부 이하, 4 중량부 이하로 포함할 수 있고, 0.01 중량부 이상 5 중량부 이하, 0.02 중량부 이상 5 중량부 이하, 0.02 중량부 이상 4 중량부 이하, 0.04 중량부 이상 4 중량부 이하 로 포함할 수 있다.
탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 100 중량부에 대하여, 자성 입자를 0.01 중량부 미만으로 지나치게 감소할 경우, 상기 마이크로 캐리어의 자성이 충분히 구현되지 않아 세포 배양 후 마이크로 캐리어와 세포의 분리 회수 시 분리 정제가 쉽지 않을 뿐만 아니라, 회수 공정이 추가적으로 수반되어 공정이 복잡해지는 한계가 있다.
반면, 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 100 중량부에 대하여, 자성 입자를 5 중량부 초과로 지나치게 첨가할 경우, 밀도가 큰 자성 입자를 과량 포함함에 따라 입자의 전체적인 밀도가 높아져 배양기 내에서 입자가 원활하게 부유하지 못할 뿐만 아니라 세포 독성을 나타낼 수 있다.
또한, 상기 단량체 조성물은 스티렌 단량체 1 중량부에 대하여 에틸렌계 불포화 가교제를 0.033 중량부 초과 3 중량부 미만으로 포함할 수 있다.
구체적으로, 스티렌 단량체 1 중량부에 대하여, 에틸렌계 불포화 가교제 0.033 중량부 미만으로 지나치게 감소할 경우, 상기 폴리스티렌계 고분자의 가교 밀도가 감소함에 따라 탄화수소 오일로 인해 생성된 공극이 안정적으로 제조되기 어려워 폴리스티렌계 입자의 밀도를 충분히 낮추기 어려운 한계가 있다.
반면, 스티렌 단량체 1 중량부에 대하여, 에틸렌계 불포화 가교제 3 중량부 이상으로 지나치게 증가할 경우, 상기 폴리스티렌계 고분자의 가교밀도가 증가하면서, 폴리스티렌계 입자의 전체적인 밀도가 목표한 수준까지 낮아지기 어려운 한계가 있다.
또한, 상기 단량체 조성물 전체 중량에 대하여 상기 탄화수소 오일의 함량이 10 중량% 이상 30 중량% 이하, 또는 14 중량% 이상 21 중량% 이하일 수 있다. 상기 탄화수소 오일의 함량이 지나치게 감소할 경우, 탄화수소 오일이 입자 내부로 함침되는 양이 감소하여 폴리스티렌계 입자의 밀도가 충분히 낮아지기 어렵다. 또한, 상기 탄화수소 오일의 함량이 지나치게 증가할 경우, 폴리스티렌계 입자의 형상이 구형을 갖기 어려워져 제조되는 입자의 균일성이 감소하게 된다.
보다 구체적으로, 상기 단량체 조성물의 현탁 중합 반응은, 상기 단량체 조성물을 수계 분산액에 혼합하고 전단력을 가하여 상기 단량체 조성물을 수계 분산액에 액적 형태로 균질화하는 단계; 및 상기 균질화된 단량체 조성물을 300 rpm 이상 1000 rpm 이하의 교반속도로 현탁 중합하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 균질화된 단량체 조성물을 300 rpm 이상 1000 rpm 이하, 또는 400 rpm 이상 800 rpm 이하의 교반속도로 현탁 중합하는 단계에서 폴리스티렌과 탄화수소 오일의 입자 구조 형성 중 폴리스티렌과 탄화수소 오일의 상분리에 의해 내부 공극을 형성하면서 세포 배양용 마이크로 캐리어의 밀도를 보다 낮출 수 있으면서도, 구형 입자 비율이 높은 세포 배양용 마이크로 캐리어 제조가 가능하다.
상기 균질화된 단량체 조성물을 300 rpm 이상 1000 rpm 이하, 또는 400 rpm 이상 800 rpm 이하의 교반속도로 현탁 중합하는 단계에서 상기 현탁 중합 조건의 예가 크게 한정되는 것은 아니나, 예를 들어, 50 ℃ 이상 100 ℃ 온도에서 3 시간 이상 18 시간 이하로 진행할 수 있다.
한편, 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어 제조방법은 상기 현탁 중합 반응을 진행하는 단계 이후에, 현탁 중합 반응 결과물을 세척하는 단계 및 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.
구체적으로 상기 현탁 중합 반응 결과물을 세척하는 단계는 현탁 중합 반응 결과물을 10 ㎛ 이상 100 ㎛ 이하의 sieve에 거른 뒤, 에탄올 100% 및/또는 50 ℃ 이상 80 ℃ 이하의 고온의 증류수에 5-7 회 상온 교반하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 현탁 중합 반응 결과물을 건조하는 단계는 진공 오븐에 넣고 상온에서 진공 건조하는 단계를 포함한다. 다만, 이에 한정되는 것은 아니고, 통상적으로 사용되는 것으로 알려진 건조 방법을 별 다른 제한 없이 사용할 수 있다.
한편, 상기 다른 구현예의 세포 배양용 마이크로 캐리어의 제조방법은, 상기 현탁 중합 반응을 진행하는 단계 이후에, 상기 현탁 중합 반응 결과물의 표면에 프라이머 고분자층, 세포부착 유도층, 또는 이들의 조합층을 도포하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 프라이머 고분자층, 세포부착 유도층에 대한 내용은 상기 일 구현예에서 상술한 내용을 모두 포함한다.
발명의 또 다른 구현예에 따르면, 세포 및 상기 일 구현예의 세포 배양용 마이크로 캐리어를 포함하는 세포 배양 조성물이 제공될 수 있다. 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어에 대한 내용은 상기 일 구현예에서 상술한 내용을 모두 포함한다.
상기 세포는 부착성 동물 세포로 그 예가 크게 한정되는 것은 아니나, 예를 들어 섬유아세포 (fibroblasts), 상피세포 (epithelial cell), 골아세포 (osteoblast), 연골세포 (chondrocyte), 간세포, 인간 유래 제대혈 세포, 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell), CHO(Chinese hamster ovary) 세포, 신장세포 (HEK293, BHK21, MDCK, vero cell 등), 또는 이들의 2종 이상 혼합물일 수 있다.
상기 세포의 밀도는 1.02 g/cm3 이상 1.1 g/cm3 미만일 수 있다.
또한, 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어와 상기 세포의 밀도 차이가 0.02 g/cm3 이상 0.20 g/cm3 이하일 수 있다. 상기 세포 배양용 마이크로 캐리어와 상기 세포의 밀도 차이가 0.02 g/cm3 이상 0.20 g/cm3 이하로 밀도 차이가 크게 나지 않더라도, 자성 입자를 포함함에 따라 세포와 마이크로 캐리어를 손쉽게 분리할 수 있다.
상기 세포 배양 조성물은 배지 용액을 더 포함할 수 있다. 상기 배지 용액은 혈장이나 림프액과 같은 체액을 근거한 생체의 조건에 가까운 영양분과 pH, 온도, 삼투압 등의 환경 조건을 충분히 만족시켜 주기 위한 각종 첨가제들을 포함할 수 있고, 이는 세포 배양 관련 기술분야에서 널리 알려진 다양한 물질을 제한 없이 사용할 수 있다.
일례로, 상기 일 구현예의 세포 배양용 마이크로 캐리어는 배지 용액보다 작은 밀도를 가져, 배지 용액 내에 주입되어 교반 조건 하에 배지 용액 내부에서 부유하게 된다. 이후, 저밀도의 마이크로 캐리어의 표면에 부착되는 세포의 수가 증가함에 따라, 세포가 부착된 마이크로 캐리어(이하, '마이크로 캐리어-세포 결합체'라고 함)의 밀도는 점차 증가하여 배지 용액내에서 점차 가라앉게 된다.
이에, 세포가 부착된 마이크로 캐리어(마이크로 캐리어-세포 결합체)을 세포 탈착효소 첨가 처리 후 원심분리를 통해 분리하여, 마이크로 캐리어-세포 결합체로부터 세포를 분리시킴으로서 배양된 세포를 용이하게 확보할 수 있다.
본 발명에 따르면, 세포 배양이 가능하도록 저밀도를 가지면서, 세포 배양 후 마이크로 캐리어와 세포의 분리 회수 시 보다 손쉽게 분리할 수 있는 세포 배양용 마이크로 캐리어, 이의 제조방법 및 이를 이용하는 세포 배양 방법이 제공될 수 있다.
도 1은 소수성 작용기로 표면 처리된 자성 입자를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1에서 얻은 세포 배양용 마이크로 캐리어의 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 1에서 얻은 세포 배양용 마이크로 캐리어의 입자 단면 형상 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 1에서 얻은 세포 배양용 마이크로 캐리어의 입자 표면 형상 SEM 이미지를 나타낸 것이다.
발명을 하기의 실시예에서 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<제조예: 자성 입자의 제조>
증류수 130 ml에 Fe3+ (Iron(III) chloride hexahydrate, 5.41 g) 및 Fe2+ salt (Iron(II) chloride tetrahydrate, 1.98 g)을 첨가하여 400 내지 600 rpm으로 교반하여 자성 입자수용액을 제조하였다.
올레산 (2 g) 및 아세톤 13 ml를 혼합한 후, 상기 자성 입자수용액에 첨가하였다.
30 분간 교반한 후, 수산화 암모늄 수용액 (고형분 함량 25 wt%) 15 ml 를 천천히 첨가하였다.
80 ℃ 내지 90 ℃로 승온하여 1 시간 이상 교반한 후, 65 ℃ 내지 75 ℃로 온도를 낮추고 1 N HCl을 반응물의 pH 가 2가 될 때까지 첨가하였다.
최종 반응물의 pH가 7이 될 때까지 증류수로 세척한 후, 상온에서 2일 이상 건조하여 표면 처리된 자성 입자(입자직경: 500~600 nm, 입자 밀도 : 5.15 g/cm3)를 제조하였다. 상기 자성 입자의 직경은 Dynamic light scattering (DLS) 을 이용하여 측정하였다.
상기 자성 입자의 밀도(진밀도; true density)는 pycnometer를 사용하여 측정하였다.
<실시예: 세포 배양용 마이크로 캐리어의 제조>
실시예1
(1) 분산상(dispersive phase)의 제조
하기 표 1에 기재된 함량으로 스티렌 모노머(styrene monomer, st), 가교제인 디비닐벤젠(divinylbezene, DVB), 상기 제조예의 자성 입자 및 저밀도 오일 (Isopar M, 밀도 0.791 g/cm3)의 혼합물을 100 ml 바이알에서 교반하였다. 이후, 열 개시제인 벤조일퍼옥사이드(benzoyl peroxide, BPO, 2.1 중량%) 와 터트-부틸 퍼옥시 벤조에이트(tert-butyl peroxybenzoate, t-BP, 0.3 중량 %)를 바이알에 추가 투입하고, 5 분 내지 10분동안 상온에서 교반하였다. 각 성분간 함량은 표 1에 기재하였다.
(2) 연속상(continuous phase)의 제조
중량평균분자량이 85,000 내지 125,000 범위 내이고, 가수분해율이 87 내지 89 % 인 PVA 6 g을 증류수 600 g에 용해하였다. 자세한 함량은 표 1과 같다.
(3) 현탁중합에 의한 입자 제조
600 g의 1% PVA 수용액을 분산상과 혼합하여 균일 분산액이 될 때까지 오일배스(oil bath) 내에서 교반하였다. 구체적으로, 상온에서 400 내지 500 rpm 으로 교반하면서 오일배스를 점차 승온시키고, 80 ℃ 내지 90 ℃의 온도 및 400 내지 600 rpm 속도 조건하에서 현탁중합을 수행하였다. 상기 중합은 질소 퍼징 하에서 실시하였다.
(4) 입자 수득
반응 4시간 후, 45 ㎛의 시이브(sieve)를 통해 제조된 입자를 회수하고, 에탄올로 3회, 70 ℃ 이상 80 ℃ 이하의 고온 증류수로 3회 세척한 후 80 ℃ 오븐에서 건조하였다.
(5) 입자 표면 처리
중합 후 상온 건조한 입자를 dopamine hydrochloride가 1mg/mL로 용해된 tris buffer (pH 8.0)에 침지하고, 상온에서 1시간 이상 교반하여 입자 표면에 폴리도파민 층을 도입하였다. 반응 후 45 ㎛의 시이브(sieve)를 통해 입자를 회수하고, 에탄올로 3회 세척한 후 80 ℃ 오븐에서 건조하였다.
실시예2 내지 실시예4
아래 표 1 과 같이 분산상과 연속상의 조성을 조절한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 과정을 거쳐 입자를 수득하였다.
비교예 1
자성 입자를 첨가하지 않은 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 과정을 거쳐 입자를 수득하였다.
비교예 2,3
아래 표 1 과 같이 분산상과 연속상의 조성을 조절하고, 저밀도 오일을 첨가하지 않은 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 과정을 거쳐 입자를 수득하였다.
참고예 1
제조예의 자성 입자 대신 올레산으로 표면을 소수성으로 개질하지 않은 자성 입자를 첨가한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 과정을 거쳐 입자를 수득하였다.
자성 입자
(g)		 저밀도 오일
(g)		 스티렌 모노머
(g)		 가교제
(g)		 개시제
(g)		 증류수
(g)
소수성 개질 O
(제조예)		 소수성 개질 X
실시예1 0.01 - 25 70 25 1.96 600
실시예2 0.1 - 25 70 25 1.96 600
실시예3 0.5 - 25 70 25 1.96 600
실시예4 1 - 25 70 25 1.96 600
비교예1 - 25 70 25 1.96 600
비교예2 0.1 - - 70 25 1.96 600
비교예3 2 - - 70 25 1.96 600
참고예 1 - 2 25 70 25 1.96 600
<실험예: 세포 배양용 마이크로 캐리어의 물성 측정>
상기 실시예, 비교예 및 참고예에서 얻어진 세포 배양용 마이크로 캐리어에 대하여, 하기 방법으로 물성을 측정하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
1. 입자 크기
상기 실시예, 비교예 및 참고예에서 얻어진 세포 배양용 마이크로 캐리어에 대하여, 광학현미경을 통해 100개의 입자 직경을 측정하고, 이들의 산술평균값을 구하였다.
실시예 1에서 얻어진 세포 배양용 마이크로 캐리어의 SEM 이미지를 도 2에 도시하였다.
2. 입자 내부 구조 및 공극 직경
(1) 입자 내부 구조
상기 실시예 1에서 얻어진 세포 배양용 마이크로 캐리어에 대하여, SEM을 통해 입자 내부 구조를 확인하였다. 구체적으로 입자를 에폭시에 embedding한 후 ion milling을 통해 단면을 제조한 후 입자 단면의 형상을 SEM을 통해 확인하고, 이를 도 3에 도시하였다.
(2) 공극 직경
상기 실시예 및 비교예에서 얻어진 세포 배양용 마이크로 캐리어를 에폭시에 embedding한 후 ion milling을 통해 단면을 제조한 후 입자 단면의 형상을 SEM으로 확인하여 입자 내부 공극 중 최소 직경과 최대 직경을 구하였다.
3. 겉보기 밀도
상기 실시예, 비교예 및 참고예에서 얻어진 세포 배양용 마이크로 캐리어에 대하여, 건조 과정이 완료된 조건의 시료를 준비하고, 상기 시료를 상온(25 ℃) 및 상압(1 atm) 조건에서, 밀도가 0.95 g/cm3, 0.97 g/cm3, 0.98 g/cm3 또는 0.995 g/cm3인 에탄올 수용액과, 밀도가 1 g/cm3인 증류수(DIW)에 각각 첨가하여 입자가 부유 또는 침강하는지 확인하여 다음 기준하에 겉보기 밀도를 평가하였다.
1) 밀도가 0.95 g/cm3인 에탄올 수용액에서 부유 : 0.95 g/cm3 미만
2) 밀도가 1 g/cm3인 증류수(DIW)에서 침강 : 1 g/cm3 초과
3) 밀도가 0.95 g/cm3인 에탄올 수용액에서 침강하고, 밀도가 1 g/cm3인 증류수(DIW)에서 부유 : 0.95 g/cm3 이상 1 g/cm3 미만
4) 밀도가 0.95 g/cm3인 에탄올 수용액에서 침강하고, 밀도가 0.97 g/cm3인 에탄올 수용액에서 부유 : 0.95 g/cm3 이상 0.97 g/cm3 미만
5) 밀도가 0.98 g/cm3인 에탄올 수용액에서 침강하고, 밀도가 0.995 g/cm3 인 에탄올 수용액에서 부유 : 0.98 g/cm3 이상 0.995 g/cm3 미만
4. 비표면적
상기 얻어진 겉보기 밀도로부터, 하기 수학식을 이용하여 세포 배양용 마이크로 캐리어의 비표면적을 계산하였다.
[수학식]
마이크로 캐리어의 비표면적(cm2/g) = 3 /(r* ρ)
상기 수학식에서, r은 마이크로 캐리어의 평균 반지름을 의미하고, ρ는 마이크로 캐리어의 겉보기 밀도를 의미한다.
5. 세포 배양 효율
100mL bioreactor에 중간엽 줄기세포(밀도: 1.05 g/cm3)를 포함하는 배양액을 채우고, 상기 실시예 및 비교예에서 얻어진 세포 배양용 마이크로 캐리어 1 g 내지 1.5g을 넣어 25 rpm으로 교반하였다. 이 때 배양액의 온도는 37 ℃ 를 유지하였고, 5일간 배양하여 다음 기준에 따라 마이크로 캐리어의 세포 배양 효율을 평가하였다.
상: 세포 배양시 세포 배양효율이 80% 이상
하: 세포 배양시 세포 배양효율이 80% 미만
6. 자성 분리 효율
상기 실시예, 비교예 및 참고예에서 얻어진 세포 배양용 마이크로 캐리어가 분산된 용액이 담긴 바이알의 한쪽 면에 강력자석을 접촉시켜, 세포 배양용 마이크로 캐리어가 이동하는지 여부를 육안으로 확인하였다.
세포 배양용 마이크로 캐리어가 90% 이상 자석이 접촉된 면 방향으로 이동하는 경우 “우수”, 90% 이하로 이동하는 경우 “불량”으로 평가하였다.
7. 공극 성분 분석
상기 실시예, 비교예 및 참고예에서 얻어진 세포 배양용 마이크로 캐리어에 대하여, 내부 공극에 함유된 성분을 분석하기 위해, 세포 배양용 마이크로 캐리어를 동결 분쇄하고 클로로포름(Chloroform)에 녹여 미반응 잔류 화합물을 추출하고, GC/FID(가스 크로마토그래피 - 불꽃 이온화 검출기)를 통해 세부 성분을 정성, 정량분석하였다.
구체적으로 클로로포름과 메탄올을 1:2 부피비로 혼합한 용매에 농도별로 스티렌 (1/4000 mg/mL~1 mg/mL), 디비닐벤젠 (1/10000 mg/mL~1 mg/mL), Isopar M (1/400 mg/mL~10 mg/mL)의 표준 시료를 제조하였다. GC/FID 기기에 1 uL의 표준 시료를 주입하고 검량선을 작성하였다. 표 1의 시료를 1 uL 주입하고 검량선을 이용하여 함량을 계산하였다. GC/FID 측정은 내경 0.53mm, 길이 30 m, 필름 두께 5 μm의 Rtx (스티렌, Isopar M) 또는 wax (디비닐벤젠)상의 컬럼을 이용하였으며, 초기 오븐 온도 50℃에서 시작하여 10℃/min 속도로 250℃까지 승온하였다. 이동상 기체는 15 mL/min의 헬륨 기체를 사용하였다.
이때, 오일 또는 이로부터 유래된 성분이 검출되는 경우를 “O”, 오일 또는 이로부터 유래된 성분이 검출되지 않는 경우를 “X”로 표시하였다.
실시예, 비교예 및 참고예의 실험예 측정 결과
구분 입자크기
(㎛)		 공극크기
(㎛)		 겉보기밀도
(g/cm3)		 비표면적
(cm2/g)		 세포배양 효율 자성분리 효율 공극성분
분석
실시예1 168(±24) 최소:1최대:3 0.996 358.58 상 우수 O
실시예2 159(±21) 최소:1최대:3 0.999 377.74 상 우수 O
실시예3 154(±32) 최소:1최대:3 1.013 384.61 상 우수 O
실시예4 164(±35) 최소:1최대:3 1.030 355.20 상 우수 O
비교예1 179(±36) 최소:1최대:3 0.995 336.88 상 불량 O
비교예2 174(±24) - 1.054 327.16 하 우수 X
비교예3 134(±18) - 1.135 394.50 하 우수 X
참고예1 180(±54) 최소:1최대:3 1.064 323.62 상 불량 O
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 실시예의 세포 배양용 마이크로 캐리어는 1.05 g/cm3 미만의 저밀도를 만족하면서도, 세포 배양 조건에서 캐리어 배양이 효과적으로 진행되고, 자성 분리 효율 또한 우수함을 확인할 수 있었다. 반면, 비교예1의 세포 배양용 마이크로 캐리어는 자성 입자를 미포함하여, 자성 분리 효율이 낮아지는 문제가 있었다.
또한, 비교예 2의 세포 배양용 마이크로 캐리어는 입자의 밀도가 1.05 g/cm3 초과로 세포와의 밀도 차이로 인해 배양기 내에서 원활한 교반이 이루어지지 않아 세포 부착성이 감소하는 문제가 있었다
또한, 비교예 3의 세포 배양용 마이크로 캐리어는 입자의 밀도가 1.05 g/cm3 초과로 세포와의 밀도 차이로 인해 배양기 내에서 원활한 교반이 이루어지지 않아 세포 부착성이 감소하여 세포배양이 불가능할 정도로 세포 배양 효율이 낮아지는 문제가 있었다.
또한, 참고예 1 의 세포 배양용 마이크로 캐리어는 소수성 작용기로 표면 처리되지 않은 자성 입자를 포함함에 따라, 수분산 자성 입자가 스티렌 모노머를 포함하는 분산상에서 고르게 분산되지 않고, 중합 시 수분산 자성 입자끼리 뭉치는 것을 확인할 수 있었다. 또한 이렇게 제조된 입자의 경우 입도 분포가 크며 자성 분리 효율이 낮아지는 문제가 있었다.

Claims (19)

  1. 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일, 또는 이로부터 유도된 공극 중 적어도 하나 이상; 및 자성 입자;를 포함한 폴리스티렌계 입자를 포함하는, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 자성 입자는 소수성 작용기로 표면 처리된 자성입자를 포함하는, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 자성 입자는 자성 입자 표면에 소수성 작용기를 함유한 소수성 리간드를 포함하고,
    상기 소수성 리간드는 탄소수 2 내지 20의 지방산 또는 이의 유도체 및 탄소수 2 내지 20의 지방산 아민 또는 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 리간드를 포함하는, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 자성 입자는 금(Au), 은(Ag), 코발트(Co), 구리(Cu), 철(Fe), 크롬(Cr), 니켈(Ni), 팔라듐(Pd), 백금(Pt) 및 주석(Sn)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 금속 또는 그 산화물을 포함하는, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일, 또는 이로부터 유도된 공극 중 적어도 하나 이상의 내부에 자성 입자가 분산된 상태로 존재하는, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로 캐리어의 겉보기 밀도가 0.95 g/cm3 이상 1.05 g/cm3 이하인, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로 캐리어의 평균 직경이 50 ㎛ 이상 400㎛ 이하이고,
    마이크로 캐리어의 비표면적이 200 cm2/g 이상 1000 cm2/g 이하인, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 공극의 직경이 0.1 ㎛ 이상 5 ㎛ 이하인, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 탄화수소 오일의 밀도가 0.75 g/cm3 이상 0.80 g/cm3 이하인, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 자성 입자의 밀도가 5 g/cm3 이상 6 g/cm3 이하인, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 탄화수소 오일은 탄소수 12 이상 50 이하인 직쇄 또는 분지쇄의 포화 탄화수소 화합물을 포함하는, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 폴리스티렌계 입자는,
    탄소수 12 이상인 탄화수소 오일, 자성 입자 및 스티렌 단량체가 함유된 단량체 조성물의 현탁 중합 반응 결과물을 포함하는, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 단량체 조성물은 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 100 중량부에 대하여,
    자성 입자를 0.01 중량부 이상 5 중량부 이하로 포함하는, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 단량체 조성물은, 스티렌 단량체 1 중량부에 대하여,
    에틸렌계 불포화 가교제를 0.033 중량부 초과 3 중량부 미만으로 포함하는, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 폴리스티렌계 입자 표면에, 프라이머 고분자층, 세포부착 유도층, 또는 이들의 조합층이 더 포함되는, 세포 배양용 마이크로 캐리어.
  16. 탄소수 12 이상인 탄화수소 오일 존재하에, 자성 입자 및 스티렌 단량체가 함유된 단량체 조성물의 현탁 중합 반응을 진행하는 단계를 포함하는, 세포 배양용 마이크로 캐리어 제조방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 자성 입자는 소수성 작용기로 표면 처리된 자성입자를 포함하는, 세포 배양용 마이크로 캐리어 제조방법.
  18. 세포 및 제1항의 세포 배양용 마이크로 캐리어를 포함하는, 세포 배양 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 세포는 섬유아세포, 연골세포, 간엽줄기세포, CHO, HEK 293, vero cell, BHK21, MDCK 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 포함하는, 세포 배양 조성물.
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