JP4293908B2 - 組換えヒトエリスロポエチンのクロマトグラフィー精製 - Google Patents

Description

本発明は、規定された組成のグリコフォームを有する組換えヒトエリスロポエチン（Ｅｐｏ）を高純度形態で、すなわち宿主細胞タンパク質を低量しか含まずに産生する方法に関する。これは、特定の一連の精製ステップと分離したアイソフォームを定量するための分析ツールを組合せることにより達成される。

エリスロポエチンは、赤血球前駆細胞の増殖及び分化並びに循環赤血球の生理学的レベルの維持を調節する主要ホルモンである。胎児では、Ｅｐｏは主に肝臓で産生され、その産生の約９０％は生後腎臓に変わる。慢性または急性の腎不全のためにＥｐｏレベルが下がったときには、立ち上がり貧血(rising anemia)を防止するために外部からＥｐｏを投与しなければならない。Ｅｐｏ遺伝子が発見され、げっ歯類細胞で該遺伝子が発現されて以来、治療上活性なヒトエリスロポエチンが利用可能となった。

ヒトＥｐｏ遺伝子は、２７アミノ酸シグナルペプチド及び１８３９６ダルトンの算出分子量を有する１６６アミノ酸タンパク質をコードする。成熟タンパク質は通常１つのアミノ酸Ｎ末端欠失を有し、１６５アミノ酸長である。シグナル配列により、ペプチドは３つのＮ−グリコシル化部位及び１つのＯ−グリコシル化部位を有する成熟タンパク質をもたらす適正なグリコシル化に関与する細胞コンパートメントに指向する。全分子量の約４０％を構成する糖部分はＥｐｏの完全生物活性にとって必須である。幾つかの研究で、末端シアル酸残基の数がインビボ半減期に対してポジティブな効果を有するものの、インビトロ活性、すなわち受容体に対する結合はグリコシル化が全くまたは部分的にしかされていない形態の場合に最高であることが判明した（Ｔａｋｅｕｃｈｉ及びＫｏｂａｔａ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１（４）：３３７−３４６（１９９１））。シアリル化度は半減期に直接比例し、シアル酸の少ないアイソフォームは生体から非常に速く取り除かれ、よって低い活性しか示さない。

高活性の組換えエリスロポエチンを作成する際の目的は、十分に最適化した発酵技術及び選択的精製プロトコルにより多くの末端シアル酸残基を有する産物を作成することである。

多数の刊行物にＥｐｏの各種ソースからの精製についての記載がある。エリスロポエチンのクローニング及び組換えＤＮＡ技術の使用以前に公表された精製方法の多くは天然ソースとしてヒト尿を使用していた。Ｅｐｏ精製についての以下のプロトコルはいずれも純粋な産物を生ずるが、規定されたアイソフォームの蓄積については言及していない。Ｔ．Ｍｉｙａｋｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２（１５）：５５５８−５５６４（１９７７）には、尿Ｅｐｏをイオン交換クロマトグラフィー、エタノール沈殿、ゲル濾過及び吸着クロマトグラフィーを含めた複数ステップ手順により精製することが記載されている。Ｎ．Ｉｎｏｕｅら，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒ，．Ｂｕｌｌ，１７（２）：１８０−１８４（１９９４）に記載されている別の手順では、ヒト尿からＥｐｏを精製するためにアニオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、レクチンクロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーを使用している。Ｇ．Ｋｒｙｓｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．６７（１）：７１−７９（１９８６）に記載されているＡｆｆｉ−Ｂｌｕｅ、等電点クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー及び分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥの５ステップ精製のソースも尿である。上記した精製ステップの別の組合せはＨ．Ｙｉａｎａｇｉら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ．，４１７：１７８−１８２（１９８７）に記載されている。下流プロセシング（ＤＳＰ）プロトコルでは、尿をエタノール沈殿、２つのレクチンクロマトグラフィーステップ、ヒドロキシアパタイト及び逆相クロマトグラフィーにより精製している。

Ｖ．Ｂｒｏｕｄｙら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２６５（２）：３２９−３３６（１９８８）では、エリスロポエチンをＡｆｆｉ−Ｇｅｌブルークロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーにより精製するためにトランスフェクトしたＢＨＫ細胞株を使用した。精製されたＥｐｏは特定のアイソフォームを多く含んでいない。

Ａ．Ｂ．Ｇｈａｎｅｍ，Ｐｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４（２）：１２７−１４２（１９９４）及びＡ．Ｇｏｋａｎａら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ．，７９１：１０９−１１８（１９９７）では、Ｂ−リンパ芽球腫細胞株で生成したエリスロポエチンのアイソフォームを分離するために、アフィニティークロマトグラフィーステップ後ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌを使用した。彼らは精製産物を等電点電気泳動により分析したが、規定アイソフォームを含むフラクションをプールしなかった。

Ｊ．Ｂｕｒｇらの国際特許出願公開第９９／２８３４６号パンフレットは、炭水化物構造中のＮ−アセチルラクトサミン単位及び／またはテトラアンテナ分枝についてＥｐｏを高度に精製した。ＤＳＰシーケンスは細胞培養上清から始め、この上清にアフィニティークロマトグラフィーにより捕捉し、疎水性相互作用クロマトグラフィーによる精製し、ヒドロキシフパタイト及び逆相クロマトグラフィーを適用した。この方法の欠点は、ブルー−セファロース捕捉マトリックスのＣｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ ３Ｇ色素−リガンドが漏出する恐れがあること、宿主細胞タンパク質がＨＩＣステップにより十分に分離されないこと及びシリカを主成分とするＰＲＣ樹脂がＮａＯＨによる衛生に対して安定でないことである。

本発明は、宿主細胞を含む細胞培養培地からの組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈＥｐｏ）の回収及び精製方法を提供し、その方法は、
（ａ）（ｉ）遠心後のデプス濾過ステップ、（ｉｉ）デプス濾過ステップ及び（ｉｉｉ）遠心からなる群から選択される手順を実施して細胞培養培地から宿主細胞、細胞成分及び破片を除去して、清澄化培地上清を得るステップ、
（ｂ）前記上清の伝導率を５ｍＳ／ｃｍ以下、ｐＨを約７．０〜８．０に調節するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）からの上清をアニオン交換クロマトグラフィー媒体を含むカラムに適用し、前記カラムを洗浄し、前記カラムからｒｈＥｐｏを溶離し、１つ以上のｒｈＥｐｏ含有ピークフラクションを収集するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）からの合わせたピークフラクションに、中圧（＜１０バール）で操作可能であり且つ高濃度のＮａＯＨに対して耐性である樹脂を用いる逆相クロマトグラフィーステップを施し、有機溶媒の直線勾配を用いてｒｈＥｐｏを溶離させるステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）で溶離した１つ以上のｒｈＥｐｏ含有フラクションをアニオン交換クロマトグラフィー媒体を含むカラムに適用し、前記カラムを洗浄し、直線塩勾配を用いてｒｈＥｐｏを溶離させるステップ、
（ｆ）ステップ（ｅ）で溶離した１つ以上のｒｈＥｐｏ含有フラクションをｒｈＥｐｏのシアリル化度に基づいて選択するステップ、及び
（ｇ）ステップ（ｆ）で溶離した１つ以上のｒｈＥｐｏ含有フラクションにゲル濾過媒体を用いるサイズ排除クロマトグラフィーステップを１回以上施して存在し得る二量体以上の多量体凝集物を除去し、ｒｈＥｐｏ含有溶離物を収集するステップ
を含む

剛性であり且つ１Ｍ ＮａＯＨまたは酢酸を含めた過酷な清浄現場手順に耐える新しいポリマー樹脂を使用する新規な精製プロトコルが開発された。更に、前記樹脂は高い結合能力を有し、生産規模で効率的プロセスのための高流速を可能とする。患者にとって問題となる恐れがある潜在的に漏出可能なリガンド（例えば、レクチンまたは色素）を有する樹脂を使用しない。

実行される精製ステップは異なる選択性を有し、これにより宿主細胞由来のタンパク質またはＤＮＡを低量しか含まない非常に純粋な産物が得られる。更に、本明細書に概説した本発明の精製方法では、幾つかの（好ましくは、少なくとも３つの）クロマトグラフィーステップにより各アイソフォームを分離することができる。特に、第２のアニオン交換クロマトグラフィーステップ（すなわち、下記するステップ（ｅ））のフラクションをプールし、最終ゲル濾過クロマトグラフィーにより更にプロセシングする前にＣＺＥ（細管ゾーン電気泳動）により分析してもよい。代替または追加的に、逆相クロマトグラフィーステップ（すなわち、下記するステップ（ｄ））のフラクションをＣＺＥにより分析し、処理してもよい。別の可能性は、（代替または追加的に）第１アニオン交換クロマトグラフィー（すなわち、下記するステップ（ｃ））を実施して得たフラクションにＣＺＥを実施することである。ＣＺＥを用いることにより、分析しようとするフラクション中にアイソフォームの混合物または組成物として含まれるグリコシル化タンパク質またはポリペプチドが特定アイソフォームに分離される。公知のアイソフォーム標準物質、特にグリコシル化パターン（例えば、シアリル化パターン）に関する標準物質と比較することにより、特定構造をＣＺＥにより分離された各アイソフォームに帰属させることが可能である。本発明によると、これによりソースの品質に関係なく高度にグリコシル化されたアイソフォームの規定組成を有するフラクションプールが生ずる。より一般的には、ＣＺＥはタンパク質またはポリペプチドそれ自体の種類に関係なくタンパク質またはポリペプチドのグリコシル化アイソフォームを含むタンパク質組成物を産生するための貴重な道具である。従って、本発明はグリコシル化タンパク質またはポリペプチドのアイソフォームの規定組成物を産生する際の分析ツールとしてのＣＺＥの使用を提供する。特に、前記使用は組換えヒトエリスロポエチンの規定アイソフォーム組成物を産生する際に有利な使用され得る。よって、本発明はグリコシル化タンパク質またはポリペプチド、特に組換えヒトエリスロポエチンの規定アイソフォーム組成物の産生方法を含み、その方法は、グリコシル化タンパク質またはポリペプチドのアイソフォームを１つ以上含むサンプル（クロマトグラフィー精製ステップのフラクションであり得る）をＣＺＥを用いて分析し、所望により、特に前記グリコシル化タンパク質またはポリペプチドのアイソフォームが組換えヒトエリスロポエチンのアイソフォームである場合に前記グリコシル化タンパク質またはポリペプチドの所望アイソフォームを含むサンプルをプールすることを含む。

更に、前記方法は、剪断応力及び細胞溶解を減じ、残留プロテアーゼが不活性で産物に対して有害でない条件を用いることにより一次分離中に非常に低量の細胞プロテアーゼのみを遊離するように設計されている。これは、まず細胞を無傷に保つように気密的に設計されたディスクスタック遠心機を用いて細胞分離し、次いで中性ｐＨで作動するアニオン交換クロマトグラフィーを用いる捕捉ステップにより達成される。ｐＨが６以下ならば、内因性低ｐＨ活性プロテアーゼにより開裂が生ずるであろう。

最後に、下流プロセシング（ＤＳＰ）における幾つかのステップはウイルス除去及び／または不活化においてロバストである。これは、ウイルス汚染は妨げられ得ないので哺乳動物細胞由来治療薬にとって重要な要件である。ナノ濾過はパルボウイルスのような非常に小さな非外被ウイルスを除去するのに特に役立つ。逆相クロマトグラフィー中及び／またはその後に溶媒に暴露させることも別のロバストなステップであり、これにより外被ウイルスが不活化される。

従って、本発明は、宿主細胞を含む細胞培養培地から組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈＥｐｏ）を回収及び精製する方法を提供し、その方法は、
（ａ）（ｉ）遠心後デプス濾過ステップ、（ｉｉ）デプス濾過ステップ及び（ｉｉｉ）遠心からなる群から選択される手順を実施して、細胞培養培地から宿主細胞、細胞成分及び破片を除去し清澄化培地上清を得るステップ、
（ｂ）前記上清の伝導率を５ｍＳ／ｃｍ以下、ｐＨを約７．０〜８．０に調節するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）からの上清をアニオン交換クロマトグラフィー媒体を含むカラムに適用し、前記カラムを洗浄し、前記カラムからｒｈＥｐｏを溶離し、１つ以上のｒｈＥｐｏ含有ピークフラクションを収集するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）からの合わせたピークフラクションに、中圧（＜１０バール）で操作可能であり且つ高濃度のＮａＯＨに対して耐性である樹脂を用いる逆相クロマトグラフィーステップを施し、有機溶媒の直線勾配を用いてｒｈＥｐｏを溶離させるステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）で溶離した１つ以上のｒｈＥｐｏ含有フラクションをアニオン交換クロマトグラフィー媒体を含むカラムに適用し、前記カラムを洗浄し、直線塩勾配を用いてｒｈＥｐｏを溶離させるステップ、
（ｆ）ステップ（ｅ）で溶離した１つ以上のｒｈＥｐｏ含有フラクションをｒｈＥｐｏのシアリル化度に基づいて選択するステップ、及び
（ｇ）ステップ（ｆ）で溶離した１つ以上のｒｈＥｐｏ含有フラクションにゲル濾過媒体を用いるサイズ排除クロマトグラフィーステップを１回以上施して存在し得る二量体以上の多量体凝集物を除去し、ｒｈＥｐｏ含有溶離物を収集するステップ
を含む。

ステップ（ａ）における遠心をディスクスタック分離機を用いて実施することが好ましい。

好ましい実施態様では、ステップ（ｂ）の伝導率を２〜５ｍＳ／ｃｍ、好ましくは約３ｍＳ／ｃｍに調節する。

有利には、ステップ（ｃ）で用いるアニオン交換媒体はＢｉｏＳｅｐｒａから入手可能なセラミックを主成分とするイオン交換媒体Ｑ−ＨｙｐｅｒＤ Ｆ（商標）である。ステップ（ｄ）で用いる樹脂は有利には約０．５ＭのＮａＯＨ濃度に耐性の樹脂である。ポリスチレン樹脂が好ましく、有利にはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なＳｏｕｒｃｅ ３０ＲＯＣ（商標）である。一方、ステップ（ｅ）で用いるアニオン交換媒体としてはセファロースアニオン交換クロマトグラフィー媒体が好ましく、有利にはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（商標）である。ステップ（ｇ）で用いるゲル濾過媒体としてはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（商標）が好ましい。

好ましい実施態様では、ステップ（ｄ）の前に、ステップ（ｃ）からのピークフラクションを好ましくは組み合わせてもよいが、このピークフラクションに硫酸アンモニウムステップを施して汚染宿主細胞タンパク質を沈殿させる。次いで、上清の硫酸フンモニウム濃度をステップ（ｄ）に適合する濃度に調節する。ステップ（ｄ）の逆相カラムに充填する前の前記硫酸アンモニウム濃度は好ましくは０．２４Ｍ未満である。

典型的には、ｐＨをステップ（ｂ）で約ｐＨ７．５に調節する。好ましくは、ステップ（ｃ）の洗浄はＮａＣｌのような塩を含む適当な水性緩衝液（例えば、トリス緩衝液）を用いて実施する。好ましい実施態様では、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．５）を用いる。同様に、溶離はＮａＣｌのような塩を含む適当な水性緩衝液（例えば、トリス緩衝液）を用いて実施する。ステップ（ｃ）の溶離ステップは通常１００ｍＭ〜１Ｍ、特に１２５ｍＭ以上、好ましくは１５０ｍＭの塩濃度を有する緩衝液を用いて実施する。好ましい実施態様では、この溶離ステップで１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．５）を用いる。ステップ（ｄ）の有機溶媒は、好ましくはアセトニトリル、エタノール及びヘキシレングリコール（すなわち、２−メチル−２，４−ペンタンジオール）からなる群から選択され、アセトニトリルが最も好ましい。エリスロポエチン含有フラクションを逆相クロマトグラフィーにかける前に、前記フラクションを有機溶媒、好ましくはアセトニトリルを含む水性緩衝液（例えば、２０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．０））で希釈する。希釈したフラクションを逆相カラムにかけた後、カラムを有機溶媒、好ましくはアセトニトリルを含む水性緩衝液（例えば、２０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．０））で洗浄することが好ましい。ステップ（ｄ）では、Ｅｐｏポリペプチドを有機溶媒濃度を約１０％から約１００％へ直線勾配させて溶離させることが好ましい。特に好ましい実施態様では、ステップ（ｄ）でアセトニトリル濃度を通常約２５％から５０％へ直線勾配させて溶離させる。ステップ（ｅ）での直線塩勾配は通常０ｍＭから３００ｍＭである。好ましくは、ステップ（ｃ）及び（ｅ）の塩はＮａＣｌである。

本発明の１実施態様では、ステップ（ｄ）で溶離した、有機溶媒、好ましくはアセトニトリルを含むフラクションを以下のアニオン交換クロマトグラフィーステップと適合する適当な水性緩衝液で希釈する。ウイルス汚染物を不活化するために、ステップ（ｅ）の前に希釈したフラクションをウイルス汚染物を所望通り不活化するのに十分な適当な時間放置する。例えば、前記フラクションをその容量の半分の水性緩衝液、特に２０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で希釈し、少なくとも約２０分〜約４０分間またはそれ以上の時間インキュベートし、その後更にフラクションの元の容量の３．５倍容量の水性緩衝液で希釈し得る。

本発明の好ましい実施態様では、ステップ（ａ）において手順（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の後に滅菌濾過ステップを実施する。典型的には、これは０．２μｍ濾過ユニットを用いて実施する。

本発明の更なる実施態様では、本発明の方法中クロマトグラフィーカラム由来のフラクションを特に濃縮するために限外濾過ステップにかけてもよい。従って、好ましい実施態様では、ステップ（ｇ）において前記フラクションを限外濾過ステップにかけた後サイズ排除クロマトグラフィーステップにかける。別の好ましい実施態様では、ステップ（ｄ）では前記フラクションを限外濾過ステップにかけた後逆相クロマトグラフィーにかける。同様の好ましい実施態様では、本発明の方法が上記した硫酸アンモニウム沈殿ステップを含むならば、ステップ（ｃ）からのピークフラクションを単独でまたは合わせて限外濾過ステップにかけた後硫酸アンモニウム沈殿ステップにかける。好ましくは、本明細書に記載した３つの限外濾過ステップのすべてを本発明の方法で用いる。例えば、５〜１０ｋＤａ（例えば、１０ｋＤａ）、好ましくは５ｋＤａのカットオフを有する膜を限外濾過方法で用いる。

好ましい実施態様では、ステップ（ｇ）の前または後、好ましくはステップ（ｇ）の後にウイルスを除去するために全量ナノ濾過ステップを含める。ユニットとしては、Ｐｌａｎｏｖａ １５Ｎ（Ａｓａｈｉ）、ＰＡＬＬ Ｕｌｔｉｐｏｒ ＶＦ Ｇｒａｄｅ ＤＶ２０またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ ＮＦＰカートリッジまたはカプセルが例示される。

上記したように、精製ステップ中に好ましいアイソフォームを選択できることが望ましく、これは本発明の精製方法を用いて達成され得る。特に、各種アイソフォームが逆相クロマトグラフィーステップ及び第２アニオン交換クロマトグラフィーステップの間に分離されるので達成され得る。各種フラクションの含量はインプロセスコントロールとして細管ゾーン電気泳動により測定され、適当ならば選択したフラクションを合わせたり、捨ててもよい。本発明の好ましい実施態様では、上記したステップ（ｆ）の選択手順、またはステップ（ｄ）とステップ（ｅ）の間の選択手順の１つ以上を上に概説した細管ゾーン電気泳動を用いて実施する。

本発明では、本明細書に記載した好ましいまたは特に好ましい実施態様は相互に組み合わせることができ、これにより更なる好ましい実施態様が構成される。

よって、好ましい実施態様では、本発明は収集した細胞培養物から組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈＥｐｏ）を回収及び精製するための方法を提供し、その方法は、
（ａ）（ｉ）ディスクスタック分離機を用いる遠心後デプス濾過ステップ、（ｉｉ）デプス濾過ステップ及び（ｉｉｉ）ディスクスタック分離機を用いる遠心からなる群から選択される手順を実施して細胞培養培地から細胞培養物を収集し、宿主細胞、細胞成分及び破片を除去し、その後０．２μｍ濾過ステップを実施して、清澄化培地上清を得るステップ、
（ｂ）前記上清の伝導率を５ｍＳ／ｃｍ以下、ｐＨを約７．０〜８．０に調節するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）からの上清をＱ−ＨｙｐｅｒＤ Ｆを充填したアニオン交換カラムに適用し、前記カラムを洗浄し、前記カラムからｒｈＥｐｏを溶離させ、１つ以上のｒｈＥｐｏ含有ピークフラクションを収集するステップ、
（ｄ）ステップ（ｃ）からの合わせたピークフラクションに、中圧（＜１０バール）で操作可能であり且つＮａＯＨ ＣＩＰ条件に対して耐性であるポリスチレン樹脂、例えばＳｏｕｒｃｅ ３０ＲＰＣを用いる逆相クロマトグラフィーステップを施し、直線勾配のアセトニトリルを用いてｒｈＥｐｏを溶離させるステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）で溶離した１つ以上のｒｈＥｐｏ含有フラクションをｒｈＥｐｏのシアリル化度に基づいて選択し、前記フラクションをＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰを充填したアニオン交換カラムに適用し、前記カラムを洗浄し、直線塩勾配を用いてｒｈＥｐｏを溶離させるステップ、
（ｆ）ステップ（ｅ）で溶離した１つ以上のｒｈＥｐｏ含有フラクションをｒｈＥｐｏのシアリル化度に基づいて選択し、存在し得る二量体以上の多量体凝集物を除去するために前記フラクションをＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅを用いるサイズ排除クロマトグラフィーにかけ、ｒｈＥｐｏ含有溶離物を収集するステップ
を含む。

好ましくは、ステップ（ｄ）及びステップ（ｅ）で得られた１つ以上のフラクションが更なるクロマトグラフィー精製のためにそれぞれステップ（ｅ）及び／またはステップ（ｆ）で選択すべきかの決定は細管ゾーン電気泳動により実施する。ガイダンスとして、ｒｈＥｐｏの高グリコシル化形態はＲＰＣステップの溶離ピークの前半部分に存在するのに対して、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰステップでは、高度にグリコシル化／シアリル化したアイソフォームは溶離ピークの後半部分に存在することが判明した。上に概説したように、好ましい実施態様では、ステップ（ｄ）の前に、ステップ（ｃ）からの合わせたピークフラクションを硫酸アンモニウム沈殿ステップにかけて、汚染宿主細胞タンパク質を沈殿させ、その後上清の硫酸アンモニウム濃度をステップ（ｄ）に適合する濃度に調節する。好ましくは、前記硫酸アンモニウム濃度は０．２４Ｍ未満である。また、本発明の好ましい方法が更にステップ（ｆ）の前または後、好ましくはステップ（ｆ）の後にウイルスを除去するためにデッドエンド（ｄｅａｄ−ｅｎｄ）ナノ濾過ステップを含むことが好ましい。

精製手順に対するソース材料に関して、宿主細胞を無血清培地で培養することが好ましい。宿主細胞を非連続流加発酵方法を用いて培養することも好ましい。特に、宿主細胞は組換えヒトエリスロポエチンを発現し、このエリスロポエチンを培地に分泌させ得る。宿主細胞は通常哺乳動物細胞である。好ましい宿主細胞はＣＨＯ細胞である。

また、本発明は、本発明の方法により産生された精製組換えヒトエリスロポエチンを含む組成物も提供する。更に、本発明は本発明の方法により得られ得る精製組換えヒトエリスロポエチン及び前記精製エリスロポエチンを含む組成物、特に医薬組成物も提供する。

好ましくは、前記組成物はｒｈＥｐｏのグリコシル化／シアリル化アイソフォームを規定量含む。これは、逆相クロマトグラフィーステップ及び第２アニオン交換クロマトグラフィーステップ中に各種形態が分離されることから達成され得る。各種フラクションの含量はインプロセスコントロールとして細管ゾーン電気泳動により測定され得、適当ならば選択したフラクションを組合せても捨ててもよい。特に、溶離ピークの前半部分をＲＰＣステップからプールする。なぜならば、この部分に高グリコシル化形態が存在するからである。対照的に、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰステップの溶離ピークの後半部分は通常高度にグリコシル化／シアリル化されたアイソフォームを含む。

発現され、本発明の方法を用いて精製される組換えポリペプチド、特にＥｐｏを含む組成物において、前記組換えポリペプチドは少なくとも９０％、９５％、９９％または９９．５％の純度を有するように実質的に純粋であることが好ましい。

精製タンパク質の生物活性はインビトロ及び／またはインビボで測定され得る。適当なインビトロ試験はＨａｍｍｅｒｌｉｎｇら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．，１４（１１）：１４５５−６９（１９９６）に記載されており、この試験は赤血球細胞株の増殖刺激について調べることを含む。適当なインビボ試験は上掲のＧｈａｎｅｍらに記載されており、この試験は赤血球増加症マウスの赤血球への^５９Ｆｅの取り込みを測定することを含む。

好ましい態様で、本発明は、（ａ）（ｉ）当該組換えポリペプチドをコードする第１ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）選択マーカーをコードし、宿主細胞を選択剤と接触させたときに増幅される第２ヌクレオチド配列を含む第１ポリヌクレオチドベクターと（ｂ）第２ヌクレオチド配列が異なる選択マーカーをコードする第３ヌクレオチド配列で置換されている以外は本質的に第１ポリヌクレオチドベクターと同一のヌクレオチド配列を有する第２ポリヌクレオチドベクターとが宿主細胞のゲノムに取り込まれている宿主細胞と核酸ベクターを用いて実施され得る。

宿主細胞は、好ましくは哺乳動物細胞であり、より好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。

好ましくは、第２ヌクレオチド配列はジヒドロ葉酸還元酵素ポリペプチドをコードし、選択剤はメトトレキサートである。好ましくは、当該組換えポリペプチドはヒトエリスロポエチンである。前記系は本明細書の実施例の欄に記載されている。

有利には、細胞は、（ａ）当該組換えポリペプチドをコードし且つ宿主細胞において前記組換えポリペプチドを発現させるヌクレオチド配列を含む宿主細胞を用意し、（ｂ）(i)水、植物由来ペプトン、浸透圧調節剤、緩衝剤、エネルギー源、アミノ酸、脂質源または前駆体、鉄源、非鉄金属イオン、及び１つ以上のビタミン及びコファクターを含み且つ(ii)完全長ポリペプチドを含まない無血清培養培地を用意し、（ｃ）前記宿主細胞を前記培地において当該組換えポリペプチドを発現させる条件下で培養することにより培養される。

好ましくは、当該組換えポリペプチドはヒトエリスロポエチンである。宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であり得る。前記方法は本明細書の実施例の欄に記載されている。

特記しない限り、本明細書で使用した技術及び科学用語はすべて（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術及び生化学の）当業者が通常理解しているのと同じ意味を有する。分子、遺伝子及び生化学的方法（一般的には、援用により本明細書に含まれるとする、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング：実験マニユアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」，第２版，ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバーに所在のＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行；Ａｕｓｕｂｅｌら，「分子生物学におけるショートプロトコール(Short Protocols in Molecular Biology)」，第４版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９９年）発行の「分子生物学における現在のプロトコル」と題する完全バージョン参照）及び化学的方法に対して一般的方法が使用される。

本発明を下記実施例を参照して更に説明する。これらの実施例は例示にすぎず、非限定的である。特に、実施例は本発明の好ましい実施態様に関する。

（実施例）
材料
［宿主細胞株］
ジヒドロ葉酸還元酵素欠乏チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６）。ブダペスト条約に基づいて米国メリーランド州ロックビルに所在のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に２００１年８月２９日にＡＴＣＣ ＰＴＡ−３６７２で寄託されている。

［細胞培養培地］
培養培地：４ｍＭ Ｌ−グルタミン，１０％ ＦＣＳ及び１× ＨＴ（ヒポキサンチンチミジン）を補充したＤＭＥＭ。

選択培地：４ｍＭ Ｌ−グルタミン，１０％ 透析ＦＣＳ及び０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を補充したＤＭＥＭ。

増幅培地：４ｍＭ Ｌ−グルタミン，１０％ 透析ＦＣＳ，０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８及び４．８×１０^−８Ｍ〜１．５４×１０^−６Ｍ ＭＴＸ（メトトレキサート）を補充したＤＭＥＭ。

凍結培地：４ｍＭ Ｌ−グルタミン，１０％ ＦＣＳ及び１０％ ＤＭＳＯを補充したＤＭＥＭ。

組換え細胞株のための無血清適応培地：６ｍＭ Ｌ−グルタミン，０．２５％ 大豆ペプトン／ＵＦ，１× ハイブリドーマ補充物，０．１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ−Ｆ６８、０．５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８及び１．５４×１０^−６Ｍ ＭＴＸを補充したＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（１：１）。

無血清産生培地：０．２５％ 大豆ペプトン／ＵＦ，１× ハイブリドーマ補充物，０．１％ ルトロール，１．５４×１０^−６Ｍ ＭＴＸ，１ｇ／Ｌ グルコース及び２．５ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ_３を補充したＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（１：１）。

組換え細胞株のための無血清凍結培地：ＰＢＳ，２０％ ＰＶＰ−１０，５％ ＤＭＳＯ。

ハイブリドーマ補充物：１００× ２．５×１０^−３Ｍ エタノールアミン，２．５×１０^−２Ｍ クエン酸第二鉄，２．０×１０^−３Ｍ Ｌ−アスコルビン酸、５．０×１０^−６Ｍ 亜セレン酸ナトリウム。

［プラスミド構築物］
ｐＥｐｏ／ｎｅｏ：このプラスミドは、それぞれＳＶ４０初期プロモーター／ターミネーター配列の制御下で２つの異なる発現カセットとしてＥｐｏのコード領域及びネオマイシン耐性遺伝子をコードする。構築の詳細は実施例１に示す。

ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ：このプラスミドは、それぞれＳＶ４０初期プロモーター／ターミネーター配列の制御下で２つの異なる発現カセットとしてＥｐｏのコード領域及びｄｈｆｒをコードする。構築の詳細は実施例２に示す。

細胞培養方法
［ＣＨＯ−ｄｈｆｒ⁻の増殖］
ジヒドロ葉酸還元酵素欠乏ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂら，ＰＮＡＳ，７７（７）：４２１６−４２２０（１９８０））（ＣＨＯ ｄｈｆｒと称する）をＤＭＥＭ培養培地において１週間に２回１：１０の分裂比で培養する。

［ＣＨＯ細胞のトランスフェクション］
リポフェクチントランスフェクションを実施する前日に２５ｃｍ^２容量のＴフラスコボトルまたは９６ウェルプレートに１〜５×１０^４細胞／ｃｍ^２を接種する。対応プラスミドを適当な比で混合し、０．５〜１μｌ／ｃｍ^２のリポフェクチン試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を製造業者のプロトコルに従って添加する。次いで、無血清ＤＭＥＭにおいて細胞にトランスフェクションカクテルを４〜１６時間載せた後ＤＮＡ含有培地を培養培地と交換する。血清含有培地において２４〜４８時間培養した後、細胞を選択培地に移す。トランスフェクトした細胞プールをまず選択培地において集密まで培養し、次いで増幅培地（４．８×１０^−８Ｍ ＭＴＸ）において培養した後細胞培養上清をＥＬＩＳＡによりＥｐｏ産生についてスクリーニングする。最高手順を決定し、ＭＴＸ濃度を２倍に上昇させ、最良の手順を更なる培養のために使用する。

分析方法
各種マトリックスにおけるＥｐｏを検出するＥＬＩＳＡ
（抗体）
ポリクローナル血清：家兎抗Ｅｐｏビオチニル化（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号ＡＢ−２８６−ＮＡ）；
モノクローナル抗体：マウス抗Ｅｐｏ（Ｇｅｎｅｚｙｍｅ；カタログコードＡＥ７Ａ５）。

（ＥＬＩＳＡ緩衝液）
コーティング緩衝液：８．４ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ_３，４．２ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＣＯ_３，ｐＨ９．６−９．８；
洗浄緩衝液：０．２ｇ／Ｌ ＫＣｌ，１．１５ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ，０．２ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４，８ｇ／Ｌ ＮａＣｌ，０．１％ ツイーン２０；
希釈緩衝液：洗浄緩衝液中２％ ＰＶＰ（Ｓｉｇｍａカタログ番号ＰＶＰ−４ＯＴ）；
サンプル緩衝液：希釈緩衝液中０．５％ α−モノチオグリセロール；
染色緩衝液：７．３ｇ／Ｌ クエン酸・２Ｈ_２Ｏ，１１．８６ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ，ｐＨ４．８−５．０；
染色溶液：１００μｌ ＯＰＤ溶液／１０ｍｌ 染色緩衝液、５μｌ Ｈ_２Ｏ_２／１０ｍｌ 染色緩衝液；
ＯＰＤストック溶液：ＰＰ：Ｌ００１７。

（方法）
使用したＥＬＩＳＡ方法はｎｇ／ｍｌ濃度範囲でＥｐｏを、特に約１０ｎｇ／ｍｌの範囲の検出限界で、５００ｎｇ／ｍｌから始めて８回倍数希釈で検出する。Ｅｐｏの最初の２６アミノ酸に対する１つのモノクローナル抗体はＥｐｏを結合するコーティング層として機能する。次のステップで、Ｅｐｏは捕捉抗体に特異的に結合する。ビオチニル化Ｅｐｏ認識家兎抗血清を用いて検出する。ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼをプレートにカップリングした後ＯＰＤで染色することにより可視化する。

イムノフルオレッセンス
Ｅｐｏ発現ＣＨＯ細胞を６ウェルプレートのカバーガラス上に５×１０^４細胞／２００μｌで接種し、２４〜７２時間インキュベートする。付着細胞をＰＢＳで２回洗浄し、−２０℃メタノールで５分間固定し、風乾した後ＰＢＳ中に再び浸す。ＰＢＳ中２０％ ＦＣＳと１５分間インキュベートすることにより非特異的タンパク質を飽和した後、抗−Ｅｐｏを１時間インキュベートする。反応物をコンジュゲートした抗−マウスＩｇＧ ＦＩＴＣを用いて可視化する。フルオレッセンスを４８８ｎｍの励起波長及び５１５ｎｍ以上の発光波長で共焦点顕微鏡により検出する。

核サイズ測定
（材料）
Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ（登録商標）モデルＺＭ（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｉｎｃ．）；
Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｈａｎｎｅｌｙｚｅｒ（登録商標）モデル２５６；
インキュベーション溶液；０．１Ｍ クエン酸，２％ トリトンＸ １００；
Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ Ｉｓｏｔｏｎ ＩＩ（カタログ番号８４４ ８０１１；Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｕｒｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＧｍｂＨ）。

Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒは電導性流体中に懸濁されている粒子をサイズ及び数の点で定量する。前記流体は両側に電極を有している毛細管を介して真空により吸着される。抵抗の変化により、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｈａｎｎｅｌｉｚｅｒによりデジタル化され得る電圧インパルスが誘導される。核サイズは細胞のＤＮＡ含量に相関し、染色体の二倍体及び多倍体を区別することができる。

（方法）
約１×１０^６ＣＨＯ細胞をＰＢＳで１回洗浄し、インキュベーション溶液（２ｍｌ）中に再懸濁し、４〜５時間放置する。以下のステップはＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒに特有である。

ＳＤＳポリアクリルアミド−電気泳動及びウェスタンブロッティング
（材料）
ＳＤＳゲル：４〜２０％ Ｎｏｖｅｘトリス−グリシン；
サンプル緩衝液：トリスグリシンＳＤＳ ２×（Ｎｏｖｅｘ ＬＣ２６７６）；
ランニング緩衝液：トリスグリシンＳＤＳ（Ｎｏｖｅｘ ＬＣ２６７５）；
ブロッティング緩衝液：５０ｍＭ Ｎａ_２Ｂ_４Ｏ_７・１０Ｈ_２Ｏ，０．１％ ＳＤＳ，２０％ メタノール；
ブロッティングマトリックス：ＰＶＤＦ Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ ０．４５μＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｋ８ＪＭ８２３８Ｈ）；
洗浄緩衝液：ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液参照；
希釈緩衝液：洗浄緩衝液中１％ 粉乳；
検出緩衝液：０．１Ｍ ＮａＣｌ，０．１Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）。

（方法）
Ｅｐｏを含むサンプルを１％ α−ＭＴＧ含有１×サンプル緩衝液中で３０ｎｇ／２０μｌに調節し、ＳＤＳゲルに適用する。ランニング後、タンパク質をＰＶＤＦ Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ膜に２時間ブロッティングし、Ｅｐｏの最初の２６アミノ酸を検出するモノクローナル抗体を用いてＥｐｏを特異的に染色する。アルカリホスファターゼにコンジュゲートした抗−マウスＩｇＧ及びＮＢＴ／ＢＣＩＰ染色により可視化する。

等電点電気泳動
（材料）
システム：Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ ＩＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；
ＩＰＧゲル：ｐＨ２．５−７；
再膨潤緩衝液：９ｇ 尿素，０．５ｇ ＣＨＡＰＳ，０．０４ｇ ＤＴＥ，０．５ｍｌ ｒｅｓｏｌｙｔｅｓ（ｐＨ３．５−１０），１０μｌ ブロモフェノールブルー（０．１％）、Ｈ_２Ｏで２５ｍｌに調節；
サンプル緩衝液：６２５μｌ Ｈ_２Ｏ中２５μｌ ＩＰＧサンプル緩衝液（ｐＨ３−１０）；
ブロッティング緩衝液：２．９３ｇ グリシン，５．８１ｇ トリス，２０ｍｌ メタノール，０．３７５ｇ ＳＤＳ、Ｈ_２Ｏで１０００ｍｌに調節；
ブロッティングマトリックス：ＰＶＤＦ Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ ０．４５μＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｋ８ＪＭ８２３８Ｈ）；
洗浄緩衝液：ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液参照；
希釈緩衝液：洗浄緩衝液中１％ 粉乳；
検出緩衝液：０．１Ｍ ＮａＣｌ，０．１Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）。

（方法）
Ｅｐｏを含有するサンプルを５００〜１０００ｍｇ／５０μｌに調節し、脱塩し、サンプル緩衝液で１：１希釈し、再膨潤ＩＰＧゲルに適用する。ランニング条件は最初３００Ｖで１分間、その後３５００Ｖまで直線的に上昇させ、最後に３５００Ｖで１時間とする。全電気泳動中、１０ｍＡ及び１０Ｗの限界を設定する。その後、タンパク質を一晩拡散するかまたはエレクトロブロッティングすることによりＰＶＤＦ Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ膜にブロッティングし、その後Ｅｐｏの最初の２６アミノ酸を検出するモノクローナル抗体を用いてＥｐｏを特異的に染色する。コンジュゲートした抗−マウスＩｇＧ Ａｐ及びＮＢＴ／ＢＣＩＰ染色により可視化する。

ＤＮＡ含量の測定
組換え細胞株のＤＮＡ含量をＦＡＣＳ分析によりＣＨＯ−ｄｈｆｒ⁻宿主細胞株と比較する。

（材料）
洗浄緩衝液：０．１Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），２ｍＭ ＭｇＣｌ_２，０．１％ トリトン Ｘ１００；
染色緩衝液：洗浄緩衝液中０．３μｇ／ｍｌ ＤＡＰＩ（Ｈｏｅｃｈｓｔ）。

（方法）
５×１０^５細胞をＰＢＳで洗浄し、氷冷７０％ エタノールで固定する。次いで、細胞を洗浄緩衝液で２回洗浄した後室温において染色緩衝液中で３０分間インキュベートする。ＤＮＡ含量をＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて３５９ｎｍの励起波長及び４５０ｎｍの発光波長で測定する。

インビトロ特異性試験
ヒト赤白血病細胞株ＴＦ−１（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）をＩＬ３またはｈＧＭ−ＣＳＦ依存的に増殖させる。前記サイトカインは増殖に対して相乗的効果を示したのに対して、Ｅｐｏは一時生存度を維持し得る。前記細胞をＧＭ−ＣＳＦ及びＥｐｏを含有する培養培地において通常通り培養する。

（試験補充物）
培養培地：４ｍＭ Ｇｌｎ，１０％ ＦＣＳ，２０μｇ／ｍｌ トランスフェリン，１０μＭ β−メルカプトエタノール，１２ｎｇ／ｍｌ ｒｈＧＭ−ＣＳＦ，３Ｕ／ｍｌ ｒｈＥｐｏを補充したＲＰＭＩ １６４０；
試験培地：４ｍＭ Ｇｌｎ，１００μｇ／ｍｌ トランスフェリン，２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを補充したＲＰＭＩ １６４０。

（方法）
機能性試験を９６ウェルプレートにおいてＭＴＴ生存度として実施する（Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．，１４（１１）：１４５５−６９（１９９６））。サンプルを試験培地１ｍｌ中１００ｎｇ Ｅｐｏから始めて８回倍数希釈する。５０μｌの各サンプル希釈物、標準希釈物またはブランクを９６ウェル試験プレートに移す。ＴＦ−１細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、試験培地１ｍｌ中２×１０^５細胞に調節する。９６ウェル試験プレートの各ウェルに細胞懸濁液（５０μｌ）を載せ、前記細胞をＣＯ_２インキュベータにおいて７２時間放置する。次いで、１０μｌのＭＴＴ溶液（ＰＢＳ１ｍｌ中６ｍｇ）を添加し、３７℃において４時間インキュベートする。暗所において色素をＳＤＳ／ＨＣｌ（０．１Ｍ ＨＣｌ中１０％ ＳＤＳ）（１００μｌ）で更に４時間溶解し、Ｅｐｏ依存性生存度を５５０／６９０ｎｍで光度計にて測定する。

プラスミドＥｐｏ／ｎｅｏの構築
１． ｐ２−ｎｅｏの構築
（１．１） ＳＶ４０初期プロモーターを含むｐＳＶ２ｎｅｏからのベクター断片の作成
ベクター構築の土台はｐＳＶ２ｎｅｏ中に含まれるｐＢＲ３２２プラスミド骨格である。より小さいＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩ制限断片はこのｐＢＲ３２２骨格を含み、ＳＶ４０由来の隣接ＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片はＳＶ４０初期プロモーターの関連断片を有している。

プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７４１９）を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断する。生じた２つの断片は３０９２ｂｐ及び２６３７ｂｐのサイズを有している。２６３７ｂｐ断片は、ｐＢＲ３２２骨格を含むＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩ制限断片及びＳＶ４０初期プロモーターの断片を含む隣接ＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片からなる。２６３７ｂｐを作成し、ゲル電気泳動により精製する。

（１．２） ネオマイシン耐性遺伝子の作成
ｎｅｏ遺伝子をｐＳＶ２ｎｅｏのトランスポゾンＴｎ５から得る。この遺伝子を遺伝子のコード領域のみを含む断片として増幅させる。クローニング戦略の一部として、制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位を両末端に導入する。ＨｉｎｄＩＩＩ部位は上流増幅プライマー中に構築し、ＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩ部位は下流プライマー中に構築する。増幅領域はｐＳＶ２ｎｅｏ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ０２４３４）の配列中のヌクレオチド２８４６〜１９３８に対応する。このオリゴヌクレオチドを以下のように設計する。

プライマー２００４−０１及び２００４−０２の増幅産物をＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いるＰＣＲにより作成する。このプロセスのパラメーターは、供給された緩衝液中２０ｎｇのｐＳＶ２ｎｅｏ、１０ｐｍｏｌの各プライマー、１０ミリモルのｄＮＴＰｓ及び２．５ＵのＰｗｏポリメラーゼ、総容量は５０μｌとし、温度プロフィールは５分×９５℃、３５回（３０秒×９５℃，２０秒×６５℃，９０秒×７２℃）、３分×７２℃、次の使用まで４℃に冷却する。

生じた９３５ｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡ単離カラム（Ｍｉｎｉ，Ｗｉｚａｒｄ Ｐｒｏｍｅｇａ ＧｍｂＨ）により精製し、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲルにより精製し、Ｓｐｉｎカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ）を用いて溶離させる。

（１．３） ｐ１−ｎｅｏの構築
増幅したＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ｎｅｏ遺伝子断片をｐＳＶ２−ｎｅｏ由来のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩベクター断片にＬｉｇａｔｉｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてライゲートし、大腸菌宿主（大腸菌ＳＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に形質転換する。形質転換体を５０ｍｇ／Ｌ アンピシリンを補充したＬＢ培地で増殖させることにより選択する。

プラスミドＤＮＡをクローンから単離し、ＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩ（それぞれ２５２７ｂｐ、７８０ｂｐ及び２５１ｂｐの３断片）を用いる制限酵素分析によりチェックする。予想断片を示すプラスミドＤＮＡを構築物の該当部分の配列を決定することにより更にチェックする。実証されたＳＶ４０初期プロモーター及びネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドＤＮＡをｐ１−ｎｅｏと呼称する。

（１．４） ＳＶＳ終止領域ＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳの作成
ｐＳＶ２ｎｅｏ中に存在するＳＶ４０終止領域の断片（ヌクレオチド７５１〜１５９８）を増幅させるようにＰＣＲプライマーを設計する。上流プライマーはＳｐｅＩに対する制限部位をも含む。ｐＳＶ２−ｎｅｏの７５１位に既に含まれるＢａｍＨＩ部位に加えて、ＥｃｏＲＩ部位をＢａｍＨＩから６ヌクレオチドスペース領域だけ離れた下流プライマーに導入する。２つのプライマーの配列は以下の通りである。

プライマー２００４−０５＋２００４−０６の増幅産物は上記したようにＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いるＰＣＲにより作成する。生じた８７３ｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡ単離カラムを用いて精製し、ＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩで消化し、ゲル精製する。

（１．５） ｐ２−ｎｅｏの作成
ｐ１−ｎｅｏプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ＋ＳｐｅＩで消化する。生じた直線化断片を精製し、ＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳを含む増幅断片とライゲートし、大腸菌宿主に形質転換する。形質転換体を５０ｍｇ／Ｌ アンピシリンを補充したＬＢ培地で増殖させることにより選択する。

プラスミドＤＮＡをクローンから単離し、ＥｃｏＲＩ（４４１１ｂｐの１断片）、ＮｃｏＩ（３６３１ｂｐ及び７８０ｂｐのサイズの２断片）及びＳｐｅＩ（３４９９ｂｐ、８４０ｂｐ及び７２ｂｐのサイズの３断片）を用いる制限酵素分析によりチェックする。構築物の関連部分の配列を決定することにより予想断片を示すプラスミドＤＮＡを更にチェックする。実証されたＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳを含むプラスミドＤＮＡをｐ２−ｎｅｏと呼称する。

２． プラスミドｐ３の構築
（２．１） ＳＶ４０初期プロモーター断片の作成
プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏをＳＶ４０初期プロモーター断片のソースとして使用する。この断片のサイズはｐ２プラスミドを構築する際に使用したものとほぼ同一である。しかしながら、前記断片の末端はＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩに対する認識部位を導入するように修飾されている。プロモーターを増幅するために使用したオリゴヌクレオチドプライマーは以下のように設計する。

プライマー２００４−０７＋２００４−０８の増幅産物は上記したようにＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いるＰＣＲにより作成する。生じた３６５ｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡ単離カラムを用いて精製し、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化し、ゲル精製する。

（２．２） ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター部分の作成
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋ＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩを用いて順次制限する。ＤＮＡをアルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化する。ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ断片を小断片からアガロースゲル電気泳動により精製した後、ライゲートする。

（２．３） プラスミドｐ３の作成及び検証
ＳＶ４０初期プロモーターを含む増幅ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片を、作成したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋ベクターにＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＧｍｂＨ）を用いてライゲートする。大腸菌ＳＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）形質転換体由来のプラスミドＤＮＡを単離し、１００ｍｇ／Ｌ アンピシリンを補充したＬＢ培地を用いてコロニーから精製する。

生じたＤＮＡをＥｃｏＲＩ＋ＮｃｏＩ（３０３９ｂｐ及び２５３ｂｐのサイズの２断片）を用いる制限酵素分析によりチェックする。

予想断片を示す２つのプラスミドＤＮＡを更に配列決定によりチェックする。各位置を実証できるようにＳＶ４０初期プロモーターの２つの鎖を配列決定する。このプラスミドをｐ３と呼称する。

３． ヒトＥｐｏ ｃＤＮＡの単離
（３．１） ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬を用いる総ＲＮＡの単離
Ｌａｉｎｚｅｒ Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓ病院から得たヒト腎臓組織からＥｐｏ ＲＮＡを単離するために使用するＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬はフェノールとグアニジンイソチアシネートの単相溶液である。細胞溶解中、グアニジンイソチアシネートはＲＮＡと水溶性複合体を形成するが、その間に細胞は破壊される。クロロホルムを添加した後遠心すると、溶液をＲＮＡ含有水性相及び有機相に分離する。水性相を分離した後、ＲＮＡをイソプロピルアルコールで沈殿させ、エタノールで洗浄し、風乾し、ＲＮＡａｓｅ非含有水中に再懸濁する。

ヒト腎臓組織断片を小片に切断し、１００μｍ細胞ストレーナに通し、１７９×ｇで１０分間遠心し、生じたペレットをＰＢＳで３回洗浄する。次いで、ペレットをＰＢＳ中に再懸濁し、滅菌チューブに分取し、−１９６℃に凍結し、次に使用するまで−８０℃で保存する。

凍結した組織をＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（１ｍｌ）を添加することにより溶解し、ホモジナイズし、完全に解離させるために１５〜３０℃において５分間インキュベートする。クロロホルム（２００μｌ）を添加し、チューブを振とうし、１５〜３０℃において２〜３分間インキュベートした後、チューブを１２０００×ｇで１０分間遠心する。遠心後、上部水性相を新しいチューブに注意深く移し、イソプロピルアルコール（５００μｌ）と混合し、１５〜３０℃において１０分間インキュベートする。沈殿したＲＮＡを１２０００×ｇで１０分間遠心し、ペレットをエタノールで洗浄し、再び遠心し、風乾し、ＲＮＡｓｅ非含有ＤＰＥＣ水に溶解させる。総ＲＮＡ含量を２６０ｎｍで光度計にて測定する。

１ＯＤ_{２６０ｎｍ}＝４０μｇ ＲＮＡ／ｍｌ
ＯＤ_{２６０ｎｍ}及びＯＤ_{２８０ｎｍ}（タンパク質の最大吸光度）の比を調べることにより、ＲＮＡ単離物の純度を推定することができる。その範囲は１．６〜１．８の間でなければならない。

（３．２） Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）_２５を用いるｍＲＮＡ単離
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）_２５ｍＲＮＡ ＤＩＲＥＣＴキットを用いて、真核ｍＲＮＡのポリアデノシン尾ＲＮＡを表面に共有結合させたデオキシチミジレートの２５ヌクレオチド長鎖を含む超磁性ポリスチレン粒子にハイダリダイズする。磁気粒子に結合したｍＲＮＡはＤｙｎａｌ磁気粒子濃縮機（Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標））を用いて分離することができる。

洗浄緩衝液：１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），０．１５ｍＭ ＬｉＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ；
２×結合緩衝液：２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１ｍＭ ＬｉＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ。

１０μｇの総ＲＮＡにつき、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）_２５（１００μｌ）をＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）において分離し、２×洗浄緩衝液で２回洗浄する。その間、総ＲＮＡを１×洗浄緩衝液を用いて２００μｌの容量に調節し、６５℃において４分間インキュベートすることにより変性させる。次いで、ＲＮＡをビーズと混合し、室温において５分間インキュベートし、Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）において分離する。ビーズを１×洗浄緩衝液で２回洗浄する。ポリアデニル化ＲＮＡを、６５℃において溶離緩衝液（２×１０μｌ）と４分間インキュベートすることによりＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）_２５から溶離させる。ＤｙｎａｂｅａｄｓをＤｙｎａｌ ＭＰＣ（登録商標）において分離し、上清を直ちに新しいＲＮＡｓｅ非含有遠心管に移す。溶離液を直接逆転写のために使用する。

（３．３） 逆転写
Ｅｐｏの特異的プライマーは８０℃において４分間インキュベートすることにより変性し、ｍＲＮＡは６５℃において５分間インキュベートすることにより変性する。以下の成分を氷上で滅菌した１．５ｍｌ容量の微量遠心管に添加する。

インキュベーション：３７℃において６０分間；
不活化：１００℃において５分間。

（３．４） ポリメラーゼ連鎖反応
以下の成分を４℃において滅菌した１．５ｍｌ容量の微量遠心管に添加する。ＰＣＲ条件も以下にリストする。

ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分析する。

（３．５） アガロースゲル電気泳動
６×ＢＸ緩衝液：０．２５％プロモフェノールブルー，０．２５％ キシレンシアノール，３０％ グリセロール；
ＴＡＥ緩衝液：２４２ｇ トリス塩基，５７．１ｍｌ 氷酢酸，１００ｍｌ ０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、Ｈ_２Ｏで１０００ｍｌに調節；
Ｌａｍｄａ−Ｍａｒｋｅｒ ＩＩＩ：１０μｇ バクテリオファージラムダ−野生型−Ｄａｎｎ（２．５μｌ ＨｉｎｄＩＩＩ＋２．５μｌ ＥｃｏＲＩ＋２０μｌ 緩衝液Ｒ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、Ｈ_２Ｏで２００μｌまで充填；３７℃で１時間消化、６５℃で２０分間不活化、４０μｌ ＢＸ充填緩衝液を補充）。

アガロース（１ｇ）及び１×ＴＡＥ緩衝液（９９ｇ）を電子レンジで溶融し、約６０℃に冷却し、１０ｍｇ／ｍｌ 臭化エチジウムストック溶液（３μｌ）を補充する。ゲルを１×ＴＡＥ緩衝液を用い、分離しようとするＤＮＡ断片の長さに応じて１００〜３００Ｖで約３０分間流す。各レーンは６×ＢＸ緩衝液（２μｌ）と混合したサンプル（１０μｌ）を含む。Ｌａｍｄａ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化分子量標準物質との比較に基づいてＤＮＡ断片を同定する。

（３．６） ＰＣＲ産物及びライゲーション用ベクターの作成
（３．６．１） 粘着末端クローニングのためのベクターＤＮＡ及びインサートの制限
制限酵素（１０ｕｌ）及び適当な制限緩衝液を製造業者の指示に従ってベクターＤＮＡ（１μｇ）及びインサートと混合する。混合物を３７℃（Ｓｍａｌの場合には３０℃）で使用した酵素、ベクター及びインサートに応じて３０〜６０分間インキュベートする。次いで、酵素を６５℃まで１０分間加熱することにより不活化し、反応化合物をアガロースゲル電気泳動により分析する。

（３．６．２） ライゲーション
ｐＩＲＥＳｎｅｏＳＶ４０ベクター
ｐＩＲＥＳｎｅｏベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、１つのメッセンジャーＲＮＡから２つのオープンリーディングフレームの翻訳を可能とする脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。ｐＩＲＥＳｎｅの発現カセットはヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要前初期プロモーター／エンハンサの後に複クローニング部位（ＭＣＳ）、ＥＣＭＶ ＩＲＥＳの後にネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子及びウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルを含む。このベクターでは、ＣＭＶプロモーターがＳＶ４０初期プロモーターで置換されている。

ベクター及びＰＣＲ産物をＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いてライゲートする。最適ライゲーションのために、（長さに応じて）約２０ｎｇのベクター及び２００ｎｇのインサートを約１：１０のモル比で使用し、総容量１０μｌのＨ_２Ｏ中で以下の試薬を混合する。１５℃で一晩、室温で３時間インキュベースする。次いで、６５℃で１０分間インキュベートすることによりリガーゼを熱不活化する。

（３．６．３） 細菌及び培地
ＪＭ１０９：（米国のＰｒｏｍｅｇａ）；
ＬＢ培地：カゼイン由来のペプトン（１０ｇ），酵母抽出物（５ｇ），ＮａＣｌ（１０ｇ）、Ｈ_２Ｏで１０００ｍｌに調節し、５Ｍ ＮａＯＨでｐＨ７．０に設定；
ＬＢ寒天：ＬＢ培地（１０００ｍｌ）中寒天（１５ｇ）；
ＬＢ−Ａｍｐ：ＬＢ培地（１０００ｍｌ）中１００ｍｇ／ｍｌ アンピシリン（１００）；
ＳＯＣ培地：バクトトリプトン（２０ｇ），酵母抽出物（５ｇ），１０ｍＭ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＫＣｌ，１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２，２０ｍＭ グルコース，１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４。

（３．６．４） ＣａＣｌ_２を用いる形質転換
コンピテント細菌（ＪＭ１０９）の作成
ＬＢ培地（１０ｍｌ）に大腸菌（ＪＭ１０９）を接種し、３７℃で一晩増殖させる。細菌培養物（４ｍｌ）をＬＢ培地で１：１００希釈し、ＯＤ_{２６０ｎｍ}が０．８になるまで増殖させる。細菌を４℃において４５００ｒｐｍで１０分間遠心し、細胞ペレットを０．１ＭＣａＣｌ_２（４℃）（１０ｍｌ）／使用した細菌懸濁液（５０ｍｌ）中に再懸濁する。細胞を遠心し、ペレットを０．１Ｍ ＣａＣｌ_２（２ｍｌ）中に再懸濁し、１００μｌの総容量まで分取し、液体窒素中で凍結し、−８０℃で保存する。

形質転換
予冷した１７×１００ｍｍポリプロピレン培養チューブにおいて、ＪＭ１０９コンピテント細菌にプラスミドＤＮＡ（５〜１０ｎｇ）を添加し、やさしく混合し、氷上に３０分間置く。次いで、細胞を正確に４２℃の水浴中で振とうせずに４５秒間熱ショックを加え、直ちに氷上に２分間置く。次いで、ＳＯＣ培地（９００μｌ）をチューブに添加し、３７℃において３０分間インキュベートした後ＬＢ−Ａｍｐプレートにおいて細菌懸濁液（１００μｌ）を平板培養する。

（３．６．５） グリセリン培養物のスクリーニング及び定着
アンピシリン耐性コロニーをＰＣＲ技術を用いて挿入したＤＮＡ断片についてスクリーニングする。アンピシリン耐性コロニーの一部をＰＣＲ反応混合物及びクローン化ＤＮＡ断片（以下参照）に対する特定プライマーと混合する。ポジティブコロニーはアガロースゲル電気泳動においてＰＣＲ増幅ＤＮＡバンドを示す。次いで、更なる分析及びプラスミド精製のために前記コロニーをＬＢ−Ａｍｐ培地において増殖させる。更なる使用及び保存のために、所望の細菌培養物（１ｍｌ）を８７％ グリセリン（５００μｌ）と混合し、−８０℃で保存する。

（３．６．６） Ｗｉｚａｒｄ（登録商標） Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製系
細胞再懸濁溶液：５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ ＥＤＴＡ，１００μｇ／ｍｌ ＲＮＡｓｅ Ａ；
細胞溶解溶液：０．２Ｍ ＮａＯＨ，１％ ＳＤＳ；
中和溶液：４．０９ｍＭ グアニジン塩酸塩，０．７５９Ｍ 酢酸カリウム，２．１２Ｍ 氷酢酸（ｐＨ４．２）；
カラム洗浄溶液：６０ｍＭ 酢酸カリウム，１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），６０％ エタノール。

ＬＢ−Ａｍｐ培地（２〜３ｍｌ）に単一コロニーを接種し、３７℃において一晩インキュベートする。溶液を１２０００×ｇで５分間遠心し、生じたペレットを順次懸濁溶液（２５０μｌ）及び細胞溶解溶液（２５０μｌ）中に十分に再懸濁し、チューブを４回反転させることにより混合し、室温において１〜５分間インキュベートする。その後、（室温で５分間インキュベートした）アルカリプロテアーゼ溶液（１０μｌ）及び中和溶液（３５０μｌ）を添加する。直ちにチューブを４回反転することにより混合し、細菌ライゼートを室温において１２０００×ｇで１０分間遠心する。清澄化したライゼートをＳｐｉｎカラムに移し、１２０００×ｇで５分間遠心し、カラムを洗浄溶液（７５０μｌ／２５０μｌ）で２回洗浄する。ＤＮＡをヌクレアーゼ非含有水（１００μｌ）で溶離させる。

（３．６．７） プラスミドの配列決定
挿入された配列を特定プライマーとＩＢＬ（オーストリアのＧｅｒａｓｄｏｒｆ）及びＧｅｎＸｐｒｅｓｓ（オーストリアのＭａｒｉａ Ｗｏｒｔｈ）を用いて配列決定する。Ｅｐｏ及びＳＶ４０初期プロモーターの増幅のため及び配列分析のためのオリゴヌクレオチドプライマーを以下にリストする。

４． プラスミドｐ５の構築
（４．１） Ｅｐｏ遺伝子断片の作成
Ｅｐｏ（ヒトエリスロポエチン）の構造遺伝子を鋳型ＤＮＡとしてｐＳＶＧＰＩＲＮＥＯを用いてＰＣＲにより増幅する。Ｅｐｏの配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ１１３１９．１で寄託されている。ＮｏｔＩ及びＫｓｐＩの認識部位をそれぞれ上流及び下流プライマーに導入する。プライマーは以下のように設計する：

プライマー２００４−０９＋２００４−１０の増幅産物は上記したようにＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いるＰＣＲにより作成する。生じた６０４ｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡ単離カラムを用いて精製し、ＫｓｐＩ及びＮｏｔＩで消化し、ゲル精製する。生じた５９２ｂｐ ＫｓｐＩ／ＮｏｔＩ断片を下記するトリプルライゲーションに使用する。

（４．２） 終止領域ＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳの作成
ＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳの終止領域を、ｐ２−ｎｅｏの構築についてセクション１．４に上記した方法と同様にしてｐＳＶ２ｎｅｏからＰＣＲにより再クローン化する。ただし、プライマーを異なる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を用いて設計する。Ｋｓｐに対する部位（＝ＳａｃＩＩ）を上流プライマーに導入し、ＳａｃＩ及びＥｃｏＲＩに対する部位を下流プライマーに導入する。

プライマー２００４−１１＋２００４−１２の増幅産物は上記したようにＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いるＰＣＲにより作成する。生じた８７３ｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡ単離カラムを用いて精製し、ＫｓｐＩ及びＳａｃＩで消化する。次いで、生じた８５８ｂｐのＤＮＡをゲル精製する。

（４．３） ｐ３ベクター部分の作成
ｐ３プラスミドＤＮＡをＮｏｔＩ及びＳａｃＩで順次消化する。ＤＮＡをアルカリホスファターゼで処理し、ベクター断片をゲル精製する。

（４．４） プラスミドｐ５のトリプルライゲーション及び単離
プラスミドｐ３のＮｏｔＩ／ＳａｃＩベクター部分、ＫｓｐＩ／ＮｏｔＩ Ｅｐｏ遺伝子及びＫｓｐ／ＳａｃＩ終止領域ＳＶ４０ＬＴＰｏｌｙＡ／ＩＶＳを１つのライゲーション反応（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でライゲートする。形質転換体を１００ｍｇ／Ｌ アンピシリンを補充したＬＢ培地において選択する。

挿入した両断片を含むポジティブ形質転換体を、標識プローブとして増幅断片２００４−０９／２００４−１０及び２００４−１１／２００４−１２を用いてコロニーハイブリダイゼーションすることによりスクリーニングする。両プローブでポジティブハイブリダイゼーションシグナルを与える１０クローンを“中間”規模プラスミド作成（Ｑｉａｇｅｎ）のために選択する。

制限分析を酵素ＢａｍＨＩ（４７２３ｂｐの１断片）、ＥｃｏＲＩ（２９１３ｂｐ及び１８１０ｂｐの２断片）及びＰｖｕＩ（２５１３ｂｐ、１２０４ｂｐ、９０３ｂｐ及び１０３ｂｐの４断片）を用いて実施する。適正な制限断片を示す２つのコロニーを選択し、配列決定によりチェックする。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋にクローン化した全カセットを配列決定し、予想ヌクレオチド配列と比較する。単一ヌクレオチドはそれぞれうまく実証することができる。このプラスミドをｐ５と呼称する。

５． ｐＥｐｏ／ｎｅｏの構築
（５．１） ｐＥｐｏ／ｎｅｏ １２−１の構築
ｐ５プラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ＳＶ４０プロモーター／Ｅｐｏ遺伝子−ＳＶターミネーターのカセットを表す生じた１７９２ｂｐ断片をゲル精製する。

プラスミドｐ２−ｎｅｏもＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、直線化ベクターをゲル精製する。更に、ＤＮＡをアルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化し、Ａｍｉｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｕｒｅ酵素リムーバーを用いて精製する。

４４１１ｂｐ ｐ２−ｎｅｏベクター及びｐ５由来の１７９２ｂｐ カセットの両断片をライゲートし（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、大腸菌ＳＵＲＥに形質転換する。プラスミドＤＮＡを７０ｍｇ／Ｌ アンピシリンを補充したＬＢ培地で増殖させた各種形質転換体から単離し、制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩＩ、ＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩを用いる消化により分析する。

予想断片（ＥｃｏＲＩ：６１９１ｂｐ、ＮｃｏＩ：４０８５ｂｐ，１３２６ｂｐ及び７８０ｂｐ、ＰｖｕＩＩ：３２７３ｂｐ，２１３０ｂｐ，６８５ｂｐ及び１０３ｂｐ）を示すクローンを選択し、ｐＥｐｏ／ｎｅｏ−１２と呼称する。

追加精製のために、ＤＮＡを大腸菌ＳＵＲＥ（上記参照）に再形質転換し、プラスミドＤＮＡを単一コロニー（ｐＥｐｏ／ｎｅｏ−１２−１）を接種した培養物から“Ｍｉｄｉ−ｐｒｅｐ”手順（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて作成する。酵素ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＰｖｕＩＩ及びＮａｒＩを用いて制限分析を実施する。予想される断片及びサイズを見つけることができ、このクローンが適正なｐＥｐｏ／ｎｅｏクローンであることが実証される。

（５．２） ｐＥｐｏ／ｎｅｏの最終構築
ｐＥｐｏ／ｎｅｏ−１２−１中のＥｐｏ遺伝子の上流領域をスタートＡＴＧから−３位で変化させる。追加ヌクレオチドＡを導入すると、スタートＡＴＧから−３位にプリン塩基Ｇが生ずる。この位置のプリンは遺伝子の発現レベルを向上させ得る。このために、Ｅｐｏ遺伝子を適応上流プライマー２００４−０９ａを用いて再増幅させる：
オリゴ２００４−０９−ａ： 長さ ４６量体
５’−ｇｇｇｇｇｃｇｇｃｃｇｃａａｔｇｇｇｇｇｔｇｃａｃｇａａｔｇｔｃｃｔｇｃｃｔｇｇｃｔｇｔｇｇ−３’ 配列番号３２。

プライマー２００４−０９＿ａ＋２００４−１０の増幅産物は上記したようにＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いるＰＣＲにより作成する。生じた６０５ｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡ単離カラムを用いて精製し、ＫｓｐＩ及びＮｏｔＩで消化する。次いで、生じた５９３ｂｐのＤＮＡをゲル精製する。

ｐＥｐｏ／ｎｅｏ−１２−１プラスミドＤＮＡをＫｓｐＩ及びＮｏｔＩで消化して、Ｅｐｏ遺伝子を除去する。次いで、５５９９ｂｐ断片をゲル精製する。作成した両ＤＮＡを相互にライゲートする（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。形質転換体由来のプラスミドＤＮＡを単離し、７０ｍｇ／Ｌ アンピシリンを補充したＬＢ培地においてコロニーから精製する。ＤＮＡを第１スクリーニングにおいてＮｃｏＩを用いる制限により分析する。

“Ｍｉｄｉ−ｐｒｅｐ”手順（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを分離するためにポジティブクローンを選択する。ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、ＮｔｏＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＰｖｕＩＩ、ＮａｒＩを用いて延長制限分析を実施する。予想される断片及び大きさを見つけることができ、クローンが適正なＥｐｏ／ｎｅｏとして実証される。ｐＢＲ３２２ベクター部分に挿入された全カセット（ＳＶ初期＿プロモーター−ｎｅｏ遺伝子−ＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳ−ＳＶ４０初期＿プロモーター−Ｅｐｏ遺伝子−ＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳ）の単一ヌクレオチドも配列決定により確認する。

プラスミドＥｐｏ／ｄｈｆｒの構築
１． ｐ２−ｄｈｆｒ−ＣＤＳの構築
（１．１） ｄｈｆｒ遺伝子の作成
ベクター構築のために使用されるｄｈｆｒ遺伝子はプラスミドｐＬＴＲｄｈｒｆ２６（ＡＴＣＣ ３７２９５）中に存在するマウスｃＤＮＡから採取する。マウスｄｈｆｒ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（ＭＵＳＤＨＦＲ）はＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ２６３１６として入手可能である。

ｄｈｆｒをＮｏ．５６のスタートコドンＡＴＧからＮｏ．６１９のストップコドンＴＡＡのコード領域を含む断片を生ずるように設計したプライマーを用いてｐＬＴＲｄｈｆｒ２６から増幅させる。上記したネオマイシン耐性遺伝子の増幅のように、ＨｉｎｄＩＩＩ部位及びＳｐｅＩ部位をそれぞれ上流及び下流増幅プライマーに導入する。ＥｃｏＲＩ部位もＳｐｅＩ部位のそばに逆プライマーに導入する。オリゴヌクレオチド配列は次の通りである：

プライマー２００４−１３＋２００４−１４の増幅産物は上記したようにＰｗｏポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いるＰＣＲにより作成する。生じた５８８ｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡ単離カラムを用いて精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ゲル精製する。

（１．２） ｐ１−ｄｈｆｒ−ＣＤＳの作成
増幅させたＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ｄｈｆｒ遺伝子断片をＬｉｇａｔｉｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてｐＳＶ２−ｎｅｏ由来のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩベクター断片にライゲートし、大腸菌宿主に形質転換する。形質転換体を５０ｍｇ／Ｌ アンピシリンを補充したＬＢ培地で増殖させることにより選択する。形質転換体由来のプラスミドＤＮＡを単離し、５０ｍｇ／Ｌ アンピシリンを補充したＬＢ培地でコロニーから精製する。

プラスミドＤＮＡをクローンから単離し、ＥｃｏＲＩ＋ＳｃａＩを用いる制限分析によりチェックする（２２２５ｂｐ、５１４ｂｐ及び４７３ｂｐのサイズの３断片）。

予想断片を示すプラスミドＤＮＡを更に構築物の関連部分を配列決定することによりチェックする。実証されたＳＶ４０初期プロモーター及びジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含むプラスミドＤＮＡをｐ１−ｄｈｆｒ−ＣＤＳと呼称する。配列の分析から、ＭＵＳＤＨＦＲの公開された配列からｄｈｆｒ遺伝子内の１つの偏位、特にＭＵＳＤＨＦＲ配列のＮｏ．４５１でのＴのＣへの変化が分かった。その後の配列決定で、この変化がソースプラスミド中にも存在することが判明した。しかしながら、ＣＴＴ及びＣＴＣがいずれもロイシンをコードするので生じた変化はヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に変化を生じさせない。

（１．３） ｐ２−ｄｈｆｒ−ＣＤＳの作成
ｐ１−ｄｈｆｒ−ＣＤＳプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ＋ＳｐｅＩで消化する。生じた直線化断片を精製し、（上記した）ＳＶ４０ＬＴｐｏｌｙＡ／ＩＶＳを含む増幅断片とライゲートする。形質転換及び選択後、生じた断片をＡｃｃＩを用いる制限分析により分析する（２９９４ｂｐ、８５５ｂｐ及び２１６ｂｐの３断片）。少数を選択し、更にＨｉｎｃＩＩ（それぞれ３４６６ｂｐ及び５９９ｂｐの２断片）、ＡｆｌＩＩＩ（それぞれ２８７２ｂｐ及び１１９３ｂｐの２断片）及びＢｇｌＩ（それぞれ２３７１ｂｐ及び１６９４ｂｐの２断片）を用いて分析する。

適正なサイズで予想断片を示すプラスミドＤＮＡを配列決定することにより更にチェックする。実証されたプラスミドをｐ２−ｄｈｆｒ−ＣＤＳと呼称する。

２． ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒの構築
（２．１） ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ ２１の作成
ｐ５プラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ＳＶ４０プロモーター−Ｅｐｏ遺伝子−ＳＶ４０ターミネーターのカセットを表す生じた１７９２ｂｐ断片をゲル精製する。

プラスミドｐ２−ｄｈｆｒ−ＣＤＳもＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、直線化ベクターをゲル精製し、Ｓｕｐｅｌｃｏスピンカラムを用いて溶離させる。更に、ＤＮＡをアルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化し、Ａｍｉｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｐｕｒｅ酵素リムーバーを用いて精製する。

４０５３ｂｐ ｐ２−ｄｈｆｒ−ＣＤＳベクターとｐ５由来の１７９２ｂｐカセットの両断片をライゲートし（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、大腸菌ＳＵＲＥに形質転換する。７０ｍｇ／Ｌ アンピシリンを補充したＬＢ培地で増殖させた形質転換体コロニーをＥｐｏ遺伝子（ＰＣＲ産物）をプローブとして用いてハイブリダイズする。プラスミドＤＮＡを各種ポジティブクローンから単離し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩを用いて消化することにより分析する。

予想断片（ＮｃｏＩ：４０８５ｂｐ及び１７６０ｂｐ）を示すクローン選択し、Ｅｐｏ／ｄｈｆｒ−２１と呼称する。更なる精製のために、ＤＮＡを（上記した）大腸菌ＳＵＲＥに形質転換し、単一コロニー（ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ−２１−１）を接種した培養物から“Ｍｉｄｉ−ｐｒｅｐ”手順（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドＤＮＡを作成する。

制限分析を酵素ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、ＮｔｏＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＰｖｕＩＩ、ＮａｒＩを用いて実施する。予想される全ての断片及びサイズを見つけることができ、前記クローンが適正なｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ−２１として実証される。

（２．２） ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒの最終構築
ｐＥｐｏ／ｎｅｏと同様にして、Ｅｐｏ／ｄｈｆｒ−２１中のＥｐｏ遺伝子の上流領域をスタートＡＴＧから−３の位置で変化させる。追加のヌクレオチドＡを導入するとスタートＡＴＧから−３の位置にプリン塩基Ｇが生ずる。Ｅｐｏ遺伝子を実施例１のセクション４．２に記載されているように再増幅させる。

ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ−２１プラスミドＤＮＡをＫｓｐＩ及びＮｏｔＩで消化してＥｐｏ遺伝子を除去する。次いで、５２５９ｂｐ断片をゲル精製する。

作成した両ＤＮＡを相互にライゲートする（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。形質転換体由来のプラスミドＤＮＡを単離し、７０ｍｇ／Ｌ アンピシリンを補充したＬＢ培地でコロニーから精製する。ＤＮＡを第１スクリーニングにおいてＮｃｏＩを用いる制限により分析する。

“Ｍｉｄｉ−ｐｒｅｐ”手順（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを単離するためにポジティブクローンを選択する。延長制限分析をＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＰｖｕＩＩ、ＮａｒＩを用いて実施する。予想される断片及びサイズを見つけることができ、前記クローンが適正なｐＥｐｏ／ｄｈｆｒとして実証される。

ｐＢＲ３２２ベクター−部分に挿入した全カセット（ＳＶ４０初期プロモーター−ｄｈｆｒ遺伝子−ＳＶ４０Ｌ ＴＰｏｌｙＡ／ＩＶＳ−ＳＶ４０初期プロモーター−Ｅｐｏ遺伝子−ＳＶ４０Ｌ ＴＰｏｌｙＡ／ＩＶＳ）の単一ヌクレオチドもすべて配列決定により確認する。

ｐＥｐｏ／ｎｅｏ及びｐＥｐｏ／ｄｈｆｒから作成した組換えＣＨＯ細胞
１〜５×１０^４／ｃｍ^２の細胞を２５ｃｍ^２容量のＴフラスコまたは９６ウェルプレートに接種した後リポフェクチントランスフェクションを実施する。２つのプラスミドを５０：１＝Ｅｐｏ／ｎｅｏ：Ｅｐｏ／ｄｈｆｒの比で混合し、リポフェクチン試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）に製造業者のプロトコルに従って吸着させる。

簡単に説明すると、０．２５μｇ／ｃｍ^２のＤＮＡ及び１．５μｌ／ｃｍ^２のリポフェクチン試薬を用い、このＤＮＡ／脂質カクテルを２００μｌ／ｃｍ^２−細胞層に調節する。次いで、無血清ＤＭＥＭ中で細胞にトランスフェクションカクテルを４時間載せた後、ＤＮＡ含有培地を培養培地で交換する。血清含有培地で２４時間培養した後、選択培地に交換する。トランスフェクトした細胞プールをまず選択培地において集密まで、次いで増幅培地（４．８×１０^−８Ｍ ＭＴＸ）において培養した後、細胞培養上清をＥＬＩＳＡによりＥｐｏ産生についてスクリーニングする。最高の手順を決定し、ＭＴＸ濃度を２倍に増加させ、最良の手順を更なる培養のために使用する。７個の組換え細胞プールを選択し、増殖性、Ｅｐｏ生産性、タンパク質パターン（ウェスタンブロット分析により）、Ｅｐｏ機能性及び染色体安定性を比較する。

Ｔ２５フラスコでのトランスフェクションは、１つのＴ２５フラスコあたり２．５μｇ ｐＥｐｏ／ｎｅｏ、０．０５μｇ ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ及び１５μｌ リポフェクチンを用い（０９／Ｔ２５／１及び０９／Ｔ２５／２）、１つのＴ２５フラスコあたり２μｇ ｐＥｐｏ／ｎｅｏ、０．４μｇ ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ及び１５μｌ リポフェクチンを用いて実施する（０９／Ｔ２５／３及び０９／Ｔ２５／４）。

更に、５プレートにそれぞれ１プレートあたり１０μｇ ｐＥｐｏ／ｎｅｏ、０．２μｇ ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ及び６０μｌ リポフェクチンをトランスフェクトし（０９／９６／１−０９／９６／５）、５プレートにそれぞれ１プレートあたり８μｇ ｐＥｐｏ／ｎｅｏ、１．６μｇ ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ及び６０μｌ リポフェクチンをトランスフェクトする（０９／９６／１−０９／９６／５）。プレート１１及び１２にはそれぞれ６．２５μｇ ｐＥｐｏ／ｎｅｏ、０．０８μｇ ｐＥｐｏ／ｄｈｆｒ及び３７．５μｌ リポフェクチンをトランスフェクトする。

簡単に説明すると、０．２５μｇ／ｃｍ^２ ＤＮＡ及び１．５μｌ／ｃｍ^２ リポフェクチン試薬を用い、このＤＮＡ／脂質カクテルを２００μｌ／ｃｍ^２−細胞層に調節する。 一連のトランスフェクションは主に微量測定プレートにおいて実施する。なぜならば、以前の実験で１つの培養ユニットでのクローン数が多くとも３〜５であるからである。このことは、Ｔフラスコにおいて数百のクローンから単離するよりもモノクローナルトランスフェクタントがより簡単に単離されることを意味する。表１に、９６ウェルプレートあたりのクローンの数及び増幅圧の存在または非存在下でのＥＬＩＳＡ力価を示す。トランスフェクトした細胞プールをまず選択培地において集密まで、次いで増殖培地（４．８×１０^−８Ｍ ＭＴＸ）において培養した後、細胞培養上清をＥＬＩＳＡによりＥｐｏ産生についてスクリーニングする。約１０００個の増殖ウェルをスクリーニングし、５０個の培養物をＭＴＸ濃度を漸増させて特異的Ｅｐｏ産生力について試験する。最高の手順を決定し、ＭＴＸ濃度を２倍に増加し、最良の手順を更なる培養のために使用する。

選択ステップ及び第１回増幅ステップを９６ウェルプレートで実施し、４．８×１０^−８Ｍ ＭＴＸで増殖させた全てのクローンをスクリーニングした後、７つのクローンを選択し、それぞれ０９／９６／１Ｆ５、０９／９６／３Ｄ５、０９／９６／３Ｈ５、０９／９６／５Ｄ４、０９／９６／５Ｈ１、０９／９６／６Ｃ５及び９６／９６／７Ｅ６と呼称し、その増殖性、Ｅｐｏ生産力、ウェスタンブロットにおけるタンパク質パターン、Ｅｐｏ機能性試験及び染色体安定性を比較する。

細胞倍化時間は全てのクローンで同一のようであり、１週間に２回１：２〜１：５分裂され得る。ＭＴＸ濃度を９．６×１０^−８Ｍから１．９×１０^−７Ｍに増加させても生産性が向上するが、ＭＴＸ濃度を更に倍化してもＥＬＩＳＡ値に変化はない。そこで、サブクローニングを３．８×１０^−７Ｍ ＭＴＸで実施する。イムノフルオレッセンスを、単一培養物に有意な差がない１．９×１０^−７Ｍ ＭＴＸで分析する。

細胞形態を光学顕微鏡及びＣｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ核ＤＮＡ分析により比較する。クローン０９／９６／７Ｅ９、０９／９６／６Ｃ５、０９／９６／５Ｈ１、０９／９６／５Ｄ４及び０９／９６／３Ｄ５は宿主細胞株ＣＨＯ−ＤＨＦＲ⁻と同じ核サイズ分布
を示す。対照的に、細胞株０９／９６／１Ｆ５及び０９／９６／３Ｈ５は大きな核を有している。以前の実験から、これは染色体の数が増えた結果生ずることは公知である。従って、更なる安定性のためにクローン０９／９６／３Ｄ５を使用することに決めた。

ＥｐｏのＴＦ−１細胞に対する機能性試験は組換え医薬産物に比較して７つ全ての培養上清で同じ勾配を示す。

組換えタンパク質を各ＭＴＸ濃度でＳＤＳ ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングにより試験し、全ての組換え培養上清で僅かの変化しか見られない。このクローンはＥｐｏを産生する。

要約及び検討：
真核発現ベクターの構築から哺乳動物細胞のトランスフェクションまでの組換えＥｐｏ発現ＣＨＯ細胞株の選択及びポリクローナルＥｐｏ発現細胞プールの単離を記載している。分析は主にＥＬＩＳＡ、イムノフルオレッセンス、ウェスタンブロッティング及びインビトロ機能性試験に基づく。これらの方法は全て、ｎｇ／ｍｌ量で低産生細胞プール培養上清及びより安定な組換え細胞をスクリーニングし得る濃度範囲で確立されている。

遺伝子コピー数を最高３．８×１０^−７Ｍ ＭＴＸで段階的に増幅させた組換えＣＨＯプールを作成する。これらの細胞は１週間に２回１：３〜１：４分裂され得、毎回高レベルのＥｐｏがＥＬＩＳＡで検出される。

組換え細胞株の更なる選択
更なる安定化のために組換え細胞プール０９／９６／３Ｄ５を使用する。ＭＴＸ濃度を段階的に０．３８μＭ ＭＴＸまで増加させる。この増幅レベルで、組換え３Ｄ５細胞を１０及び２０細胞／ウェルでサブクローニングする。ウェルの培養上清の単一クローンでのスクリーニングはＥＬＩＳＡにより実施する。表２に、サブクローニング条件及び０．３８μＭ ＭＴＸの存在下での組換え細胞プール３Ｄ５の効率を示す。単一クローンの３００上清を試験する。継代から４日後高いＥｐｏ力価を有するクローンを２４ウェルプレートにおいて０．７７μＭ ＭＴＸを用いて選択する。

前記クローンのうち７個のクローンを液体窒素中で保存し、ＭＴＸ濃度を１．５４μＭまで増加させることにより遺伝子コピー数を更に増幅させるために選択する。

表３は、平板培養条件及び第２回安定化の効率を示す。ここで、クローン０９／９６／３Ｄ５／１Ｈ９及び０９／９６／３Ｄ５／１８Ｅ５を１．５４μＭ ＭＴＸで最後にサブクローン化する。１ウェルあたりの細胞数を４細胞に減ずる。２６０単一クローンをスクリーニングし、そのうち各サブ培養の２０以上のクローンをＴフラスコに移し、特異的生産性についてスクリーニングする。最終産生クローンを特異的発現率、増殖条件及び核サイズ分布のような基準により決定する。四倍性を示すクローンは経験からバイオリアクターにおいて複雑な増殖パターンを示す傾向にあるので、このような細胞は捨てる。スクリーニング後、６つのサブクローン（４つの１Ｈ９サブクローン及び２つの１８Ｅ５サブクローン）、すなわち０９／９６／３Ｄ５／１Ｈ９／４Ｃ２、０９／９６／３Ｄ５／１Ｈ９／６Ｃ２、０９／９６／３Ｄ５／１Ｈ９／６Ｄ４、０９／９６／３Ｄ５／１Ｈ９／１５Ｂ４、０９／９６／３Ｄ５／１８Ｅ５／７Ａ６及び０９／９６／３Ｄ５／１８Ｅ５／１５Ｃ３を選択し、液体窒素中で凍結する。

無血清培養培地への適応
実施例４からの最終６個の組換え細胞株を最後のサブクローニングステップ後無血清培養条件への適応のために選択する。

細胞をＴ２５フラスコに約５×１０^４／ｃｍ^２の細胞でサブクローニングから７〜１２継代で接種し、集密まで３〜４日培養する。この時点で培地を無血清適応培地で完全に交換し、その後培地の８０％を毎日新しくする。全ての懸濁細胞を培養物に戻す。ほぼすべての細胞が懸濁増殖する適応時間後、クローンを１週間に２回継代し、懸濁液培養として培養する。

クローンを無血清適応培地で１１〜１３継代培養した後、凍結保存する。それぞれ５×１０^６細胞を含む６本のアンプルを液体窒素中無血清凍結培地と一緒に細胞株毎に凍結させる。融解後、クローンを無血清産生培地において培養する。産生クローンを選択するための分析特性付けは融解後第２または第３継代の上清で実施する。

分析試験には、
特異的増殖率［μ］−（μ＝Ｉｎ（Ｘ_２／Ｘ_１）／日数）、
特異的生産性［ｑ_ｐ］−（Ｑｐ＝産物産生×１０^６／（細胞数×日数））、
ウェスタンブロット、
等電点電気泳動、
ＤＮＡ含量及び安定性、
クローン安定性
が含まれる。

６つ全ての細胞株を無血清増殖培地で増殖させることができ、１週間に２回分裂させる。血清なしでも凍結保存し、融解後培養培地を無血清産生培地に交換する。この処方物は高いグルコース及びアミノ酸濃度を有する。

５継代後、異なるタンパク質及び細胞パラメーターを測定し、１つの産生クローン（０９／９６／３Ｄ５／１Ｈ９／６Ｃ２；６Ｃ２と略記）及び１つのバックアップクローン（０９／９６／３Ｄ５／１Ｈ９／４Ｃ２；４Ｃ２と略記）を選択する。

組換え細胞株の比較
実施例４及び５からの６個の細胞株の増殖特性を、培養物中の細胞数及び継代中の分裂比を測定することにより数週間にわたり調べる。Ｅｐｏ生産性をＥＬＩＳＡにより試験する。これらのデータから、上記した特異的生産性及び特異的増殖率を計算する。

表４に、３日の培養後１：３の分裂比で標準培養条件下で得たデータが要約されている。

分裂後及び更に３日後の細胞数（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒで測定）を示す。

還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
６個の細胞株の上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、分子量の違いについて比較する。６個の上清は、通常高度にグリコシル化したタンパク質中に見られるスミアと同一のＳＤＳパターンを示す（データ示さず）。

類似の市販品は、多分下流プロセシング中に分離するばらばらのバンドから生ずるより明確なバンドとして移動する。

ＩＥＦ−ウェスタンブロット
ＩＥＦ−ウェスタンブロット分析は糖タンパク質の可能性あるタンパク質ミクロ不均質性を反映しなければならない。ゲルに充填されるタンパク質の量に従って１４個のバンドが目に見えるようになる。ゲルのほぼ真ん中にウェスタンブロットで見られる１つの特徴的な二重バンドが存在する。この二重バンドの下の次のバンドはバンド番号１として規定され、９〜１０バンドがゲルの酸性部分で肉眼で観察可能である。類似の市販品は異質産物中のバンド番号６〜９に相当する４つの主要バンドを与える。

組換え細胞のＤＮＡ含量
ＤＮＡ含量は細胞株の染色体の数に比例する。組換え細胞株の安定性は部分的に染色体数に影響され、ＤＮＡ含量の同一性は宿主細胞株（ＣＨＯ ｄｈｆｒ）と比較することにより証明される。

要約及び検討：
組換えＥｐｏ発現ＣＨＯ細胞株の単離について記載する。２回のサブクローニング後、６個の細胞株を１つの最終産生クローンの呼称の基礎として諸特性について比較する。分析の基準は主にＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング及びＩＥＦ試験、並びにＦＡＣＳ分析によるＤＮＡ測定である。

組換え培養上清のウェスタンブロットパターンは、市販の精製タンパク質に比較して幾つかの追加低分子量バンドを示す。１つの説明は、これらの追加バンドは比較の市販物につながる下流プロセシング中に除去されるアイソフォームを示すことである。別の可能性は、ＳＤＳの不完全取り込みのために人為的バンドが検出されることである。等電点電気泳動はそのＱｐに関係なくすべての細胞培養上清で同一のアイソフォーム分布を示す。

最良の産生クローン及び最も簡単なハンドリングは産生クローンとして選択されるクローン６Ｃ２である。バックアップとしてクローン４Ｃ２を選択する。両クローンはローラーボトルにおいて増殖され得る。

ＴフラスコにおけるＣＨＯ細胞の培養
組換えヒトエリスロポエチンをＴフラスコ中無血清条件下でチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ）において産生させる。培養物に２．６７×１０^５／ｍｌの細胞を接種する。３日のインキュベーション期間後、最終細胞密度は９．３５×１０^５細胞／ｍｌに達する（＝＞μ＝０．４２日^−１）。

実施例１〜６はＥｐｏを発現する多数のＣＨＯクローンの作成を記載している。実施例４及び５で得た６クローンのうち、クローンＣＨＯ ６Ｃ２を優れた高い細胞特異的生産性及び高い特異的増殖率を有するために選択する。

バイオリアクターにおけるＣＪＯ細胞の培養
ＣＨＯ細胞株６Ｃ２を１５０Ｌ容量のバイオリアクター中フェッド−バッチ（Ｔ４３Ｃ６Ｃ２）モードで培養する。アミノ酸補充した５０：５０ ＤＭＥＭ／Ｈａｍｓ Ｆ１２から構成され、０．２５％ 植物ペプチド、０．１％ ルトロール、１．５４μＭ メトトレキサート（ＭＴＸ）、４ｇ／Ｌ グルコース、２．５ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ_３、エタノールアミン、クエン酸第二鉄、アスコルビン酸及び亜セレン酸ナトリウムを含有する細胞培養培地を用いる。この培地は高価な機能性タンパク質（組換えまたは天然源由来のもの）を含んでいない。動物起源の成分を存在させる。細胞を５６Ｌ培地に約５×１０^５細胞／ｍｌで接種する。ｐＯ_２を５０％空気飽和、温度を３７℃、ｐＨ７．０に設定し、発酵中一定に保つ。

グルコース濃度を１ｇ／Ｌ以上に保つ。４日後、リアクターに新鮮な培地を１５０Ｌまで充填する。９日後に１８７５ｍｌのアミノ酸、炭水化物及び植物由来ペプトンを含有する栄養濃縮物を添加することによりバッチを延長させる。１０日後、更に１８７５ｍｌの栄養濃縮物を添加する。２日後（１２日目）にエリスロポエチンを含む上清を収集する。

メトトレキサートの非存在下でのバイオリアクターにおけるエリスロポエチンの産生
ＣＨＯ細胞株６Ｃ２を５Ｌ容量のバイオリアクター中フェッド−バッチ（Ｋａｍｐ ４ Ｂ５−１及び２）モードで培養する。培地は実施例９と同じである。第１バイオリアクター（Ｋａｍｐ ４ Ｂ５−１）には培地中に１．５４μｍ ＭＴＸを存在させ、第２バイオリアクター（Ｋａｍｐ ４ Ｂ５−２）にはＭＴＸを存在させない。

グルコース濃度を１ｇ／Ｌ以上に保つ。細胞を１２５０ｍＬ培地に約５×１０^５細胞／ｍｌで接種する。ｐＯ_２を５０％空気飽和、温度を３７℃、ｐＨを７．０に設定し、発酵中一定に保つ。２日後、リアクターに新鮮培地を５Ｌまで充填する。６、７、８、９及び１０日後５０〜１２２ｍｌのアミノ酸、炭水化物及び植物由来ペプトンを含有する栄養濃縮物を添加することによりバッチを延長させる。１１日目にエリスロポエチンを含む上清を収集する。

メトトレキサートなしの培養はより優れたグリコシル化パターンのために優れていることが判明する。

富化培地を含むバイオリアクターにおけるエリスロポエチンの産生
ＣＨＯ細胞株６Ｃ２を５Ｌ容量のバイオリアクター中フェッド−バッチ（Ｋａｍｐ １１ Ｂ５−１及び２）モードで培養する。バイオリアクター１は実施例１０（Ｋａｍｐ ４ Ｂ５−２）と同様に操作し、バイオリアクター２では富化アミノ酸を補充した５０：５０ ＤＭＥＭ／Ｈａｍｓ Ｆ−１２から構成され、０．３２５％ 植物ペプチド、０．１％ ルトロール、６．４ｇ／Ｌ グルコース、２．５ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ_３、エタノールアミン、クエン酸第二鉄、アスコルビン酸及び亜セレン酸ナトリウム及び０．６ｇ／Ｌ ホスフェートを含有する細胞培養培地を用いる。ｐＯ_２を５０％空気飽和、温度を３７℃、ｐＨを最初７．０に設定する。発酵中ｐＨを段階的に６．９に低下する。

培養中、バイオリアクター２中のグルコース濃度を３〜４ｇ／Ｌに保つ。２．５日後、リアクターに新鮮培地を５Ｌまで充填する。６、７、８、９及び１０日後、アミノ酸、炭水化物及び植物由来ペプトンを含有する富化栄養濃縮物を添加することによりバッチを延長させる。１１日目にＥｐｏを含む上清を収集する。

栄養富化培地（アミノ酸、グルコース、植物ペプトン及びホスフェート）を用いる培養及び７から６．９へのｐＨ変化が同様のグリコシル化プロフィールで最終Ｅｐｏ濃度を２倍以上とすることが分かる。

動物由来成分を含まないバイオリアクターにおけるエリスロポエチンの産生
ＣＨＯ細胞株６Ｃ２を５Ｌ容量のバイオリアクター中フェッド−バッチ（Ｋａｍｐ １７ Ｂ５−１及び３）モードで培養する。パラメーターはすべて特記しない限り実施例１０（Ｋａｍｐ ４ Ｂ５−２）のように設定する。バイオリアクター２では、動物由来の成分を全く含まない細胞培養培地を用いる。例えば、通常（サケまたはヒト毛髪のような）動物由来のアミノ酸チロシンまたはシステインを合成アミノ酸で置換する。

２．５日後、リアクターに新鮮培地を５Ｌまで充填する。６、７、８、９及び１０日後、アミノ酸、炭水化物及び植物由来ペプトンを含有する栄養濃縮物を添加することによりバッチを延長させる。９〜１０日目にエリスロポエチンを含む上清を収集する。

動物起源の成分を含まない培地は同様の最終Ｅｐｏ濃度を生ずることが分かる。しかしながら、培養物はよりゆっくり増殖し、追加の栄養濃縮物の添加が必要である。

富化培地（ビタミン、微量元素）を含むバイオリアクターにおけるエリスロポエチンの産生
ＣＨＯ細胞株６Ｃ２を１０Ｌ容量のバイオリアクター中フェッド−バッチ（Ｋａｍｐ １２Ｃ）モードで培養する。バイオリアクターを以下の例外を除き実施例１１（Ｋａｍｐ １１ Ｂ５−２）のように操作する。

富化アミノ酸を補充した５０：５０ ＤＭＥＭ／Ｈａｍｓ Ｆ１２から構成され、０．３２５％ 植物ペプチド、０．１％ ルトロール、６．４ｇ／Ｌ グルコース、２．５ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ_３、エタノールアミン、クエン酸第二鉄、ビタミン、微量元素及び亜セレン酸ナトリウム及び０．６ｇ／Ｌ ホスフェートを含有する細胞培養培地を用いる。濃縮物中の濃度を倍とし、ビタミンで富化する。

細胞を４５００ｍｌ培地に約５×１０^５細胞／ｍｌで接種する。ｐＯ_２を５０％空気飽和、温度を３７℃に設定する。ｐＨを最初７．１に設定する。発酵中ｐＨは段階的に６．９に低下する。

培養中、バイオリアクター中のグルコース濃度を３〜４ｇ／Ｌに保つ。３日後、リアクターに新鮮培地を１０Ｌまで充填する。６、７、８、９、１０、１１及び１２日後、富化栄養濃縮物を添加することによりバッチを延長させる。１３日目にエリスロポエチンを含む上清を収集する。

Ｅｐｏの分離
細胞分離
組換えヒトエリスロポエチンを不連続フェッド−バッチ発酵により無血清条件下でチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ）において産生させる。発酵（２つの異なるバイオリアクターにおいて４×約１＋２バッチモード延長ステージ）後、約２００〜３００ｍｇ／ＬのｒｈＥｐｏを含む収集ブロスを２〜８℃に冷却し、暫定保存期間を置かずにまずディスクスタッグ分離機を用いて遠心し、次いでデプス（ＰＰ Ｐｏｌｙｇａｒｄ ０．１μｍ，Ｓｅｉｔｚ Ｂｉｏ １０またはＣｕｎｏ Ａ９０Ｍ０８，処理量約３００Ｌ／ｍ^２濾過面積）及び０．２μ 濾過（Ｓａｒｔｏｂｒａｎ Ｐ，ＳａｒｔｏｒｉｕｓまたはＤｕｒｏｐｏｒｅ ０．２２μ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により清澄化する。高い細胞溶解及びその結果のＨＣＰ（宿主細胞タンパク質）による高い産物汚染を避けるために、まず最適時点（主培養において約１２日，酸素消費滞留）で収集し、次いで脆い真核細胞を分離するように特別設計された細胞分離装置、例えば水密性供給入口を有するＣＳＣ６（６０００ｍ^２ ＥＣＡ，１５５００×ｇ，約２００Ｌ／時，Ｗｅｓｔｆａｌｉａ）または一般的なディスク入口及び転針出口を有するＢＴＰＸ ２５０（１１０００ｍ^２ ＥＣＡ，１３０００×ｇ，３００Ｌ／時，Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ）を用いることが重要である。接線流濾過及び遠心を含めた各種分離方法の比較から、剪断応力（細胞内マーカー酵素ＬＤＨの放出により測定）による細胞溶解の違いが示される。遠心が最も穏和な分離（＜３Ｕ ＬＤＨ／ｍｇ ｒｈＥｐｏ）を与え、好ましい。

或いは、上記したディスクスタック分離機を用いる遠心のみ（デプス濾過ステップなし）を細胞分離ステップで用いる。或いは、上記したデプス濾過ステップ（遠心ステップなし）を用いる。

アニオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーによる捕捉
清澄後、粗な上清を５ｍＳ／ｃｍ以下の最終伝導率に達するように約３容量の水で希釈し、トリス塩基でｐＨ７．５に調節した後、ＡＥＸ−捕捉樹脂にかける。

使用したＡＥＸカラムは約１０〜２０ｃｍベッド高を有し、良好な流動性を有するＱ Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｆ（Ｂｉｏｓｅｐｒａ）が充填されている。２０ｍＭ トリス（ｐＨ７．５）及び５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化されている。次いで、希釈した細胞上清をカラムに４〜８ｃｍ／分の流速で充填し（１０〜１５ｍｇ ｒｈＥｐｏ／ｍｌ樹脂）、カラムを１０〜１５カラム容量（ＣＶ）の平衡緩衝液で洗浄する。産物を、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ トリス（ｐＨ７．５）の高伝導度緩衝液に交換することにより達成される段階溶離により溶離させる。ピークフラクションをプールし、約５０〜６０％の収率を得る。

或いは、中間容量に減量し、次の沈殿条件を標準化するためにフラクションプールを限外濾過により濃縮する。好ましくは、５〜１０ｋＤａカットオフ膜を使用し、標的産物濃度を約２０ｍｇ／ｍｌに調節する。

硫酸アンモニウム沈殿
前ステップからの捕捉プールは、典型的には汚染宿主細胞タンパク質を２．４Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４で沈降させることにより更に精製される。このＡＳ濃度では、沈殿中に殆ど産物は認められず、純粋なＨＣＰ非含有上清が残る。この上清は以下のＲＰＣ精製の前にＲＰＣ充填物中＜２４０ｍＭ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４に希釈しなければならない。

１容量の捕捉プールに対して１．５容量の硫酸アンモニウムストック溶液（４Ｍ ＮＨ_４）_２ＳＯ_４，２０ｍＭ トリス（ｐＨ７．５））を添加して沈殿させ、１０〜１５℃において３０分間インキュベートし、沈殿をデプス（Ｓｅｉｔｚ Ｂｉｏ １０またはＣｕｎｏ Ａ９０Ｍ０８）及び０．２μ濾過（Ｓａｒｔｏｂｒａｎ Ｐ，ＳａｒｔｏｒｉｕｓまたはＤｕｒｏｐｏｒｅ ０．２２μ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により分離する。高溶離容量＝希ｒｈＥｐｏ溶離プール（＜５ｍｇ ｒｈＥｐｏ／ｍｌ）の場合、ＨＣＰ沈殿は任意のＵＦ濃縮ステップ（１０ｋＤａカットオフ）により改善され得る。

硫酸アンモニウム沈殿は疎水性相互作用クロマトグラフィーより有効である。

前沈殿ステップからの硫酸アンモニウム含量を低減させるために、産物を含む上清を上記したように希釈しなければならない。代替方法は限外濾過／デプス濾過ステップである。好ましくは、５〜１０ｋＤａカットオフ膜を使用し、標的硫酸アンモニウム濃度を２４０ｍＭ未満、産物濃度を約３０ｍｇ／ｍｌに調節する。ダイアフィルトレーションステップのために使用した緩衝液は２０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）である。

逆相クロマトグラフィー
次の精製ステップは逆相クロマトグラフィーである。この逆相クロマトグラフィーは、ａ）異なるアイソフォームがその糖骨格（高度にグリコシル化／シアリル化した溶離物の後に低度にグリコシル化／シアリル化した形態）に従って分離される；ｂ）残留宿主細胞タンパク質がこの高速クロマトグラフィーにより除去される；及びｃ）クロマトグラフィーがウイルス除去及び有機溶媒によるウイルス不活化のためのロバストなステップである点で有用である。Ｓｏｕｒｃｅ ３０ＲＰＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、ａ）中圧（＜１０バール）で操作可能であり且つｂ）高濃度ＮａＯＨで衛生処理され得るポリマー樹脂である。好ましいベッド高は１０〜１５ｃｍであり、推奨される負荷物は充填樹脂１ｍｌあたり８〜１２ｍｇのｒｈＥｐｏである。

ＲＰＣステップの前に、産物を含む上清を０．２４Ｍ未満の硫酸アンモニウムの最終濃度に調節しなければならない。このコンディショニングは、ＲＰＣ充填中にその後のオンライン希釈ステップ（２０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中１容量のｒｈＥｐｏ−上清＋４容量の２０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）＋５容量の５０ｖｖ％ ＡＣＮ）により、または高価な有機溶媒を節約するために充填ステップの前に優先的に再度の２０ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に対するダイフィルトレーション／濃縮（１０ｋＤａカットオフのＵＦ）ステップにより実施し得る。カラムを予め平衡化し、２０ｍＭ トリス（ｐＨ７．０）中２５ｖｖ％ アセトニトリル（ＡＣＮ）を充填後洗浄する。産物をＡＣＮ濃度を２５％から５０％へ直線勾配させて溶離し、凝集を誘導する恐れがあり、次のＡＥＸクロマトグラフィーを害する溶媒濃度を直ちに減ずるために４容量の希釈緩衝液（５０ｍＭ トリス（ｐＨ７．０））を予め充填した小フラクション（特に、約０．２ＣＶ、或いは約０．３〜０．５ＣＶ）で集める。溶離ピークのほぼ前半部分のフラクションをプールして、ＲＰＣプールを得、これは更にプロセシングする。このプールは好ましい高度のグリコシル化を有するアイソフォームを含む。Ｓｅｒ１２６でＯ−グリカンを欠く脱−Ｏ−グリコシル化ｒｈＥｐｏ産物は細胞培養物中に最高２０％のレベルで存在するが、この産物は上記分画レジメにより除去される。

代替方法では、有機溶媒に曝すことによりウイルス不活化を誘導するために、フラクションに４容量の上記したと同じ緩衝液の代わりに０．５容量の２０ｍＭ トリス（ｐＨ７．０）を予備充填し、２０〜４０分間またはそれ以上インキュベートする。このインキュベーションステップ後、元の非希釈フラクションを指す別の３．５容量の２０ｍＭ トリス（ｐＨ７．０）を添加し、よってウイルス不活化を停止する。

ウイルス不活化を伴うまたは伴わないフラクションを更なる精製のためにプールする。プーリングは通常上行部位では最大ＯＤの５０〜１００％で始め、下行部位では７０〜８０％以上でほぼ終わらす。最初に溶離するフラクションは宿主細胞タンパク質を含む可能性があるのに対して、後から溶離するフラクションは低シアリル化で低活性のアイソフォームを含む。更に、ＣＺＥ分析をあるアイソフォームのプーリングを裏付けるために実施し得る。

アニオン交換クロマトグラフィー
次いで、希釈したＲＰＣプールを、特定アイソフォームを選択し、宿主細胞タンパク質を除去するのを助ける高速ＡＥＸカラムに充填する。この時、アイソフォームは等電点に従って、すなわちグリコシル化のグレードに比例するシアル酸の数に従って分離される。優れた分離効率を示すＱ−Ｓｅｐａｒｏｓｅ ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の高性能樹脂を使用する。ベッド高は１５〜２０ｃｍである。充填、勾配及びベッド高のような全ての条件はかなり低い産物濃度を保つように規定される。さもなければ、溶離中産物の溶媒誘導凝集により有意なポスト−ピークが生ずる。

ＲＰＣプールに、２０ｍＭ トリス（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰに対して２〜４ｍｇ／ｍｌのＥｐｏを充填する。平衡緩衝液での洗浄ステップ後、産物を平衡緩衝液中０から３００ｍＭ ＮａＣｌの１０ＣＶ直線塩勾配で溶離させる。溶離ピークを０．１ＣＶまたは０．２５ＣＶフラクションで集め、分析プールをＣＺＥにより分析して、所望エリスロポエチンアイソフォームを含む適正なフラクションプールを見つける。ＡＥＸプールは典型的には溶離ピークの後半部分から構成され、ここに高度にグリコシル化及びシリル化されたアイソフォームが溶離されている。

インプロセスコントロールとして細管ゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を用いることにより、異なる発酵条件及び宿主系のためにソースが高シリル化アイソフォームを僅かに含んでいるとしてもエリスロポエチンアイソフォームの正確に規定された混合物を産生することができる。

ＣＺＥは異なる電荷を有するアイソフォームを分離することができる高分離法である。各フラクションで１つのアイソフォーム毎に定量的な結果を与える。この情報により、バッチ毎に一定のアイソフォームプロフィールをもたらす特定フラクションをプールすることができる。典型的には、遅れて溶離するフラクションをプールすることにより最初に溶離する低シアリル化アイソフォームが排除される。

サイズ排除クロマトグラフィー
最後のクロマトグラフィーステップでは、存在する恐れがある二量体以上の多量体凝集物を除去し、最終処方物のために緩衝液交換を実施するサイズ排除によりＡＥＸプールを研磨する。このステップで使用するＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）はカラム容量の１５％までの高い充填容量でも良好な分離を有する。好ましいベッド高さは６０〜８０ｃｍである。

ＡＥＸプール中の産物濃度を高めるように前ステップのＡＥＸクロマトグラフィーを実施することは不可能であるので、前記プールを濃縮した後ゲル濾過しなければならない。これは５〜１０ｋＤａ ＵＦ膜を用いる限外濾過ステップにより実施され、これにより約１０ｍｇ／ｍｌのエリスロポエチンを含む約１０倍濃縮されたＵＦ保持物が得られる。

ＵＦ保持物の約３〜７ＣＶ％を直接、予め２０ｍＭ Ｎａ−ホスフェート（ｐＨ７．０）、７５ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇカラムに充填する。約１〜１．５ＣＶ後、産物がカラムから溶離し始め、溶離ピークを集めてＳＥＣプールを得る。

ナノ濾過
可能性あるウイルス負荷物を除去するために、追加のデッドエンド（ｄｅａｄ−ｅｎｄ）ウイルス濾過ステップを実行する。この濾過は、１５ｎｍくらいの小さい粒子を除去するように設計された特定膜、例えばＰｌａｎｏｖａ １５Ｎ（Ａｓａｈｉ）を用いて実施する。或いは、デッドエンドナノ濾過ユニットはＰＡＬＬ Ｕｌｔｉｐｏｒ ＶＦ Ｇｒａｄｅ ＤＶ２０またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ ＮＦＰカットリッジまたはカプセルである。特にパルボウイルスのような小さい非外被ウイルスの場合には、ウイルス除去または不活化の別の道具はほとんどない。

滅菌濾過したＳＰＥプールを適当な膜を有する全量フィルターに通し、濾液は最終バルク状薬物である。或いは、ナノ濾過をＵＦ濃縮とサイズ排除クロマトグラフィーの間に挿入してもよい。

本明細書において言及した刊行物はすべて援用により本明細書に含まれるとする。本明細書に記載した本発明の方法及びシステムに本発明の範囲及び趣旨を逸脱することなく各種修飾及び変更を加えることは当業者に自明である。本発明を特定の好ましい実施態様に関連して説明してきたが、本発明はこれらの実施態様に不当に限定されるべきではないと理解されたい。実際、分子生物学または関連分野の当業者に自明の本発明を実施するための本発明の各種修飾は請求の範囲の範囲内であると意図される。

Claims (25)

1. （ａ）（ｉ）遠心後デプス濾過ステップ、（ｉｉ）デプス濾過ステップ及び（ｉｉｉ）遠心からなる群から選択される手順を実施して、細胞培養培地から宿主細胞、細胞成分及び破片を除去し、清澄化培地上清を得るステップ、
   （ｂ）前記上清の伝導率を５ｍＳ／ｃｍ以下、ｐＨを７．０から８．０に調節するステップ、
   （ｃ）ステップ（ｂ）からの上清をアニオン交換クロマトグラフィー媒体を含むカラムに適用し、前記カラムを洗浄し、前記カラムからｒｈＥｐｏを溶離させ、１つ以上のｒｈＥｐｏ含有ピークフラクションを収集するステップ、
   （ｄ）ステップ（ｃ）からの合わせたピークフラクションに、中圧（＜１０バール）で操作可能であり且つ高濃度のＮａＯＨに対して耐性である樹脂を用いる逆相クロマトグラフィーステップを施し、有機溶媒の直線勾配を用いてｒｈＥｐｏを溶離させるステップ、
   （ｅ）ステップ（ｄ）で溶離した１つ以上のｒｈＥｐｏ含有フラクションをアニオン交換クロマトグラフィー媒体を含むカラムに適用し、前記カラムを洗浄し、直線塩勾配を用いてｒｈＥｐｏを溶離させるステップ、
   （ｆ）ステップ（ｅ）で溶離した１つ以上のｒｈＥｐｏ含有フラクションをｒｈＥｐｏのシアリル化度に基づいて選択するステップ、及び
   （ｇ）ステップ（ｆ）で溶離した１つ以上のｒｈＥｐｏ含有フラクションにゲル濾過媒体を用いるサイズ排除クロマトグラフィーステップを１回以上施して存在し得る二量体以上の多量体凝集物を除去し、ｒｈＥｐｏ含有溶離物を収集するステップ
   を含む、宿主細胞を含む細胞培養培地からの組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈＥｐｏ）の回収及び精製方法。
2. ステップ（ａ）における遠心をディスクスタック分離機を用いて実施することを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. ステップ（ｄ）とステップ（ｅ）の間に、更にステップ（ｄ）で溶離した１つ以上のｒｈＥｐｏ含有フラクションをｒｈＥｐｏのシアリル化度に基づいて選択する追加ステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. ステップ（ｄ）の前に、ステップ（ｃ）からのピークフラクションに硫酸アンモニウム沈殿ステップを施して汚染宿主細胞タンパク質を沈殿させ、その後上清の硫酸アンモニウム濃度をステップ（ｄ）に適合する濃度に調節することを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 硫酸アンモニウム濃度が０．２４Ｍ未満であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. ステップ（ｂ）におけるｐＨがｐＨ７．５であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. ステップ（ｃ）における溶離ステップを１２５ｍＭ以上の塩濃度を有する緩衝液を用いて実施することを特徴とする請求項１に記載の方法。
8. ステップ（ｄ）における有機溶媒をアセトニトリル、エタノール及びヘキシレングリコールからなる群から選択することを特徴とする請求項１に記載の方法。
9. ステップ（ｄ）においてＥｐｏポリペプチドを有機溶媒の１０％から１００％への直線勾配を用いて溶離させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
10. ステップ（ｄ）における有機溶媒はアセトニトリルであり、Ｅｐｏポリペプチドを２５％から５０％への勾配を用いて溶離させることを特徴とする請求項８に記載の方法。
11. ステップ（ｅ）の前に、ステップ（ｄ）で溶離したフラクションを適当な水性緩衝液で希釈することを特徴とする請求項１に記載の方法。
12. ステップ（ｅ）の前に、希釈したフラクションをウイルス汚染物質を不活化するのに十分な適当な時間放置することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. ステップ（ｇ）において、サイズ排除クロマトグラフィーステップの前にフラクションに限外濾過ステップを施すことを特徴とする請求項１に記載の方法。
14. ステップ（ｄ）において、逆相クロマトグラフィーの前にフラクションに限外濾過ステップを施すことを特徴とする請求項１または４に記載の方法。
15. 硫酸アンモニウム沈殿ステップの前にステップ（ｃ）からの合わせたピークフラクションに限外濾過ステップを施すことを特徴とする請求項４に記載の方法。
16. ステップ（ｇ）の前またはその後に、更にウイルスを除去するためにデッドエンドナノ濾過ステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
17. ステップ（ａ）において、手順（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の後に０．２μｍ濾過ステップを実施することを特徴とする請求項１に記載の方法。
18. ステップ（ｆ）におけるまたはステップ（ｄ）とステップ（ｅ）の間の１つ以上の選択手順を細管ゾーン電気泳動を用いて実施することを特徴とする請求項１または３に記載の方法。
19. （ａ）（ｉ）ディスクスタック分離機を用いる遠心後デプス濾過ステップ、（ｉｉ）デプス濾過ステップ及び（ｉｉｉ）ディスクスタック分離機を用いる遠心からなる群から選択される手順を実施して、細胞培養培地から宿主細胞、細胞成分及び破片を除去し、清澄化培地上清を得るステップ、
    （ｂ）前記上清の伝導率を５ｍＳ／ｃｍ以下、ｐＨを７．０から８．０に調節するステップ、
    （ｃ）ステップ（ｂ）からの上清をＱ−ＨｙｐｅｒＤ Ｆ（ＢｉｏＳｅｐｒａ）アニオン交換クロマトグラフィー媒体を含むカラムに適用し、前記カラムを洗浄し、前記カラムからｒｈＥｐｏを溶離させ、１つ以上のｒｈＥｐｏ含有ピークフラクションを収集するステップ、
    （ｄ）ステップ（ｃ）からの合わせたピークフラクションに、中圧（＜１０バール）で操作可能であり且つ高濃度のＮａＯＨに対して耐性であるポリスチレン樹脂を用いる逆相クロマトグラフィーステップを施し、アセトニトリルの直線勾配を用いてｒｈＥｐｏを溶離させるステップ、
    （ｅ）ステップ（ｄ）で溶離した１つ以上のｒｈＥｐｏ含有フラクションをｒｈＥｐｏのシアリル化度に基づいて選択し、前記フラクションをＱ−Ｓｅｐｈ ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）アニオン交換クロマトグラフィー媒体を含むカラムに適用し、前記カラムを洗浄し、直線塩勾配を用いてｒｈＥｐｏを溶離させるステップ、
    （ｆ）ステップ（ｅ）で溶離した１つ以上のｒｈＥｐｏ含有フラクションをｒｈＥｐｏのシアリル化度に基づいて選択し、存在し得る二量体以上の多量体凝集物を除去するために前記フラクションにＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーを施し、ｒｈＥｐｏ含有溶離物を収集するステップ
    を含む、宿主細胞を含む細胞培養培地からの組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈＥｐｏ）の回収及び精製方法。
20. ステップ（ｄ）において、ポリスチレン樹脂がＳｏｕｒｃｅ ３０ＲＰＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
21. ステップ（ｅ）及び／またはステップ（ｆ）において１つ以上のフラクションを細管ゾーン電気泳動により選択することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
22. ステップ（ｄ）の前に、ステップ（ｃ）からの合わせたピークフラクションに硫酸アンモニウム沈殿ステップを施して汚染宿主細胞タンパク質を沈殿させ、その後上清の硫酸アンモニウム濃度をステップ（ｄ）に適合する濃度に調節することを特徴とする請求項２１に記載の方法。
23. 硫酸アンモニウム濃度が０．２４Ｍ未満であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
24. ステップ（ｆ）の前またはその後に、更にウイルスを除去するためにデッドエンドナノ濾過ステップを含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
25. 培養培地が無血清であり、宿主細胞を不連続流加発酵プロセスを用いて培養することを特徴とする請求項１９に記載の方法。