CN112940101A - 重组人促红细胞生成素的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种促红细胞生成素的纯化方法，包括特定顺序的纯化步骤。与现有的纯化方法相比，工艺简单，可获得高纯度高活性的重组人促红细胞生成素蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质纯化领域。更具体地，本发明涉及一种对重组人促红细胞生成素(rhEPO)蛋白的纯化方法。
背景技术
重组人促红细胞生成素(rhEPO)是一种激活并调节红细胞生成的糖蛋白激素，广泛用于因慢性肾病、化疗及其他原因引起的贫血症。作为第一代重组蛋白药物，rhEPO疗效明确，医生认可度高，产品生命周期长。
促红细胞生成素(EPO)的分子骨架具有不同的糖基化位点，为一种高度糖基化的蛋白，糖链的末端带有唾液酸，唾液酸含量的多少决定了EPO在体内的代谢速度，对体内的生物活性有决定性的影响。末端唾液酸残基数量较多的EPO会相对较慢地从生物体中清除，有较长的半衰期和较高的活性；反之亦然。EPO末端唾液酸化的差异会体现在其所带电荷量上，不同唾液酸化的EPO也可以视为糖异构体。因此EPO蛋白中糖异构体的含量分布是影响安全性和有效性的重要因素。糖异构体的含量分布与纯化工艺有着紧密的联系，通过改进蛋白纯化工艺制得高品质EPO，从而保证药品的有效性和安全性是迫切需要的。
发明内容
本发明的目的是通过改进促红细胞生成素(EPO)蛋白的纯化方法，以提供一种不需要亲和层析来获得高纯度高活性的EPO的纯化方法。本发明的的纯化方法包括特定顺序的纯化步骤，工艺简单，获得的EPO纯化产物的纯度达到99.0％以上，且富集到的EPO同分异构体唾液酸残基数量高，EPO活性高。具体的，本发明包括以下内容：
本发明涉及一种促红细胞生成素(EPO)的纯化方法。
在本发明的一个实施方案中，其包括以下步骤：
步骤1、过滤与浓缩含有促红细胞生成素的细胞培养液；
步骤2、将步骤1处理后的过滤浓缩产物进行Q琼脂糖凝胶强阴离子交换层析；
步骤3、将步骤2处理后的层析产物进行Oligo R3反相层析；
步骤4、将步骤3处理后的层析产物进行DEAE琼脂糖凝胶弱阴离子交换层析；
步骤5、将步骤4处理后的层析产物进行葡聚糖凝胶S200分子筛层析。
在本发明的一个实施方案中，所述Oligo R3反相层析依次包括平衡柱床、上样、淋洗、洗脱、收集洗脱峰步骤，所述Oligo R3反相层析洗脱步骤使用pH为6.8-7.2的62-72％的乙醇/0.01M Tris-HCl的缓冲液洗脱。在本发明的一个具体实施方案中，所述Oligo R3反相层析洗脱步骤使用pH为7.0的66％的乙醇/0.01M Tris-HCl的缓冲液洗脱。
在本发明的一个实施方案中，所述Oligo R3反相层析淋洗步骤使用pH为6.8-7.2的48-58％乙醇/0.01MTris-HCl的缓冲液淋洗至基线。在本发明的一个具体实施方案中，所述Oligo R3反相层析淋洗步骤使用pH为7.0的54％乙醇/0.01MTris-HCl的缓冲液淋洗至基线。
在本发明的一个实施方案中，所述Q琼脂糖凝胶强阴离子交换层析依次包括平衡柱床、上样、淋洗、洗脱、收集洗脱峰步骤，所述Q琼脂糖凝胶强阴离子交换层析淋洗步骤包括两次淋洗，先用pH为4.2-4.6的6M尿素/1mM甘氨酸淋洗至基线平稳，再用pH为6.8-7.2的0.02-0.08M的NaCl/0.01M Tris-HCl的缓冲液淋洗至基线平稳。在本发明的一个具体实施方案中，所述Q琼脂糖凝胶强阴离子交换层析淋洗步骤先用pH为4.5的6M尿素/1mM甘氨酸淋洗至基线平稳，再用pH为6.8-7.2的0.06M的NaCl/0.01M Tris-HCl的缓冲液淋洗至基线平稳。
在本发明的一个实施方案中，所述Q琼脂糖凝胶强阴离子交换层析洗脱步骤使用pH为6.8-7.2的0.10M-0.18M NaCl/0.01M Tris-HCl的缓冲液洗脱。在本发明的一个具体实施方案中，所述Q琼脂糖凝胶强阴离子交换层析洗脱步骤使用pH为7.0的0.13M NaCl/0.01MTris-HCl的缓冲液洗脱。
在本发明的一个实施方案中，所述Oligo R3反相层析使用pH为6.8-7.2的1-25％乙醇/0.01MTris-HCl的缓冲液以平衡柱床。在本发明的一个具体实施方案中，所述OligoR3反相层析使用pH为7.0的5％乙醇/0.01MTris-HCl的缓冲液以平衡柱床。
在本发明的一个实施方案中，所述DEAE琼脂糖凝胶弱阴离子交换层析依次包括平衡柱床、上样、洗脱、收集洗脱峰步骤，所述DEAE琼脂糖凝胶弱阴离子交换层析洗脱步骤使用pH为6.8-7.2的0.15-0.3M NaCl/0.01MTris-HCl的缓冲液洗脱。在本发明的一个具体实施方案中，所述DEAE琼脂糖凝胶弱阴离子交换层析洗脱步骤使用pH为7.0的0.25M NaCl/0.01MTris-HCl的缓冲液洗脱。
在本发明的一个实施方案中，所述Q琼脂糖凝胶强阴离子交换层析和/或DEAE琼脂糖凝胶弱阴离子交换层析使用pH为6.8-7.2的0.01-0.1M Tris-HCl的缓冲液平衡柱床。
在本发明的一个实施方案中，所述葡聚糖凝胶S200分子筛层析依次包括平衡柱床、上样、洗脱、收集洗脱峰步骤。所述葡聚糖凝胶S200分子筛层析平衡柱床步骤使用pH为6.7-7.1的50-100mM NaCl/10-30mM磷酸盐缓冲液平衡柱床，例如pH为6.9的75mM NaCl/24mM磷酸盐缓冲液。所述葡聚糖凝胶S200分子筛层析洗脱步骤使用pH为6.7-7.1的50-100mM NaCl/10-30mM磷酸盐缓冲液洗脱，例如pH为6.9的75mM NaCl/24mM磷酸盐缓冲液。
在本发明的一个实施方案中，所述浓缩步骤包括使用0.01-0.03M的NaCl/0.01MTris-HCl缓冲液浓缩含有促红细胞生成素的细胞培养液，例如0.02M NaCl-0.01MTris-HCl缓冲盐溶液。在本发明的一个具体实施方案中，浓缩处理后的浓缩液的电导率在2.0-4.0mS/cm范围内。
在本发明的一个实施方案中，所述过滤步骤包括使用膜过滤器过滤。在本发明的一个具体实施方案中，使用孔径为1.2微米和0.45微米的膜过滤器串联过滤。
在本发明的一个具体实施方案中，促红细胞生成素(EPO)来源于细胞培养液。所述细胞具有表达EPO和/或将表达的EPO分泌到胞外的能力，例如CHO细胞。
在本发明的一个具体实施方案中，促红细胞生成素(EPO)是重组促红细胞生成素(rEPO),例如人重组促红细胞生成素(rhEPO)。
附图说明
图1是实施例1纯化rhEPO的毛细管区带电泳法(CZE)的异构体分布检测图，从左到右依次为异构体3-8。
图2是实施例2纯化rhEPO的毛细管区带电泳法(CZE)的异构体分布检测图，从左到右依次为异构体3-9。
图3是实施例3纯化rhEPO的毛细管区带电泳法(CZE)的异构体分布检测图，从左到右依次为异构体3-9。
图4是是实施例4纯化rhEPO的毛细管区带电泳法(CZE)的异构体分布检测图，从左到右依次为异构体2-9。
图5是EPO标准品CRS的毛细管区带电泳法(CZE)的异构体分布检测图，从左到右依次为异构体1-8。
具体实施方式
以下实验例是对本发明进行的进一步说明，不应理解为对本发明的限制。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法或按照制造厂商所建议的条件操作。下列实施例中未注明具体来源的实验材料，按照常规方法制备或从商业渠道可获得。
下面结合实施例与其检测结果对本发明的纯化方法做进一步详细说明。
实施例1 rhEPO的纯化
1、过滤浓缩
将CHO细胞培养的促红细胞生成素收获液用1.2μm和0.45μm的滤器串联过滤。然后使用0.02M NaCl-0.01M Tris-HCl缓冲盐溶液进行浓缩，浓缩处理后的浓缩液的电导率在2.0-4.0mS/cm范围内。
2、强阴离子交换层析(Q-Sepharose Fast Flow，Q高流速琼脂糖)
(柱规格为14*14cm,流速为185ml/min)
1)平衡：使用pH 7.0的0.01M Tris-HCl的缓冲液平衡柱床。
2)上样：浓缩液上样于Q高流速琼脂糖强阴离子交换层析柱。
3)淋洗：pH为4.5的6M尿素/1mM甘氨酸淋洗后再使用pH值约为7.0的0.06M NaCl-0.01MTris-HCl的缓冲液淋洗5个柱体积至基线平稳。
4)洗脱：pH 7.0的0.13M NaCl-0.01M Tris-HCl的缓冲液洗脱，收集洗脱峰，获得收集液1。蛋白质收率约为15％。
3、反相层析(Oligo R3)
(柱规格为4*50，流速为55ml/min)
1)平衡：使用pH 7.0的5％乙醇/0.01MTris-HCl的缓冲液以平衡柱床。
2)上样：收集液1上样于Oligo R3反相层析柱。
3)淋洗：用pH 7.0的54％乙醇/0.01MTris-HCl的缓冲液淋洗至基线。
4)洗脱：使用pH 7.0的66％乙醇/0.01MTris-HCl的缓冲液洗脱，收集洗脱峰，获得收集液2。蛋白质收率约为55％。
4、弱阴离子交换层析(DEAE-Sepharose Fast Flow，DEAE高流速琼脂糖)
(柱规格为10*8cm，流速为220ml/min)
1)平衡：使用pH值7.0的0.01M Tris-HCl的缓冲液以平衡柱床
2)上样：收集液2上样于DEAE高流速琼脂糖弱阴离子交换层析柱。
3)洗脱：使用pH 7.0的0.25M NaCl/0.01MTris-HCl的缓冲液洗脱，收集洗脱峰，获得收集液3。蛋白质收率约为90％。
5、分子筛层析(sephacryl S200，葡聚糖凝胶S200)
(柱规格为14*65cm，流速为70ml/min)
1)平衡：使用pH 6.9的75mM NaCl/24mM磷酸盐缓冲液以平衡柱床。
2)上样：收集液3上样于葡聚糖凝胶S200分子筛层析柱。:
3)洗脱：继续使用pH 6.9的75mM NaCl/24mM磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱峰。得到最终目的蛋白产物，即纯化的rhEPO。蛋白质收率约为99％。
实施例2(比较例一)强阴离子交换层析工艺参数改变
与实施例1的区别在于，强阴离子交换层析步骤的0.13M NaCl/0.01M Tris-HCl的缓冲液更换为0.22M NaCl/0.01MTris-HCl的缓冲液。其他步骤与实施例1相同。
实施例3(比较例二)Oligo R3反相层析工艺参数改变
与实施例1的区别在于，Oligo R3反相层析步骤的54％乙醇/0.01MTris-HCl的缓冲液更换为40％乙醇/0.01MTris-HCl的缓冲液。其他步骤与实施例1相同。
实施例4(比较例三)强阴离子交换层析和Oligo R3反相层析工艺参数改变
与实施例1的区别在于，强阴离子交换层析步骤的pH为4.5的6M尿素/1mM甘氨酸更换为pH为4.7的6M尿素/1mM甘氨酸，Oligo R3反相层析步骤的66％乙醇/0.01MTris-HCl的缓冲液更换为75％乙醇/0.01MTris-HCl的缓冲液。其他步骤与与实施例1相同。
实施例5纯化rhEPO蛋白理化性质检测
对统一批次细胞收获液实施的实施例1-4的蛋白产物和欧洲药典EPO标准品CRS(Chemical Reference Substance，化学标准品)进行了尺寸排除色谱法(SEC)的纯度检测与毛细管区带电泳法(CZE)的异构体分布检测。尺寸排除色谱法(SEC)参照《中行人民共和国药典》2015版第三部，毛细管区带电泳法(CZE)参照欧洲药典EP9.0,ph.eur.monograph1316。比较尺寸排除色谱法(SEC)的纯度检测与毛细管区带电泳法(CZE)的异构体分布检测的结果。
从纯度检测结果表1可以看出实施例1的纯化后的rhEPO的纯度达到100％(见表1)，高于比较例一，二，三。
毛细管区带电泳法(CZE)的异构体检测以欧洲药典EPO标准品CRS异构体分布为准。检测样品前后均包括EPO标准品检测，以对比确定对应异构体。按欧洲药典EP9.0里的标准，异构体为1-8。异构体1-8的唾液酸含量依次增多。
异构体检测结果(图1-图5)显示实施例1的纯化后的rhEPO的异构体分布包括异构体3-8，其分布符合欧洲药典标准，而比较例一，二，三的纯化产物的异构体分别为异构体3-9、异构体3-9，和异构体2-9，包括了不在欧洲药典EPO标准品CRS异构体分布图的第9个异构体。同时，实施例1的rhEPO纯化产物与欧洲药典EPO标准品CRS相比不含有唾液酸相对较少的异构体1和2，即实施例1的纯化方法能去除唾液酸含量较少的rhEPO的异构体，如欧洲药典标准品异构体分布图中的异构体1和/或2。实施例1纯化后获得的rhEPO纯化产物唾液酸含量更高，可以预期其具有更长的半衰期和更高的药学活性。
表1 SEC纯度检测结果
Claims (10)
1.一种纯化促红细胞生成素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、过滤与浓缩含有促红细胞生成素的细胞培养液；
步骤2、将步骤1处理后的过滤浓缩产物进行Q琼脂糖凝胶强阴离子交换层析；
步骤3、将步骤2处理后的层析产物进行Oligo R3反相层析；
步骤4、将步骤3处理后的层析产物进行DEAE琼脂糖凝胶弱阴离子交换层析；
步骤5、将步骤4处理后的层析产物进行葡聚糖凝胶S200分子筛层析。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Oligo R3反相层析依次包括平衡柱床、上样、淋洗、洗脱、收集洗脱峰步骤，所述Oligo R3反相层析洗脱步骤使用pH为6.8-7.2的62-72％的乙醇/0.01M Tris-HCl的缓冲液洗脱。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Oligo R3反相层析淋洗步骤使用pH为6.8-7.2的48-58％乙醇/0.01MTris-HCl的缓冲液淋洗至基线。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述Q琼脂糖凝胶强阴离子交换层析依次包括平衡柱床、上样、淋洗、洗脱、收集洗脱峰步骤，所述Q琼脂糖凝胶强阴离子交换层析淋洗步骤包括两次淋洗，先用pH为4.2-4.6的6M尿素/1mM甘氨酸淋洗至基线平稳，再用pH为6.8-7.2的0.02-0.08M的NaCl/0.01M Tris-HCl的缓冲液淋洗至基线平稳。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述Q琼脂糖凝胶强阴离子交换层析洗脱步骤使用pH为6.8-7.2的0.10M-0.18M NaCl/0.01MTris-HCl的缓冲液洗脱。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述Oligo R3反相层析使用pH为6.8-7.2的1-25％乙醇/0.01MTris-HCl的缓冲液以平衡柱床。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述DEAE琼脂糖凝胶弱阴离子交换层析依次包括平衡柱床、上样、洗脱、收集洗脱峰步骤，所述DEAE琼脂糖凝胶弱阴离子交换层析洗脱步骤使用pH为6.8-7.2的0.15-0.3M NaCl/0.01MTris-HCl的缓冲液洗脱。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述Q琼脂糖凝胶强阴离子交换层析和/或DEAE琼脂糖凝胶弱阴离子交换层析使用0.01-0.1M Tris-HCl的缓冲液平衡柱床。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述葡聚糖凝胶S200分子筛层析依次包括平衡柱床、上样、洗脱、收集洗脱峰步骤，所述葡聚糖凝胶S200分子筛层析洗脱步骤使用pH为6.7-7.1的50-100mM NaCl/10-30mM磷酸盐缓冲液洗脱。
10.如权利要求8或权利要求9所述的方法，所述浓缩步骤包括使用0.01-0.03M的NaCl/0.01MTris-HCl缓冲液浓缩含有促红细胞生成素的细胞培养液。
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