CN1549727A - 粘膜炎莫拉氏(布拉汉氏)菌多肽及相应dna片段 - Google Patents

粘膜炎莫拉氏(布拉汉氏)菌多肽及相应dna片段 Download PDF

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Abstract

本发明涉及可用于预防、诊断和/或治疗用途的粘膜炎莫拉氏(布拉汉氏)菌多肽。

Description

粘膜炎莫拉氏(布拉汉氏)菌多肽 及相应DNA片段
发明领域
本发明涉及可用于预防、诊断和/或治疗粘膜炎莫拉氏(布拉汉氏)菌(Moraxella(Branhamella)catarrhalis)感染的多肽，特别是粘膜炎莫拉氏(布拉汉氏)菌的SMC-1和SMC-2多肽。
发明背景
粘膜炎莫拉氏(布拉汉氏)菌为革兰氏阴性双球菌，可引起人体呼吸道感染。目前认为在婴幼儿和儿童中，粘膜炎莫拉氏菌是仅次于肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)引起中耳炎的第三常见致病因。粘膜炎莫拉氏菌还和其他几种类型的感染有关，其中包括鼻窦炎、持续性咳嗽、急性咽喉炎、化脓性角膜炎和新生儿结膜炎。
由于近90％的粘膜炎莫拉氏菌株系对抗生素具有抗性(β-内酰胺酶阳性)，而且复发的中耳炎具有高发病率，因而有必要开发一种能使宿主免受粘膜炎莫拉氏菌感染的疫苗。由粘膜炎莫拉氏菌引起的感染诱导产生针对细菌细胞表面抗原的免疫应答。然而，许多这些表面蛋白质尚未得到鉴定，而且对防护不同株系感染的免疫反应也没有确定。
为了开发一种能使宿主免受粘膜炎莫拉氏菌感染的疫苗，人们主要集中对外膜蛋白质进行尝试，此类蛋白质如名为遍在的表面蛋白质A(UspA)的高分子量蛋白质。该蛋白质被认为是有价值的疫苗备选物，因为在鼠类肺部清除模型中其单克隆抗体和多克隆抗体均表现为具有杀菌和防护功效。然而，该蛋白质对不同的粘膜炎莫拉氏菌株系表现出强烈的差异。除该蛋白质以外，其他粘膜炎莫拉氏菌蛋白质作为潜在疫苗备选物也引发了兴趣。铁传递蛋白结合蛋白暴露于细菌表面，具有保守的抗原决定部位。然而，从一个株系到另一株系蛋白质间存在抗体交叉反应性程度上的偏差。其他一些研究者还关注于45kDa的蛋白质CD(OMP CD)。该蛋白质在粘膜炎莫拉氏菌各株系中高度保守，然而患有慢性梗阻性肺病的成年人中表现出对OMP CD的免疫应答的差异性。
因此对用于预防、诊断和/或治疗粘膜炎莫拉氏(布拉汉氏)菌感染的粘膜炎莫拉氏菌多肽仍然存在仍未满足的需求。
发明概述
从一方面来看，本发明提供一种分离的多聚核苷酸，其编码的多肽与包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的第二多肽有至少70％同一性。
从一方面来看，本发明涉及包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的多肽。
从另一方面来看，提供由本发明的多聚核苷酸编码所得的多肽、药物组合物、包含可操作地与表达控制区相连接的本发明多聚核苷酸的载体，以及转染上述载体的宿主细胞和包含在适于表达的条件下培养上述宿主细胞以生产多肽的方法。
发明简述
图1出示来源于粘膜炎莫拉氏菌株ETSU C-2的SMC-1基因的DNA序列；SEQ ID NOS：1。序列下划线部分表示编码引导肽的区域。
图2出示来源于粘膜炎莫拉氏菌株ETSU C-2的SMC-1多肽的氨基酸序列；SEQ ID NOS：2。序列下划线部分表示35个氨基酸残基的引导肽。
图3出示来源于粘膜炎莫拉氏菌株ETSU C-2的SMC-2基因的DNA序列；SEQ ID NOS：3。序列下划线部分表示编码引导肽的区域。
图4出示来源于粘膜炎莫拉氏菌株ETSU C-2的SMC-2多肽的氨基酸序列；SEQ ID NOS：4。序列下划线部分表示47个氨基酸残基的引导肽。
发明详述
本发明提供分离和纯化的多聚核苷酸，其编码的莫拉氏菌多肽可用于预防、诊断和/或治疗莫拉氏菌感染。
从一方面来看，本发明提供一种分离的多聚核苷酸，其编码的多肽与包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的第二多肽有至少70％同一性。
从一方面来看，本发明提供一种分离的多聚核苷酸，其编码的多肽与包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的第二多肽有至少80％同一性。
从一方面来看，本发明提供一种分离的多聚核苷酸，其编码的多肽与包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的第二多肽有至少95％同一性。
从一方面来看，本发明提供一种分离的多聚核苷酸，其编码的多肽与包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的第二多肽有至少98％同一性。
从一方面来看，本发明提供一种分离的多聚核苷酸，其编码的多肽与包含SEQ ID NOS：2或4序列的第二多肽有至少70％同一性。
从一方面来看，本发明提供一种分离的多聚核苷酸，其编码的多肽与包含SEQ ID NOS：2或4序列的第二多肽有至少80％同一性。
从一方面来看，本发明提供一种分离的多聚核苷酸，其编码的多肽与包含SEQ ID NOS：2或4序列的第二多肽有至少95％同一性。
从一方面来看，本发明提供一种分离的多聚核苷酸，其编码的多肽与包含SEQ ID NOS：2或4序列的第二多肽有至少98％同一性。
从一方面来看，本发明涉及包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的氨基酸序列的多肽。
从一方面来看，本发明涉及包含选自SEQ ID NOS：2和4的氨基酸序列的多肽。
从一方面来看，本发明涉及的多肽特征为其氨基酸序列包含SEQ IDNOS：2，4或其片段或类似物。
从一方面来看，本发明涉及的多肽特征为其氨基酸序列包含SEQ IDNOS：2，或4。
从一方面来看，本发明提供一种多聚核苷酸，其编码包含选自SEQID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的多肽的带有抗原决定部位的一部分。
从一方面来看，本发明提供一种多聚核苷酸，其编码的抗原决定部位带有包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的多肽的一部分。
从一方面来看，本发明涉及包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的多肽的带有抗原决定部位的一部分。
从一方面来看，本发明涉及包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的多肽的带有抗原决定部位的一部分。
从一方面来看，本发明提供一种分离的多聚核苷酸，其包含选自下列的多聚核苷酸：
(a)编码的多肽与包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的第二多肽有至少70％同一性的多聚核苷酸；
(b)编码的多肽与包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的第二多肽有至少80％同一性的多聚核苷酸；
(c)编码的多肽与包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的第二多肽有至少95％同一性的多聚核苷酸；
(d)编码的多肽包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的多聚核苷酸；
(e)编码的多肽能引发具有与包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的多肽的结合特异性的抗体的多聚核苷酸；
(f)编码包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的多肽的带有抗原决定部位的一部分的多聚核苷酸；
(g)包含选自SEQ ID NOS：1，3或其片段或类似物的序列的多聚核苷酸；
(h)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)中的多聚核苷酸互补的多聚核苷酸。
从一方面来看，本发明提供一种分离的多聚核苷酸，其包含选自以下的多聚核苷酸：
(a)编码的多肽与包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的第二多肽有至少70％同一性的多聚核苷酸；
(b)编码的多肽与包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的第二多肽有至少80％同一性的多聚核苷酸；
(c)编码的多肽与包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的第二多肽有至少95％同一性的多聚核苷酸；
(d)编码的多肽包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的多聚核苷酸；
(e)编码的多肽能引发具有与包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的多肽的结合特异性的抗体的多聚核苷酸；
(f)编码包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的多肽的带有抗原决定部位的一部分的多聚核苷酸；
(g)包含选自SEQ ID NOS：1，3的序列的多聚核苷酸；
(h)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)中的多聚核苷酸互补的多聚核苷酸。
从一方面来看，本发明提供一种分离的多肽，其包含选自下列的多肽：
(a)与包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的第二多肽有至少70％同一性的多肽；
(b)与包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的第二多肽有至少80％同一性的多肽；
(c)与包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的第二多肽有至少95％同一性的多肽；
(d)包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的多肽；
(e)能引发具有与包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的多肽的结合特异性的抗体的多肽；
(f)包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的多肽的带有抗原决定部位的一部分；
(g) (a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽，其中N-末端的甲硫氨酸残基已缺失；
(h) (a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽，其中分泌相关的氨基酸序列已缺失。
从一方面来看，本发明提供一种分离的的多肽，其包含选自以下的多肽：
(a)与包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的第二多肽有至少70％同一性的多肽；
(b)与包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的第二多肽有至少80％同一性的多肽；
(c)与包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的第二多肽有至少95％同一性的多肽；
(d)包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的多肽；
(e)能引发具有与包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的多肽的结合特异性的抗体的多肽；
(f)包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的多肽的带有抗原决定部位的一部分；
(g) (a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽，其中N-末端的甲硫氨酸残基已缺失；
(h) (a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽，其中分泌相关的氨基酸序列已缺失。
本领域技术人员会意识到本发明包含DNA分子，即多聚核苷酸序列及其互补序列，其编码类似物，诸如由本专利申请在此描述的这些多肽的突变体、变体、同源物和衍生物。本发明还包括与本发明DNA分子相应的RNA分子。除DNA和RNA分子以外，本发明还包括相应的多肽和特异地与该多肽结合的单特异性抗体。
在另一个实施方案中，本发明的多肽为抗原性的。
在另一个实施方案中，本发明的多肽为免疫原性的。
在另一个实施方案中，本发明的多肽能引发宿主中的免疫应答。
在另一个实施方案中，本发明还涉及能引发具有与上述本发明的多肽的结合特异性的抗体的多肽。
“具有结合特异性”的抗体指抗体识别并与所选的多肽结合，但是基本不识别和结合样品例如生物学样品中的其他分子。可以使用ELISA分析测量特异性结合，其中所选的多肽用作抗原。
依据本发明，生物学研究中的“保护”定义为存活曲线、速率或时期上的显著增加。分别使用对数级检测比较生存曲线和用Fisher精密测试(exact test)比较生存速率和到死亡为止的天数来进行统计学分析，可能有助于计算P值并确定两组之间的差异是否具有统计学上的显著性。通常认为0.05的P值不具有显著性。
从本发明的另一方面来看，提供了本发明多肽的抗原性/免疫原性片段，或其类似物。
本发明中的片段应当包括一个或更多该抗原决定部位区域或者与该区域充分相似以保持其抗原性/免疫原性特性。因此，对于依据于本发明的片段，其同一性程度是相对的，因为按照此处所述可以和多肽或者其类似物的特定部分完全同一。本发明还提供来源于本发明多肽序列的具有至少10个连续的氨基酸残基的片段。在一个实施方案中，有至少15个连续的氨基酸残基。在一个实施方案中，有至少20个连续的氨基酸残基。
本领域技术人员会意识到本发明多肽的类似物还可在本发明中使用，即作为抗原性/免疫原性物质。因此，例如包含一个或多个添加、缺失、替换等的蛋白质或多肽也包含在本发明中。
在此处所使用的，本发明多肽的“片段”、“类似物”或者“衍生物”包括其中用保守或非保守氨基酸残基(优选保守的)替换一个或多个氨基酸残基的多肽，该多肽可能是天然的或非天然的。在一个实施方案中，本发明多肽的衍生物和类似物与图或者片段中所示那些序列有约70％同一性。也就是，70％的残基相同。在另一实施方案中，多肽会具有高于80％的同一性。在另一实施方案中，多肽会具有高于85％的同一性。在另一实施方案中，多肽会具有高于90％的同一性。在另一实施方案中，多肽会具有高于95％的同一性。在另一实施方案中，多肽会具有高于99％的同一性。在另一实施方案中，本发明多肽的类似物只取代、修饰或删除少于20个氨基酸残基，甚至在更优选条件下少于10个。
这些取代对多肽的二级结构和亲水性质具有最低限度的影响。本领域已知优选的取代为保守取代，即替换的残基具有相同的物理或化学特性，例如亲水性、大小、电荷或官能团。这些包括了由Dayhoff，M.in Atlas of Protein Sequence and Structure 5，1978和Argos，P.in EMBO J.8，779-785，1989中所描述的取代。举例来说，无论是天然的还是非天然的氨基酸，归属于以下组之一的代表保守取代：
ala，pro，gly，gln，asn，ser，thr，val；
cys，ser，tyr，thr；
val，ile，leu，met，ala，phe；
lys，arg，orn，his；
以及phe，tyr，trp，his.
优选的取代还包括D-对映异构体将相应L-氨基酸取代。
在另一种方法中，类似物可为融合多肽，所结合的部分可使得纯化更为简单，例如通过有效地将所需多肽进行标记。有可能必须将标记去除，或者可能出现融合肽段自身保留了充分的抗原性质的情况。
同源性百分比定义为同一性的百分比数额与氨基酸类型的相似性或者保守性的百分比数额之和。
在一种实施方案中，本发明多肽的类似物与图中或片段所示的序列有约70％同源性。在另一实施方案中，多肽会具有高于80％的同源性。在另一实施方案中，多肽会具有高于85％的同源性。在另一实施方案中，多肽会具有高于90％的同源性。在另一实施方案中，多肽会具有高于95％的同源性。在另一实施方案中，多肽会具有高于99％的同源性。在另一实施方案中，本发明多肽的类似物只取代、修饰或删除少于20个氨基酸残基，更优选条件下少于10个。
可以使用诸如CLUSTAL这样的程序对氨基酸序列进行比较。该程序对氨基酸序列进行比较并通过适当地在两序列中插入空格找到优化的比对。可以为优化比对进行氨基酸同一性或同源性计算。类似BLASTx的程序会比对出最长的相似序列串并对匹配度赋值。从而可以对发现有相似性的几个区域进行比较，每个区域有不同的分值。本发明中安排有两种同一性分析。
在另一种方法中，类似物或衍生物可以为结合了利于纯化的部分的融合多肽，例如由对所需蛋白质或多肽进行有效标记而实现，可能有必要去除“标记”，或者可能会出现融合肽段自身充分保留有用的抗原特性的情况。
众所周知有可能通过筛选抗原性多肽来确定抗原决定部位区域，即决定多肽抗原性或免疫原性的区域。本领域中进行此类筛选的方法广为人知。因此，本发明中的片段应该包括一个或多个此类抗原决定部位区域或与该区域充分相似并保留其抗原性/免疫原性特性。
从本发明另一方面来看，提供本发明蛋白质或多肽的抗原性/免疫原性片段，或者其类似物或衍生物。
因此，对类似物、衍生物和片段而言，重要的是它们至少在一定程度上具有衍生出它们的蛋白质或多肽的抗原性/免疫原性。
同样还包括融合有其他化合物以改变其生物学或药理学性质的多肽，即用于延长半衰期的聚乙二醇(PEG)；为便于纯化加上的引导或分泌相关的氨基酸序列；原前-和前-序列；以及(多)糖。
此外，在发现具有多态性的氨基酸区域情况下，可有利地改变一个或多个特定氨基酸以更有效地模仿不同莫拉氏菌株系的不同抗原决定部位。
此外，本发明中的多肽可通过对末端胺基酰化进行修饰(例如乙酰化、巯基乙酸酰胺化或如用氨或甲胺进行的末端羧基酰胺化)以提供稳定性、亲水性的增加，利于与支持物或其他分子连接或结合。
多肽片段和类似物的异和同多肽多聚体也包括在内。该多聚体形式包括例如一个或多个以例如生物素结合蛋白/生物素、戊二醛或dimethylsuperimidate之类的交联剂交联的多肽。该多聚体形式还包括包含两或多种前后串连或反向相连的序列的多肽，该多肽从由重组DNA技术产生的多顺反子mRNA生成。
在另一实施方案中，本发明还涉及包含如本申请图中所示的一个或多个多肽或其片段或类似物的嵌合多肽。
在另一实施方案中，本发明还涉及包含两或多种具有选自SEQ IDNOS：2，4或其片段或类似物的序列的多肽的嵌合多肽；只要这些多肽相连形成一条嵌合多肽。
在另一实施方案中，本发明还涉及包含两或多种具有选自SEQ IDNOS：2或4序列的多肽的嵌合多肽；只要这些多肽相连形成一条嵌合多肽。
优选，本发明多肽的片段、类似物或衍生物包含至少一个抗原性区域，即至少一个抗原决定部位。
为了实现形成抗原性多聚体(即合成的多聚体)，给多肽加上二卤乙酰基(bishaloacetyl)、硝基芳香卤化物等，带此类试剂具有对含硫基团的特异性。因此，不同多肽间两个巯基的连接可能形成一个单键，或者由含至少两个碳原子的连接基团组成，典型的常为至少4个，而且不超过16个，但是通常不超过14个碳原子。
在一个特定实施方案中，本发明的多肽片段和类似物不包含如甲硫氨酸(Met)或缬氨酸的起始残基。优选，多肽不结合引导或分泌序列(信号序列)。本发明多肽的信号部分可以根据已有的分子生物学技术测定。通常，目的多肽可以从莫拉氏菌培养物中分离，随后可测序确定成熟蛋白质的起始残基以及成熟多肽的序列。
需知可以在没有起始密码子(甲硫氨酸或缬氨酸)和/或没有引导肽的情况下生产和/或使用多肽以协助生产和纯化重组多肽。已经知道在没有编码引导肽的序列的情况下克隆基因可以使多肽限制在大肠杆菌(E.coli)的细胞质内，从而利于其回收(Glick，B.R.和Pasternak，J.J.(1998)Manipulation of gene expression in prokaryotes.在“Molecular biotechnology：Principles and applications ofrecombinant DNA”中，第二版，ASM Press，Washington DC，p.109-143)。
从本发明另一方面来看，还提供(i)包含本发明多肽以及载体、溶剂或辅助剂的物质的组合物；(ii)包含本发明多肽以及可药用的载体、稀释剂或辅助剂的药物组合物；(iii)包含本发明多肽以及可药用载体、稀释剂或辅助剂的疫苗；(iv)一种诱导宿主体内对莫拉氏菌的免疫反应的方法，通过给宿主施用免疫原性有效量的本发明多肽来引起免疫应答，例如针对莫拉氏菌的保护性免疫应答；以及特别是(v)一种预防和/或治疗莫拉氏菌感染的方法，通过给有需求的宿主施用预防或治疗量的本发明多肽来实现。
从本发明另一方面来看，还提供(i)包含本发明多聚核苷酸以及载体、稀释剂或辅助剂的物质的组合物；(ii)包含本发明多聚核苷酸以及可药用的载体、烯释剂或辅助剂的药物组合物；(iii)一种诱导宿主体内针对莫拉氏菌的免疫反应的方法，通过给宿主施用产生免疫原性有效量的本发明多聚核苷酸来引起免疫应答，例如针对莫拉氏菌的保护性免疫应答；以及特别是(iv)一种预防和/或治疗莫拉氏菌感染的方法，通过给有需求的宿主施用预防或治疗量的本发明多聚核苷酸来实现。
在免疫作用之前，本发明多肽还可与载体蛋白质偶联或缀合，载体蛋白质诸如破伤风毒素、白喉毒素、B型肝炎病毒表面抗原、脊髓灰质炎病毒VP1抗原或任何其他病毒或细菌毒素或抗原或者是任何适于刺激形成更强免疫应答的蛋白质。这种偶联或缀合可以通过化学或遗传手段完成。在Van Regenmortel，M.H.V.，Briand J.P.，MullerS.，Plau é S.的《Synthetic Polypeptides as antigens》inLaboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Vol.19(ed.)Burdou，R.H.和Van Knippenberg P.H.(1988)，Elsevier New York中有对肽载体缀合更为详细的描述。
从本发明另一方面来看，提供包含与可药用的辅助剂混和的一或多种本发明莫拉氏菌多肽的药物组合物。合适的辅助剂包括(1)水包油，如MF59TM，SAFTM，RibiTM；(2)弗氏完全或不完全佐剂；(3)盐，即AlK(SO4)2、AlNa(SO4)2、AlNH4(SO4)2、Al(OH)3、AlPO4、二氧化硅、高岭土；(4)皂苷衍生物如StimulonTM或者由其生成的诸如ISCOMs(免疫刺激复合物)之类颗粒；(5)细胞因子，例如白细胞介素、干扰素、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)；(6)其他物质比如碳多聚核苷酸，即用于诱导粘膜免疫的多聚IC和多聚AU、去毒的霍乱毒素(CTB)和大肠杆菌热变毒素。在M.Z.I Khan等人在Pharmaceutical Research，vol.11，No.1(1994)pp2-11的综述和另一篇Gupta等人在Vaccine Vol.13，No.14，pp1263-1276(1995)的综述和WO99/24578中有对辅助剂更为详细的描述。优选辅助剂包括QuilATM、QS21TM、AlhydrogelTM和AdjuphosTM。
本发明的药物组合物可通过注射、快速输液、鼻咽吸收、皮肤吸收或口腔或口咽吸收在肠胃外施用。
术语“药物组合物”的含义还包括抗体。在本发明中，还提供一种或多种具有针对本发明多肽的结合特异性的抗体，在治疗或预防莫拉氏菌感染和/或由莫拉氏菌介导的疾病和症状中的用途。
本发明的药物组合物用于治疗或预防如E.J.Baron，M.A.Pfaller，F.C.Tenover和R.H.Yolken所著Manual of ClinicalMicrobiology，P.R.Murray(Ed，in chief)，ASM Press，Washington，D.C.1999第七版1773p中所描述的莫拉氏菌感染和/或由莫拉氏菌介导的疾病和症状。在一个实施方案中，本发明的药物组合物用于对中耳炎、鼻窦炎、持续性咳嗽、急性咽喉炎、化脓性角膜炎、新生儿结膜炎(conjunctivitis neonatorum)和侵染性疾病的预防性和治疗性处理，包括对宿主施用预防或治疗量的本发明组合物。在一个实施方案中，本发明的药物组合物用于治疗或预防莫拉氏菌感染和/或由莫拉氏菌介导的疾病和症状。在另一实施方案中，莫拉氏菌感染为粘膜炎莫拉氏菌感染。
在另一实施方案中，本发明提供一种对易受莫拉氏菌感染的宿主进行针对莫拉氏菌感染的预防性或治疗性处理的方法，包括对宿主施用预防或治疗量的本发明组合物。
在本申请中所使用的术语“宿主”包括哺乳动物。在另一实施方案中，哺乳动物指人。在另一实施方案中，人指的是新生儿、婴幼儿和儿童。在另一实施方案中，人指的是成年人。
在一个特殊实施方案中，药物组合物施用于那些有风险受莫拉氏菌感染的宿主，例如婴幼儿、上了年纪以及免疫妥协的宿主。
优选药物组合物为单位剂量形式，其为约0.001至100μg/kg(抗原/体重)，且更优选为0.01至10μg/kg以及最优选为0.1至1μg/kg，施用一至三次，每次免疫间有约1至6周的间隔。
优选药物组合物为单位剂量形式，其为约0.1μg至10mg，且更优选为1μg至1mg以及最优选为10至100μg，施用一至三次，每次免疫间有约1至6周的间隔。
从另一方面来看，发明提供编码特征为其氨基酸序列包含SEQ IDNOS：2，4或其片段或类似物的多肽的多聚核苷酸。
在一个实施方案中，多聚核苷酸为在SEQ ID Nos：1，3中所示可能包括开放阅读框(ORF)的那些序列，其编码本发明的多肽。
需知在图中所示的多聚核苷酸序列可由简并密码子替换但仍然编码本发明的多肽。相应地本发明另外提供与上述多聚核苷酸序列(或者上述序列的互补序列)杂交的在序列之间有70％同一性的多聚核苷酸。在一个实施方案中，序列之间至少有80％同一性。在一个实施方案中，序列之间至少有85％同一性。在一个实施方案中，序列之间至少有90％同一性。在另一实施方案中，多聚核苷酸在严紧条件能杂交，即具有至少95％同一性。在另一实施方案中，同一性高于97％。
杂交的适合的严紧条件可以很容易地由本领域技术人员进行确定(示例参见Sambrook等人，(1989)Molecular cloning：A LaboratoryManual，2nd ed，Cold Spring Harbor，N.Y.；Current Protocols inMolecular Biology，(1999)，Ausubel F.M.等人编辑，John Wiley &Sons，Inc.，N.Y.)。
在另一实施方案中，本发明提供的多聚核苷酸在严紧条件下与以下任一杂交：
(a)编码多肽的DNA序列，或者
(b)编码的多肽DNA序列的互补序列；
其中该多肽包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列。
在另一实施方案中，本发明提供的多聚核苷酸在严紧条件下与以下任一杂交：
(a)编码多肽的DNA序列，或者
(b)编码的多肽DNA序列的互补序列；
其中该多肽包含选自SEQ ID NOS：2或4序列。
在另一实施方案中，本发明提供的多聚核苷酸在严紧条件下与以下任一杂交：
(a)编码多肽的DNA序列，或者
(b)编码的多肽DNA序列的互补序列；
其中该多肽包含至少10个连续的氨基酸残基，其来源于包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的多肽。
在另一实施方案中，本发明提供的多聚核苷酸在严紧条件下与以下任一杂交：
(a)编码多肽的DNA序列，或者
(b)编码的多肽DNA序列的互补序列；
其中该多肽包含至少10个连续的氨基酸残基，其来源于包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的多肽。
在另一实施方案中，多聚核苷酸编码SEQ ID NOS：2，4中所示的本发明多肽。
在另一实施方案中，多聚核苷酸为SEQ ID NOS：1，3中所示编码本发明多肽的多聚核苷酸。
本领域的技术人员很容易理解到，多聚核苷酸包括了DNA和RNA。
本发明还包括与本申请中所描述的多聚核苷酸互补的多聚核苷酸。
从另一方面来看，提供了一种通过重组技术由在宿主细胞中表达编码上述多肽的多聚核苷酸并将表达的多肽产物回收的生产本发明多肽的方法。或者，多肽还可以根据现有的化学合成技术进行生产，即液相或者固相合成寡聚核苷酸，将其连接起来生产出完整多肽(嵌段连接)。
以下参考文献中描述了获得和测定多聚核苷酸和多肽的常规方法：Sambrook等人，Molecular cloning：A Laboratory Manual，2nded，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；Current Protocols inMolecular Biology，，Ausubel F.M.等人编辑，John Wiley & Sons，Inc.，N.Y.；PCR Cloning Protocols，from Molecular Cloning toGenetic Engineering，Edited by White B.A.，Humana Press，Totowa，New Jersey，1997，490页；Protein Purification，Principles andPractices，Scopes R.K.，Springer-Verlag，New York，3rd Edition，1993，380页；Current Protocols in Immunology，Edited by ColiganJ.E.等人，John Wiley & Sons Inc.，New York。
本发明提供转染有含本发明多聚核苷酸的载体的宿主细胞。
本发明提供一种生产多肽的方法，其包括在适于表达上述多肽的条件下培养本发明的宿主细胞。
重组生产中，宿主细胞被转染有编码本发明多肽的载体，随后在营养培养基中培养，培养基经过调整以适于活化启动子、选择转化株或扩增基因。合适的载体可在所选宿主体内生存和复制，并包含染色体、非染色体和合成DNA序列，例如细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒和来源于质粒和噬菌体DNA重组的载体。使用限制性酶可将多肽序列插入到载体中合适的位点上，从而操作性地与包含启动子、核糖体结合位点(共有序列或Shine-Dalgarno序列)和可选的操纵子(调控元件)的表达控制区相连。对于指定的宿主和载体，人们可以根据现有分子生物学原理(Sambrook等人，Molecular cloning：A Laboratory Manual，2nd ed，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；Current Protoeols in Molecular Biology，，Ausubel F.M.等人编辑，John Wiley & Sons，Inc.，New York)选择适合的个别的表达控制区的组成部分。合适的启动子包括但不只限于LTR或SV40启动子、大肠杆菌lac、tac或trp启动子以及λ噬菌体PL启动子。优选，除了包括选择标记即氨卞青霉素抗性基因以外，载体还会包括一个复制起始点。合适的细菌载体包括pET、pQE70、pQE60、pQE-9、pD10phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、PNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223-3、PKK233-3、pDR540、pRIT5和真核载体pBlueBacIII、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。宿主细胞可为细菌，即如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、链霉菌(Streptomyces)；真菌即如黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulins)；酵母，即糖酵母属(Saccharomyces)或真核生物即CHO、COS。
在培养物中表达多肽时，一般离心收获细胞，然后用物理或化学方法破碎(如果所表达的多肽没有分泌到培养基中)并且保留所得的粗提取物以分离目的多肽。依据多肽的特性可以通过现有技术实现从培养基或溶菌产物纯化多肽，即使用硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、羟磷灰石层析和植物凝集素层析。最终的纯化可通过HPLC实现。
多肽可以在引导或分泌序列存在或不存在的情况下表达。前一种情况下引导肽需要用翻译后处理去除(参见US 4,431,739；US4,425,437；以及US 4,338,397)，或者在纯化所表达的多肽之后用化学方法去除。
从另一方面来看，本发明的莫拉氏菌多肽可用于莫拉氏菌感染的诊断检测，尤其是莫拉氏菌感染。
有几种可能的诊断方法，例如在生物学样品中检测莫拉氏菌个体，或在易受莫拉氏菌感染的宿主体内诊断莫拉氏菌感染，可以进行以下过程：
(a)从宿主中获得生物学样品；
(b)将具有同本发明莫拉氏菌多肽的反应性的抗体或片段与生物学样品一起孵育以形成混合物；并且
(c)检测混合物中特异性结合的抗体或结合片段，这指示莫拉氏菌的存在。
或者，对于在包含或疑似包含针对莫拉氏菌抗原特异的抗体的生物学样品中检测上述抗体的方法可按照以下过程进行：
(a)从宿主中获得生物学样品；
(b)将一种或多种本发明的莫拉氏菌多肽或其片段与生物学样品一起孵育以形成混合物；并且
(c)检测混合物中特异性结合的抗原或结合的片段，这指示莫拉氏菌的存在。
本领域技术人员会承认该诊断检测可具有多种形式，包括例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定或者乳胶粘着测定的免疫学检测，本质上都为了检测在个体中是否存在对所述蛋白质特异的抗体。
利用编码本发明多肽的DNA序列设计DNA探针可用于在疑似包含莫拉氏菌的生物学样品中检测莫拉氏菌的存在。本发明的检测方法包括：
(a)从宿主中获得生物学样品；
(b)将一种或多种具有编码本发明多肽或其片段的DNA序列的DNA探针与生物学样品一起孵育以形成混合物；并且
(c)检测混合物中特异性结合的DNA探针，这指示莫拉氏菌的存在。
本发明的DNA探针还可用于检测循环中的莫拉氏菌，即样品中的莫拉氏菌核酸，作为一种诊断莫拉氏菌感染的方法，例如使用多聚酶链式反应。探针可使用常规方法合成，并可固定在固相载体上，或者使用可探测的标记进行标记。本申请优选的DNA探针为其有与本发明莫拉氏菌多肽的至少6个连续核苷酸互补的序列的寡聚体。在另一实施方案中，优选的DNA探针为具有与本发明莫拉氏菌多肽的至少15个连续核苷酸互补的序列的寡聚体。在另一实施方案中，优选的DNA探针为具有与本发明莫拉氏菌多肽的至少30个连续核苷酸互补的序列的寡聚体。在另一实施方案中，优选的DNA探针为具有与本发明莫拉氏菌多肽的至少50个连续核苷酸互补的序列的寡聚体。
另一检测宿主中莫拉氏菌的诊断方法包括：
(a)用可探测的标记将与本发明多肽或片段有反应活性的抗体标记；
(b)将标记的抗体或标记的片段施用于宿主；并且
(c)检测宿主中特异性结合的标记抗体或标记片段，这指示莫拉氏菌的存在。
本发明另一方面为本发明的莫拉氏菌多肽作为免疫原在生产用于诊断以及特别是治疗莫拉氏菌感染的特异性抗体中的用途。使用合适的筛选方法可以确定合适的抗体，例如通过测量检测模型中特定抗体对莫拉氏菌感染的被动保护能力。此处实施例中所描述的一个动物模型的例子为小鼠模型。抗体可为完整的抗体或为其抗原结合片段，并且可属于任一免疫球蛋白类型。抗体或片段可以来源于动物，特别是来源于哺乳动物，更具体的为来源于鼠、大鼠或人类。其可为天然抗体或其片段，或在需要时为重组抗体或抗体片段。术语重组抗体或抗体片段指使用分子生物学技术生产的抗体或抗体片段。抗体或抗体片段可为多克隆的，或优选为单克隆的。抗体可对莫拉氏菌多肽相关的多个抗原决定部位具有特异性，但优选只对一个抗原决定部位有特异性。
从一个方面来看，本发明提供抗体在预防和/或治疗莫拉氏菌感染中的用途。
另一方面，本发明提供一种在对莫拉氏菌感染易感的宿主中对莫拉氏菌感染进行预防性或治疗性处理的方法，包括对宿主施用预防性或治疗量的本发明药物组合物。
另一方面，编码本发明多肽或其片段、类似物或衍生物的多聚核苷酸可用于DNA免疫接种方法。也就是说，可将其插入到注射后可复制和表达的载体上从而在体内产生抗原性多肽。举例来说，多聚核苷酸可以插入受CMV启动子调控的质粒载体中，该启动子可在真核细胞中产生作用。优选将该载体进行肌肉注射。
本发明的另一方面是针对本发明多肽的抗体在被动免疫中的用途，在此由本发明的多肽引发的抗体以足够量施用于宿主以提供被动免疫。可以使用本申请中所描述的抗体。使用适当的筛选方法可以确定合适的抗体，例如通过测量检测模型中特定抗体对莫拉氏菌感染的被动保护能力而确定。此处实施例中所描述的一个动物模型的例子为小鼠模型。抗体可为完整的抗体或为其抗原结合片段，并且可属于任一免疫球蛋白类型。抗体或片段可以来源于动物，特别是来源于哺乳动物，更具体的为来源于鼠、大鼠或人类。可为天然抗体或其片段，或在需要时可为重组抗体或抗体片段。术语重组抗体或抗体片段指使用分子生物学技术生产的抗体或抗体片段。抗体或抗体片段可为多克隆的，或优选为单克隆的。抗体可对莫拉氏菌多肽上相关的多个抗原决定部位具有特异性，但优选只对一个抗原决定部位有特异性。
对本发明的多聚核苷酸在基因免疫接种的应用中优选使用合适的施用方法或系统，例如直接肌肉注射质粒DNA[Wolf等人HMG(1992)1：363；Turnes等人，Vaccine(1999)，17：2089；Le等人，Vaccine(2000)18：1893；Alves等人，Vaccine(2001)19：788]，注射带有或不带有辅助剂的质粒DNA[Ulmer等人，Vaccine(1999)18：18；MacLaughlin等人，J.Control Release(1998)56：259；Hartikka等人，Gene Ther.(2000)7：1171-82；Benvenisty and Reshef，PNASUSA(1986)83：9551；Singh等人，PNAS USA(2000)97：811]，通过递送复合特异性载体的DNA靶向细胞[Wa等人，J Biol Chem(1989)264：16985；Chaplin等人，Infect.Immun.(1999)67：6434]，注射以不同形式脂质体复合或封裹的质粒[Ishii等人，AIDS Researchand Human Retroviruses(1997)13：142；Perrie等人，Vaccine(2001)19：3301]，用不同的轰击方法施用DNA[Tang等人，Nature(1992)356：152；Eisenbraun等人，DNA Cell Bio1(1993)12：791；Chen等人，Vaccine(2001)19：2908]，以及以活载体形式施用DNA[Tubulekas等人，Gene(1997)190：191；Pushko等人，Virology(1997)239：389；Spreng等人，FEMS(2000)27：299；Dietrich等人，Vaccine(2001)19：2506]。
从一个方面来看，本发明提供抗体在预防和/或治疗莫拉氏菌感染中的用途。
在另一实施方案中，本发明提供本发明的药物组合物在用于莫拉氏菌感染的预防性或治疗性处理药物制造中的用途。
从一个方面来看，本发明提供包含本发明多肽的用于检测或诊断莫拉氏菌感染的试剂盒。
除非另有说明，此处使用的所有技术和科技术语的含义与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义同一。此处所涉及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献均完整引为参考文献。对于冲突的地方，由包括定义在内的本发明书控制。另外，材料、方法以及实施例仅为示例性质，并无特定限制。
实施例1
本实施例阐明SMC-1基因以及相应多肽的克隆和分子特性。
从粘膜炎莫拉氏菌株ETSU C-2基因组DNA上用PCR方法(DNAThermal Cycler GeneAmp PCR systerm 2400 Perkin Elmer，San Jose，CA)扩增粘膜炎莫拉氏菌SMC-1(SEQ ID NO：1)的编码区，扩增使用包含用于添加限制性酶切位点NcoI(CCATGG)和XhoI(CTCGAG)碱基扩展区的寡聚核苷酸：RIOS30(5’-TATGTACCATGGCTGAACTCAATACCAGCCGTTCA-3’)和RIOS31(5’-GGCATGCTCGAGGTAATCATGTCTCCAAGCATTTTG-3’)。根据制造商的说明使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Chatsworth，CA)从琼脂糖凝胶中纯化PCR产物，并用NcoI和XhoI(Amersham PharmaciaBiotech，Inc，Baie d’Urf é，Canada)消化。用NcoI和XhoI消化pET21d(+)载体(Novagen，Madison，WI)并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中纯化产物。将NcoI-XhoI PCR产物和NcoI-XhoI pET21d(+)表达载体相连。根据Simanis的方法(Hanahan，D.DNA Cloning，1985，D.M.Glover(ed)，pp.109-135)将连接产物转化到大肠杆菌菌株DH5α中[φ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169 endA1 recA1 hsdR17(rκ-mκ+)deoR thi-1supE44λ- gyrA96 relA1](Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。使用Qiagen试剂盒纯化包含SMC-1基因的重组pET21d(+)质粒(r pET21d(+))并对DNA插入序列测序(Taq Dye Deoxy Terminator CycleSequencing试剂盒，ABI，Foster City，CA)。
表格1. PCR扩增粘膜炎莫拉氏菌基因所用的寡聚核苷酸引物。
基因   引物I.D.(识别号)   限制性酶切位点    载体                  序列(SEQ ID No)
SMC-1    RIOS30    NcoI    pET21d(+)     5’-TATGTACCATGGCTGAACTCAATACCAGCCGTTCA-3’(SEQ ID No：5)
SMC-1    RIOS31    XhoI    pET21d(+)     5’-GGCATGCTCGAGGTAATCATGTCTCCAAGCATTTTG-3’(SEQ ID No：6)
SMC-1    RIOS187    BglII    PCMV-GH     5’-GGCAGATCTTGGAACTCAATACCAGCCGTTC-3’(SEQ ID No：7)
SMC-1    RIOS188    SalI    PCMV-GH     5’-ACGCGTCGACTTAGTAATCATGTCTCCAAGCAT-3’(SEQ ID No：8)
SMC-2    RIOS20    NdeI    pET21d(+)     5’-CGTACCAGCACATATGAATAAACAAAACGCCAATCAA-3’(SEQ ID No：9)
SMC-2    RIOS21    XhoI    pET21d(+)     5’-GCCCATCTCGAGTTGCGATTCTGTCTCTGCC-3’(SEQ ID No：10)
SMC-2    RIOS189    BamHI    pCMV-GH     5’-CGAGGATCCTAATAAACAAAACGCCAATCAAAC-3’(SEQ ID No：11)
SMC-2    RIOS190    HindII    pCMV-GH     5’-CAGAAGCTTTTATTGCGATTCTGTCTCTGCC-3’(SEQ ID No：12)
已经确定编码SMC-1多肽的开放阅读框(ORF)含2781-bp(碱基对)并编码有926个氨基酸残基的多肽，预测pI为6.31，预测分子量为104054.84Da。使用Spscan软件(Wisconsin Sequence AnalysisiPackage；Genetics Computer Group)对预测的氨基酸残基序列(SEQID NO：2)进行分析，结果表明存在35个氨基酸残基的信号肽(MHTAHHHRSKTYLTTAIRYALFGIASLPFVIPTYA)，信号肽终止于位于丙氨酸和谷氨酸残基之间的切割点。
为了确定通过PCR扩增后SMC-1基因(SEQ ID NO：1)的存在，使用了由East Tennessee State University(东田纳西州立大学)提供的粘膜炎莫拉氏菌的3个不同的菌株：粘膜炎莫拉氏菌ETSU C-2、ETSU T-25以及ETSU 658临床分离株。实验中使用大肠杆菌XL1-BlueMRF’作为负对照。SMC-1基因(SEQ ID NO：1)从3个粘膜炎莫拉氏菌和作对照的大肠杆菌菌株的基因组DNA上用PCR方法(DNA ThermalCycler GeneAmp PCR systerm 2400 Perkin Elmer)扩增，使用寡聚核苷酸引物RIOS30和RIOS31(表格1)。PCR进行过程包括94℃下15秒5个循环，47℃下30秒以及68℃下3分钟，随后是30个循环的94℃下15秒、63℃下30秒和68℃下3分钟，最后为68℃下5分钟延伸时期。在1％的琼脂糖凝胶中对PCR产物按分子大小进行分离，并用溴乙啶染色观察。表格2出示了PCR扩增的结果。对扩增产物的分析表明在所检测的3种粘膜炎莫拉氏菌菌株中均存在SMC-1基因(SEQ ID NO：1)。而在作对照的大肠杆菌DNA中用这些寡聚核苷酸引物进行同样的PCR扩增时没有检测到此类产物。
表格2.通过PCR扩增确定粘膜炎莫拉氏菌的基因。
菌株识别号 通过PCR扩增验证结果
 SMC-1   SMC-2
 ETSU C-2   +   +
 ETSU 658   +   +
 ETSU T-25   +   +
 大肠杆菌   -   -
实施例2
本实施例阐明SMC-2基因以及相应多肽的克隆和分子特性。从粘膜炎莫拉氏菌株ETSU C-2基因组DNA上用PCR方法(DNA ThermalCycler GeneAmp PCR systerm 2400 Perkin Elmer，San Jose，CA)扩增粘膜炎莫拉氏菌SMC-2(SEQ ID NO：3)的编码区，扩增使用包含用于添加限制性酶切位点NcoI(CCATGG)和XhoI(CTCGAG)的碱基扩展区的寡聚核苷酸：RIOS20和RIOS21，二者已在表格1中列出。将SMC-2基因克隆到表达载体并进行测序的方法与实施例1中所描述的方法类似。
已经确定编码SMC-2的开放阅读框(ORF)含957-bp(碱基对)并编码有318个氨基酸残基的多肽，预测pI为5.78，预测分子量为35954.10Da。使用Spscan软件(Wisconsin Sequence AnalysisiPackage；Genetics Computer Group)对预测的氨基酸残基序列(SEQID NO：4)进行分析，结果表明存在47个氨基酸残基的信号肽(VGKIMSKIPMMNEKYFRRQALYWLIAAAIMAGLWLIVWLTSSVPAMI)，信号肽终止于位于异亮氨酸和天冬氨酸残基之间的切割点。
使用寡聚核苷酸引物RIOS20和RIOS21进行PCR，结果表明在3个受检测粘膜炎莫拉氏菌菌株中存在SMC-2基因。对SMC-2基因使用的PCR扩增方法与实施例1中所用的相似。而在作对照的大肠杆菌DNA中用这些寡聚核苷酸引物进行同样的PCR扩增时没有检测到此类产物。
实施例3
本实施例阐明粘膜炎莫拉氏菌基因在CMV质粒pCMV-GH中的克隆。
将粘膜炎莫拉氏菌多肽的DNA编码区同相位地插入到载体pCMV-GH(Tang等人，Nature，1992，356：152)中受质粒巨细胞病毒(CMV)启动子转录调控的人类生长激素(hGH)基因的下游。CMV启动子在大肠杆菌细胞中不具备功效，但在施用于真核细胞时表现出活性。载体上还插入了氨卞青霉素抗性基因。
从粘膜炎莫拉氏菌株ETSU C-2的基因组DNA上将不含引导肽的SMC-1(SEQ ID NO：1)和SMC-2(SEQ ID NO：3)编码区通过PCR扩增，扩增使用包含用于添加限制性酶切位点BamHI(GGATCC)、BglII(AGATCT)、SalI(GTCGAC)或HindIII(AAGCTT)碱基扩展区的寡聚核苷酸，表格1中已列出。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)将PCR产物从琼脂糖凝胶中纯化，并用限制性酶消化(AmershamPharmacia Biotech，Inc)。pCMV-GH载体(Dr.Stephen A.Johnson的实验室，得州大学生化系Dallas，Texas)用BamHI、BglII、SalI或HindII消化并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中纯化。将消化的DNA片段和消化后的pCMV-GH载体连接生成在CMV启动子调控下的hGH-SMC-1和hGH-SMC-2融合多肽。根据Simanis的方法(Hanahan，D.DNA Cloning，1985，D.M.Glover(ed)，pp.109-135)将连接产物转化到大肠杆菌菌株DH5α中[φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169 endAl recAl hsdR17(rκ-mκ+)deoR thi-1 supE44λ-gyrA96 relA1](Gibco BRL)。使用Qiagen试剂盒将重组pCMV质粒纯化，并通过DNA测序确证插入DNA片段的核酸序列。
实施例4
本实施例阐明DNA在引发对粘膜炎莫拉氏菌多肽抗原的免疫应答中的用途。
8只一组雌性BALB/c小鼠(Charles River，St-constant，Qu ébec，Canada)通过间隔两周或三周三次肌肉注射100μl进行免疫，其中含50μg编码SMC-1(SEQ ID NO：1)和SMC-2(SEQ ID NO：3)基因的重组pCMV-GH，并加有50μg粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)-表达质粒pCMV-GH-GM-CSF(Laboratory of Dr.StephenA.Johnston，Department of Biochemistry，The University ofTexas，Dallas，Texas)。作为对照，对一组小鼠注射50μg pCMV-GH并加有50μg pCMV-GH-GM-CSF。每次免疫之前以及第三次注射后七天从眼眶窦收集血样。通过使用相应His-标签标记的粘膜炎莫拉氏菌重组多肽作为包被抗原用ELISA检测血清抗体反应。实施例5中出示对该His-标签标记的粘膜炎莫拉氏菌重组多肽的生产和纯化。
实施例5
本实施例阐明对粘膜炎莫拉氏菌重组多肽的生产和纯化。
将带有SMC-1(SEQ ID NO：1)和SMC-2(SEQ ID NO：3)基因的重组质粒pET21通过电穿孔(Gene Pulser II apparatus，BIO-RADLabs，Mississauga，Canada)转化到大肠杆菌菌株AD494(DE3)[Δara-leu7697 ΔlacX74ΔphoA PvuII phoR ΔmalF3 F’[lac+(lacIq)pro]trxB：：Kan(DE3)](Novagen)中。在该大肠杆菌菌株中，T7启动子控制表达的重组多肽由T7 RNA聚合酶(在λDE3前噬菌体上携带)特异性识别，该酶的基因由受异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的lac启动子调控。转化体AD494(DE3)/rpET21在250rpm37℃下在每毫升包含100μg羧苄青霉素(Sigma-Aldrich Canada Ltd.，Oakville，Canada)的LB肉汤(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L)中振荡培养至A600值达到0.5。为了诱导生成His-标记的粘膜炎莫拉氏菌重组多肽，在加入终浓度为1mM的IPTG后将细胞再孵育3个小时。500毫升培养液中的受诱导细胞通过离心沉淀并在-70℃冷冻。
通过亲和层析从IPTG-诱导的AD494(DE3)/rpET21的可溶性细胞质部分中纯化重组多肽，依据His·标签序列(6个连续的组氨酸残基)与His·结合金属螯合树脂上固定化的二价阳离子(Ni2+)结合的特性。简而言之，将从500毫升IPTG诱导后的培养液中沉淀得到的细胞在包含1mM PMSF的裂解缓冲液(20mM Tris，500mM氯化钠，10mM咪唑，pH7.9)中重新悬浮，超声波裂解后并在12,000×g离心20分钟去除细胞残骸。上清液加至Ni-NTA琼脂糖柱(Qiagen)。用250mM咪唑500mM氯化钠20mM Tris pH7.9的液体洗脱His-标签标记的粘膜炎莫拉氏菌重组多肽。在4℃用PBS透析去除样品中的盐和咪唑。从大肠杆菌可溶性部分中获得的重组多肽的量通过MicroBCA(Pierce，Rockford，Illinois)测定。
实施例6
本实施例阐明His-标记的粘膜炎莫拉氏菌重组多肽与人腭扁桃体中抗体的反应活性。
如表格3所示，通过存在于人腭扁桃体中的抗体在免疫印迹中对SMC-1和SMC-2的His-标记的重组多肽进行识别。结果表明经常接触粘膜炎莫拉氏菌的人确实生成了对这些多肽特异作用的抗体。这些特异性的人的抗体可能用于防护粘膜炎莫拉氏菌感染。
表格3.免疫印迹中人腭扁桃体中的抗体对粘膜炎莫拉氏菌His-标记的融合重组多肽的反应活性。
纯化的重组多肽识别号1 表观分子量(kDa)2 免疫印迹中与腭扁桃体中的抗体的反应活性3
SMC-1  104  +
SMC-2  36  +
1将如实施例5中所述生产并纯化的His-标记重组多肽用于免疫印迹。
2通过SDS-PAGE测定His-标记重组多肽的分子量。
3人腭扁桃体的提取物未经稀释以用于免疫印迹。
实施例7
本实施例阐明在粘膜炎莫拉氏菌株表面的SMC-1和SMC-2多肽对抗体的可接近性。
细菌在包含1％右旋葡萄糖的脑心浸液(BHI)肉汤及含8％CO2的空气中37℃培养至OD490nm值为0.650(约108CFU/ml)。随后加入抗-SMC-1或抗-SMC-2或者对照血清的稀释液，并使之与细胞结合，细胞在振荡下4℃孵育2小时。用封闭缓冲液[含2％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)]清洗样品4次，然后加入1ml特意用封闭缓冲液稀释的山羊耦连荧光素(FITC)的抗-鼠IgG Fc(γ)片段。在室温下振荡避光再孵育60分钟后，用封闭缓冲液清洗样品4次，并用含0.25％甲醛的PBS缓冲液在4℃固定18小时。将细胞离心并用0.5毫升PBS缓冲液重新悬浮。细胞在流式细胞仪(Epics XL；BeckmanCoulter，Inc.)分析之前一直保持4℃避光。流式细胞仪分析表明SMC-1和SMC-2特异性抗体有效地识别在所测试的同源的(ETSU C-2)粘膜炎莫拉氏菌株(表格4)相应的表面暴露的抗原决定部位。已经测定在分析的10,000个莫拉氏菌细胞中超过89％标记了SMC-1和SMC-2特异性血清中的抗体。另外在SMC-1和SMC-2特异性血清池中的抗体附着于粘膜炎莫拉氏菌ETSU 658菌株(表格4)的表面。而且测定发现本株系的10,000个细胞中，获得特异性抗体标记的细胞超过90％。这些发现明确地证明了SMC-1和SMC-2多肽在表面是可接近的，在表面可易于被抗体识别。抗-粘膜炎莫拉氏菌抗体在对粘膜炎莫拉氏菌感染的防护中扮演了重要的角色。
表格4.评价SMC-1和SMC-2特异性抗体在完整粘膜炎莫拉氏菌细胞表面上的附着。
血清识别号    菌株  荧光指数2  标记细胞的百分比％3
SMC-1-特异性血清池1  ETSU C-2  19.8  96.1
 ETSU 658  15.2  93.1
SMC-2-特异性血清池  ETSU C-2  11.0  89.8
 ETSU 658  11.9  90.5
负对照血清池4  ETSU C-2  1.0  1.0
 ETSU 658  1.0  1.0
正对照血清5  ETSU C-2  25.0  97.4
 ETSU 658  19.6  93.3
1间隔两周一共5次对小鼠用混有10μg QuilA辅助剂(Cedarlane实验室，Hornby，Canada)的20μg纯化的重组多肽进行皮下注射。血清稀释50倍。
2计算的荧光指数来源于用免疫血清标记细胞后获得的荧光值的中值除以对照小鼠血清所得的荧光值。荧光值为1表明在完整粘膜炎莫拉氏菌细胞表面上未结合有抗体。
3％为10,000个受分析的细胞中标记的细胞。
4存积从未免疫或假阳性免疫的小鼠中收集的血清，稀释50倍，用作本检测的负对照。
5用来源于粘膜炎莫拉氏菌株ETSU-C2的20μg纯化的外膜多肽免疫小鼠，从该小鼠中获得的血清样品稀释1000倍作为本检测的正对照。
实施例8
本实施例阐明抗-SMC-1和抗-SMC-2小鼠血清的杀菌活性。
将细菌涂布在巧克力琼脂平板上并在含8％CO2的空气中于37℃培养16小时。然后用溶菌缓冲液[10％Hank’s平衡盐溶液(HBSS)和1％水解酪蛋白，pH值7.3]将细菌细胞重新悬浮至OD490nm值为0.25，并稀释至8×104CFU/ml。将25μl菌悬浮液与50μl稀释的热失活检测血清以及15μlHBSS混和，在8％CO2中37℃振荡(200rpm)孵育15分钟进行杀菌检测。然后加入兔的含补体的血清至终浓度10％，然后在8％CO2气氛于37℃再孵育60分钟。在孵育结束时，将10μl检测混和液涂布在巧克力琼脂平板上以检测存活细菌数量。平板在8％CO2中37℃培养18-24小时。将细菌与从免疫前小鼠中收集的热失活血清和兔补体一起孵育组成对照。和对照相比造成杀死50％或更多细菌的最高血清稀释度决定了杀菌滴度。使用粘膜炎莫拉氏菌株ETSU 658评价血清的杀菌活性。对粘膜炎莫拉氏菌株ETSU 658的杀菌活性以从用20μg纯化的重组SMC-1或SMC-2多肽免疫5次的小鼠中收集的血清进行测定。
实施例9
本实施例阐明由免疫接种诱导小鼠对粘膜炎莫拉氏菌感染的防护。
使用带有10％QuilA辅助剂(Cedarlane Laboratories Ltd)的20μg亲和纯化的His-标记的粘膜炎莫拉氏菌重组多肽对10只一组雌性BALB/c小鼠(Charles River)间隔两周地皮下免疫5次，或用只含QuilA辅助剂的PBS免疫作为对照。在每次免疫之前的第0、14、28、42和56天以及第五次注射后的第14天(第70天)从眼眶窦收集血样。一周之后在肺内施用约1×106CFU的粘膜炎莫拉氏菌株ETSU658对小鼠进行免疫攻击。将粘膜炎莫拉氏菌接种体的样品涂布于巧克力琼脂平板以测定CFU值来确定免疫攻击剂量。腹膜腔注射戊巴比妥钠(EuthanylTM)5小时后将小鼠杀死。将完好的肺切除并用组织匀浆器匀浆。通过连续稀释涂布平板测定肺匀浆中细菌的清除程度以确定CFU值。
                            序列表
<110>Shire Biochem Inc.
<120>粘膜炎莫拉氏(布拉汉氏)菌多肽及相应DNA片段
<130>74872-86
<150>US 60/314,634
<151>2001-08-27
<160>14
<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>2781
<212>DNA
<213>粘膜炎莫拉氏菌
<400>1
atgcacaccg ctcatcacca tcgctcaaag acatatttga ctaccgctat tcgttacgca    60
ctatttggta tcgccagttt gccatttgtc ataccaactt atgcagaact caataccagc    120
cgttcactga cagtcgttgg tgctgacagc tcaaaaaatt tgcctgatac accaaatacc    180
aaacccaata ctgtcttagc cttagacgcc catctacaaa gtcatgatga tactgccaat    240
gcctttgatg gctttgattt tgaagttatc acacagcagg cagccgagca gacaagcagt    300
caagcaaatc aaggcaatca tcagatgagc cagcttgacg cctttgctag taagtcagac    360
aatccaagtt taaacactgc caggctgacg gataagcatg atacaccctc tgccagtaaa    420
agcttagcca aattagccga aaactaccat attaagtccg atccagacgc tcatcgttgt    480
cagggtatgt ggatgcagcc aatccaccaa gcaacacaca caaaccgccc taccacccca    540
aaactggatg aaaatggtaa tccgattaca gaagatggta tttttgctca agctgattat    600
ggatattatg acgctcaaac ttatgccgaa ctgtctggca atgtcattat ggaacaaaac    660
ggtcggcgtg taaccgctga taagcttact ttagacaccc aaacagggca agccactgcg    720
tcaggtcaag tacaatttag tgatggcggt gcaagtgatc acagtgctgg cattattggc    780
atggctgaaa acttagtata ccatacagat ggtcagacag cgaccgcaca agatgttgct    840
tttgcaagca ctaccatcaa tgctcacggt tatgccagtc aaatggataa aataagcagt    900
agcgaatatc ggcttcaaca tgtcatgttc accacctgtc cacccacaga acgcaaatgg    960
tacttagata ctgatagcat tgatatcaat accgatacag gtcgtgctat cgccaaaaat    1020
accaccttgc gtatcaaaaa agtacctgtc ttttacctgc cctattttaa ctttccgatc    1080
gatgctcgtc gctcttctgg atttttatta ccatcaatgg gatttggtgc atcggacagt    1140
tttgaaatta gtacgcctta ttatctgaat ttggcaccag attatgatgc aaccattacg    1200
ccaactgtat ttactaaccg caatcctatg ctgactggcg aatttcgtta tctgacccaa    1260
gattatggat caggggtgtt gactgcttcg tatcttccaa aagatcagca atatcatgat    1320
aaagaccgta gccgaataca atttgatcat acatggcaac ccaagcagtt tgataaaatt    1380
accacttacg cacaatatca atctgtttct gatgccaatt atttatcaga ctttaatgcc    1440
ttgggtgttg agagtgctaa gctaaatcta ccaagacgca tcggcacaag cttcttggat    1500
gaaaatgtct cagctgattt aagatttgaa gattttcagc gtttagacgg ttttggctta    1560
gatggtcggc caattacaga caaagataga ccatatgcac gcctaccaca gctatcggtc    1620
aactatcgtt tgcctcgcat atggatgggt acacccagcg gtcttgaact gggtggtatt    1680
cataattctg cctatttcaa aaaatccatt aaagataact ctgaaccaga aaaaagcggt    1740
ggtagaatat ttaaccaatt cacagccagt tatccactgc ttcgctcttg gggttatttg    1800
acgccaaaac ttagcctgac acatctatat accagctatg acgaagacag cttagccgac    1860
caaaatatcg ctaagaaaaa tggtcgccat tcggtatttg caccgacggt cagcttggat    1920
gctgggctat tttttgaaaa agcgggtgca ccatttggca tgcatcaaga tacaggtggc    1980
tatcaagtac tgacaccaag attacactat acttacacgc cttttaaaga tcaacacaat    2040
gtaccaaatt ttgagacaaa aattgcacag cttagctatg agcagctttt gaacaataac    2100
tggtttttgg gtcatgatcg cattcaagat ttacacgccg tcacgcctgc agtcagctac    2160
cgttatatag ataaaatggg caggacacgc tttgaaggcg ggatcgcaga acagatttta    2220
ttgagtcata tccgtgttgg tatcaatgac agcgaaagct atagcagcag aagctctggt    2280
ttggcatggc aagccagcct acagccaaaa gacaatttat ggtttgatgc atcaggttca    2340
tttagaacaa attatgattt gagcagtatt gtggcacaaa ttcgctatcg tccaagtgat    2400
cgtaagttat ttaacctagg tattgtcaaa agaaaagaaa atcgtgcttt taatcaatca    2460
gcattatcag catatactgc ctccgccatt tttccaatca ataatcgctg gcgtatgatg    2520
ggtcaactac aatacgacta caacttagat tatgtcatgg attctttgat ggggctaaat    2580
tatgaagatt gctgttatgg tttgtcaatc tatgcaagac gctatcgtga tgctttcaat    2640
ccacatttat cacctgatac tgcagtaatg gcagaagttc gcctaaacgg tatcggtggc    2700
ggcggtcgtt tgaatcgact tttgagcgaa aaggtactag gctatgatca ggttcgaaat    2760
gcttggagac atgattacta a                                              2781
<210>2
<211>926
<212>PRT
<213>粘膜炎莫拉氏菌
<400>2
Met His Thr Ala His His His Arg Ser Lys Thr Tyr Leu Thr Thr Ala
1               5                   10                  15
Ile Arg Tyr Ala Leu Phe Gly Ile Ala Ser Leu Pro Phe Val Ile Pro
            20                  25                  30
Thr Tyr Ala Glu Leu Asn Thr Ser Arg Ser Leu Thr Val Val Gly Ala
        35                  40                  45
Asp Ser Ser Lys Asn Leu Pro Asp Thr Pro Asn Thr Lys Pro Asn Thr
    50                  55                  60
Val Leu Ala Leu Asp Ala His Leu Gln Ser His Asp Asp Thr Ala Asn
65                  70                  75                  80
Ala Phe Asp Gly Phe Asp Phe Glu Val Ile Thr Gln Gln Ala Ala Glu
                85                  90                  95
Gln Thr Ser Ser Gln Ala Asn Gln Gly Asn His Gln Met Ser Gln Leu
            100                 105                 110
Asp Ala Phe Ala Ser Lys Ser Asp Asn Pro Ser Leu Asn Thr Ala Arg
        115                 120                 125
Leu Thr Asp Lys His Asp Thr Pro Ser Ala Ser Lys Ser Leu Ala Lys
    130                 135                 140
Leu Ala Glu Asn Tyr His Ile Lys Ser Asp Pro Asp Ala His Arg Cys
145                 150                 155             160
Gln Gly Met Trp Met Gln Pro Ile His Gln Ala Thr His Thr Asn Arg
                165                 170             175
Pro Thr Thr Pro Lys Leu Asp Glu Asn Gly Asn Pro Ile Thr Glu Asp
            180                 185             190
Gly Ile Phe Ala Gln Ala Asp Tyr Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Thr Tyr
        195                 200             205
Ala Glu Leu Ser Gly Asn Val Ile Met Glu Gln Asn Gly Arg Arg Val
    210                 215             220
Thr Ala Asp Lys Leu Thr Leu Asp Thr Gln Thr Gly Gln Ala Thr Ala
225                 230             235                     240
Ser Gly Gln Val Gln Phe Ser Asp Gly Gly Ala Ser Asp His Ser Ala
                245             250                     255
Gly Ile Ile Gly Met Ala Glu Asn Leu Val Tyr His Thr Asp Gly Gln
            260                 265                 270
Thr Ala Thr Ala Gln AsD Val Ala Phe Ala Ser Thr Thr Ile Asn Ala
        275                 280                 285
His Gly Tyr Ala Ser Gln Met Asp Lys Ile Ser Ser Ser Glu Tyr Arg
    290                 295                 300
Leu Gln His Val Met Phe Thr Thr Cys Pro Pro Thr Glu Arg Lys Trp
305                 310                 315                 320
Tyr Leu Asp Thr Asp Ser Ile Asp Ile Asn Thr Asp Thr Gly Arg Ala
                325                 330                 335
Ile Ala Lys Asn Thr Thr Leu Arg Ile Lys Lys Val Pro Val Phe Tyr
            340                 345                 350
Leu Pro Tyr Phe Asn Phe Pro Ile Asp Ala Arg Arg Ser Ser Gly Phe
        355                 360                 365
Leu Leu Pro Ser Met Gly Phe Gly Ala Ser Asp Ser Phe Glu Ile Ser
    370                 375                 380
Thr Pro Tyr Tyr Leu Asn Leu Ala Pro Asp Tyr Asp Ala Thr Ile Thr
385                 390                 395                 400
Pro Thr Val Phe Thr Asn Arg Asn Pro Met Leu Thr Gly Glu Phe Arg
                405                 410                 415
Tyr Leu Thr Gln Asp Tyr Gly Ser Gly Val Leu Thr Ala Ser Tyr Leu
            420                 425                 430
Pro Lys Asp Gln Gln Tyr His Asp Lys Asp Arg Ser Arg Ile Gln Phe
        435                 440                 445
Asp His Thr Trp Gln Pro Lys Gln Phe Asp Lys Ile Thr Thr Tyr Ala
    450                 455                 460
Gln Tyr Gln Ser Val Ser Asp Ala Asn Tyr Leu Ser Asp Phe Asn Ala
465                 470                 475                 480
Leu Gly Val Glu Ser Ala Lys Leu Asn Leu Pro Arg Arg Ile Gly Thr
                485                 490                 495
Ser Phe Leu Asp Glu Asn Val Ser Ala Asp Leu Arg Phe Glu Asp Phe
            500                 505                 510
Gln Arg Leu Asp Gly Phe Gly Leu Asp Gly Arg Pro Ile Thr Asp Lys
        515                 520                 525
Asp Arg Pro Tyr Ala Arg Leu Pro Gln Leu Ser Val Asn Tyr Arg Leu
    530                 535                 540
Pro Arg Ile Trp Met Gly Thr Pro Ser Gly Leu Glu Leu Gly Gly Ile
545                 550                 555                 560
His Asn Ser Ala Tyr Phe Lys Lys Ser Ile Lys Asp Asn Ser Glu Pro
                565                 570                 575
Glu Lys Ser Gly Gly Arg Ile Phe Asn Gln Phe Thr Ala Ser Tyr Pro
            580                 585                 590
Leu Leu Arg Ser Trp Gly Tyr Leu Thr Pro Lys Leu Ser Leu Thr His
        595                 600                 605
Leu Tyr Thr Ser Tyr Asp Glu Asp Ser Leu Ala Asp Gln Asn Ile Ala
    610                 615                 620
Lys Lys Asn Gly Arg His Ser Val Phe Ala Pro Thr Val Ser Leu Asp
625                 630                 635                 640
Ala Gly Leu Phe Phe Glu Lys Ala Gly Ala Pro Phe Gly Met His Gln
                645                 650                 655
Asp Thr Gly Gly Tyr Gln Val Leu Thr Pro Arg Leu His Tyr Thr Tyr
            660                 665                 670
Thr Pro Phe Lys Asp Gln His Asn Val Pro Asn Phe Glu Thr Lys Ile
        675                 680                 685
Ala Gln Leu Ser Tyr Glu Gln Leu Leu Asn ASn ASn Trp Phe Leu Gly
    690                 695                 700
His Asp Arg Ile Gln Asp Leu His Ala Val Thr Pro Ala Val Ser Tyr
705                 710                 715                 720
Arg Tyr Ile Asp Lys Met Gly Arg Thr Arg Phe Glu Gly Gly Ile Ala
                725                 730                 735
Glu Gln Ile Leu Leu Ser His Ile Arg Val Gly Ile Asn Asp Ser Glu
            740                 745                 750
Ser Tyr Ser Ser Arg Ser Ser Gly Leu Ala Trp Gln Ala Ser Leu Gln
        755                 760                 765
Pro Lys Asp Asn Leu Trp Phe Asp Ala Ser Gly Ser Phe Arg Thr Asn
    770                 775                 780
Tyr Asp Leu Ser Ser Ile Val Ala Gln Ile Arg Tyr Arg Pro Ser Asp
785                 790                 795                 800
Arg Lys Leu Phe Asn Leu Gly Ile Val Lys Arg Lys Glu Asn Arg Ala
                805                 810                 815
Phe Asn Gln Ser Ala Leu Ser Ala Tyr Thr Ala Ser Ala Ile Phe Pro
            820                 825                 830
Ile Asn Asn Arg Trp Arg Met Met Gly Gln Leu Gln Tyr Asp Tyr Asn
        835                 840                 845
Leu Asp Tyr Val Met Asp Ser Leu Met Gly Leu Asn Tyr Glu Asp Cys
    850                 855                 860
Cys Tyr Gly Leu Ser Ile Tyr Ala Arg Arg Tyr Arg Asp Ala Phe Asn
865                 870                 875                 880
Pro His Leu Ser Pro Asp Thr Ala Val Met Ala Glu Val Arg Leu Asn
                885                 890                 895
Gly Ile Gly Gly Gly Gly Arg Leu Asn Arg Leu Leu Ser Glu Lys Val
            900                 905                 910
Leu Gly Tyr Asp Gln Val Arg Asn Ala Trp Arg His Asp Tyr
        915                 920                 925
<210>3
<211>957
<212>DNA
<213>粘膜炎莫拉氏菌
<400>3
gtgggtaaaa ttatgtcaaa aattcccatg atgaatgaaa agtattttcg tcgtcaggca    60
ctttattggt tgattgcggc ggctatcatg gcaggcttgt ggttgattgt ttggttgacc    120
agctccgtac cagcaatgat taataaacaa aacgccaatc aaacatcgtc ctatgttgcg    180
acattgccga ccacaatcac agcgttaaat gagcttgatc atgttgttaa gcccatggat    240
aattcggcac ttgtgcgaga cttacgcaac tatccacctg aatttaagga caaagtttat    300
tttaatggta ttagtggtcg ttataccatt gagctgatgg atgttaccga aaatgaagtt    360
atcgtggatt atctaaacag ccgagaagat cgtaacaatt ttgcttattt tcgctatact    420
gatgccaatg ataataagcg atatgtactg acttatggta aatttaccag tccagctgat    480
gcagaatctg ctttgcaaac cgtaaatttt agactgccaa aatcagtgat acaaaagacc    540
accaaaatct ctgagttggt cgcagtaatg gacaattatg aattgggtca agatgtggtg    600
gatttggcag acttccagcc tcgccgagtt cgcctgcaag cgacgcgtac cgaaattcca    660
gtcaaagcgg ccacgccagc agatgaagaa ttggcacgcc taagccgtga gcgtgcatta    720
caaacacaaa tttcccagca aactgagtcg gtcaggcagc cgactgattt ggatatccaa    780
aacgatatca atcgtttgtc taatcaaaga tctcaagtca gctctagcga tttgcctatg    840
gcaccaactg cacgcccaca gtcaccgcag caaacagccg atatagtacc caaaaatgaa    900
atatctaaag gcactgcacc aacccaaagc cattcggcag agacagaatc gcaataa       957
<210>4
<211>318
<212>PRT
<213>粘膜炎莫拉氏菌
<400>4
Val Gly Lys Ile Met Ser Lys Ile Pro Met Met Asn Glu Lys Tyr Phe
1               5                   10                  15
Arg Arg Gln Ala Leu Tyr Trp Leu Ile Ala Ala Ala Ile Met Ala Gly
            20                  25                  30
Leu Trp Leu Ile Val Trp Leu Thr Ser Ser Val Pro Ala Met Ile Asn
        35                  40                  45
Lys Gln Asn Ala Asn Gln Thr Ser Ser Tyr Val Ala Thr Leu Pro Thr
    50                  55                  60
Thr Ile Thr Ala Leu Asn Glu Leu Asp His Val Val Lys Pro Met Asp
65                  70                  75                  80
Asn Ser Ala Leu Val Arg Asp Leu Arg Asn Tyr Pro Pro Glu Phe Lys
                85                  90                  95
Asp Lys Val Tyr Phe Asn Gly Ile Ser Gly Arg Tyr Thr Ile Glu Leu
            100                 105                 110
Met Asp Val Thr Glu Asn Glu Val Ile Val Asp Tyr Leu Asn Ser Arg
        115                 120                 125
Glu Asp Arg Asn Asn Phe Ala Tyr Phe Arg Tyr Thr Asp Ala Asn Asp
    130                 135                 140
Asn Lys Arg Tyr Val Leu Thr Tyr Gly Lys Phe Thr Ser Pro Ala Asp
145                 150                 155                 160
Ala Glu Ser Ala Leu Gln Thr Val Asn Phe Arg Leu Pro Lys Ser Val
                165                 170                 175
Ile Gln Lys Thr Thr Lys Ile Ser Glu Leu Val Ala Val Met Asp Asn
            180                 185                 190
Tyr Glu Leu Gly Gln Asp Val Val Asp Leu Ala Asp Phe Gln Pro Arg
        195                 200                 205
Arg Val Arg Leu Gln Ala Thr Arg Thr Glu Ile Pro Val Lys Ala Ala
    210                 215                 220
Thr Pro Ala Asp Glu Glu Leu Ala Arg Leu Ser Arg Glu Arg Ala Leu
225                 230                 235                 240
Gln Thr Gln Ile Ser Gln Gln Thr Glu Ser Val Arg Gln Pro Thr Asp
                245                 250                 255
Leu Asp Ile Gln Asn Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asn Gln Arg Ser Gln
            260                 265                 270
Val Ser Ser Ser Asp Leu Pro Met Ala Pro Thr Ala Arg Pro Gln Ser
        275                 280                 285
Pro Gln Gln Thr Ala Asp Ile Val Pro Lys Asn Glu Ile Ser Lys Gly
    290                 295                 300
Thr Ala Pro Thr Gln Ser His Ser Ala Glu Thr Glu Ser Gln
305                 310                 315
<210>5
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>5
tatgtaccat ggctgaactc aataccagcc gttca                                35
<210>6
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>6
ggcatgctcg aggtaatcat gtctccaagc attttg                               36
<210>7
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>7
ggcagatctt ggaactcaat accagccgtt c                                    31
<210>8
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
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<400>9
cgtaccagca catatgaata aacaaaacgc caatcaa                             37
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<211>31
<212>DNA
<213>人工的
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<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
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<210>13
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
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<223>引物
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tatgtaccat ggctgaactc aataccagcc gttca                                35
<210>14
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>14
ggcatgctcg aggtaatcat gtctccaagc attttg                               36

Claims (31)

1.一种分离的多聚核苷酸，包含选自下列的多聚核苷酸：
(a)编码的多肽与包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的第二多肽有至少70％同一性的多聚核苷酸；
(b)编码的多肽与包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的第二多肽有至少80％同一性的多聚核苷酸；
(c)编码的多肽与包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的第二多肽有至少95％同一性的多聚核苷酸；
(d)编码包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的多肽的多聚核苷酸；
(e)编码的多肽能引发对包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的多肽具有结合特异性的抗体的多聚核苷酸；
(f)编码多肽的带有抗原决定部位的部分的多聚核苷酸，该多肽包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列；
(g)包含选自SEQ ID NOS：1，3或其片段或类似物的序列的多聚核苷酸；
(h)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)中的多聚核苷酸互补的多聚核苷酸。
2.一种分离的多聚核苷酸，包含选自下列的多聚核苷酸：
(a)编码的多肽与包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的第二多肽有至少70％同一性的多聚核苷酸；
(b)编码的多肽与包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的第二多肽有至少80％同一性的多聚核苷酸；
(c)编码的多肽与包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的第二多肽有至少95％同一性的多聚核苷酸；
(d)编码包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的多肽的多聚核苷酸；
(e)编码的多肽能引发对包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的多肽具有结合特异性的抗体的多聚核苷酸；
(f)编码多肽的带有抗原决定部位的部分的多聚核苷酸，该多肽包含选自SEQ ID NOS：2或4的序列；
(g)包含选自SEQ ID NOS：1或3的序列的多聚核苷酸；
(h)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)中的多聚核苷酸互补的多聚核苷酸。
3.权利要求1中的多聚核苷酸，其中该多聚核苷酸为DNA。
4.权利要求2中的多聚核苷酸，其中该多聚核苷酸为DNA。
5.权利要求1中的多聚核苷酸，其中该多聚核苷酸为RNA。
6.权利要求2中的多聚核苷酸，其中该多聚核苷酸为RNA。
7.一种分离的多聚核苷酸，其在严紧条件下与以下任一杂交：
(a)编码多肽的DNA序列，或者
(b)编码多肽的DNA序列的互补序列；
其中该多肽包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列。
8.权利要求1中的多聚核苷酸，其在严紧条件下与以下任一杂交：
(a)编码多肽的DNA序列，或者
(b)编码多肽的DNA序列的互补的序列；
其中该多肽包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列。
9.权利要求2中的多聚核苷酸，其在严紧条件下与以下任一杂交：
(a)编码多肽的DNA序列，或者
(b)编码多肽的DNA序列的互补序列；
其中该多肽包含选自SEQ ID NOS：2或4的序列。
10.权利要求1中的多聚核苷酸，其在严紧条件下与以下任一杂交：
(a)编码多肽的DNA序列，或者
(b)编码多肽的DNA序列的互补序列；
其中该多肽包含至少10个连续的氨基酸残基，后者来源于包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的多肽。
11.权利要求2中的多聚核苷酸，其在严紧条件下与以下任一杂交：
(a)编码多肽的DNA序列，或者
(b)编码多肽的DNA序列的互补序列；
其中该多肽包含至少10个连续的氨基酸残基，后者来源于包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的多肽。
12.一种包含权利要求1中多聚核苷酸的载体，其中所述DNA可操作地连接于表达控制区。
13.一种包含权利要求2中多聚核苷酸的载体，其中所述DNA可操作地连接于表达控制区。
14.一种转染有权利要求12的载体的宿主细胞。
15.一种转染有权利要求13的载体的宿主细胞。
16.一种生产多肽的方法，其包括在适于表达所述多肽的条件下培养根据权利要求14的宿主细胞。
17.一种生产多肽的方法，其包括在适于表达所述多肽的条件下培养根据权利要求15的宿主细胞。
18.一种分离的多肽，其包含选自下列的多肽：
(a)与包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的第二多肽有至少70％同一性的多肽；
(b)与包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的第二多肽有至少80％同一性的多肽；
(c)与包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的第二多肽有至少95％同一性的多肽；
(d)包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的多肽；
(e)能引发对包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的多肽具有结合特异性的抗体的多肽；
(f)包含选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的多肽的带有抗原决定部位的部分；
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽，其中N-末端的甲硫氨酸残基已缺失；
(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽，其中分泌相关的氨基酸序列已缺失。
19.一种分离的多肽，其包含选自下列的多肽：
(a)与包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的第二多肽有至少70％同一性的多肽；
(b)与包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的第二多肽有至少80％同一性的多肽；
(c)与包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的第二多肽有至少95％同一性的多肽；
(d)包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的多肽；
(e)能引发对包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的多肽具有结合特异性的抗体的多肽；
(f)包含选自SEQ ID NOS：2或4序列的多肽的带有抗原决定部位的部分；
(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽，其中N-末端的甲硫氨酸残基已缺失；
(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽，其中分泌相关的氨基酸序列已缺失。
20.一种包含两或多种具有选自SEQ ID NOS：2，4或其片段或类似物的序列的多肽的嵌合多肽；只要这些多肽相连形成一条嵌合多肽。
21.一种包含两或多种具有选自SEQ ID NOS：2或4序列的多肽的嵌合多肽；只要这些多肽相连形成一条嵌合多肽。
22.包含根据权利要求18至21任一项的多肽以及可药用的载体、稀释剂或辅助剂的药物组合物。
23.一种在易受莫拉氏菌感染的宿主中对莫拉氏菌感染进行预防性或治疗性处理的方法，包含对上述宿主施用预防或治疗量的根据权利要求22的组合物。
24.一种根据权利要求23的方法，其中宿主为新生儿、婴幼儿或儿童。
25.一种根据权利要求23的方法，其中宿主为免疫妥协的宿主。
26.一种根据权利要求23的方法，其中宿主为成年人。
27.一种对中耳炎、鼻窦炎、持续性咳嗽、急性咽喉炎、化脓性角膜炎、新生儿结膜炎和侵染性疾病进行预防性或治疗性处理的方法，该方法包含对上述宿主施用预防或治疗量的根据权利要求22的组合物。
28.一种在易受莫拉氏菌感染的宿主体内诊断莫拉氏菌感染的方法，包含
(a)从宿主中获得生物学样品；
(b)将对根据权利要求18至21任一项的多肽具有反应活性的抗体或其片段与生物学样品一起孵育以形成混合物；并且
(c)检测混合物中特异性结合的抗体或结合的片段，这指示莫拉氏菌的存在。
29.一种在包含或疑似包含特异于莫拉氏菌抗原的抗体的生物学样品中检测上述抗体的方法，其包含
(a)从宿主中获得生物学样品；
(b)将一种或多种根据权利要求18至21任一项的多肽或其片段与生物学样品一起孵育以形成混合物；并且
(c)检测混合物中特异性结合的抗原或结合的片段，这指示莫拉氏菌的存在。
30.根据权利要求22的药物组合物在制造用以预防性或治疗性处理莫拉氏菌感染的药物中的用途。
31.包含根据权利要求18至21任一项的多肽的试剂盒，其用于检测或诊断莫拉氏菌感染。
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