CN102861159A - 一种治疗痛经的药物组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种治疗痛经的药物组合物，它含有下述重量配比的原料药制备而成的制剂：柴胡70-210份、白芍140-420份、枳壳70-210份、丹参70-210份、乳香42.5-127.5份、甘草43.5-130.5份、没药42.5-127.5份。本发明还提供了该药物组合物的制备方法和用途。本发明药物疏肝养血、活血止痛，养血以益肝体，行气以助其用，更以活血之品祛其瘀，排其阻，使气顺血通而痛自除，共奏未痛先防、既痛防变之效，用于治疗肝郁血瘀型痛经，疗效肯定，药效明显。

Description

一种治疗痛经的药物组合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种治疗痛经的药物组合物，属药物领域。

背景技术

痛经(dysmenorrhea），是指经期前后或行经期间，出现下腹部痉挛性疼痛，并有全身不适，严重影响日常生活者，分原发性和继发性两种。经过详细妇科临床检查未能发现盆腔器官有明显异常者，称原发性痛经，也称功能性痛经。继发性痛经则指生殖器官有明显病变者，如子宫内膜异位症、盆腔炎、肿瘤等。

原发性痛经〔Primary Dysmenorrhea)属月经病范畴，指生殖器官无明显器质性病变，经行前后或行经期间下腹疼痛，甚至连及腰骸、坠胀感，有时伴有头晕或恶心呕吐，严重者可见面色苍白、周身冷汗出、手足厥冷、剧痛昏倒等危象。原发性痛经好发于15-25岁，其发病率呈逐年升高的趋势，流行病学研究表明，我国发病率为50.06%—76.36%，国外最高达95%，是青春期常见病、多发病。随年龄增长及结婚以后痛经逐渐减轻，妊娠及分娩后消失。现代医学认为原发性痛经病因病机可能与子宫异常收缩及内分泌因素有关，激素失调、子宫内膜、肌层和经血前列腺素(Prosta-glandins，PG)、加压素(Vasopressin，AVP)、内皮素-1(Endothelin-1，ET-1)、催产素(oxytocin，OT)、钙(calcium，Ca)含量过高，β一内啡肽(β-endorphins，β-EP)、一氧化氮(Nitric oxide，N0)水平降低等原因有关。

西医在原发性痛经治疗上，主要采用口服药物、物理、手术等治疗措施对症处理，而以口服非甾体抗炎药及避孕药物为主。其中非甾体抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAID)自20世纪70年代以来，广泛用于治疗原发性痛经，成为治疗原发性痛经的一线药物。但因其副作用多，且只能起到止痛作用，不能从根本上治疗疼痛，需长期服药，随着用药时间的增加易降低患者对药物的敏感性，产生耐药性而降低疗效。消化道症状是NSAIDs最主要的不良反应,从无症状到消化不良、腹痛、溃疡、出血至穿孔等；其次为肝肾损害、皮疹、中枢症状等。此外，除复方丹参滴丸以外的其他NSAIDs，可能增加心血管血栓事件的发生。近年来国外有研究表明:长期服用布洛芬等NSAID药物可能增加妇女乳腺癌风险。口服避孕药对原发性痛经患者有效率高达90%，但此类药物对机体代谢有明显的影响，常引起月经紊乱，因此具有更多的不良反应。

中医学把原发性痛经的病因归为寒、热、虚、实四端，四者或单独成因或复合成因，或互为因果，最终导致冲任失调，不通则痛或不荣则痛，引起痛经的发生，其中不通则痛临床常见。由于本病病程较长、易反复，加之临床辨证分型多种多样，中药汤剂给患者带来了诸多不便。为此，探索临床疗效好，疗程短，易被广大患者接受的中成药具有重要的临床价值。

发明内容

本发明的技术方案是提供了一种治疗痛经的药物组合物，本发明的另一技术方案是提供了该药物组合物的制备方法和用途。

本发明提供了一种治疗痛经的药物组合物，它含有下述重量配比的原料药制备而成的制剂：

柴胡70-210份、白芍140-420份、枳壳70-210份、丹参70-210份、乳香42.5-127.5份、甘草43.5-130.5份、没药42.5-127.5份。

进一步优选地，它是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂：

柴胡105-175份、白芍210-350份、枳壳105-175份、丹参105-175份、乳香64-106份、甘草65-109份、没药64-106份。

更进一步优选地，它是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂：

柴胡140份、白芍280份、枳壳140份、丹参140份、乳香85份、甘草87份、没药85份。

其中，所述的乳香、没药为醋制乳香、醋制没药或炒乳香、没药。所述的柴胡为醋炒柴胡；所述的柴胡来源于竹叶柴胡：竹叶柴胡为伞形科植物膜缘柴胡Bupleurum marginatum Wall.ex DC.、马尾柴胡Bupleurummicrocephalum Diels.、马尔康柴胡Eupleurum malconense Shan et Y.Li或小柴胡Bupleurum tenue Buch.-Ham.ex D.Don的干燥全草；或来源于伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡Bupleurumscorzonerifolium Willd.的干燥根。

本发明药物组合物是由柴胡、白芍、枳壳、丹参、乳香、甘草、没药的原生药粉或水或有机溶剂提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。

其中，所述的制剂是片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液。所述的胶囊剂中每粒含芍药苷不得少于2.50mg。

本发明还提供了一种制备所述的药物组合物的方法，它包括如下步骤：

a、称取原料药；

b、枳壳、乳香、没药采用水蒸气蒸馏法收集挥发油，蒸馏后的水溶液收集备用，药渣备用；

c、将b步骤的挥加油加入以β-环糊精包合，β-环糊精与油的重量配比为：6-10：1，包合物备用；

d、丹参加入60%-80%的乙醇回流提取，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成清膏，药渣备用；

e、将b、d步骤的药渣与柴胡、白芍、甘草加水煎煮，滤过，滤液与b步骤蒸馏后的水溶液混合浓缩，加入d步骤的清膏、c步骤的β-环糊精包合物，混合，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。

其中，d步骤所述的β-环糊精:油比例为10:1，包合条件为：包合温度60℃，包合时间2h；e步骤所述的乙醇浓度为60%。

本发明还提供了所述的药物组合物在制备治疗痛经的药物中的用途。进一步优选地，所述的药物是治疗肝郁血瘀型痛经的药物。

进一步优选地，所述的药物是治疗原发性痛经的药物。

其中，所述的药物是具有镇痛、抗炎，活血化瘀作用，具有调节子宫内膜组织前列腺素、NO、ET-1的分泌，增加外周血清β-内啡肽含量达到缓解疼痛的作用的药物。

据“月节律”气血盈亏变化，女性经前、经期冲任气血由盛而满、由满而溢、由实而虚，气血变化急骤，易失和调，“经欲行而肝不应，则拂其气而痛生。”若素多抑郁，再伤于情怀，令肝气拂郁，气郁不舒，血海气机不利，肝郁血瘀，经血不畅，胞膜瘀阻，不通则痛而发为痛经。本发明药物原料药全方以养血益肝、行气助血、祛瘀止痛为法则，方中醋炒柴胡轻升疏达肝气；枳壳苦降理气行滞，一升一降调达疏理气机；白芍柔肝养阴，甘草缓急，二药合用缓急止痛；丹参活血化瘀，通络止痛，兼以养血；配伍乳香、没药增强活血行气，化瘀定痛之效。本药入肝经血分，能通肝经聚血而理冲任，化瘀血而不伤新血，逐瘀通经而不伤正气。诸药合用疏肝养血、活血止痛，养血以益肝体，行气以助其用，更以活血之品祛其瘀，排其阻，使气顺血通而痛自除，共奏未痛先防、既痛防变之效。该方药简效佳，每年诊治原发性痛经肝郁血瘀型患者1万余例，病员反映效佳。

本发明药物疏肝养血、活血止痛，养血以益肝体，行气以助其用，更以活血之品祛其瘀，排其阻，使气顺血通而痛自除，共奏未痛先防、既痛防变之效，用于治疗肝郁血瘀型痛经，疗效肯定，药效明显。

附图说明

图1正常组大鼠子宫内膜组织HE染色x200

图2痛经模型组大鼠子宫内膜组织HE染色x200

图3本发明药物胶囊组大鼠子宫内膜组织HE染色x200

图4田七痛经胶囊组大鼠子宫内膜组织HE染色X200

图5正常组大鼠子宫内膜组织的PGF2a表达（免疫组化x200）

图6痛经模型组大鼠子宫内膜组PGF2a表达（免疫组化x200）

图7本发明药物胶囊组大鼠子宫内膜组织PGF2a表达（免疫组化x200）

图8田七痛经胶囊组大鼠子宫内膜组织PGF2a表达（免疫组化x200）

图9正常组大鼠子宫内膜组织PGE2的表达（免疫组化x200）

图10痛经模型组大鼠子宫内膜组织PGE2的表达（免疫组化x200）

图11本发明药物胶囊组大鼠子宫内膜组织膜组织PGE2的表达（免疫组化x200）

图12田七痛经胶囊组大鼠子宫内PGE2的表达（免疫组化x200）

具体实施方式

实施例1本发明药物胶囊剂的制备

1、原料药处方

柴胡140g         白芍280g    枳壳140g        丹参140g

乳香（制）85g    甘草87g     没药（制）85g

2、制法

以上七味，枳壳、乳香（制）、没药（制）加10倍量水，水蒸气蒸馏6小时，收集挥发油备用，蒸馏后的水溶液另器收集，挥发油以β-环糊精∶油=10∶1在60℃下包合2小时，包合物备用；丹参加6倍量60%的乙醇回流提取三次，每次1小时，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成清膏；丹参、枳壳、乳香（制）、没药（制）药渣与竹叶柴胡、白芍、甘草加10倍量水煎煮三次，每次1小时，滤过，滤液与蒸馏液减压浓缩至适量，加入上述清膏，继续浓缩至相对密度为1.25～1.35（60℃）稠膏，干燥，粉碎，加入β-环糊精包合物，混匀，制粒，整粒，分装，即得，制备成1000粒胶囊剂。

本发明药物原料药分别来源于：

柴胡：竹叶柴胡：竹叶柴胡为伞形科植物膜缘柴胡Bupleurum marginatumWall.ex DC.、马尾柴胡Bupleurum microcephalum Diels.、马尔康柴胡Bupleurum malconense Shan et Y.Li或小柴胡Bupleurum tenue Buch.-Ham.ex D.Don的干燥全草；或来源于伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根。

白芍：白芍为毛莨科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根。

枳壳：枳壳为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种的未成熟果实。

丹参：丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。

乳香（制）为橄榄科植物卡氏乳香树Boswellia carterii Birdw.及其同属植物皮部渗出的油胶树脂。

没药（制）没药为橄榄科植物没药树Commiphora myrrhaEngl.(C.molmol Engl.)或其他同属植物茎干皮部渗出的油胶树脂。

甘草甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、账果甘草G.inflata Bat.或光果甘草(欧甘草)G.glabra L.的根和根茎。

实施例2本发明药物片剂的制备

取原料药竹叶柴胡210g、白芍420g、枳壳210g、丹参210g、乳香（制）127.5g、甘草130.5g、没药（制）127.5g,直接打粉，加入硬脂酸镁，压片，得片剂。

实施例3本发明药物口服液制备

取原料药竹叶柴胡70g、白芍140g、枳壳70g、丹参70g、乳香（制）42.5g、甘草43.5g、没药（制）42.5g，按实施例1的方法提取，加入矫味剂，得口服液。

实施例4本发明药物胶囊剂的制备

取实施例1的原料药，丹参、乳香、没药粉碎成细粉，过筛，混匀，备用；枳壳加水蒸馏提取挥发油，备用；药渣与其余柴胡等三味，加水煎煮提取，合并水煎液，滤过，滤液浓缩为稠膏，加入上述细粉，混匀，干燥，粉碎成细粉，喷入上述挥发油，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。

实施例5本发明药物片剂的制备

取实施例1的原料药，丹参、乳香、没药粉碎成细粉，过筛，混匀，备用；枳壳加水蒸馏提取挥发油，备用；药渣与其余柴胡等三味，加水煎煮提取，合并水煎液，滤过，滤液浓缩为稠膏，加入上述细粉及适量的辅料，混匀，制粒，干燥，加入助流剂适量，喷入上述挥发油，混匀，压片，制成1000片，即得。

实施例6本发明药物合剂的制备

以上七味，枳壳加水蒸馏提取芳香水200ml，备用；药渣与其余柴胡等六味，加水煎煮提取三次，合并水煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.10（40～50℃）的清膏,加乙醇醇沉，静置，取上清液，回收乙醇至无醇味，加入防腐剂，煮沸，混匀，加入上述芳香水，加纯化水至1000ml，混匀，分装，即得。

实施例7本发明药物的制备工艺筛选试验

1、提取工艺研究

1.1、枳壳、乳香（制）、没药（制）挥发油提取工艺研究

1）吸水率的考察

称取适量药材置烧杯中称重，加水浸没药材并浸泡至透心后滤去多余的水，量取，计算。按处方比例称取枳壳、乳香（制）、没药（制）共310g（三份），加水10倍量，浸泡24小时，直至透心，滤过，测得吸水率为207%。

2）浸泡与提取时间的考察

按处方比例称取枳壳、乳香（制）、没药（制）共155g，共两组，均加8倍量水，一组浸泡12h，另一组不浸泡。在相同条件下蒸馏提取8h，参照2005版药典一部附录XD挥发油测定法测定挥发油提取量，试验结果见表2。

表2浸泡与提取时间的考察

由表可知，浸泡与否对挥发油总收量影响不大，7h后两组收量差异不大，提取6h后挥发油收量达90%以上。因此，以药材不浸泡，药材提取时间为6h为宜。

3）加水量的考察

按处方比例称取枳壳、制乳香、制没药共155g，共6份，分别加入6、8、10、12、14、16倍水，在相同条件下蒸馏提取6小时，收集挥发油。试验结果见表3。

表3加水量的考察

由表3可知，加水量对挥发油收量有一定影响，加水10倍、12倍、14倍挥发油量差异不大。故水量以10倍量较合适。

4）验证试验

按处方比例称取枳壳、乳香（制）、没药（制）共155g，共3份，分别加入10倍水，在相同条件下蒸馏提取6小时，重复三次试验，收集挥发油。试验结果见表4。

表4挥发油提取验证试验结果

由表4可知，验证结果与实验结果相接近，说明该提取条件稳定可行，由此，枳壳、乳香（制）、没药（制）提取挥发油的条件应为：加水10倍量，不浸泡，提取6小时。

1.2、枳壳、乳香（制）和没药（制）挥发油β-环糊精包合工艺研究

1）包合方法选择

挥发油包合常用方法有研磨法、超声法和搅拌法，选用β-环糊精加入量，挥发油加入量，包合时间，冷藏时间和烘干时间、温度相同，计算其包合率和收得率，见表5。

包合物中实际含油量的测定：取包合物约10g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入蒸馏水200ml，连接挥发油提取器，按《中国药典》2005年版一部附录XD挥发油测定法测定，加热煮沸至油量不再增加时，停止加热，放置30min后读取挥发油量。

挥发油空白回收率测定：精密量取挥发油2ml，置圆底烧瓶中，加入200ml蒸馏水，水蒸气蒸馏提取挥发油，至油量不再增加时停止加热，测得回收油1.9ml，故空白回收率为1.9/2.0=95.0％。

表5不同包合方法包合情况表

由上表可知，搅拌法比研磨法、超声法的包合率和收得率都高，所以采用搅拌法进行β-环糊精包合工艺正交实验考察考察，结果为：β-环糊精:油比例10:1，包合温度60℃，包合时间2h。根据此条件进行重复性验证实验。

取挥发油2ml，按正交实验优选的包合工艺进行重复性验证实验，实验结果见表6。

表6β-环糊精包合工艺重复性验证实验结果

从重复性验证实验结果可见，正交优选工艺即β-环糊精:油比例10:1于60℃恒温搅拌2h，确为最佳包合工艺条件，该包合工艺包合率、收得率稳定，重复性好，可见该包合工艺是合理、可行的。

1.3、丹参醇提取工艺研究

丹参为臣药，其主要酯溶性成分为丹参酮ⅡA等，为了保证丹参脂溶性成分能尽可能的提取出来，故选用乙醇回流法提取。

1）正交实验设计

采用乙醇浓度、乙醇用量、提取时间和提取次数为考察因素，以丹参酮ⅡA含量为评价指标，采用正交设计优选丹参回流提取最佳条件。因素水平设计见表7。

表7因素水平表

2)评价指标

①丹参酮ⅡA含量测定

色谱条件色谱柱：Hypersil ODS—C₁₈(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：甲醇-水（73:27）；流速：1mL／min；柱温：35℃；检测波长：270nm；理论板数以丹参酮ⅡA峰计算不低于2000。

对照品溶液制备精密称取丹参酮ⅡA对照品4.89mg，置25ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取2ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成39.12μg/ml的对照品溶液，即得。

标准曲线的制备分别精密吸取丹参酮ⅡA对照品溶液(39.12μg/ml)0.5、1、3、5、10、15、20μl注入高效液相色谱仪，依上述色谱条件测定峰面积。以色谱峰面积为纵坐标（y），以丹参酮ⅡA量为横坐标（x），进行线性回归。结果表明：丹参酮ⅡA在19.56~782.4μg范围内线性关系良好，回归方程是y=5284.99563x+0.224247，r=0.99993。

供试液的制备称取丹参药材约50g，共9份，分别按表8条件进行提取实验，收集提取液，放冷，量取总体积，精密量取适量体积，加甲醇定容至25ml，作为供试品溶液。

3）实验结果

表8正交实验结果分析表

由于在试验设计时，四因素已经排满，于是将极差平方和最小的设为空白项，进行正交试验方差分析，结果见表9。

表9方差分析

注：F_0.05(2,2)=19.00；F_0.01（2，2）=99.00

由实验结果的直观分析结果可知，影响乙醇回流提取效果的因素顺序为：D(提取次数)>A(乙醇浓度)>B(乙醇用量)>C(提取时间)，D(提取次数)对乙醇回流提取效果影响最大，A(乙醇浓度)和B(乙醇用量)对提取效果影响次之，根据直观分析，并结合实际生产，因此优选提取工艺为：A₁B₁C₂D₃，即药材加6倍量60%的乙醇提取3次，每次1h。根据此条件进行重复性验证实验。

4）验证实验

取丹参药材50g，按正交实验优选的回流提取工艺条件进行重复性验证实验，实验结果见表10。

表10丹参乙醇提取工艺重复性验证实验结果

从重复性验证实验结果可见，正交优选工艺即药材加6倍量60%的乙醇提取3次，每次1h，确为最佳提取工艺条件，该提取工艺丹参酮ⅡA提取率稳定，重复性好，可见该提取工艺是合理、可行的。

1.4、水提工艺研究

1）吸水率的考察

按处方比例称取竹叶柴胡、白芍、甘草药材（三份）适量，加10倍量水浸泡24小时，每隔一定时间观察一次浸润程度，待全部药物浸透为止，滤过至尽，计算吸水率，测得吸水率为155％。

2）正交实验设计

采用加水量、提取时间和提取次数为考察因素，以芍药苷含量、丹参素钠含量和干膏得率为评价指标，进行综合评分，采用正交设计优选煎煮工艺最佳条件。因素水平设计见表11。

表11因素水平表

3）评价指标

①干浸膏得率的测定

精密吸取正交试验各样品溶液10ml，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105℃干燥3h，取出，置干燥器中冷却0.5h，取出立即称重，计算干浸膏得率。结果见表12。

②芍药苷含量测定

色谱条件色谱柱：Hypersil ODS—C₁₈(4.6mm×150mm，5.0μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸（14:86）；流速：1mL／min；柱温：25℃；检测波长：230nm；理论板数以芍药苷峰计算不低于2000。

对照品溶液制备精密称取芍药苷对照品2.85mg，置25ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成0.114mg/ml的对照品溶液，即得。

标准曲线的制备分别精密吸取芍药苷对照品溶液(0.114mg/ml)1、3、5、8、10μl注入高效液相色谱仪，依上述色谱条件测定峰面积。以色谱峰面积为纵坐标（y），以芍药苷量为横坐标（x），进行线性回归。结果表明：芍药苷在0.114~1.14mg范围内线性关系良好，回归方程是y=1266.17686x+5.97795，r=0.99993。

供试液的制备按处方比例称取竹叶柴胡、白芍、甘草、丹参(药渣)共69.3g，共9份，分别按表13条件进行提取实验，收集提取液，浓缩至100ml，精密量取1ml，加甲醇定容至25ml，作为供试品溶液。

③丹参素钠含量测定

色谱条件色谱柱：Diamond C₁₈(4.6mm×250mm，5.0μm，依利特公司)；流动相：乙腈-0.15%磷酸（5:95）；流速：1mL／min；柱温：25℃；检测波长：280nm；理论板数以丹参素钠峰计算不低于2000。

对照品溶液制备精密称取丹参素钠对照品3.80mg，置25ml容量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，制成0.152mg/ml的对照品溶液，即得。

标准曲线的制备分别精密吸取丹参素钠对照品溶液(0.152mg/ml)1、3、5、8、10、15μl注入高效液相色谱仪，依上述色谱条件测定峰面积。以色谱峰面积为纵坐标（y），以丹参素钠量为横坐标（x），进行线性回归。结果表明：丹参素钠在0.152~2.28mg范围内线性关系良好，回归方程是y=660.47224x-0.187294，r=0.99993。

供试液的制备按处方比例称取竹叶柴胡、白芍、甘草、丹参(药渣)共69.3g，共9份，分别按表1-15条件进行提取实验，收集提取液，浓缩至100ml，精密量取15ml，加甲醇定容至25ml，作为供试品溶液。

4）实验结果

表12正交实验结果分析表

注：采用综合加权评分对实验结果进行分析。

芍药苷含量评分=（40/最大芍药苷含量）×芍药苷含量；

丹参素钠含量评分=（40/最大丹参素钠含量）×丹参素钠含量；

干膏得率评分=（20/最大干膏得率）×干膏得率；

综合评分=芍药苷含量评分+丹参素钠含量评分+干膏得率评分

表13方差分析

注：F_0.05(2,2)=19.00；F_0.01（2，2）=99.00

由实验结果的直观分析及方差分析可知，影响提取效果的因素顺序为：C(提取次数)>A(加水量)>B(提取时间)，C(提取次数)对提取效果有显著影响（P<0.05）,A(加水量)、B(提取时间)对提取效果不显著（P>0.05），由直观分析最佳提取工艺为：A₃B₃C₃，鉴于A(加水量)、B(提取时间)因素对提取效果无显著影响，为节约成本，将A₃调整为A₂，B₃调整为B₂，因此优选提取工艺为：A₂B₂C₃，即药材加10倍量水煎煮3次，每次1h。根据此条件进行重复性验证实验。

5）验证实验

按处方比例称取竹叶柴胡、白芍、甘草、丹参(药渣)共69.3g，按正交实验优选的提取工艺条件进行重复性验证实验，实验结果见表14。

表14水提工艺重复性验证实验结果

从重复性验证实验结果可见，正交优选工艺即药材加10倍量水煎煮3次，每次1h，确定为最佳提取工艺条件，该提取工艺芍药苷、丹参素钠提取率和干膏得率稳定，重复性好，可见该提取工艺是合理、可行的。

2、分离与纯化工艺研究

根据预试验结果，未经过醇沉的日服剂量已经达到临床日服剂量要求，为尽可能保留有效成分，避免不必要的损失，不采用其他纯化工艺，直接将药液浓缩干燥。

3、浓缩工艺研究

为了便于生产操作控制和避免有效成分损失，采用减压浓缩工艺。醇提药液浓缩回收乙醇；水提药液减压浓缩的条件为：温度为80℃，真空度为0.1～0.12Mpa。醇提药液和水提药液均浓缩至相对密度为1.08～1.10（60℃）的清膏，两者清膏合并，减压浓缩至相对密度为1.25～1.35(60℃)的稠膏。试验过程以浓缩前后药液中丹参酮ⅡA和芍药苷含量为指标对其浓缩工艺进行考察。结果见表15。

表15浓缩工艺考察结果

结果表明，浓缩前后有效成分损失较小，工艺合理。

4干燥工艺研究

曾将减压浓缩后得的1.08～1.10（60℃）的清膏用喷雾干燥，但清膏中含有树脂、树胶等成分较多，喷雾干燥中粘壁现象严重，浸膏损失较大，影响药物质量。从方中各药化学成分来看，本方主要有效成分为皂苷类、环烯醚萜苷类、有机醛酸类等，均具有较高的稳定性，于是采用常压干燥，即将相对密度为1.25～1.35(60℃)的稠膏混匀，与80℃烘干，得干膏，粉碎，过80目筛。

5成型工艺研究

5.1、处方设计

本方为临床经验方，一日用生药量约为9g，制成胶囊剂，一日服用3次,一次3粒。预试试验结果表明，醇提与水提浓缩液平均出膏率约为34.02%，每日用药粉约为3.33g。

5.2、赋形剂种类考察

通过吸湿性、流动性（休止角）及外观为物料性质考察指标，对辅料的种类进行筛选，取浸膏粉四份，一份不加任何辅料，另外三份加入相应剂量的β-环糊精包合物混合制成混合浸膏粉，其中两份分别以4:1比例加入淀粉和糊精，加相同条件下湿法制粒，烘干，测定其制粒后的流动性；在温度为25℃，相对湿度为75%的条件下测定其吸湿率，并观察其放置后外观。结果见表16、17。

表16吸湿性考察结果

表17物料性质影响结果

结果表明，纯浸膏粉在加入β-环糊精包合物制成混合浸膏粉后，吸湿性和外观与纯浸膏粉相比有很大改善，且流动性好，而混合浸膏粉分别加入淀粉、糊精后，与未加任何赋形剂的混合浸膏粉在改善吸湿性、外观方面相似，为减少服药量，综合考虑，不另加其它赋形剂，直接用混合浸膏粉制粒。由于不加入其它赋形剂，不进行赋形剂用量考察。

5.3、润湿剂考察

根据预实验结果，本实验选择乙醇作为润湿剂湿法制粒，对乙醇浓度、乙醇用量和干燥温度进行考察。

1）润湿剂浓度的考察

取混合浸膏粉（β-环糊精包合物）8g，共3份，分别用70%、80%、95%的乙醇为润湿剂制软材，过40目筛，60℃烘箱干燥，40目筛整粒，80目筛去细粉，即得40-80目颗粒。以各种颗粒的制粒情况、物料外观及颗粒收率为考察指标，筛选最佳润湿剂浓度。试验结果见表18。

表18润湿剂浓度筛选结果

结果分析：根据以上实验，以95%的乙醇作为润湿剂，制软材比较合适，捏之成团揉之即散，70%、80%制备软材时，容易结块，不易过筛。且以95%的乙醇作为润湿剂得到的颗粒收率最高。最终选定润湿剂为95%乙醇。

2）润湿剂用量的筛选

取混合浸膏粉（含β-环糊精包合物）8g，共3份，以95%乙醇为润湿剂，分别加入1ml，2ml，3ml制软材，过40目筛，60℃烘箱干燥，40目筛整粒，80目筛筛去细粉，即得40～80目颗粒。以各种颗粒的制粒情况、物料外观及颗粒收率为考察指标，筛选最佳润湿剂用量。试验结果见表19。

表19润湿剂用量筛选结果

结果分析：根据以上结果，随着乙醇的加多，软材粘网严重，难于制粒，以加入2ml乙醇为佳。故选混合浸膏粉:乙醇的比例为4:1（g/ml）。

3）干燥温度筛选

取混合浸膏粉（含β-环糊精包合物）8g，共3份，按选定工艺制粒，于不同温度下干燥，观察颗粒干燥情况。结果见表20。

表20干燥温度的筛选结果

根据以上实验可以看出，干燥温度越高，颗粒结块现象越严重，整粒越难，且易于使β-环糊精包合物中挥发油损失，所以选定干燥结果为：60～65℃。

6、装量规格的确定

本方每天服用量为9g，制成胶囊剂，所有醇提和水提部分出膏率为34.02%，每日服用浸膏粉约为3.33g，加入β-环糊精包合物0.36g，测得平均堆密度值为0.575g/ml，根据空胶囊号码和近似容量的关系，选择0号胶囊。根据日服剂量和实际工艺，确定本品规格为0.41g/粒，每日三次,每次3粒。

7、中试样品质量检查将三批中试产品按2005版《中国药典》一部胶囊剂项下检查，结果见表21。

表21三批中试样品一般质量检查结果

由上表可知，三批试制的样品，按照胶囊剂通则及本品含量测定方法检查均符合要求，所拟订工艺合理、可行。

以下通过临床试验及药效学试验证明本发明的有益效果。

试验例1本发明药物临床试验

1、研究对象

1.1病例来源

本研究纳入2010年7月至2011年1月于成都中医药大学附属医院妇科门诊就诊的年龄在14－30岁之间的患者，符合中医原发性痛经诊断标准、中医肝郁血瘀证辨证标准及最近两周内未服用止痛药、镇静药及激素类药物的患者，并自愿签署知情同意书者，共74例。

1.2纳入标准

①西医诊断为原发性痛经者；

②中医辨证属肝郁血瘀型者；

③年龄为14-30岁；

④用药前两周内未服用止痛药、镇静药及激素类药物；

⑤自愿签署知情同意书者。

凡符合以上五项标准者，可纳入病例。

1.3排除标准

①中医辨证不属于肝郁血瘀型痛经；

②西医诊断属继发性痛经，由子宫内膜异位症、盆腔炎、子宫肌瘤、卵巢病变等所致痛经者；

③年龄在14岁以下或30岁以上者；

④妊娠或哺乳期妇女；

⑤合并有心血管、肝、肾等重要脏器严重性器质性疾病和造血系统严重原发性疾病，精神病患者；

⑥不符合纳入标准，未按规定用药，或资料不全等影响安全性判断者；

⑦过敏体质，或对本药已知成分过敏者；

⑧近三月内采用过相关治疗，致使疗效无法判断者。

1.4病例剔除标准

已入组病例但符合以下之一者，应予剔除：

①符合排除标准；

②误诊、误纳；

③未曾用药者；

④无任何检测记录者；

⑤由于使用某种禁用药物，以致无法评价疗效者。

剔除病例应说明原因。

2、研究方法

2.1完善各项评分标准

参照1993年中华人民共和国卫生部制定颁发的《中药新药治疗痛经的临床研究指导原则》，结合全国高等医药院校教材第六版及全国高等医药院校八年制医学教材《妇产科学》中有关痛经的内容拟定以下相关评分标准。1、中医肝郁血瘀证的辨证标准；2、原发性痛经西医诊断标准；3、中医证候辨证标准；4、痛经症状评分标准；5、中医证候评分标准；6、疼痛程度标尺评分标准；7、病情程度分级标准。

1、中医肝郁血瘀证的辨证标准

参照1993年中华人民共和国卫生部制定颁发的《中药新药临床研究指导原则》，结合第七版《中医妇科学》拟定。

①经前乳房胀痛②经期胸胁胀痛③胸闷不舒④善叹息⑤经血量少、色紫黯⑥经血有块，块下痛减。

舌脉：舌质紫黯或有瘀点，脉弦或涩。

必备：经前或经期小腹胀痛拒按，另：①-④必备两项，⑤-⑥必备一项，结合舌脉，即可辨证。

2、原发性痛经西医诊断标准

参照1993年中华人民共和国卫生部制定颁发的《中药新药治疗痛经的临床研究指导原则》，结合全国高等医药院校教材第六版及全国高等医药院校八年制医学教材《妇产科学》中有关痛经的内容拟定。

病史：可无相关病史。

症状：疼痛多发生在行经前后或月经期，行经第1日疼痛最剧，持续2-3日后缓解。疼痛常呈痉挛性，多位于下腹部耻骨上，可放射至大腿内侧和腰骶部；可伴发恶心、呕吐、腹泻、头晕等症状，严重时面色发白、出冷汗、甚至晕厥。

妇科检查：双合诊或肛诊无异常。

辅助检查：B超检查生殖器官无器质性病变。

2.2试验设计

2.2.1试验设计

本研究采取随机、单盲、安慰剂平行对照设计。

2.2.2样本含量

参考郑青山教授编写：临床试验样本量计算中所需样本量（非劣及等效性试验）公式N=12.365×P(1一P)/δ2，取α=0.05，β=0.2（把握度=80%）时，试验组（N1）样本量与对照组（N2）样本量的比例为1：1；若δ（优侧界值）=0.15，临床治疗的平均总有效率为95%，根据统计学预算，得出样本例数为N1≈36（例）,N2≈36（例），共计72例，考虑剔除脱落率≤10%，总受试样本量确定为80例。

2.2.3随机分组方法

①随机数字表生成软件：《中国医学百科全书·医学统计学》统计软件包(第三版)）（PEMS3.1for Windows，Package for encyclopaedia ofmedical statistics）。

②随机数字表提供单位：四川大学华西公共卫生学院卫生统计学教研室。

③随机纳入方式：所有按随机数字表纳入原发性痛经肝郁血瘀型患者80例(含剔除、脱落病例10%)，随机分配至对照组与试验组，完成病例观察。

2.2.4盲法设计

采取单盲方法，根据病例数生成1～80个药物号，观察中设立盲法，即一级盲底，确定各药物号所对应的组别，标明产生盲底的种子号；另设二级盲底，确定A药与B药为试验药还是对照药。盲底用不透明信封包装，交研究单位及课题组两处妥善保管,并规定揭盲的要求。

2.2.5对照药选择

本试验采用安慰剂对照法。根据赫尔辛基原则，安慰剂能可靠地证明受试药物的疗效，并可反映受试药的“绝对”有效性和安全性，所以本试验选择安慰剂作对照，只有证实受试药优于安慰剂时，才能确定受试药本身的药效作用。且本研究用药时间短，使用安慰剂不会增加受试者任何严重的、或不可逆损害的风险，故选用安慰剂对照。

3治疗方案

3.1试验药品的名称和规格

试验用药：本发明药物（由实施例1制备）。规格：每粒0.3克，每瓶45粒，生产批号：20100301。

对照药品：安慰剂，由成都中医药大学药厂提供。规格：每粒0.3克，每瓶45粒，生产批号：20100301。

3.2用药方法及疗程

治疗组：本发明药物胶囊（由实施例1制备），口服，一次3粒，一日3次。

对照组：安慰剂，口服，一次3粒，一日3次。

两组均于经前5天开始服用，连服5天，共服药2个月经周期。

3.3随访

显愈的受试者，停药后显愈患者随访1个月经周期。

3.4疗效评定标准

3.4.1疼痛程度标尺疗效评定标准

采用“标尺法”0—10数字强度分级，患者据自身疼疼痛程度在相应数字上画圈。0为无痛，1-3为轻度疼痛，4-6为中度疼痛，7-9为重度疼痛，10为极重度疼痛。

轻度疼痛：虽有疼痛但可忍受，并能正常生活，睡眠不受干扰。

中度疼痛：疼痛明显，不能忍受，要求使用镇痛药，睡眠受干扰。

重度疼痛：疼痛剧烈不能忍受，必须使用镇痛药物，睡眠受到严重干扰，可伴有植物神经功能紊乱表现或被动体位。

无极度

0__1___2___3___4___5___6___7___8___9___10

治愈：治疗后症状消失；

显效：治疗后较治疗前降低2个等级；

有效：治疗后较治疗前降低1个等级；

无效：治疗后症状无改善或加重。

疼痛等级记录时间:记录时间与疼痛强度评定时间同步。

3.4.2痛经症状疗效评定标准

参考1993年中华人民共和国卫生部制定颁发的《中药新药治疗痛经的临床研究指导原则》。

痛经疗效指数＝（治疗前痛经评分－治疗后痛经评分）/治疗前痛经评分。

临床痊愈：治疗后痛经评分为0分；

显效：疾病疗效指数减少1/2以上者；

有效：疾病疗效指数减少1/2～1/4者；

无效：疾病疗效指数减少不足1/4者或病情加重。

3.4.3中医证候疗效评定标准

参考1993年中华人民共和国卫生部制定颁发的《中药新药治疗痛经的临床研究指导原则》。

临床痊愈：治疗后积分较前减少，疗效指数≥95%；

显效：治疗后积分较前减少，95%＞疗效指数≥70%；

有效：治疗后积分较前减少，70%＞疗效指数≥30%；

无效：治疗后积分较前减少，疗效指数＜30%。

3.4.4综合疗效判定标准

临床痊愈：经行下腹痛及其他症状全部消失，疗效指数≥95%；

显效：经行下腹痛疼痛明显减轻，其余症状好转，95%＞疗效指数≥70%；

有效：经行下腹痛疼痛减轻，其余症状好转，70%＞疗效指数≥30%；

无效：经行下腹痛疼痛及其症状无改变者，疗效指数＜30%。

注：疗效指数计算公式(尼莫地平法)为：[(治疗前积分－治疗后积分)/治疗前积分]×100%。

4试验结果

4.1两组病例分布情况

本实验共入选病例74例，其中治疗组38例，对照组36例，完成试验74例，脱落0例，剔除0例。（见表22）。

表22病例分布（例）

4.2综合疗效分析

4.2.1疗后总疗效分析

表23疗后总疗效分析[例(%)]

注：治疗结束后总疗效分析，经秩和检验，P＜0.05，差异有统计学意义。

表24疗后总的优效性检验

注：按总评分的疗效进行优效性检验，a值取0.05，经有效性检验P＜0.05，可认为治疗组总评分的疗效优效于对照组。

4.2.2疗后痛经症状疗效分析

表25疗后痛经症状疗效分析[例(%)]

注：两组药物疗后痛经症状疗效分析表明：治疗组痊愈率为21.05%，显效率为55.26%，有效率为15.79%，无效率为7.89%。对照组痊愈率为8.33%，显效率为25.00%，有效率为19.44%，无效率为47.22%。两组间比较，经秩和检验，两组差异有统计学意义（P＜0.05）。

4.2.3疗后中医证候疗效分析

表26疗后中医证候疗效分析[例(%)]

注：两组药物治疗后中医证候疗效分析表明：治疗组痊愈率为23.68%，显效率为42.11%，有效率为31.58%，无效率为2.63%。对照组痊愈率为2.78%，显效率为2.78%，有效率为27.78%，无效率为66.67%。两组间比较，经秩和检验，两组差异有统计学意义（P＜0.05）。

5结论

5.1本发明药物胶囊治疗原发性痛经（肝郁血瘀型）能明显缓解痛经疼痛程度

本研究表明本发明药物胶囊治疗原发性痛经（肝郁血瘀型）能明显缓解患者的痛经的疼痛程度，疗效优于安慰剂，差异有统计学意义（P＜0.05）。

5.2本发明药物胶囊治疗原发性痛经（肝郁血瘀型）对中医症状有明显改善作用

本研究表明本发明药物胶囊治疗原发性痛经（肝郁血瘀型）在改善经量、经色、经质、经期胸胁胀痛、经前乳胀、胸闷不舒、善叹息等症状疗效优于安慰剂，差异有统计学意义（P＜0.05）。

5.3本发明药物胶囊对原发性痛经（肝郁血瘀型）疗效肯定

本研究1个月后随访表明，治疗组治疗前后比较，痛经的各项症状未见复发，差异有统计学意义（P＜0.05）。该药在整个试验过程中未发现不良反应事件。临床使用安全，便利，值得进一步研究和推广。

试验例2本发明药物的安全性试验

按最大浓度、最大给药容量0．4ml／10g体重，一次性灌胃给予小鼠，观察本发明药物对小鼠的急性毒性。结果显示：给药后观察期间，与对照组比较，给药组小鼠未出现任何异常反应，无一只动物死亡，体重增长与对照组比较无显著性差异。实验结束时尸检肉眼观察主要脏器未见异常。本发明药物小鼠灌胃给药的最大给药量为50g/kg，相当于临床拟用一日用量的110倍，未见明显毒性反应。

试验例3本发明药物胶囊对痛经模型大鼠的影响

1、本发明药物胶囊对痛经模型大鼠子宫内膜组织病理形态学及子宫内膜组织PGF2a、PGE2、PGF2a/PGE2表达的影响

1.1实验材料

1.1.1实验动物

性成熟未交配过的SD雌性大鼠24只，体重180—220g,一级动物，由成都中医药大学实验动物中心提供（合格证号：scxk2008-11）。在取得实验动物开放系统使用许可证的实验室中饲养（许可证号：SYXK（川）2008-028），于实验开始前一周购进动物，进行适应性喂养。

1.1.2受试药物

本发明药物粉末：由实施例1制备；lg粉末相当于2.5g生药，由成都中医药大学附院制剂室提供，批号：20100301。实验时用蒸馏水配制成混悬液，浓度为0.81g生药/ml。

阳性对照药：田七痛经胶囊，成人每日用量3.6g，贵州圣济堂制药有限公司生产，批号：200900501。实验时用蒸馏水配置成混悬液

缩宫素注射液：10单位／ml。安徽丰原药业股份有限公司马鞍山药厂生产。批号。批号100130-l。

苯甲酸雌二醇(E2)注射液：O．5mg/ml，上海通用药业有限公司生产，批号:09011l。

1.1.3主要实验试剂

前列腺素E₂放射免疫测定试剂盒：北京普尔伟业生物科技有限公司，产品批号：20070525。

前列腺素F_2a放射免疫测定试剂盒：北京普尔伟业生物科技有限公司，产品批号：20070525。

1.1.4主要仪器和设备

普通光学显微镜OLYMPUS一206—007—463。

1.2实验方法

1.2.1大鼠痛经模型建立

采用皮下注射苯甲酸雌二醇(E2)注射液以增加子宫对药物的敏感性，腹腔注射缩宫素产生扭体反应(类痛经症)的方法进行造模。除空白组外，其余各组大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇(E2)注射液，连续注射l0d，第l、10d每只皮下给药O．5mg，余日均为每只O．2mg。第10日灌胃45min后，除空白组外每只动物腹腔注射催产素2U，制备原发性痛经大鼠模型。(见表27)

表27原发性痛经大鼠模型的制备

1.2.2动物分组及给药

将24只雌性大鼠按体重随机分为空白组、模型组、田七痛经胶囊组、本发明药物胶囊组(前期通过对本发明药物胶囊药效学的初步实验研究发现高剂量组疗效最优故本实验取大鼠高剂量，相当于临床拟用一日用量的18倍)，每组6只。自造模第8日起，开始给药，连续3天。

（1）本发明药物胶囊组（由实施例1制备）：8.10g生药／kg，每日灌胃给药一次，连续3天。

（2）田七痛经胶囊组：田七痛经胶囊混悬液1.296g／kg，每日灌胃给药一次，连续3天。

（3）痛经模型组和空白组同法给予等体积蒸馏水。

1.2.3检测指标及方法

1.2.3.1本发明药物胶囊对痛经模型子宫病理组织形态学的影响

实验结束时，每组大鼠脱颈椎处死后迅速取子宫放入4％多聚甲醛固定液固定48小时，修剪组织块，纱布包裹，流水冲洗24小时，经梯度酒精脱水，即50％、80％、85％、90％、95％、95％、100％、100％，二甲苯透明，浸蜡，常规石蜡包埋。用组织切片机将组织块切为3～3．5u m厚的切片，将切片常规脱蜡至水，苏木素染色1--5min，自来水洗1min，0．5％盐酸酒精(2．5ml盐酸+70％酒精500m1)分化20秒，自来水洗lmin，稀氨水(1％)返蓝数秒、自来水洗或蒸馏水洗1min，伊红染色1-5min，自来水洗，逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察大鼠子宫的病理组织形态学变化并进行显微摄影。

1.2.3.2本发明药物胶囊对痛经模型大鼠子宫组织PGF2a、PGF2a/PGE2比值和PGE2表达的影响

脱颈椎处死各组大鼠后，迅速取子宫，放入4％多聚甲醛固定液固定，48小时后取出，经常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片（片厚4um)，石蜡切片脱蜡，用PBS液(O．01mol／L PH7．4)冲洗3次，每次5分钟；3％H₂O₂室温孵育lO分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟；10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育lO分钟。倾去血清，勿洗，滴加l：100比例稀释的一抗，37℃孵育1小时。PBS冲洗，冲洗3次，每次5分钟，滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟；PBS冲洗，冲洗3次，每次5分钟；滴加第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育30分钟；PBS净洗，净洗3次，每次5分镑；显色剂(DAB)显色；自来水充分冷洗，苏木精复染，封片。将其中本发明药物胶囊组、模型组、田七痛经胶囊组的子宫组织经免疫组化染色后，采用Mias图形分析系统，选3个视野(200×)浏览，测量含有棕黄色颗粒物质的面积、平均光密度、积分光密度、平均黑度均值，以此表示PGE₂及PGF_2a的表达情况。

1.3统计学方法

Mias-2001图像分析结果均采用Spssl3．0统计软件处理，以均数±标准差

表示，组间的差异比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齐时(P>O．05)用LSD法，方差不齐时(P<O．05)用Tamhane’ST2法。

1.4实验结果

1.4.1本发明药物胶囊对痛经模型大鼠子宫内膜病理组织形态学的影响

空白组：子宫壁各层组织结构清晰；子宫内膜薄厚不均，由腺上皮和固有层组成。内膜为单层柱状上皮细胞；固有层较厚，腺体和血管丰富，螺旋动脉和基质细胞形态结构正常；子宫肌层由成束平滑肌组成；未见蜕膜组织及其它病理改变（见下图1）。

痛经模型组：子宫壁各层组织结构清晰，内膜层薄厚不均，内膜单层柱状上皮细胞水肿、界线不清；固有层腺体和血管丰富，螺旋动脉管腔狭窄，基质细胞水样变性，内膜水肿；子宫肌层平滑肌排列整齐；可见少量炎症细胞浸润（见下图2）。

本发明药物胶囊组和田七痛经胶囊组：子宫壁各层组织结构清晰，内膜层薄厚不均，内膜上皮细胞水肿、界线不清；固有层厚度稍有变薄，腺体和血管较丰富，螺旋动脉管腔稍有狭窄，基质细胞水样变性，内膜组织轻度水肿；子宫肌层平滑肌排列整齐；子宫壁各层可见以嗜酸性粒细胞为主的炎症细胞浸润，以固有层为甚（见下图3、4）。

从以上四个图可见，给药组间的病理组织学改变无显著差别，与模型组相比，本发明药物胶囊组和田七组痛经胶囊组病变程度较为轻微。

1.4.2本发明药物胶囊对痛经模型大鼠子宫内膜组织PGF2a、PGF2a/PGE2比值和PGE2表达的影响

1.4.2.1本发明药物胶囊对痛经模型大鼠子宫内膜组织PGF2a表达的影响

（1）经免疫组化染色后，光镜下观察本发明药物胶囊对痛经模型大鼠子宫内膜组织PGF2a的表达情况的影响：大鼠子宫组织PGF2a表达于子宫内膜血管壁上，阳性染色呈棕黄色。正常组大鼠子宫组织内膜PGF2a微弱表达,见图5；模型组大鼠子宫组织内膜PGF2a阳性染色明显，见图6；本发明药物胶囊组和田七痛经胶囊组显色较少见图7和8。

（2）经免疫组化染色后，采用Mias图形分析系统，测量本发明药物胶囊对痛经模型大鼠子宫内膜组织PGF2a表达的影响：从以下表28可知，与空白组比较，模型组极显著增加了PGF2a表达的面积总和、平均光密度、平均黑度均值、积分光密度总和(P<0.01)。与模型组比较，本发明药物胶囊组、田七痛经胶囊组有极显著降低PGF2a表达的面积总和、平均光密度、平均黑度均值、积分光密度总和(P<0.01)。

表28本发明药物胶囊对痛经大鼠子宫组织PGF2a表达的影响

注：与模型组对比，﹡P<O.05，**P<0.0l。与空白组比较，△P<0.05，△△P<0.01

1.4.2.2本发明药物胶囊对痛经模型大鼠子宫内膜组织PGF2a/PGE2比值表达的影响

与空白组比较，模型组组有显著增加了PGF2a/PGE2比值表达的面积总和、平均黑度均值、积分光密度总和(P<0.05，P<0.01)。与模型组比较，本发明药物胶囊组和田七痛经胶囊组有极显著降低子宫内膜组织PGF2a/PGE2比值的面积总和、平均光密度、平均黑度均值、积分光密度总和表达(P<0.01)。见以下表29。

表29

注：与模型组对比，﹡P<O.05，**P<0.0l。与空白组比较，△P<0.05，△△P<0.01

1.4.2.3本发明药物胶囊对痛经模型大鼠子宫内膜组织PGE₂表达的影响

（1）经免疫组化染色后，光镜下观察本发明药物胶囊对痛经模型大鼠子宫内膜组织PGE₂的表达情况的影响：经免疫组化染色后，光镜下观察PGE₂的表达情况：大鼠子宫内膜组织PGE₂表达于子宫内膜血管壁和间质细胞上，阳性染色呈棕黄色。正常组大鼠子宫内膜组织PGE₂表达微弱,见图9；模型组大鼠子宫内膜组织PGE₂表达阳性染色明显，见图10；本发明药物胶囊组和田七痛经胶囊组显色较模型组明显见图11和12。（2）经免疫组化染色后，采用Mias图形分祈系统，测量本发明药物胶囊对痛经模型大鼠子宫内膜组织PGE₂表达的影响：由下表30可知，与空白组比较，模型组有显著增加PGE₂表达的面积总和、平均光密度、平均黑度均值、积分光密度总和（P<0.01或P<0.05）。与模型组比较，本发明药物胶囊组极显著增加了PGE₂的面积总和、平均光密度、平均黑度均值、积分光密度总和的表达(P<0.01)。

表30本发明药物胶囊对痛经大鼠子宫组织PGE₂表达的影响

注：与模型组对比，﹡P<O.05，**P<0.0l。与空白组比较，△P<0.05，△△P<0.01

综上研究表明，痛经模型大鼠子宫内膜组织PGF2a、PGF2a/PGE₂比值和PGE₂含量表达较空白组明显；表明前列腺素含量的升高可能是导致痛经的原因之一；本发明药物胶囊能调节前列腺素的分泌，通过降低PGF2a、PGF2a/PGE₂比值含量表达，升高痛经模型大鼠子宫内膜组织PGE₂的含量表达，从而达到镇痛的效果。

结果表明：本发明药物胶囊能极显著降低PGF2a表达的面积总和、平均光密度、平均黑度均值、积分光密度总和(P<0.01)；增加PGE2表达的面积总和、平均光密度、平均黑度均值、积分光密度总和(P<0.01)。从而降低PGF2a/PGE2比值表达的面积总和、平均光密度、平均黑度均值、积分光密度总和(P<0.01)；本发明药物胶囊可使痛经模型大鼠子宫内膜组织水肿减轻，固有层厚度变薄，腺体分泌细胞增多，螺旋动脉数量减少。

2、本发明药物胶囊对痛经模型大鼠子宫内膜组织NO、子宫内皮素-1表达及血清β-内啡肽含量的影响

2.1实验材料

2.1.1实验动物

SD雌性普通级大鼠，24只，体重185～230g，由成都中医药大学实验动物中心提供（合格证号：SCYK（川）2008-11，在取得实验动物开放系统使用许可证的实验室中饲养，许可证号：syxk（川）2008-028）。实验前置动物于室内适应环境一周，室温控制20℃-25℃，采用架式分笼喂养，标准普通柱状饲料，饮水为自来水。

2.1.2实验用药、药量

受试药物：本发明药物粉末（由实施例1方法制备）规格：每1g粉末相当于原生药材2.5g。成人用量0.45g生药/kg.d。

2.1.3实验对照药物及主要试剂

2.1.3.1实验对照药物

田七痛经胶囊：贵州圣济堂制药有限公司，国药准字Z52020048。功效主治：活血化瘀，理气止痛。通调气血，止痛调经，用于经期腹痛及因寒所致的月经失调。规格：每片0.4g。用法用量：口服，一次4片，一日3次。

2.1.3.2主要试剂

苯甲酸雌二醇注射液：O．5mg/ml，天津金耀氨基酸有限公司提供，国药准字H12020529。

缩宫素注射液：10单位／ml。上海第一生化药业有限公司提供，国药准字H31020862。批号100129

β-内啡肽Elisa试剂盒：北京北方生物科技研究所提供。添加药物批号一抗：内皮素-1，武汉博士德生物工程有限公司提供。

一抗：一氧化氮合成酶3型（Nos3），武汉博士德生物工程有限公司提供。

2.1.3.3实验仪器

酶标仪，仪器型号：KC-100，深圳凯特生物医疗电子科技有限公司。普通光学显微镜OLYMPUS一206—007—463。

2.2实验方法

2.2.1动物分组

因实验经费及时间有限，本实验只选用本发明药物胶囊高剂量作为药物组。

将24只雌性大鼠随机分为空白对照组、痛经模型组、阳性对照组(田七痛经胶囊组，临床剂量18倍)、本发明药物胶囊组(临床剂量18倍)，每组6只。

2.2.2给制剂量与方法：

本发明药物胶囊组（由实施例1制备）：本发明药物胶囊8.10g生药／kg.d，灌胃给药。

田七痛经胶囊组：田七痛经胶囊1.296g／kg.d，灌胃给药。

痛经模型组：等体积蒸馏水。

空白组：等体积蒸馏水。

2.3检测指标及方法

2.3.1方法

将24只SD雌性大鼠按体重随机分为4组，每组6只，分别为空白对照组、痛经模型组、本发明药物胶囊组和田七止痛胶囊组。除空白对照组外，其余3组大鼠连续皮下注射苯甲酸雌二醇10天，每天1次(第l天0.5mg/只，第2至9天0.2mg/只，第10天0.5mg/只)。注射第8天开始灌胃给药，连续3天。末次给药30min后，腹腔注射缩宫素2u/只。1h后眼眶静脉丛取血，采用酶免法检测血清β-内啡肽的含量。处死动物，快速剥取子宫组织用4％多聚甲醛固定，采用免疫组化方法检测内皮素-1（ET-1）及一氧化氮（NO）。

2.3.2痛经模型大鼠血清β-EP含量检测

大鼠眼眶经脉丛采血完毕，室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分），仔细收集上清。手工洗板方法：甩掉β-EP酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，β-EP酶标板朝下用力拍几次；将稀释后的洗涤液至少0.35ml注入孔内，浸泡1-2分钟。分别设空白孔、标准品孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品孔中加入稀释好的标准品50μl；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。轻轻晃动混匀，37℃温育30分钟。弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。如此重复5次，拍干。每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。轻轻晃动混匀，37℃温育30分钟。弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。如此重复5次，拍干。每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃色10钟。取出酶标板，每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。测定：以空白孔调零，在450nm波长下测量各孔的吸光度值（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。

2.3.3痛经模型子宫病理组织形态学检测

每组大鼠眼眶静脉丛采血完毕，大鼠脱颈椎处死后迅速取子宫放入4％多聚甲醛固定液固定48小时，修剪组织块，纱布包裹，流水冲洗24小时，经梯度酒精脱水，即50％、80％、85％、90％、95％、95％、100％、100％，二甲苯透明，浸蜡，常规石蜡包埋。用组织切片机将组织块切为3～3．5um厚的切片，将切片常规脱蜡至水，苏木素染色l～5min，自来水洗1min，0．5％盐酸酒精(2．5ml盐酸+70％酒精500m1)分化20秒，自来水洗1min，稀氨水(1％)返蓝数秒、自来水洗或蒸馏水洗1min，伊红染色1～5min，自来水洗，逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察大鼠子宫的病理组织形态学变化并进行显微摄影。

2.3.4痛经模型大鼠子宫组织ET-1、NO含量检测

大鼠眼眶静脉丛采血完毕后，脱颈处死各组大鼠后，迅速取子宫，放入4％多聚甲醛固定液固定，48小时后取出，经常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片（片厚4um)，石蜡切片脱蜡，用PBS液(O．01mol／L PH7．4)冲洗3次，每次5分钟；3％H₂0₂。室温孵育lO分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水冲洗，PBS浸漶5分钟；10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育lO分钟。倾去血清，勿洗，滴加l：100比例稀释的一抗，37℃孵育1小时。PBS冲洗，冲洗3次，每次5分钟，滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟；PBS冲洗，冲洗3次，每次5分钟；滴加第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育30分钟；PBS净洗，净洗3次，每次5分钟；显色剂(DAB)显色；自来水充分冷洗，苏木精复染，封片。将其中本发明药物胶囊组、模型组、田七痛经胶囊组的子宫组织经免疫组化染色后，采用Mias图形分析系统，选3个视野(200×)浏览，测量含有棕黄色颗粒物质的面积、平均光密度、积分光密度、平均黑度均值，以此表示ET-1及NO的表达情况。

2.4统计学处理

所有数据均采用Spssl7.0for windows统计分析软件处理，计量资料以均数

±标准差(s)表示，多组间比较采用单因素方差分析(One．WayANOVA)。方差齐性组间差异显著性采用单因素方差分析中的LSD(Least-significant diffrerence)方法进行多重比较检验，方差不齐组间差异显著性采用Tamhane’S T2进行多重性比较检验，P<O.05为差异有显著性，P<0.01作为有极显著性差异。

2.5结果

2.5.1对血清β-内啡肽含量的影响

本发明药物胶囊对大鼠血清β-EP影响：与空白组相比，模型组大鼠β-EP显著升高，差异有极显著性意义(P<O．01)。与模型组比较，田七组β-EP含量显著升高，差异有显著性意义(P<O．05)。与模型组比较，本发明药物胶囊组β-EP含量显著升高，差异有极显著性意义(P<O．01)。见表31。

表31本发明药物胶囊对痛经模型大鼠血清β-内啡肽含量的影响

注：与空白组比较，☆P<0.05，☆☆P<0.01；与模型组对比，△P<O.05，△△P<O.O1

2.5.2对大鼠子宫内皮素-1表达的影响

2.5.2.1对大鼠子宫ET-1面积表达的影响

本发明药物胶囊对大鼠ET-1影响：与空白组相比，模型组大鼠ET-1面积显著增加，差异有极显著性意义(P<O．01)。与模型组比较，田七组与本发明药物胶囊组的ET-1面积显著降低，差异有极显著性意义(P<O．01)。见表32。

表32本发明药物胶囊对大鼠子宫ET-1面积表达的影响

注：与空白组比较，☆P<0.05，☆☆P<0.01；与模型组对比，△P<O.05，△△P<O.O1

2.5.2.2对大鼠子宫ET-1积分光密度总和表达的影响

本发明药物胶囊对大鼠ET-1影响：与空白组相比，模型组大鼠ET-1积分光密度总和显著增加，差异有极显著性意义(P<O．01)。与模型组比较，田七组与本发明药物胶囊组的ET-1积分光密度总和显著降低，差异有极显著性意义(P<O．01)。见表33。

表33本发明药物胶囊对大鼠子宫ET-1积分光密度总和表达的影响

注：与空白组比较，☆P<0.05，☆☆P<0.01；与模型组对比，△P<O.05，△△P<O.O1

2.5.2.3对大鼠子宫ET-1平均光密度表达的影响

本发明药物胶囊对大鼠ET-1影响：与空白组相比，模型组大鼠ET-1平均光密度显著增加，差异有显著性意义(P<O．05)。与模型组比较，田七组与本发明药物胶囊组的ET-1平均光密度显著降低，差异有极显著性意义(P<O．01)。见表34。

表34本发明药物胶囊对大鼠子宫ET-1平均光密度表达的影响

注：与空白组比较，☆P<0.05，☆☆P<0.01；与模型组对比，△P<O.05，△△P<O.O1

2.5.2.4对大鼠子宫ET-1平均黑度均值表达的影响

本发明药物胶囊对大鼠ET-1影响：与空白组相比，模型组大鼠ET-1平均黑度均值显著增加，差异有极显著性意义(P<O．01)。与模型组比较，田七组与本发明药物胶囊组的ET-1平均黑度均值显著降低，差异有极显著性意义(P<O．01)。见表35。

表35本发明药物胶囊对大鼠子宫ET-1平均黑度均值表达的影响

注：与空白组比较，☆P<0.05，☆☆P<0.01；与模型组对比，△P<O.05，△△P<O.O1

2.5.3对一氧化氮表达的影响

2.5.3.1对大鼠子宫一氧化氮面积表达的影响

本发明药物胶囊对大鼠NO影响：与空白组相比，模型组大鼠NO面积表达显著降低，差异有极显著性意义(P<O．01)。与模型组相比，本发明药物胶囊组和田七痛经胶囊组NO面积表达显著升高，差异有极显著性意义(P<0.01)。见表36。

表36本发明药物胶囊对痛经模型大鼠一氧化氮面积表达的影响

注：与空白组比较，☆P<0.05，☆☆P<0.01；与模型组对比，△P<O.05，△△P<O.O1

2.5.3.2对大鼠子宫一氧化氮积分光密度总和表达的影响

本发明药物胶囊对大鼠NO影响：与空白组相比，模型组大鼠NO积分光密度总和表达显著降低，差异有极显著性意义(P<O．01)。与模型组相比，本发明药物胶囊组和田七痛经胶囊组NO积分光密度总和表达显著升高，差异有极显著性意义(P<0.01)。见表37。

表37本发明药物胶囊对痛经模型大鼠一氧化氮积分光密度总和表达的影响

注：与空白组比较，☆P<0.05，☆☆P<0.01；与模型组对比，△P<O.05，△△P<O.O1

2.5.3.3对大鼠子宫一氧化氮平均光密度表达的影响

本发明药物胶囊对大鼠NO影响：与空白组相比，模型组大鼠NO平均光密度表达显著降低，差异有显著性意义(P<O．05)。与模型组相比，本发明药物胶囊组和田七痛经胶囊组的NO平均光密度表达显著升高，差异有极显著性意义(P<O．01)。见表38。

表38本发明药物胶囊对痛经模型大鼠一氧化氮平均光密度表达的影响

注：与空白组比较，☆P<0.05，☆☆P<0.01；与模型组对比，△P<O.05，△△P<O.O1

2.5.3.4对大鼠子宫一氧化氮平均黑度均值表达的影响

本发明药物胶囊对大鼠NO影响：与空白组相比，模型组大鼠NO平均黑度均值显著降低，差异有显著性意义(P<O．05)。与模型组相比，本发明药物胶囊组和田七痛经胶囊组的NO平均黑度均值显著升高，差异有极显著性意义(P<O．01)。见表39。

表39本发明药物胶囊对痛经模型大鼠一氧化氮平均黑度均值表达的影响

注：与空白组比较，☆P<0.05，☆☆P<0.01；与模型组对比，△P<O.05，△△P<O.O1

综上实验结果表明：本发明药物胶囊可明显增加大鼠子宫一氧化氮面积、积分光密度总和、平均光密度、平均黑度均值表达，能明显降低大鼠子宫内皮素-1面积、积分光密度总和、平均光密度、平均黑度均值表达；与模型组比较，本发明药物胶囊组β-EP含量显著升高，差异有极显著性意义(P<O．01)。

试验例4本发明药物胶囊镇痛作用试验

1本发明药物胶囊对热刺激所致小鼠疼痛的影响

1.1实验材料

1.1.1实验动物

昆明种雌性小鼠，体重18-22g，清洁级动物。由成都中医药大学实验动物中心提供。（合格证号：scxk2008-11，在取得实验动物开放系统使用许可证的实验室中饲养，许可证号：SYXK（川）2008-028）于实验前一周购进，饲养于安静，温暖且避强光的环境中。

1.1.2实验药物及制备

(1)本发明药物粉末（由实施例1制备）：lg粉末相当于2.5g生药，由成都中医药大学附院制剂室提供，批号：20100301。实验时用蒸馏水配制成混悬液（本发明药物胶囊高剂量9.0g生药/ml、中剂量4.5g生药/ml、低剂量2.25g生药/ml）。

(2)消炎痛：西药阳性对照药物，25mg／粒，成人每日用量75mg，江苏亚邦爱普森药业有限公司，批号：0812010。实验时用蒸馏水配置成混悬液。

(3)田七痛经胶囊：中药阳性对照药，成人每日用量3.6g，贵州圣济堂制药有限公司生产，批号：200900501。实验时用蒸馏水配置成混悬液。

1.1.3主要实验仪器和设备

热板测痛仪(冀星实验仪器有限公司生产，型号：7280H07)

1.2实验方法

1.2.1选择动物：将热板测痛仪打开预热10分钟，调节热板的温度为55士0．5℃，一次放一只小鼠到热板上，取其舔后足的动作作为痛反应指标。记录其出现舔足所需时间(s)，间隔5min，测3次，取其均值作为该鼠的痛阈值，选择72只30S以内舔后足的小鼠做后面的实验。

1.2.2动物分组：将已选好的合格小鼠，按痛阈值随机分为6组：

(1)本发明药物胶囊（由实施例1制备）高剂量组9.0g生药／kg.d(相当于成人一日剂量20倍)，12只

(2)本发明药物胶囊中剂量组4.5g生药／kg.d（相当于成人一日剂量10倍），12只

(3)本发明药物胶囊低剂量组2.25g生药／kg.d（相当于成人一日剂量5倍)，12只

(4)西药阳性对照组(消炎痛组)0.03g／kg．d(相当于成人一日剂量20倍)12只

(5)中药阳性对照组(田七痛经胶囊组)1.44g／kg．d(相当于成人一日剂量20倍)，12只

(6)空白组：灌胃等容积蒸馏水，12只

1.2.3给药方法：以上各组每天灌胃给药一次，连续3天。末次给药后30分钟，用55．5℃(±0．5℃)的恒温热板上分别测量给药后30min，60min，120min小鼠的痛阈值，超过60秒仍不舔后足的记60秒。

1.3统计学方法

以上最后测定结果用SPSS13.0软件进行统计学处理，以均数±标准差

表示，组间的差异比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齐时(P>O．05)用LSD法，方差不齐时(P<O．05)用Tamhane’ST2法。

1.4实验结果

对热刺激所致小鼠疼痛，各组间痛阈值比较，结果见表40

表40本发明药物胶囊对热刺激致小鼠疼痛的影响

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

由表40可看出，与空白组相比，在观测的各时间段，本发明药物胶囊高、中、低剂量组，消炎痛组、田七痛经胶囊组均能提高小鼠的痛阈值。其中本发明药物胶囊高剂量组、消炎痛组极显著提高小鼠的痛阈值（P<0.001），本发明药物胶囊中剂量组显著提高小鼠的痛阈值（P<0.01），田七痛经胶囊、本发明药物胶囊低剂量组均能提高小鼠的痛阈值（P﹤0.O5或P﹤0.O1）。

提示：本发明药物胶囊可提高小鼠疼痛阈值，具有良好的镇痛作用，高剂量组对热刺激引起小鼠疼痛的镇痛作用明显优于低剂量组，说明其存在一定的量效和时效关系。

2本发明药物胶囊对醋酸所致小鼠疼痛的影响

2.1实验方法

取小鼠72只，体重18-22g，按体重随机分为6组，即本发明药物胶囊高、中、低剂量组，消炎痛组、田七痛经胶囊组、空白组。给药量及给药方式如实验1，末次给药1h后对各小鼠腹腔注射0．6％醋酸0．2ml／只，记录3Omin内各组小鼠出现扭体反应(腹部内凹，四肢伸展，臀部抬高)的次数。计算出各组药物的抑制率。

扭体抑制率=(空白组扭体次数一用药组扭体次数)／空白组扭体次数×100%

2.2统计学方法

以上最后测定结果用SPSS13.0软件进行统计学处理，以均数±标准差(X±s)表示，组间的差异比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齐时(P>O．05)用LSD法，方差不齐时(P<O．05)用Tamhane’ST2法。

2.3实验结果

对醋酸所致小鼠疼痛，各组间扭体反应次数比较，见表41。

表41本发明药物胶囊对醋酸所致小鼠扭体反应的影响

注：与空白对照组比较，*P﹤0．05，**P<0．01，***P<0.001。

据表41可知，与空白对照组相比，各给药组均能明显减少醋酸所致的小鼠扭体反应的次数，均有显著性差异。其中本发明药物胶囊高、中剂量组可显著减少小鼠扭体次数（P<0.001、P<0.01）。本发明药物胶囊各剂量组的扭体抑制率均高于田七痛经胶囊组，且随着药量的增加，其扭体抑制率升高。表明本发明药物胶囊有明显的镇痛作用。其镇痛作用优于田七痛经胶囊；且存在一定的量效关系。

结论：采用热板法和扭体法来观测本发明药物胶囊的镇痛作用，实验结果显示：本发明药物胶囊能显著提高小鼠的痛阈值，减少醋酸所致的小鼠和痛经模型大鼠扭体反应的次数，表明本发明药物胶囊有显著的镇痛作用。

试验例5本发明药物胶囊抗炎作用的实验研究

1本发明药物胶囊对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响

1.1实验方法

取昆明种雌性小鼠72只，按体重随机分为6组，即本发明药物胶囊高、中、低剂量组，消炎痛组、田七痛经胶囊组、空白组。给药量及给药方式如实验2.1，末次给药后30分钟，在小鼠的左耳正反两面均匀涂上二甲苯20ul，右耳作空白对照。1小时后脱颈处死小鼠，沿耳廓基线剪下两耳，用打孔器在小鼠左右耳相同部位打孔并分别用电子天平称重，记录左右两耳片重量，肿胀度为重量之差(mg)，计算肿胀抑制率,肿胀抑制率(％)=(A—B)／A×100％，式中，A代表空白对照组肿胀度，B代表受试药物组或阳性对照药物组肿胀度。

1.2统计学方法

以上最后测定结果用SPSS13.0软件进行统计学处理，均以均数±标准差

表示，组间的差异比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齐时(P>O.05)用LSD法，方差不齐时(P<O.05)用Tamhane’ST2法。

1.3实验结果

表42本发明药物胶囊对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响

注：与空白对照组比较，*P﹤0.05，**P<0.01，***P<0.001。

由表42可以看出，与空白对照组相比，本发明药物胶囊各剂量组对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀均有明显的抑制作用。其中高剂量、中剂量组显著抑制小鼠耳肿胀（P<0.001、P<0.01），本发明药物胶囊各剂量肿胀抑制率均高于田七痛经胶囊组，并且肿胀抑制率随剂量增加而递增。表明本发明药物胶囊有明显的抗炎作用，其作用优于田七痛经胶囊；且存在一定的量效关系。

2本发明药物胶囊对新鲜蛋清所致大鼠足跖肿胀的影响

2.1实验方法

动物分组：将60只雌性大鼠按体重随机分成6组，每组10只

(1)本发明药物胶囊（由实施例1制备）高剂量组：8.10g生药／kg．d(相当于成人一日药量的18倍)；

(2)本发明药物胶囊中剂量组：4.05g生药／kg．d(相当于成人一日药量的9倍)

(3)本发明药物胶囊低剂量组：2.025g生药/kg．d(相当于成人一日药量的4.5倍)

(4)西药阳性对照组（消炎痛）：27mg／kg.d(相当于成人一日药量的l8倍)

(5)中药阳性对照组(田七痛经胶囊)：1.296g／kg．d(相当于成人一日剂量18倍)。

(6)对照组：等容积蒸馏水。

给药方法：致炎前每日灌胃给药一次，连续1周。对照组给予等量的蒸馏水。末次给药后1h后，每鼠右后足跖腱膜下注射10%新鲜蛋清0．1ml／只，分别于致炎前、致炎后0．5、1、2、3h采用容积法测定右后足踝关节以下肿胀的足容积，计算出肿胀度，分别比较各时间点给药组与对照组的差异情况。肿胀度=致炎后足容积一致炎前足容积。

2.2统计学方法

以上最后测定结果用SPSS13.0软件进行统计学处理，均以均数±标准差

表示，组间的差异比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齐时(P>O.05)用LSD法，方差不齐时(P<O.05)用Tamhane’ST2法。

2.3实验结果

表43本发明药物胶囊对新鲜蛋清所致大鼠足跖肿胀的影响

注：与对照组比较，*P﹤0．05，**P<0．01。

由表43可知，与对照组比较，致炎0.5h时，高剂量组与消炎痛组均能显示抑制大鼠足跖肿胀，P＜0.001，均由极显著性差异，其他组无明显性差异（P＜0.05）。致炎1h、3h时，各给药组均能显示抑制大鼠足跖肿胀，有显著性差异（P＜0.01或P＜0.05）。与低剂量组之间比较，本发明药物胶囊高剂量组在给药后所观察的各时间段均能极显著的抑制大鼠足跖肿胀P＜（0.01）。表明本发明药物胶囊具有良好抗炎作用，以高剂量组最佳，其抗炎作用存在一定的量效关系。

结论：采用对二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验和蛋清致大鼠足爪肿胀实验来观测本发明药物胶囊的抗炎作用，实验结果显示：本发明药物胶囊对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀和蛋清致大鼠足爪肿胀均有明显的抑制作用，表明本发明药物胶囊有显著的抗炎作用。

试验例6本发明药物胶囊活血化瘀作用的实验研究

1本发明药物胶囊对血瘀模型大鼠血液流变学的影响

1.1实验方法

1.1.1动物分组

将60只雌性大鼠按体重随机分为空白对照组、血瘀模型组、阳性对照组(复方丹参滴丸组，临床剂量18倍)、本发明药物胶囊高剂量组(临床剂量18倍)、本发明药物胶囊中剂量组(临床剂量9倍)、本发明药物胶囊低剂量组(临床剂量4.5倍)，每组10只。

1.1.2给药剂量与方法：自动物适应环境一周后起，开始给药，连续给药7天。本发明药物胶囊（由实施例1制备）高剂量组：本发明药物胶囊8.10g生药／kg.d。灌胃给药。

本发明药物胶囊中剂量组：本发明药物胶囊4.05g生药／kg.d。灌胃给药。本发明药物胶囊低剂量组：本发明药物胶囊2.025g生药／kg.d。灌胃给药。复方丹参滴丸组：复方丹参滴丸0.108g/kg.d。灌胃给药。

血瘀模型组：等体积蒸馏水。

空白组：等体积蒸馏水。

1.1.3实验方法

空白对照组及血瘀模型组给予等体积蒸馏水，本发明药物胶囊高、中、低剂量组及复方丹参滴丸组灌胃给药一次。第7天给药30min后，除空白组外，于各组大鼠尾静脉注射10％高分子右旋糖酐(50万分子量)5ml/kg，注射后30min，观察大鼠皮毛、活动及皮肤色泽。观察完毕大鼠眼眶静脉丛取血2ml，迅速注入含有肝素的抗凝管中混匀，摇匀后用于测定血液流变学指标。由成都中医药大学附属医院检验科测定。

1.1.4检测指标及观察指标

1.1.4.1一般状态：对各组大鼠的精神状态及活动情况进行观察。

1.1.4.2检测指标

检测大鼠全血粘度(1S、5S、30S、200S切变率)、血浆粘度、红细胞压积、红细胞聚集指数、红细胞刚性指数、红细胞变形指数、全血低切还原粘度、全血高切还原粘度、全血低切相对指数、全血高切相对指数。

1.2统计学处理

所有数据均采用Spssl7.0 for windows统计分析软件处理，计量资料以均数()±标准差(s)表示，多组间比较采用单因素方差分析(One．WayANOVA)。方差齐性组问差异显著性采用单因素方差分析中的LSD(Least-significant diffrerence)方法进行多重比较检验，方差不齐组问差异显著性采用Tamhane’S T2进行多重性比较检验，P＜0.05为差异有显著性，P＜0.01作为有极显著性差异。

1.3结果

1.3.1血液流变实验大鼠一般情况

空白组：精神正常，喜活动，善打斗。耳色红润，活动灵敏，其他未见明显异常。

模型组：精神萎靡，活动显著减少，口唇、四肢、耳部及尾部呈深紫色，四肢水肿明显。

丹参滴丸组：精神尚好，活动减少，口唇、四肢、耳部及尾部呈紫色，四肢轻度水肿。

本发明药物胶囊高剂量组：精神尚好，活动减少，口唇、四肢、耳部及尾部呈紫色，四肢轻度水肿。

本发明药物胶囊中剂量组：精神稍差，活动减少，口唇、四肢、耳部及尾部呈紫色，四肢水肿较明显。

本发明药物胶囊低剂量组：精神稍差，活动减少，口唇、四肢、耳部及尾部呈紫色，四肢水肿较明显。

1.3.2对血瘀模型大鼠血液流变的影响

1.3.2.1对血瘀模型大鼠全血粘度（1S、5S、30S、200S切变率）的影响

与空白组相比，模型组大鼠全血粘度显著升高，差异有极显著性意义(P<O．01)。与模型组比较，复方丹参滴丸组与本发明药物胶囊中、低剂量组的全血粘度显著降低，差异有显著性意义(P<O．05)。与模型组相比，本发明药物胶囊高剂量组全血粘度显著降低，差异有极显著性意义(P<O．01)。见表44。

表44本发明药物胶囊血瘀模型大鼠全血粘度（1S、5S、30S、200S切变率）的影响

注：与空白组比较，☆P<0.05，☆☆P<0.01；与模型组对比，△P<O.05，△△P<O.O1。

1.3.2.2对血瘀模型红细胞压积的影响

本发明药物胶囊对大鼠血液流变学影响：与空白组相比，模型组大鼠红细胞压积显著升高，差异有显著性意义(P<O．05)。与模型组比较，复方丹参滴丸组与本发明药物胶囊中、低剂量组的红细胞压积显著降低，差异有显著性意义(P<O．05)。与模型组比较，本发明药物胶囊高剂量组红细胞压积显著降低，差异有极显著性意义(P<O．01)。见表45。

表45本发明药物胶囊对血瘀模型大鼠红细胞压积的影响

注：与空白组比较，☆P<0.05，☆☆P<0.01；与模型组对比，△P<O.05，△△P<O.O1

1.3.2.3对血瘀模型大鼠血浆粘度、全血低切还原粘度、全血高切还原粘度的影响

本发明药物胶囊对大鼠血液流变学影响：与空白组相比，模型组大鼠血浆粘度、全血低切还原粘度、全血高切还原粘度显著升高，差异有极显著性意义(P<O．01)。与模型组比较，复方丹参滴丸组与本发明药物胶囊高、中、低剂量组的血浆粘度、全血低切还原粘度、全血高切还原粘度显著降低，差异有极显著性意义(P<O．01)。见表46。

表46本发明药物胶囊对血瘀模型大鼠血浆粘度、全血低切、高切还原粘度的影响

注：与空白组比较，☆P<0.05，☆☆P<0.01；与模型组对比，△P<O.05，△△P<O.O1

1.3.2.4对血瘀模型大鼠全血低切相对指数、全血高切相对指数的影响

本发明药物胶囊对大鼠血液流变学影响：与空白组相比，模型组大鼠全血低切、高切相对指数升高，差异有极显著性意义(P<O．01)。与模型组比较，复方丹参滴丸组与本发明药物胶囊高、中、低剂量组的全血低切相对指数显著降低，差异有极显著性意义(P<0．01)。与模型组比较，复方丹参滴丸组与本发明药物胶囊中、低剂量组的全血高切相对指数显著降低，差异有显著性意义(P<0．05)。与模型组比较，本发明药物胶囊高剂量组的全血高切相对指数显著降低，差异有极显著性意义(P<0．01)。见表47。

表47本发明药物胶囊对血瘀模型大鼠全血低切、高切相对指数的影响

注：与空白组比较，☆P<0.05，☆☆P<0.01；与模型组对比，△P<0.05，△△P<0.01

1.3.2.5对血瘀模型大鼠红细胞聚集指数、红细胞变形指数、红细胞刚性指数的影响

与空白组相比，模型组大鼠红细胞聚集指数、刚性指数显著升高，差异有极显著性意义(P<0．01)。与模型组比较，复方丹参滴丸组与本发明药物胶囊中、低剂量组的红细胞聚集指数显著降低，差异有显著性意义(P<0．05)。与模型组比较，本发明药物胶囊高剂量组的红细胞聚集指数显著降低，差异有极显著性意义(P<0．01)。与空白组相比，模型组大鼠红细胞变形指数显著降低，差异有极显著性意义(P<0．01)。与模型组比较，复方丹参滴丸组、本发明药物胶囊高、中、低剂量组的红细胞变形指数显著降低，差异有极显著性意义(P<0．01)。见表48。

表48本发明药物胶囊对血瘀模型大鼠红细胞聚集指数、变形指数、刚性指数的影响

注：与空白组比较，☆P<0.05，☆☆P<0.01；与模型组对比，△P<0.05，△△P<0.01

实验结果显示：本发明药物胶囊组能有效地降低大鼠血液流变学全血粘度（1S、5S、30S、200S切变率）、血浆粘度、红细胞压积、红细胞聚集指数、红细胞刚性指数、全血低切还原指数、全血高切还原指数、全血低切相对指数、全血高切相对指数；能有效的升高红细胞变形指数。说明本发明药物胶囊能使血瘀模型大鼠血液粘、凝、聚状态明显减轻，提示该药有较强的活血化瘀作用。

Claims (13)

1.一种治疗痛经的药物组合物，其特征在于：它含有下述重量配比的原料药制备而成的制剂：

柴胡70-210份、白芍140-420份、枳壳70-210份、丹参70-210份、乳香42.5-127.5份、甘草43.5-130.5份、没药42.5-127.5份。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：它是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂：

柴胡105-175份、白芍210-350份、枳壳105-175份、丹参105-175份、乳香64-106份、甘草65-109份、没药64-106份。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于：它是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂：

柴胡140份、白芍280份、枳壳140份、丹参140份、乳香85份、甘草87份、没药85份。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的药物组合物，其特征在于：所述的乳香、没药为醋制乳香、醋制没药或炒乳香、没药；所述的柴胡为醋炒柴胡；所述的柴胡来源于竹叶柴胡，为伞形科植物膜缘柴胡Bupleurummarginatum Wall.ex DC.、马尾柴胡Bupleurum microcephalum Diels.、马尔康柴胡Bupleurum malconenseShan et Y.Li或小柴胡Bupleurum tenueBuch.-Ham.ex D.Don的干燥全草；或来源于伞形科植物柴胡Bupleurumchinense DC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根。

5.根据权利要求2或3所述的药物组合物，其特征在于：它是由柴胡、白芍、枳壳、丹参、乳香、甘草、没药的原生药粉或水或有机溶剂提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于：所述的制剂是片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于：所述的胶囊剂中每粒含芍药苷不得少于2.50mg。

8.一种制备权利要求2或3所述的药物组合物的方法，它包括如下步骤：

a、称取原料药；

b、枳壳、乳香、没药采用水蒸气蒸馏法收集挥发油，蒸馏后的水溶液收集备用，药渣备用；

c、将b步骤的挥加油以β-环糊精包合，β-环糊精与油的重量配比为：6-10：1，包合物备用；

d、丹参加入60%-80%v/v的乙醇回流提取，滤过，滤液回收乙醇并浓缩成清膏，药渣备用；

e、将b、d步骤的药渣与柴胡、白芍、甘草加水煎煮，滤过，滤液与b步骤蒸馏后的水溶液混合浓缩，加入d步骤的清膏、c步骤的β-环糊精包合物，混合，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药学上常用的制剂。

9.根据权利要求8所述的药物组合物的制备方法，其特征在于：d步骤所述的β-环糊精:油比例为10:1，包合条件为：包合温度60℃，包合时间2h；e步骤所述的乙醇浓度为60%v/v。

10.权利要求1-7任意一项所述的药物组合物在制备治疗痛经的药物中的用途。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述的药物是治疗肝郁血瘀型痛经的药物。

12.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述的药物是治疗原发性痛经的药物。

13.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述的药物是具有镇痛、抗炎，活血化瘀、调节子宫内膜组织前列腺素、NO、ET-1的分泌或增加外周血清β-内啡肽含量达到缓解疼痛的作用的药物。

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