CN102716424A - 一种治疗乳癖的药物组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗乳癖的药物组合物，它是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂：白芍400-700份、瓜蒌皮250-400份、莪术250-400份、香附250-400份、青皮250-400份、当归350-550份、全蝎80-140份、鳖甲350-550份、昆布250-400份、半枝莲400-700份、夏枯草350-550份、茯苓350-550份。本发明药物组合物，具有良好的抗炎、镇痛、活血化瘀功效，不仅能够有效改善乳腺增生的病理症状，还能抑制乳腺癌癌前病变，为临床治疗乳腺增生、预防乳腺癌提供了新的用药选择。

Description

一种治疗乳癖的药物组合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种治疗乳癖的药物组合物及其制备方法和用途。

背景技术

乳癖主要指乳腺囊性增生病，西医学认为是一种既非炎症、又非肿瘤的疾病，而是以乳腺纤维组织及上皮增生伴囊肿形成的一种乳腺结构紊乱的疾病，故国外学者称之为纤维囊性乳腺病。乳癖的临床表现是以乳房疼痛和乳房肿块为主要临床特征。为了便于中西医之间对本病在病名含义上的统一，1995年国家中医药管理局制订的《中医病证诊断疗效标准》，规范了本病的病名及含义，将西医乳腺增生病与中医乳癖的病名相统一。

目前中医对本病的成因主要有以下几种观点：①天癸的量与质发生变化，或天癸之调节失衡，是乳癖的重要病机。②肝郁气滞是本病的主要病理环节。③痰瘀凝结是本病的发病机制。④阳明胃热是本病主要原因，由于阳明胃热，气滞火郁，煎熬津液成痰，气滞则血瘀，痰瘀交结不散。⑤肝郁气滞，脾失健运，肝脾两伤，痰瘀互结，凝滞于乳络是乳癖的病机。⑥情志内伤，肝郁气滞，肝肾亏损，冲经失调是病之本，痰瘀互结阻于乳络是病之标，标本之间又可互为因果。

中医药治疗乳癖的临床报道中，以行气活血、散结止痛之法组方治疗乳癖者较为多见。如：柴瓜消结汤，药物组成：柴胡、香附、郁金、瓜蒌、通草、昆布、薤白、三棱、莪术、猫爪草、海藻、白花蛇舌草，临床运用收治160例患者，单纯增生76例，囊性增生20例，腺性增生24例，混合性增生40例。经治疗有效46例，有效率55.6%；治愈89例，治愈率84.4%。又如乳癖汤，药物组成：柴胡、杭芍药、当归、茯苓、白术、甘草、生姜、薄荷、昆布、海藻、夏枯草、牡蛎、鹿角霜、半夏，临床运用治疗乳癖时，总有效率达96.7%。

然而，目前常见的组方中，常包含了久用存在安全隐患之品（如川楝子、青木香、山慈菇、猫爪草、金果榄、川乌、天南星、八角莲、重楼、乳香、没药），或资源受限的药材（如鼠妇虫、鹿含草、冬虫夏草、黑蚂蚁、鹿角（霜）、皂角刺），部分药物其作用峻猛，或有副作用而令患者有畏惧心理，因此实际用于乳癖治疗的药品较少，这与如此庞大的乳癖患者群体的需求极不相称。

鉴于目前存在的上述缺陷，急需一种无需资源稀缺药材，且能够安全、有效地治疗乳癖的中药新组方。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗乳癖的药物组合物及其制备方法和用途。

本发明提供了一种治疗乳腺增生的药物组合物，它是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂：

白芍400-700份、瓜蒌皮250-400份、莪术250-400份、香附250-400份、青皮250-400份、当归350-550份、全蝎80-140份、鳖甲350-550份、昆布250-400份、半枝莲400-700份、夏枯草350-550份、茯苓350-550份。

进一步地，它是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂：

白芍500-600份、瓜蒌皮300-350份、莪术300-350份、香附300-350份、青皮300-350份、当归400-500份、全蝎100-120份、鳖甲400-500份、昆布300-350份、半枝莲500-600份、夏枯草400-500份、茯苓400-500份。

进一步优选地，它是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂：

白芍556份、瓜蒌皮333份、莪术333份、香附333份、青皮333份、当归444份、全蝎111份、鳖甲444份、昆布333份、半枝莲556份、夏枯草444份、茯苓444份。

其中，所述鳖甲为醋制鳖甲。

其中，所述制剂为颗粒剂、片剂、胶囊剂、散剂或丸剂。

进一步地，所述颗粒剂中，每1g颗粒剂含芍药苷不得少于5mg。

本发明还提供了上述的药物组合物的制备方法，它包括如下操作步骤：

（1）按配比称取原料药；

（2）取当归、莪术、香附、青皮，经水蒸气蒸馏法提取，所得芳香水经β-环糊精包合后，干燥、粉碎，所得包合物备用；将经水蒸气蒸馏法提取的水提液与药渣分离，分别收集水提液、药渣，备用；

（3）取步骤（2）收集的药渣，与瓜蒌皮、全蝎、鳖甲、昆布、茯苓混合后加水提取，所得提取液再与步骤（2）收集的水提液合并，减压浓缩至清膏，离心后，得水提清膏，备用；

（4）取白芍、夏枯草、半枝莲，加60-80%V/V乙醇提取，合并提取液，回收乙醇后，浓缩，得醇提清膏，再与步骤（3）制备的水提清膏合并，喷雾干燥，所得干粉与步骤（2）制备的包合物混匀，再加入药学上常用的辅料或辅助性成分制剂，即得。

进一步地，步骤（2）中所述包合物的具体制备方法如下：取当归、莪术、香附、青皮，加10-14倍量水，水蒸气蒸馏法提取3-5小时，收集芳香水并重蒸馏至药材重量的30-35%v/w，再加入芳香水7-8%w/v的β-环糊精，经胶体磨研磨包合后，冷藏、干燥、粉碎后，即得包合物；

步骤（3）中，加药材干重10-14倍量的水，浸泡20-40分钟，提取3次，每次40-60分钟；减压浓缩至60℃时相对密度为1.03~1.05的清膏；

步骤（4）中，加药材干重10-14倍量的60-80%V/V乙醇，提取3次，每次90-120分钟；醇提清膏的相对密度在60℃时为1.03~1.05；喷雾干燥参数为：进风温度为180~200℃、出风温度为90~100℃。

进一步优选地，步骤（2）中，水蒸气蒸馏法提取4小时，收集芳香水并重蒸馏至药材重量的32%v/w，加入芳香水7.5%w/v的β-环糊精，胶体磨研磨包合30min；

步骤（3）中，加水浸泡20分钟，提取3次，每次45分钟；

步骤（4）中，加70%V/V乙醇，提取3次，每次90分钟。

本发明还提供了上述的药物组合物在制备抗炎、镇痛、抗血栓、预防乳腺癌或治疗乳腺增生的药物中的用途。

进一步地，所述乳腺增生为乳腺囊性增生。

本发明还提供了上述药物组合物在制备活血化瘀的药物中的用途。

发明人在对乳癖的长期临床研究中发现，肝郁气滞是本病发展和形成的最基本因素。本病主要多发于女子，女子以肝为先天，肝主疏泄，调节情志，肝宜调达，而忌怫郁。如肝郁气滞，疏泄失司，则天癸失其调节；肝木横逆克土，胃失和降，脾失健运，水谷运化失常，或郁而化火，煎熬津液成痰；或水谷精微不能正常输布而变生痰浊，兼之气滞则血瘀，痰瘀互结，凝积成块阻于乳络而成乳癖，肝郁气滞，久则致虚，肝肾亏损而致冲经失调，从而形成本虚标实之证。因此，在治疗上，应紧紧抓住肝郁气滞这一基本病机，以行气疏肝为治疗大法，兼以消痰化瘀散结，调经止痛，并注意顾护脾胃，调理冲任，从而标本兼治而以治标为主，攻补同施而以攻邪为要，做到治标而顾本，攻邪不伤正，才能收到良好的临床疗效。

本发明药物组合物的有益效果主要体现在如下几个方面：

①本方主治乳癖中的囊性增生，其发生、发展和形成过程中，肝郁气滞、冲任失调是关键病因，瘀痰互结、阳明郁热是基本病理，结块有形、肿胀疼痛是主要临床表现。方中香附，性平、味辛而微有甘苦，主入肝经，功能疏肝解郁，调经止痛。白芍性微寒，味甘而微苦酸，亦主要归肝经之药，功能养血敛阴，柔肝止痛，并兼通利血脉之性。此二药，既能针对肝郁不舒、冲任不足的主要病因病机，又可兼顾血瘀作痛、月经不调诸多症状，标本同治，且辛香之香附与养血敛阴之白芍同用，于阴血不伤，故共为君药。

青皮辛苦、微温，主入肝胃二经。以疏肝行气，消积散结为主要功效，且可消痰；本品与香附同用，可助其疏肝行气之力，其与活血、消痰之品同用，可增强消散瘀血与痰结之功。当归性温而味甘、辛，主入肝与冲任，既可补血，又可活血止痛，有补血不留瘀，化瘀不伤血的优势，为古今临床用以补血与调经止痛之要药；方中其与白芍等品配伍，共同补营血、滋阴精，益冲任，补而不滞；其与莪术诸药配伍，助其活血、补气、止痛之效，且破血而不伤正。莪术性平味辛，破血行气，散结止痛。其作用虽较峻猛，历来被视为破血之品，但与白芍、当归、鳖甲、茯苓等养血、益阴、健脾药同用，则于气血不伤。鳖甲性微寒而味甘咸，善入肝肾二经，以滋阴退热，平肝潜阳，软坚散结。以上四药，共助君药疏肝气，养阴血，调冲任，并活血化瘀，软散癖块，且滋养阴血而不凝滞，活血散结而不耗伤，两全扶正攻邪之效，作为臣药。

瓜蒌皮性味苦寒，主入肺、胃，兼归肝经；为清热化痰，利气散结常用之品，不仅用于主治热痰阻于肺窍之咳喘，亦多用以治疗痰热凝结之乳病及痈肿等。因山甲出于保护动物，故本方以具与鳖甲、全蝎配伍，亦善通络散结以治乳癖。昆布性凉寒咸，归肝胃二经；功能消痰软坚，利水退肿，本方只要用以消痰散结。夏枯草辛、苦性寒，主入肝经，长于清肝火，散郁结，乳癖之病，多系肝胃郁热，化火灼津为痰，痰热结于乳房而成，本品善清肝胃之火，消散郁结，故用之有效。半枝莲辛苦性平，为近年从民间发掘出的清热解毒，活血止痛之药，主要用于疮痈肿毒，虫蛇咬伤、癌症肿瘤，月经不调及乳腺增生等病证；本方用以协助清解肝胃郁火，并增强活血散结之功。全蝎辛温，功能息风止痉，攻毒散结，通络止痛，本方中则主要取其通络、散结、止痛，协助诸消痰、活血之品，利于乳癖消散。以上五药，主要针对乳癖痰结成块及兼有肝胃郁热的病因病理，共为佐药。

茯苓性平儿味甘、淡，主归脾胃，功能利湿，健脾，为主治脾虚气弱诸证的常用辅助之物。本品益气补虚，调理冲任，又助瓜蒌、昆布实脾运湿，祛痰散结，作为使药。

全方养肝肾，益气血，调冲任以培元固本，又疏肝解郁，活血化瘀，消痰散结，通络止痛，且兼清阳明胃经之热，能全面切中乳癖冲任失调、肝气不舒、痰瘀互结并兼郁热的病因病机；又直接针对结块肿胀疼痛的局部症状，散结止痛，标本兼顾，因症同求，故组方合理，用之有效而安全。

②用药安全：乳癖患者需较长时间服药，本方所用药物，无药性峻猛的弊端，既消散癖块，又不伤正气，确保临床用药安全有效；与现上市品种相比，未用川楝子、青木香、山慈菇、猫爪草、金果榄、川乌、天南星、八角莲、重楼、乳香、没药等久用存在安全隐患之品；

③无资源限制：方中药物，均是种植或养殖之品，未用资源受限的鼠妇虫、鹿含草、冬虫夏草、黑蚂蚁、鹿角（霜）、皂角刺等，有利于资源保护和可持续利用；并且，与现有乳癖药品的处方组成相比较，本发明组方中鳖甲、全蝎、昆布、莪术、半枝莲等，为其他药品未用或少用之品。

综上，本发明药物组合物，具有良好的抗炎、镇痛、活血化瘀功效，不仅能够有效改善乳腺增生的病理症状，还能抑制乳腺癌癌前病变，为临床治疗乳腺增生、预防乳腺癌提供了新的用药选择；该药物组合物既有临床疗效确切、稳定的优点，又无药性峻猛的弊端，既消散癖块，又不伤正气，确保临床用药安全、有效，且组方中未用资源受限药材，有利于资源保护和可持续利用。

附图说明

图1本发明药物组合物对实验性乳腺增生大鼠模型乳腺组织病理形态学的影响（HE×100），其中，A空白对照组、B模型对照组、C大剂量组（42g原生药/kg）、D中剂量组（21g原生药/kg）、E小剂量组（10.5g原生药/kg）、F乳癖消组；

图2用免疫组化SP法测乳腺增生大鼠ER、PR表达；其中，A乳腺组织ER表达阳性，核棕黄色为表达阳性；B乳腺组织PR表达阳性，核红色为表达阳性；

图3本发明药物组合物对兔乳腺增生实验给药后兔乳头观察；A空白组兔乳头、B模型组兔乳头（乳头增大红肿）、C本发明药物组合物21g原生药/kg；

图4本发明药物组合物对实验性乳腺增生兔乳腺组织形态影响；A空白组图乳腺腺泡（HE×100）、B空白组兔乳腺导管（HE×40）、C模型组图乳腺腺泡（HE×100）、D模型组兔乳腺导管（HE×40）、E青香大剂量组图乳腺腺泡（HE×100）、F青香大剂量组兔乳腺导管（HE×40）；

图5本发明药物组合物对DMBA致大鼠乳腺癌前病变实验乳腺组织病理形态影响（HE×100），其中，A大鼠正常乳腺组织、B大鼠乳腺增生、C大鼠乳腺非典型增生、D大鼠乳腺癌。

具体实施方式

实施例1本发明药物组合物的制备

【处方】

白芍556g、瓜蒌皮333g、莪术333g、香附333g、青皮333g、当归444g、全蝎111g、鳖甲（醋制）444g、昆布333g、半枝莲556g、夏枯草444g、茯苓444g    共制成1000g颗粒。

【制法】

以上十二味，当归、莪术、香附、青皮加10倍量水，加热提取挥发油4小时，收集芳香水重蒸馏为462ml，加入β-环糊精34.67g，用胶体磨研磨包合30min，研磨液置冰箱中冷藏过夜，离心，抽滤，40℃干燥粉碎后备用；提取挥发油后的药液另器收集备用；药渣与瓜蒌皮、全蝎、鳖甲、昆布、茯苓加10倍量的水，浸泡20分钟，提取3次，每次45分钟，滤过，药液与提取挥发油后的药液合并，减压浓缩（温度80℃、真空度-0.08~-0.1Mpa）至相对密度1.03~1.05（60℃）的清膏，10000r/min的转速离心后备用；白芍、夏枯草、半枝莲加10倍量的70%乙醇，提取3次，每次90分钟，滤过，滤液减压（温度80℃、真空度-0.08~-0.1Mpa）回收乙醇，然后再在此条件下浓缩至相对密度1.03~1.05（60℃）的清膏，与水提液浓缩后的清膏合并，喷雾干燥（进风温度为180~200℃、出风温度为90~100℃），收集干粉，与β-环糊精包合的挥发油混匀，再加入适量β-环糊精调整重量至1000g，在相对湿度低于67%，温度18～22℃的条件下干法制粒（主压力4.5～5.5Mpa，侧压力0.25Mpa），过筛，收集一至五号筛的颗粒，分装，即得。

本方以行气疏肝，调理冲任的香附、青皮疏肝解郁；以当归、白芍、鳖甲调补冲任，共用针对病因；以莪术、瓜蒌皮、昆布及当归活血化瘀，消痰散结；以夏枯草、半枝莲清解郁热；辅以全蝎通络，助其化瘀之力；茯苓健脾除湿，助其充养气血，并防生痰；以八白芍、当归、香附、莪术、全蝎止痛。全方能全面针对本病的基本病机、病理和症状，有的放矢、标本兼顾，因症同求故有准确的适应性。

实施例2本发明药物组合物的制备

按如下配方称取取原料药：

白芍700g、瓜蒌皮250g、莪术250g、香附400g、青皮250g、当归350g、全蝎80g、鳖甲350g、昆布250g、半枝莲400g、夏枯草350g、茯苓350g；

按照实施例1方法制备成颗粒剂后，加入适当崩解剂，压片，即得本发明药物组合物片剂。

实施例3本发明药物组合物的制备

按如下配方称取取原料药：

白芍500g、瓜蒌皮350g、莪术350g、香附350g、青皮350g、当归500g、全蝎120g、鳖甲500g、昆布350g、半枝莲600g、夏枯草500g、茯苓500g；

按照实施例1方法收集喷雾干燥所得干粉后，与β-环糊精包合的挥发油混匀，加入适量的微晶纤维素，混匀后，装胶囊，即得本发明药物组合物胶囊剂。

实施例4本发明药物组合物中芍药苷的含量测定

白芍为方中君药，其指标成分为芍药苷。为了进一步规范本发明药物组合物的质量标准，对其中的芍药苷含量进行了测定。

对照品：

芍药苷（批号110736-200630，供含量测定用）对照品由中国药品生物制品检定所提供；

供试品溶液的制备：

取本发明药物组合物（实施例1制备得到）约0.5g，精密称定，置50ml容量瓶中，加入甲醇约45ml，超声处理30分钟，取出，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，离心，即得。

色谱条件：

色谱柱：Shim-pack VP-ODS柱（4.6mm×150mm，5μm）；保护柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6mm×12.5mm，5μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸（16：84）；柱温30℃；检测波长：230nm。

经测定，三批样品中芍药苷的含量分别为7.543mg/g、7.353mg/g、7.625mg/g，考虑到药材含量上的差异，本标准暂定本品每1g颗粒剂中含芍药苷，不得少于5mg/g。

实施例5本发明药物组合物的提取工艺研究

1当归、莪术、香附、青皮挥发油提取工艺的确定

挥发油为上述药物中的与本处方功能主治有关的有效成分，因此，对挥发油的提取进行考察。

1.1挥发油提取的工艺研究

1.1.1吸水率的考察

称取上述药材三份，每份39g，加10倍量水浸泡至透心、滤过，测得吸水率，结果见表1。

表1吸水率测定结果

由上表可见，药材吸水率较高，为避免长时间加热过程中药材糊化或粘壁，保证提取顺利进行，提取时应额外加入2倍量水以补足药材的吸水量。

1.1.2考察浸泡时间对挥发油收量的影响

称取上述药材三份，每份195g，加10倍量水浸泡0小时、2小时和过夜（≥12小时），分别提取8小时，计算挥发油收量，结果见表2。

表2浸泡时间考察结果

可见，浸泡时间对挥发油收量影响甚微，因此采用不浸泡直接提取挥发油。

1.1.3考察加水量对挥发油收量的影响

称取药材三份，每份195g，加不同倍量水，分别提取8小时，计算挥发油收量，结果见表3。

表3加水量考察结果

结果可见，加水量对挥发油收量影响不明显。但考虑提取挥发油后的药液含水溶性有效成分，故应适当提高加水量利于水溶性有效成分的溶出。所以，选用10倍量水提取挥发油。

1.1.4考察提取时间对挥发油收量的影响

称取药材三份，各195g，加10倍量水，分别提取，计算不同时间挥发油收量、累积收率，结果见表4。

表4提取时间考察结果

实验结果可见，挥发油以前四小时的提取速度最快，至四小时挥发油累积收率已达总量的96.67%，故确定当归等挥发油提取时间为4小时。

综上所述，挥发油提取工艺确定为：当归、莪术、香附、青皮加10倍量水，不浸泡，加热提取挥发油4小时，考虑到大生产只能收集到芳香水,因此收集4小时芳香水备用。提取后的水溶液另器收集，备用。

1.2挥发油包合的工艺研究

挥发油经β-环糊精包合后，可增加稳定性，不易挥发、氧化，且β-环糊精又具有防潮作用，可降低中药颗粒剂的吸湿性，因此我们对挥发油β-环糊精包合工艺进行了研究。

大生产中挥发油提取收集的是芳香水，因此我们用芳香水进行包合工艺研究。首先对大生产收集的芳香水中的含油量进行了考察：取1950g药材按挥发油提取工艺提取4小时芳香水，并将芳香水重蒸馏为300ml，测定其中的挥发油含量，结果见表5。

表5大生产提取挥发量考察结果（n=3）

挥发油平均提取率为0.439%，因此大生产挥发油提取率应不低于0.35%。

1.2.1包合物的制备称取β-环糊精一定量与一定量含挥发油的芳香水混合，加入胶体磨中研磨（磨面间隙5um，转速2825转/分），研磨液置冰箱中冷藏过夜，离心，抽滤，包合物于40℃干燥即得。收得率按下面公式计算。

包合物收得率=（包合物重量/（β-环糊精的量+芳香水中挥发油的量））×100%

1.2.2挥发油包合率的测定

挥发油含量：将制得的包合物置500ml烧瓶中，加入蒸馏水200ml，连接挥发油提取器，按《中国药典》2005年版一部附录XD操作，读取挥发油量。

挥发油空白回收率测定：量取挥发油1ml，置500ml烧瓶中，加入蒸馏水至200ml，按上述操作进行，计算空白回收率为91%。

挥发油空白回收率=（收集挥发油量/加入挥发油量）×100%

在测定包合物中挥发油含量，空白回收率的基础上，计算出挥发油包合率公式如下。

包合率=（包合物中实际含油量/（芳香水中挥发油的量×空白回收率））×100%

1.2.3包合物工艺条件的考察

由预试情况及文献资料得知，油∶水、油∶β-环糊精、研磨时间对包合率、包合物收得率有较大影响，本法采用芳香水进行包埋,因此我们将收集的芳香水重蒸馏后以芳香水中油水比、芳香水中油:β-环糊精、研磨时间进行包合研究，选择上述三项为考察因素，各取三个水平进行L₉（3⁴）正交试验。因包合率为衡量包合效果的重要指标，包合率越高，包合效果越好，因而可作为包合工艺筛选的主要指标，权重系数定为0.7，收得率在大生产中也很有意义，在β-环糊精和挥发油投入量一定的情况下，收得率越高，包合效果越好，故收得率可作为次要筛选指标，权重系数定为0.3。正交表表头设计及试验结果见表6、表7、表8。

表6因素水表

表7正交试验结果

Z=30X/86.45+70Y/78.57。

表8方差分析

由试验结果的直观分析可知，影响挥发油包合的顺序为：C>A>B，以包合时间影响最大，由方差分析可知，A、C因素具有显著影响，由直观分析得β-环糊精包合挥发油的最佳工艺条件为A₂B₂C₂，即在芳香水中油水比为1：80，且芳香水中每1ml挥发油加入6g β-环糊精进行研磨包合30min，研磨液置冰箱中冷藏过夜，离心，抽滤，40℃干燥粉碎即得。据此条件验证三批结果见表9。

表9β-环糊精包合挥发油验证试验

以上实验表明该包合工艺合理、可行。为方便大生产时芳香水的收集以及β-环糊精加入量的计算，根据前面的实验结果，包合时芳香水中的油水比为1：80，挥发油提取率按0.35%计，1000g药材提取挥发油后的芳香水应重蒸馏为150ml，即将收集芳香水重蒸馏为药材量的15%,芳香水中油:β-环糊精为1：6，所以需加入β-环糊精21g，为药材量的2.1%，用胶体磨研磨30min。

2提取挥发油后的药渣与剩余水提取药材水提取工艺研究

2.1吸水率的考察

按处方比例称取瓜蒌皮、全蝎，鳖甲、昆布、茯苓药材45g，加10倍水浸泡至透心，滤过，测得吸水率，结果见表10。

表10吸水率测定结果

以上结果表明，瓜蒌皮等药材的吸水率为129.63%，加上挥发油提取后的药材，吸水率为69.44%，因此初次提取时应额外加入约1倍量水以补足药材的吸水量。

2.2实验方法

影响中药材水提取效果的因素主要有：药材粉碎粒度、提取温度、浸泡时间、加水量、煎煮时间、煎煮次数等。根据药材所含成分的性质和工厂的实际情况，药材采用饮片形式以水煎煮提取数次，即可充分浸出有效成分。因此，本研究对浸泡时间、加水量、煎煮时间和次数四个因素各设三个水平，按照L₉（3⁴）正交表安排试验，因素水平表见11。由于当归为方中臣药，阿魏酸是当归的指标性成分，但经试验预试，处方中其它药味中也含有阿魏酸，因此我们以阿魏酸的含量作为提取考察的指标性成分，同时和干膏的收率为指标进行综合评价。

按处方比例称取当归、香附、青皮、莪术药材，按挥发油提取工艺提取挥发油，滤过，药渣加入瓜蒌皮，全蝎等药，按正交试验条件进行提取，过滤，合并滤液，备用。

各评价指标的含量测定方法

①阿魏酸的含量测定

阿魏酸的含量测定：采用高效液相色谱法。

色谱条件：Agilent 1100型高效液相色谱仪，VWD紫外检测器，色谱柱Agilent Eclipse XBD-C18柱（4.6×150mm，5um）；流动相为乙腈-0.085%磷酸溶液（17∶83）；流速：1ml/min；柱温35℃；紫外检测波长：316nm。

供试品溶液的制备：取正交试验项下的提取液，浓缩至250ml，从中精密吸取15ml，于50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，离心，取上清液即得。

阿魏的转移率（%）=测得阿魏酸的量(mg)/正交试验中用当归中阿魏酸的量(mg)*100%

②干膏的收率

精密量取阿魏酸含量测定项下提取液一定量，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥5小时，移至干燥器中，冷却30分钟，迅速精密称定重量，计算浸膏得率；

正交试验结果及分析见表11~14。

表11因素水平表

表12正交试验结果表

表13阿魏酸含量方差分析表

表14出膏率方差分析表

由阿魏酸含量直观分析可知，影响提取效果的因素顺序为：D>C>B>A，方差分析结果表明：B、C、D因素对实验结果无显著性意义，以A₁B₃C₃D₃组合最佳；由出膏率直观分析可知，影响提取效果的因素顺序为：D>B>C>A，方差分析结果表明：B、D因素对实验结果有显著性意义，以A₂B₃C₂D₃组合最佳。综合以上结果，以A₁B₃C₂D₃为最佳，即药材加10倍量的水，浸泡20分钟，提取3次，每次45分钟。

为确证该工艺的优劣和稳定性，根据所筛选的最佳条件，对A₁B₃C₂D₃工艺验证三次，结果见表15。

表15验证试验结果

验证试验结果说明，A₁B₃C₂D₃工艺所得结果相差不大，说明所筛选的提取工艺条件稳定可行。

3白芍、夏枯草、半枝莲乙醇提取工艺的确定

3.1吸醇率的考察

按处方比例称取白芍、夏枯草、半枝莲药材42g，加10倍60%乙醇浸泡至透心，滤过，测得吸醇率，结果见表16。

表16吸醇率测定结果

以上结果表明，白芍等药材的吸醇率为153.22%，因此初次提取时应额外加入约1.5倍量乙醇以补足药材的吸醇量。

3.2实验方法

白芍所含的芍药苷，夏枯草含有熊果酸，半枝莲含有野黄芩苷等黄酮类成分，易溶于乙醇，因此我们对以上3味药采用乙醇提取。根据生产实践中常用的考察条件，拟订影响提取效果的四个因素，即乙醇浓度、提取次数、提取时间及加醇量。由于白芍为方中君药，芍药苷是其主要成分，出膏率为发挥疗效的物质基础，也应为提取工艺条件的一个评价指标，故以芍药苷的转移率和干膏的收率为指标进行综合评价。

称取白芍等药材42g，按正交试验设计方案进行提取，滤过，药液备用。

各评价指标的含量测定方法

①芍药苷的含量测定

色谱条件：Agilent 1100型高效液相色谱仪，VWD紫外检测器，色谱柱Shim-pack VP-ODS柱（4.6mm×150mm，5um）；流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（14：86）为流动相；流速1ml/min；柱温30℃；紫外检测波长：230nm。

供试品溶液的制备：取正交试验项下的提取液，量取总体积，从中精密吸取一定量药液，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀即得。

芍药苷的转移率(%)=测得芍药苷的含量/正交试验白芍中芍药苷的含量×100%

②干膏的收率

精密量取芍药苷含量测定项下提取液一定是量，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥5小时，移至干燥器中，冷却30分钟，迅速精密称定重量，计算浸膏得率。

正交试验结果及分析见表17、18、19。

表17因素水平表

表18正交试验结果表

表19芍药苷转移率方差分析表

表20出膏度率方差分析表

由芍药苷直观分析可知，影响提取效果的因素顺序为：D>A>B>C。方差分析结果表明：D因素对实验结果有极显著性意义（P<0.01），A、B因素的影响有显著意义（P<0.1），以A₂B₃C₂D₃组合最佳；由出膏率直观分析可知，影响提取效果的因素顺序为：D>C>B>A。方差分析结果表明：D因素对实验结果有极显著性意义（P<0.01），C因素的影响有显著意义（P<0.1），以A₁B₁C₃D₃组合最佳。综合以上结果，以A₂B₃C₃D₃为最佳组合。即白芍、夏枯草、半枝莲加10倍量的70%乙醇，提取3次，每次90分钟。

为确证该工艺的优劣和稳定性，根据所筛选的最佳条件，对A₂B₃C₃D₃工艺验证三次，结果见表21。

表21验证试验结果

验证试验结果说明，该工艺所得结果相差不大，说明所筛选的提取工艺条件稳定可行。

12.4.4浓缩工艺研究

12.4.4.1水提液浓缩工艺研究

药液经滤过后，需要进一步浓缩成一定相对密度的清膏，再进行除杂工序，本方采用减压浓缩方法，控制浓缩温度80℃、真空度-0.08~-0.1Mpa，将药液浓缩至相对密度1.03~1.05（60℃）的清膏备用。测定浓缩前后芍药苷和总多糖含量变化，结果如下：

表22提取液减压浓缩前后阿魏酸保有率

结果表明，采用以上条件进行减压浓缩，有效成分损失小。

12.4.5.2醇提液的浓缩工艺

醇提取液过滤后需回收乙醇，再浓缩至一定相对密度的清膏，本方采用减压回收乙醇的方法（温度80℃、真空度-0.08~-0.1Mpa）回收乙醇，然后再在此条件下浓缩至相对密度1.03~1.05（60℃）的清膏备用。并对浓缩前后中人参皂苷含量进行了考察，结果如下：

表23回收酒精及浓缩前后芍药苷含量的变化

结果表明，采用以上条件进行减压浓缩，有效成分损失小。

12.4.4.5除杂工艺

水煎煮时，药液杂质较多，如淀粉、果胶、树脂、粘液质、树胶、蛋白质、蜡质等。常用的除杂方法有板框压滤法、乙醇沉淀法、吸附澄清法、高速离心等。本方药材中含有多糖等成分，因此不宜采用乙醇沉淀法除杂；板框压滤法除杂效果不理想；吸附澄清法能保留较多有效成分，但工序多，操作繁琐，加入澄清剂搅拌后仍需离心，成本也较高（只比醇沉工艺费用低）。因此我们选用高速离心法除去水提取液中的固体微粒体系，高速离心除杂是一种物理分离方法，分离程度与离心机转速直接相关，转速越高除去杂质越多，为保证疗效，控制制剂质量，对离心转速进行了考察。

实验方法：按处方比例称取一定量药材，依所筛选的工艺条件进行提取，趁热滤过，取一定体积滤液数份，分别以4000、6000、8000、10000转/分钟的转速离心15分钟，再取各离心液分别测定芍药苷、干膏收率，结果见表24。

表24不同转速除杂效果比

从上表可见，转速在4000r/min以上时，固形物收率相差不大，而相对来说10000r/min阿魏酸保有率都较高，故选择水煎液以10000r/min的转速离心。

12.4.5干燥

采用喷雾干燥法对所得的半成品清膏进行干燥，影响喷雾干燥的主要因素有：进料温度、清膏相对密度、进料速度、进风温度、出风温度等。根据中试生产操作经验和中试情况，确定清膏喷雾干燥工艺条件为：料液密度1.05~1.10（25℃），进风温度为180~200℃、出风温度为90~100℃。此时喷雾干燥进行顺利，清膏粘壁损失少，而且可得到干燥疏松浸膏粉末。

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。下述试验例中所用本发明药物组合物，均是由实施例1制备得到。

试验例1本发明药物组合物对乳腺增生模型作用实验研究

1实验材料

1.1实验药物

1.1.1受试药物

本发明药物组合物浸膏，批号：090201，浓度为2g原生药/g浸膏，成人每天服原生药量126g。

1.1.2阳性对照药物

乳癖消片，0.67g/片，一次3片，一日3次。产地：辽宁好护士药业有限责任公司。批号：090509。

1.2实验动物

SD大鼠，体重180～220g，未孕雌性，清洁级，由四川省中药研究所实验动物中心提供，合格证号为SCXK（川）2008-24。

日本大耳白兔。体重(1.99±0.12)kg，未孕雌性，清洁级，由四川省中药研究所实验动物中心提供，合格证号为SCXK（川）2008-14。

1.3实验试剂

苯甲酸雌二醇注射液：天津金耀氨基酸有限公司，批号：0907161

黄体酮注射液：浙江仙琚制药股份有限公司，批号：090705

己烯雌酚注射液：天津金耀氨基酸有限公司，批号：0804301

雌二醇试剂盒（化学发光法）：日本雅培制药有限公司，批号：77257QL00

孕酮试剂盒（化学发光法）：美国雅培制药有限公司，批号：79010JU00

雌二醇放免试剂盒：天津九鼎医学生物工程有限公司，批号：POG61005S

孕酮放免试剂盒：天津九鼎医学生物工程有限公司，批号：RG51005

1.4实验仪器

精密游标卡尺，成都成量工具有限公司，0～150mm，0.02mm

0412-1台式低速离心机，上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂

AXSYM全自动免疫化学发光分析仪，美国雅培公司

OLYMPUS（BH-2）照相显微镜，Olympus Com.Japan生产

Mias-300图像分析系统，四川大学图像图形研究所

GC-1200γ放射免疫计数器，科大创新股份有限公司中佳分公司

2实验环境

试验在四川省中医药科学院中医研究所药理毒理研究室进行，试验场地为动物毒性试验专用恒温恒湿实验室，环境设施：三级（GB14925-2001），实验动物使用许可证：SYXK（川）2008-057。室温20～23℃，相对湿度55±15%；荧光灯照明，12h/12h明暗相间；洁净空气（1万洁净度），换气频度20次/h，梯度压差20～50Pa，气流速度0.1～0.2m/s，氨浓度<14mg/M³。大鼠、小鼠均按性别于鼠笼中饲养，每笼5只，大鼠笼体积45cm×35cm×25cm，小鼠笼体积为25×16×14cm。小鼠大鼠从鼠笼不锈钢丝分隔外饲料箱中自由取食，水瓶自由饮水，水为清洁水，水瓶容量500ml，每日更换新鲜水。兔按性别于兔笼中饲养，每笼1只。

3统计学方法

采用T-test方法进行统计

4实验方法和结果

4.1对大鼠乳腺增生血清激素、激素受体及乳腺病理的影响

4.1.1实验原理

使用外来激素导致内分泌紊乱在动物身上复制出乳腺增生模型。肌肉注射雌二醇注射液后，连续注射黄体酮注射液诱导大鼠雌、孕激素比例失调，刺激乳腺组织使其不能有增值转入复旧，出现乳腺小叶数目增多，小叶内腺泡数增加，腔内出现分泌物甚或腺泡形成囊肿等乳腺增生的病理改变。

4.1.2动物分组及给药

取SD鼠60只，未孕雌性，按体重随机分为6组，每组10只。其中第1-3组分别为本发明药物组合物大、中、小剂量组（后简称青香组），成人体重以60Kg计，大鼠等效剂量以10倍人用量计。用蒸馏水配成相应浓度的混悬液，当日配制当日使用。即给药量分别为42原生药/kg、21原生药/kg、10.5原生药/kg。第4组分别为乳癖消片对照（分别简称“乳癖消组”）。第5、6组分别为模型对照组，正常对照组。除模型及正常对照组给予10ml/kg蒸馏水外，其余各组分别ig同体积相应药物，每日1次。

4.1.3实验方法及结果

造模前先用标卡尺测量每只大鼠第2对乳房直径，除空白对照组外，其余各组大鼠肌肉内注射苯甲酸雌二醇0.5mg/kg，每天1次，连续25天后改用黄体酮4mg/kg，每天1次，连续5天，复制大鼠乳腺增生模型，空白对照组注射生理盐水。于模型成立后再次测量每只大鼠胸部第2对乳房直径，并开始给予相应药物，空白对照组和模型对照组给予等体积蒸馏水，不间断连续给药30天。

1）乳房外观及乳头直径观察：末次给药后24小时再次测量第2对乳房直径。造模成功后，外观观察发现模型组大鼠乳头红肿。与空白对照组比较，模型组第二对乳房直径给药前和给药后均显著增大（p﹤0.01）。连续给治疗药30天后，本发明药物组合物42g原生药/kg、21g原生药/kg及乳癖消组给药后乳头直径比给药前显著减小（p﹤0.05）。实验结果见表25

表25本发明药物组合物对大鼠乳头直径的影响

注：与模型组比较，*p﹤0.05；与空白组比较，△△p﹤0.01

2）激素测定：测过乳头直径后进行实验。10%水合氯醛麻醉3ml/g，股动脉取血，2000r/min离心15min，分离血清，用化学发光法测定血清中雌二醇、孕酮的含量。

表26对大鼠乳腺增生血清激素的影响

注：与模型组比较，*p﹤0.05；与空白组比较，△△p﹤0.01

实验结果见表26，与空白组比较，模型组雌二醇明显升高（p﹤0.01），而模型组孕酮降低不明显（p﹥0.05）；与模型组比较，本发明药物组合物42g原生药/kg组雌二醇明显下降（p﹤0.05），其他给药组则雌二醇和孕酮变化均不明显（p﹥0.05），E2有降低趋势，P有升高趋势，说明本发明药物组合物有调节E2和P水平的作用。

3）病理检查：取血后动物断头处死，用8mm打孔器，取胸部第2对乳房的乳腺，固定于10%中性福尔马林溶液内，HE染色，进行乳腺病理检查（主要观察乳腺小叶腺泡数、腺泡腔直径及导管直径）；常规石蜡包埋切片，用做免疫组化SP法测ER（DAB显色）、PR（AP-red显色）阳性表达情况的测定。

（1）乳腺病理切片

空白对照（正常）大鼠：乳房内乳腺小叶很少，稀疏分布，每个小叶内仅有几个无功能的腺泡，腺泡腔窄小，腺泡不扩张，腺泡上皮细胞呈立方形，无分泌物，处于静止状态。乳腺导管呈闭琐状态，无增生，乳腺组织正常（见图1A）。

乳腺增生模型大鼠：乳腺组织出现重度增生。乳房内乳腺小叶的数量增多，小叶体积明显增大，小叶内腺泡的数量增加，腺泡高度扩张、分泌旺盛，腔内有比较多的分泌物和脱落的细胞，高倍镜下腺泡上皮细胞呈扁平状或梭形。（图1B）。

本发明药物组合物大剂量组：与模型组比较，乳腺小叶数目明显减少，小叶面积减小，腺泡数明显减小，腺泡腔变小，分泌物减少，高倍镜下腺泡上皮细胞呈立方形。（图1C）

本发明药物组合物中剂量组：与模型组比较，乳腺小叶数目减少，腺泡数明显减小，腺泡腔变小，分泌物减少，高倍镜下腺泡上皮细胞呈立方形。（图1D）

本发明药物组合物小剂量组：与模型组比较，乳腺小叶数目减少，腺泡数减小，腺泡腔变小，分泌物减少。（图1E）

乳癖消阳性组：小叶面积减小，腺泡数减少，腺泡腔变小，分泌物减少，高倍镜下腺泡上皮细胞呈立方形。（图1F）

（2）各组雌、孕激素受体水平的对比

大鼠乳腺组织ER、PR表达：ER阳性判断标准为乳腺导管和小叶上皮细胞核或细胞浆着棕黄色时为阳性表达。PR阳性判断标准为乳腺导管和小叶上皮细胞核或细胞浆着红色时为阳性表达。阳性细胞率<20％者为(一)；阳性细胞率不足20％，但局部区域有少量较强着色的阳性细胞者为(±)；阳性细胞率>20％者且阳性细胞数由少至多，着色由浅至深依次计为一，±，+，++，+++，++++，并分别计1，2，3，4，5，6分，积分愈高表明ER、PR含量愈高。用免疫组化SP法测ER、PR阳性表达见图2。

表27本发明药物组合物对ER、PR阳性表达的影响

注：与模型组比较，*p﹤0.05，**p﹤0.01；与空白组比较，△p﹤0.01

结果见表27，模型组ER、PR阳性表达积分值明显高于空白组（p﹤0.01），本发明药物组合物各给药组ER、PR积分值明显低于模型组（p﹤0.05或p﹤0.01），说明本发明药物组合物可降低ER、PR含量。

4.2对兔乳腺增生血清激素及乳腺病理的影响

4.2.1实验方法

将36只雌兔随机分为6组。空白组动物肌注生理盐水0.4mL/(kg·d)，连续30d。造模前先用游标卡尺测各组兔第3对乳头直径。测后其余各组动物肌注己烯雌酚0.2mg/(kg·d)，连续25d后肌注黄体酮1mg/(kg·d)，连续5d。模型成功后再次测量各组兔第3对乳头直径，并开始给予相应药物，即给药量分别为本发明药物组合物21原生药/kg、10.5原生药/kg、5.25原生药/kg、乳癖消片对照（分别简称“乳癖消组”）。除模型及正常对照组给予10ml/kg蒸馏水外，其余各组分别ig同体积相应药物，每日1次，不间断连续给药30天。

标本采取：处死动物，观察其外观。10%的水合氯醛2.5ml/kg麻醉，耳缘静脉取血，40℃恒温水浴2h，3000r/min离心15min，分离血清；剥离兔的第2对乳腺，10%甲醛固定。指标检测：乳腺组织石腊包埋，切片，HE染色，光学显微镜观察乳腺组织（主要观察乳腺小叶腺泡数、腺泡腔直径及导管直径）。血清雌二醇(E2)、孕酮(P)分别使用相关试剂盒，采用放射免疫法进行检验。

4.2.2实验结果

1）乳房外观观察及乳房直径变化：末次给药后24小时再次测量第2对乳房直径。结果造模成功后，外观观察发现模型组的乳头红肿。与空白对照组比较，模型组第二对乳房直径给药前和给药后均显著增大（p﹤0.01）。连续给药30天后，与模型组比较，本发明药物组合物42g原生药/kg、21g原生药/kg及乳癖消组给药后乳头直径比给药前显著减小（p﹤0.05）。结果见表28。（图3）

表28本发明药物组合物对兔乳头直径的影响

注：与模型组比较，*p﹤0.05，**p﹤0.01；与空白组比较，△△p﹤0.01

2）激素测定：实验结果见表29，模型组雌二醇明显升高，孕酮降低（p﹤0.01）；本发明药物组合物能降低乳腺增生兔雌二醇及升高孕酮（p﹤0.05），说明本发明药物组合物有调节E2和P水平的作用。

表29对兔乳腺增生血清激素的影响

注：与模型组比较，*p﹤0.05；与空白组比较，△p﹤0.053）乳腺病理观察：光镜下检查增生乳腺病理组织变化。

（1）乳腺组织病理增生状况。空白组（正常）兔：乳腺小叶不增生，腺泡数量极少，腺泡和导管不扩张，处于静止状态；模型组兔：乳腺小叶增生，腺泡和导管增生明显，导管明显扩张，腺泡内及导管内有大量的分泌物；本发明药物组合物给药组兔：乳腺小叶少量增生，部分腺泡和导管扩张乳腺小叶轻度增生，腺泡和导管处于轻度扩张状态。结果见图4。

（2）光学显微镜观察乳腺增生情况，计数每视野的小叶数、平均腺泡数及导管直径（100倍），小叶的腺泡直径（200倍）。结果见表30.

表30本发明药物组合物对兔乳腺增生的影响

注：与模型组比较，*p﹤0.05，**p﹤0.01；与空白组比较，△p﹤0.05，△△p﹤0.01

结果显示，造成实验性兔乳腺增生模型后，模型对照组乳腺腺泡直径导管直径显著性增大（P<0.05），乳腺腺泡数量显著性增加（P<0.01）；本发明药物组合物各剂量组能显著减少乳腺腺泡数量减少（P<0.01），乳腺腺泡直径和导管直径除了本发明药物组合物21g原生药/kg组其他组未见到明显改善（P>0.05）。

试验例2本发明药物组合物对DMBA致大鼠乳腺癌癌前病变防治作用

1实验材料

1.1实验药物

1.1.1受试药物

同试验例1“1.1.1”

1.1.2阳性对照药物

三苯氧胺片，产地：上海复旦复华药业有限公司。批号：090210。

1.2实验动物

SD未孕大鼠，鼠龄45±5天，体重160～180g，全雌，清洁级，由四川省中药研究所实验动物中心提供，合格证号为SCXK（川）2008-24。

1.3实验试剂

DMBA：7，12-dimethybenz(a)anthracene，sigma，每次15mg溶于1.5ml芝麻油中

1.4实验仪器

OLYMPUS（BH-2）照相显微镜，Olympus Com.Japan生产

2实验环境

同试验例1“2实验环境”

3统计学方法

同试验例1“3统计学方法”

4实验方法和结果

4.1实验方法

4.1.1实验原理

DMBA是多环芳烃类化合物，为强力致癌剂，其作用机制可能是：DMBA进入细胞后，在微粒体的羟化酶系作用下，经过羟基化、环氧化等代谢过程最终产生致癌物，引起DNA损伤，导致基因突变，正常细胞分化受阻，出现异常增生，最终形成肿瘤。在此过程中，DMBA可能只起到使细胞中原癌基因活化的作用，为癌变创造条件，而引起癌变的主要因素是抑癌基因失活，细胞生长失去控制，癌基因突变所转录的突变型癌基因蛋白出现异常生物学活性等。DMBA对乳腺的选择作用强，特异性高达70%～80%，是目前诱发乳腺癌及癌前病变最常用的致癌剂。

4.1.2动物分组及给药方法

将60只未孕大鼠，全雌，按体重随机分为即给药量分别为本发明药物组合物42g原生药/kg、21g原生药/kg、10.5g原生药/kg、三苯氧胺阳性对照组、模型对照组、正常对照组，每组10只，每天上午灌胃1次，除模型和正常对照组灌蒸馏水外，余各组给予相应药物，除空白对照组外，其余各组大鼠灌胃DMBA以100mg/kg体重，每次15mg溶于1.5ml芝麻油中，7d后再灌同剂量的DMBA，每周称体重、检查大鼠乳腺及相邻部位，记录肿瘤发生情况。各组荷瘤大鼠数与各组大鼠总数之比即为该组大鼠的恶性肿瘤诱发率。于实验的第23周，颈椎离断处死所有大鼠，切开皮肤，暴露六对乳腺，详细检查各对乳腺，有肿瘤者，取下肿瘤并已录其分布、形态，无肿瘤者也取部分放10%的中性福尔马林固定，常规取材制片，HE染色光镜下观察乳腺病变。常规石蜡包埋切片，用做免疫组化ER、PR测定。

4.2实验结果

1）大鼠肿瘤诱发率：结果见表31

表31大鼠出现肉眼可见肿瘤情况

结果由表7可见，本发明药物组合物各给药组与模型组比较，荷瘤大鼠数无明显减少，这可能与样本数及生活环境有关。

2）乳腺病理观察：结果见表32及图5。结果由表32可以看出本发明药物组合物对DMBA致大鼠乳腺癌前病变并无明显的抑制作用。

表32大鼠乳腺病理学改变

3）大鼠乳腺组织ER、PR表达：ER阳性判断标准为乳腺导管和小叶上皮细胞核或细胞浆着棕黄色时为阳性表达。PR阳性判断标准为乳腺导管和小叶上皮细胞核或细胞浆着红色时为阳性表达见图2。阳性细胞率<20％者为(一)；阳性细胞率不足20％，但局部区域有少量较强着色的阳性细胞者为(±)；阳性细胞率>20％者且阳性细胞数由少至多，着色由浅至深依次计为一，±，+，++，+++，++++，并分别计1，2，3，4，5，6分，积分愈高表明ER、PR含量愈高。本发明药物组合物对各组乳腺增生ER、PR的影响见表33。

表33本发明药物组合物对ER、PR阳性表达的影响

注：与模型组比较，*p＞0.05；与空白组比较，△p＞0.05

结果见表33，本发明药物组合物对DMBA之乳腺癌癌前病变大鼠乳腺组织的ER、PR阳性表达并无明显的影响作用。这主要与各组大鼠乳腺组织形态变化有关，因病变类型的不同，ER和PR的分布及浓度亦不同。

试验例3活血化瘀作用

1实验材料

1.1实验药物

1.1.1受试药物

同试验例1“1.1.1受试药物”

1.1.2阳性对照药物

阿司匹林肠溶片，产地：南京白敬宇制药有限责任公司。批号：090620复方丹参片：太极集团四川绵阳制药有限公司，批号55090008。

1.2实验动物

SD大鼠，体重180～220g，全雌，壹级，由四川省中药研究所实验动物中心提供，合格证号为SCXK（川）2008-24。

KM小鼠，体重18～22g，雌性，清洁级，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，并配给全价颗粒饲料。合格证号：SCXK(川)2008－19。

1.3实验试剂

角叉菜胶：sigma-alorich，C1013-500G

盐酸肾上腺素注射液：上海禾丰制药有限公司，批号090803。

水合氯醛：成都市科龙化工试剂厂，批号：20071226。

1.4实验仪器

0412-1台式低速离心机，上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂

YDA-AV(D)血液粘度仪（北京宏润科技发展有限公司）

日立7170型全自动生化分析仪，日本日立公司生产

BY171半自动生化分析仪，澳大利亚生产

米尺毛细玻管秒表

2实验环境

同试验例1“2实验环境”

3统计学方法

同试验例1“3统计学方法”

4实验方法和结果

4.1对大鼠凝血时间的影响（毛细玻管法）

4.1.1实验分组及给药方法

取SD大鼠40只，全雌，先称重编号，按性别、体重分层，将其分为4组，即空白对照组，给药量分别为本发明药物组合物42g原生药/kg、21g原生药/kg、10.5g原生药/kg。除空白对照组ig蒸馏水外，其余各组ig相应的药物，每天1次，连续一周。末次灌胃1h后，用毛细玻管插入大鼠眼内眦后静脉丛，自血液流进玻管开始记时，待血液注满玻管后，取出平放于桌面上。每隔30S，折断玻管约5mm，并缓慢向左右拉开观察折断处是否有血凝丝出现，直至有血凝丝出现所需时间即为凝血时间。

4.1.2实验结果

结果见表34可知，本发明药物组合物各剂量组可不同程度的延长凝血时间的作用。

表34本发明药物组合物对大鼠凝血时间的影响

注：与空白组相比，*P＜0.05，**P＜0.01

4.2对角叉菜胶致小鼠尾部血栓形成的影响

4.2.1实验分组及给药方法

小鼠50只，全雌，随机分为5组，分别为本发明药物组合物42g原生药/kg、21g原生药/kg、10.5g原生药/kg、阿司匹林组、空白对照组。除空白对照组组给予蒸馏水外，其余各组分别ig相应药物，给药容积为0.1ml/10g，每日1次，共9次，第6次给药60分钟后，各鼠两后足分别注射1.5%角叉菜胶生理盐水溶液0.03ml，将小鼠放置于室温15℃的环境中24小时。测量注射角叉菜胶后24h、48h、72h小鼠尾全长及血栓形成长度，以小鼠血栓长度除以尾巴总长度得出血栓形成长度百分数。

4.2.2实验结果

表35本发明药物组合物对角叉菜胶致小鼠尾部血栓形成的影响

注：与空白组相比，*P＜0.05，**P＜0.01

结果见表35示，青香各剂量组对角叉菜胶致小鼠尾部血栓的形成均有不同程度的抑制作用（p﹤0.05），且以大剂量为最优。说明本发明药物组合物有一定抑制血栓形成，改善微循环的作用。

4.3本发明药物组合物对急性血瘀模型大鼠血液流变性的影响

4.3.1实验分组及给药方法

大鼠72只，全雌，随机分为6组，第1、2组分别为正常对照组和模型对照组，给予蒸馏水；第3-6组为本发明药物组合物42g原生药/kg、21gg原生药/kg、10.5g原生药/kg、复方丹参片组，连续给药14日，除正常对照组外，其余各鼠均于末次给药30分钟后皮下注射盐酸肾上腺素1ml/kg，共2次，两次间隔4小时。在两次之间（前后各间隔2小时），将大鼠浸入0℃冰水中浸泡5分钟，处置后禁食不禁水18h，建立急性血瘀模型。次日10%水合氯醛3ml/kg，颈总动脉插管取血测以下指标：全血粘度、血浆粘度、血细胞压积、全血高切还原粘度、全血低切还原粘度、红细胞刚性指数、红细胞聚集指数、全血高切相对粘度、全血低切相对粘度、红细胞变性指数。

4.3.2实验结果

表36本发明药物组合物对急性血瘀模型大鼠血液流变性的影响

与空白组比较，^△P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

结果：由表36可以看出本发明药物组合物能使急性血瘀型大鼠的全血粘度、血浆粘度值显著降低（p﹤0.05），表明本发明药物组合物可改善急性大鼠血瘀模型的血液流变学，说明本发明药物组合物有一定的活血化瘀作用。

试验例4抗炎实验

1实验材料

1.1实验药物

1.1.1受试药物

同试验例1“1.1.1受试药物”

1.1.2阳性对照药物

醋酸地塞米松片，天津太平洋制药有限公司。批号：070702.。阿司匹林肠溶片，南京白敬宇制药有限责任公司。批号：090620

1.2实验动物

同试验例3“1.2实验动物”

1.3实验试剂

二甲苯：重庆天府精细化学品厂批号：050628

1.4实验仪器

眼科剪酒精灯剪刀等

METTLER TOLEDO电子天平（AB204-E）

2实验环境

同试验例1“2实验环境”

3统计学方法

同试验例1“3统计学方法”

4实验方法和结果

4.1小鼠棉球肉芽肿实验

4.1.1实验分组及给药方法

取KM小鼠50只，全雌，称重，10%水合氯醛3ml/kg麻醉，将胸部剑突上皮肤消毒后，用眼科剪剪开一小口，以眼科镊将高压灭菌棉球(5土0.5mg，庆大霉素浸润烘干)，植入小鼠右侧腋窝皮下。然后按体重随机分为5组。第一组灌胃蒸馏水作为空白对照组；第二到第四组为本发明药物组合物42g原生药/kg、21g原生药/kg、10.5g原生药/kg。第五组醋酸地塞米松片作为阳性对照组。每天给药1次，连续7天。末次给药24h后，脱颈处死，将棉球连同周围结缔组织一起取出，剔除脂肪，60℃烘箱中4h烘干、称重，将称得的重量减去棉球的原重量即得肉芽肿重量，并计算其肉芽指数(mg/10g)=肉芽重/体重×10，及肉芽抑制率=（对照组肉芽平均重量-给药组肉芽平均重量）/对照组肉芽平均重量×100%。

4.1.2实验结果

表37本发明药物组合物对小鼠棉球肉芽肿的影响

注：与空白组相比，*P＜0.05

结果由表37可知，本发明药物组合物大、中剂量组连续7天给药后，可明显延长抑制小鼠棉球肉芽肿的形成（P＜0.05），且大、中剂量的肉芽肿抑制率超过30%，说明本发明药物组合物具有抑制增生性炎症的作用。

4.2小鼠耳肿胀实验

4.2.1实验分组及给药

小鼠60只，雌雄各半，随机分为5组：本发明药物组合物大剂量组（42g/kg），中剂量组（21g/kg），小剂量组（10.5g/kg），阿司匹林组（150mg/kg），空白对照组。各组分别ig相应药物0.1ml/10g，每日1次，连续7d。

4.2.2实验方法

末次给药后60min将二甲苯0.02ml滴于小鼠右耳两面，30min后处死动物，沿耳廓基线剪下双耳，用直径约9mm的打孔器分别于同一部位打下圆耳片，电子天平称重，按照下式计算各组肿胀度和肿胀抑制率，用t检验比较各组间差异显著性，肿胀度=右耳片重（mg）-左耳片重（mg），肿胀抑制率=（对照组耳片肿胀度-给药组耳片肿胀度）/对照组耳片肿胀度×100%

4.2.3实验结果

结果见表38示，连续灌胃7天后，本发明药物组合物42g原生药/kg剂量组明显减轻二甲苯所致耳廓炎症肿胀程度（P<0.05），其他给药组有减轻耳廓肿胀的趋势，但无明显差异性（P﹥0.05）炎症抑制率大于40%，具有抑制炎症反应的作用。

表38本发明药物组合物对小鼠耳肿胀实验的影响

注：与空白组相比，*P＜0.05

试验例5镇痛作用

1实验材料

1.1实验药物

1.1.1受试药物

同试验例1“1.1.1受试药物”

1.1.2阳性对照药

罗通定片：成都市湔江制药厂，批号：060402，30mg/片.阿司匹林肠溶片，南京白敬宇制药有限责任公司。批号：090620醋酸：成都市科龙化工试剂厂，批号：20060709

1.2实验动物

KM小鼠，体重18～22g，全雌，壹级，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，并配给全价颗粒饲料。合格证号：SCXK(川)2008－19。

1.3实验仪器

501A型超级数显恒温水浴，上海浦东荣丰科学仪器有限公司。

2实验环境

同试验例1“2实验环境”

3统计学方法

同试验例1“3统计学方法”

4实验方法和结果

4.1扭体试验

4.1.1实验方法

小鼠50只，全雌，随机分为5组按药物浓度分为本发明药物组合物大剂量组（42g/kg），中剂量组（21g/kg），小剂量组（10.5g/kg），阿司匹林组（150mg/kg），空白对照组。各组分别ig相应药物0.1ml/10g，每日1次，连续7d。分别ig相应药物0.1ml/10g，每日1次，共7次。给药60分钟后，各鼠均腹腔注射0.75%醋酸0.2ml/只。观察各组小鼠出现扭体反应（腹部内凹、伸展后肢、臀部抬高）的时间和20分钟内出现扭体的次数。

4.1.2实验结果

4.2.1扭体试验结果见表39

表39本发明药物组合物对醋酸致小鼠扭体试验的影响

注：与空白组相比：*P＜0.05，**P＜0.01

结果：见表39本发明药物组合物42g原生药/kg组、21g原生药/kg组连续给药7天，可明显延长小鼠出现扭体反应的潜伏期（P＜0.05），减少小鼠扭体的次数（P＜0.01），表明本发明药物组合物对化学刺激引起的疼痛有镇痛作用。

4.2热板实验试验

4.2.1实验方法

雌性小白鼠，调节恒温器水温自动控制在(55±0.5)℃，将小鼠置恒温盒内，以小鼠舔后足的时间为痛阈值，选择痛阈值在5～30秒的小鼠50只，随机分为对照组，罗通定组，青木乳香颗粒高、中、低剂量组，测定给药前痛阈值。分别连续灌胃给药7天，每天1次，末次给药后各组动物在给药后30、60、90、120min分别测各鼠1次痛阈值，(超过60s者以60s计)。求出每组动物给药后2h内提高痛阈值，比较各组差异。

4.2.2实验结果

4.2.1热板试验

结果：见表40本发明药物组合物42g原生药/kg剂量组、21g原生药/kg剂量组可明显延长给药后30min小鼠痛阈值（P<0.05），说明本发明药物组合物对热刺激致疼痛有一定的镇痛作用。

表40本发明药物组合物对小鼠热板试验的影响

注：与空白组相比：*P＜0.05，**P＜0.01

综上所述，本发明药物组合物，具有良好的抗炎、镇痛、活血化瘀功效，不仅能够有效改善乳腺增生的病理症状，还能抑制乳腺癌癌前病变，为临床治疗乳腺增生、预防乳腺癌提供了新的用药选择；该药物组合物既有临床疗效确切、稳定的优点，又无药性峻猛的弊端，既消散癖块，又不伤正气，确保临床用药安全、有效，且组方中未用资源受限药材，有利于资源保护和可持续利用。

Claims (12)

1.一种治疗乳癖的药物组合物，其特征在于：它是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂：

白芍400-700份、瓜蒌皮250-400份、莪术250-400份、香附250-400份、青皮250-400份、当归350-550份、全蝎80-140份、鳖甲350-550份、昆布250-400份、半枝莲400-700份、夏枯草350-550份、茯苓350-550份。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：它是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂：

白芍500-600份、瓜蒌皮300-350份、莪术300-350份、香附300-350份、青皮300-350份、当归400-500份、全蝎100-120份、鳖甲400-500份、昆布300-350份、半枝莲500-600份、夏枯草400-500份、茯苓400-500份。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于：它是由如下重量配比的原料药制备而成的制剂：

白芍556份、瓜蒌皮333份、莪术333份、香附333份、青皮333份、当归444份、全蝎111份、鳖甲444份、昆布333份、半枝莲556份、夏枯草444份、茯苓444份。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的药物组合物，其特征在于：所述鳖甲为醋制鳖甲。

5.根据权利要求1-3任意一项所述的药物组合物，其特征在于：所述制剂为颗粒剂、片剂、胶囊剂、散剂或丸剂。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于：所述颗粒剂中，每1g颗粒剂含芍药苷不得少于5mg。

7.权利要求1-3任意一项所述的药物组合物的制备方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：

（1）按配比称取原料药；

（2）取当归、莪术、香附、青皮，经水蒸气蒸馏法提取，所得芳香水经β-环糊精包合后，干燥、粉碎，所得包合物备用；将经水蒸气蒸馏法提取的水提液与药渣分离，分别收集水提液、药渣，备用；

（3）取步骤（2）收集的药渣，与瓜蒌皮、全蝎、鳖甲、昆布、茯苓混合后加水提取，所得提取液再与步骤（2）收集的水提液合并，减压浓缩至清膏，离心后，得水提清膏，备用；

（4）取白芍、夏枯草、半枝莲，加60-80%V/V乙醇提取，合并提取液，回收乙醇后，浓缩，得醇提清膏，再与步骤（3）制备的水提清膏合并，喷雾干燥，所得干粉与步骤（2）制备的包合物混匀，再加入药学上常用的辅料或辅助性成分制剂，即得。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：

步骤（2）中所述包合物的具体制备方法如下：取当归、莪术、香附、青皮，加10-14倍量水，水蒸气蒸馏法提取3-5小时，收集芳香水并重蒸馏至药材重量的30-35%v/w，再加入芳香水7-8%w/v的β-环糊精，经胶体磨研磨包合后，冷藏、干燥、粉碎后，即得包合物；

步骤（3）中，加药材干重10-14倍量的水，浸泡20-40分钟，提取3次，每次40-60分钟；减压浓缩至60℃时相对密度为1.03~1.05的清膏；

步骤（4）中，加药材干重10-14倍量的60-80%V/V乙醇，提取3次，每次90-120分钟；醇提清膏的相对密度在60℃时为1.03~1.05；喷雾干燥参数为：进风温度为180~200℃、出风温度为90~100℃。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：

步骤（2）中，水蒸气蒸馏法提取4小时，收集芳香水并重蒸馏至药材重量的32%v/w，加入芳香水7.5%w/v的β-环糊精，胶体磨研磨包合30min；

步骤（3）中，加水浸泡20分钟，提取3次，每次45分钟；

步骤（4）中，加70%V/V乙醇，提取3次，每次90分钟。

10.权利要求1-6任意一项所述的药物组合物在制备抗炎、镇痛、抗血栓、预防乳腺癌或治疗乳腺增生的药物中的用途。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述乳腺增生为乳腺囊性增生。

12.权利要求1-6任意一项所述的药物组合物在制备活血化瘀的药物中的用途。

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