CN107488212B - 华法林-4-o-乙酰-rgd四肽，其合成，活性和应用 - Google Patents

华法林-4-o-乙酰-rgd四肽，其合成，活性和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了三种华法林‑4‑O‑乙酰‑Arg‑Gly‑Asp‑Val、华法林‑4‑O‑乙酰‑Arg‑Gly‑Asp‑Ser、华法林‑4‑O‑乙酰‑Arg‑Gly‑Asp‑Phe，公开了它们的制备方法,公开了它们的抗动脉血栓活性，公开了它们的抗静脉血栓活性，公开了它们降低体内维生素K的含量的活性，公开了它们降低体内凝血因子Ⅱ的含量的活性，公开了它们抑制血小板聚集的活性，公开了它降低体内血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)的含量的活性，公开了它们没有华法林样出血风险的优势。因而本发明公开了它们在制备抗动脉血栓药物中的应用、在制备抗静脉血栓药物中的应用、在制备抑制血小板聚集药物中的应用、在制备GPⅡb/Ⅲa拮抗剂中的应用、在制备维生素K拮抗剂中的应用和在制备凝血因子II拮抗剂中的应用。

Description

华法林-4-O-乙酰-RGD四肽，其合成，活性和应用
技术领域
本发明涉及华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe,涉及它们的制备方法，涉及它们的抗动脉血栓活性，涉及它们的抗静脉血栓活性，涉及它们降低体内血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)的含量的作用，涉及它们降低体内凝血因子Ⅱ(FⅡ)的含量的作用，涉及它们抑制血小板聚集的作用。因而本发明涉及它们在制备抗动脉血栓药物中的应用、在制备抗静脉血栓药物中的应用、在制备抑制血小板聚集药物中的应用、在制备GPⅡb/Ⅲa拮抗剂中的应用和在制备凝血因子II拮抗剂中的应用。本发明属于生物医药领域。
背景技术
动脉血栓和静脉血栓两种病症已成为当下发病率高和死亡率高的疾病。其中静脉血栓症主要包括深静脉血栓和肺栓塞。深静脉血栓和肺栓塞发病的患者数超过了心肌梗塞和中风发病的总人数，而且比乳腺癌和艾滋病所引起死亡的总人数高。由于动脉血栓症和静脉血栓症的发病率随年龄增长呈指数态增加，所以两种病症对我国这样的老龄化国家的人民健康的威胁尤其严重。如果把人口基数考虑进去，对我国国计民生的绝对负面影响尤其严重。于是，动脉血栓症与静脉血栓症的预防及治疗一直是医药领域所关注的重点。虽然华法林作为代表药物于1941年被用于临床实践，但是由于华法林的活性由它的药代动力学特点、凝血因子代谢以及维生素K的可用性的共同的复杂作用来表现。华法林的量效关系表现出很大的可变性，这也就说明华法林的抗凝治疗有一个很大的剂量范围，并且表现出很大的个体差异。由于华法林的窗口窄，其剂量不足会有导致肺栓塞的可能，而剂量过量有导致致命性出血的风险。过去的50多年对华法林进行了大量结构改造，却都没有能够得到抗静脉血栓活性强和出血副作用低的类似物。与传统的思维不同，发明人修饰华法林结构的目标是，将华法林转化为具有抗动脉血栓和抗静脉血栓双重活性的类似物。不过，也一直未能如愿。Arg-Gly-Asp序列肽是一系列具有多重活性的寡肽，整合素上的GPⅡb/Ⅲa受体上有Arg-Gly-Asp序列肽的结合位点。吸引了很多实验室对其进行结构的修饰，却都没有能够得到抗动脉血栓活性更强的类似物。与传统的思维不同，发明人修饰Arg-Gly-Asp序列肽结构的目标是，将Arg-Gly-Asp序列肽转化为具有抗动脉血栓和抗静脉血栓双重活性的类似物。不过，也一直未能如愿。之后，又经过5年探索，发明人发现华法林的4位用乙酰Arg-Gly-Asp四肽修饰，生成的华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe在体外抗血小板聚集模型上显示优秀的抗血小板聚集活性。显然，它们不是华法林的前药。华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe的抗动脉血栓活性比阿司匹林强1670倍，抗静脉血栓活性比华法林强48.7倍。可见，本发明具有显著的技术进步。于是，发明人提出本发明。
发明内容
本发明的第一个内容是提供华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe。
Figure BDA0001015501180000021
本发明的第二个内容是提供三种华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe的制备方法，该方法包括：
1.合成华法林-4-O-乙酸苄酯；
2.合成华法林-4-O-乙酸；
3.采用DCC为缩合剂，HOBt为催化剂的液相缩合的方法，合成HCl·Arg-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl、HCl·Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl、HCl·Arg-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
4.采用DCC为缩合剂，HOBt为催化剂的液相缩合的方法，华法林-4-O-乙酸与HCl·Arg-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl、HCl·Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl、HCl·Arg-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl缩合
5.合成华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe
本发明的第三个内容是评价华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe抗动脉血栓的作用。
本发明的第四个内容是评价华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe抗静脉血栓的作用。
本发明的第五个内容是评价华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe抑制由血小板活化因子(PAF)、凝血酶(TH)及二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集的作用。
本发明的第六个内容是评价华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe降低体内GPⅡb/Ⅲa含量的作用。
本发明的第七个内容是评价华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe降低体内维生素K含量的作用。
本发明的第八个内容是评价华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe降低体内凝血因子Ⅱ含量的作用。
本发明的第九个内容是利用连续给药6天后生存率的记录，出血时间、凝血酶原时间的测定，评价华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser降低华法林出血风险的作用。
附图说明
图1华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe的合成路线.(i)溴-2-乙酸苄酯,丙酮,K2CO3,45℃；(ii)CH3OH,Pd/C,H2；(iii)DCC,HOBt,NMM,THF；(iv)4N氯化氢的乙酸乙酯溶液；(v)2N NaOH,CH3OH；
图2华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe抗动脉血栓活性，n＝10；
图3华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe抗静脉血栓活性评价结果，n＝10；
图4华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe对体内GPⅡb/Ⅲa含量的影响，n＝5；
图5华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe对体内维生素K的含量的影响，n＝5；
图6华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe对体内FⅡ含量的影响，n＝5；
图7华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser连续给药6天后大鼠生存率，n＝7；
图8华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser连续给药6天后抗静脉血栓活性，n＝5；
图9华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser连续给药6天后出血时间结果，n＝5；
图10华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser连续给药6天后PT测定结果，n＝5。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1 制备华法林-4-O-乙酸苄酯
将3.31g(10.00mmol)华法林置于100mL茄瓶中，加入约40mL丙酮，未能将其完全溶解，45℃油浴加热搅拌至华法林溶解，加入1.73mL(11.00mmol)溴-2-乙酸苄酯，继续于45℃油浴下进行反应，约1h后发现有白色固体附于瓶壁上。反应48h后，薄层层析(TLC，石油醚/乙酸乙酯＝2:1)监测反应进程，华法林消失，将反应产生的无色固体滤去，减压除去丙酮，得到淡黄色油状物，通过硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝8:1)，得到3.02g(65％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e):457[M+H]+；1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ/ppm＝7.89(dd,J1＝3.0Hz,J2＝9.0Hz,1H),7.63(dt,J1＝3.0Hz,J2＝9.0Hz,1H),7.43～7.31(m,9H),7.24(t,J＝9.0Hz,2H),7.15(tt,J＝9.0Hz,1H),5.26(s,2H),5.61(s,1H),5.02(d,J＝15.0Hz,1H),4.85(d,J＝15.0Hz,1H),4.97(t,J＝9.0Hz,1H),3.45(dq,J1＝9.0Hz,J2＝18.0Hz,2H),2.11(s,3H)。
实施例2 制备华法林-4-O-乙酸
将2.26g(4.95mmol)华法林-4-O-乙酸苄酯溶于20mL甲醇中，加入220mg钯碳(Pd/C)，搅拌下于水泵中抽去空气，通入氢气，如此操作重复进行3次，通入氢气室温下搅拌10h。TLC监测反应完全，过滤除去Pd/C，滤液减压浓缩除去溶剂，残留物用石油醚固化，无水乙醚进行磨洗，得到1.72g(93％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e):367[M+H]+；1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝12.86(s,1H),7.90(d,J＝6.0Hz,1H),7.63(t,J＝6.0Hz,1H),7.43～7.34(m,4H),7.27(t,J＝9.0Hz,2H),7.17(t,J＝9.0Hz,1H),4.99(t,J＝9.0Hz,1H),4.75(q,J1＝15.0Hz,J2＝30.0Hz,2H),3.54～3.47(m,2H),2.14(s,3H)。
实施例3 制备Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl
将10.21g(31.61mmol)Boc-Asp(OBzl)加入到500mL茄瓶中，用250mL无水四氢呋喃将其溶解，于冰浴(0℃)下加入4.18g(30.97mmol)HOBt及7.65g(37.16mmol)DCC，活化30min。有大量二环己基脲(DCU)析出。将11.73g(30.94mmol)Tos·Val-OBzl溶解于150mL无水四氢呋喃中，将其于冰浴下加入反应液中，用N-甲基吗啉(NMM)调节pH值到8～9，在室温下搅拌反应6h后TLC(二氯甲烷/甲醇＝30:1)监测反应进程，原料点消失，滤除DCU，将滤液减压除去溶剂，残留物用100mL乙酸乙酯溶解，滤去不溶的DCU，滤液分别用饱和Na2CO3溶液(40mL×3)，饱和NaCl溶液(40mL×3)，饱和KHSO4溶液(40mL×3)，饱和NaCl溶液(40mL×3)，饱和Na2CO3溶液(40mL×3)，饱和NaCl溶液(40mL×3)洗涤，得到的乙酸乙酯相用无水硫酸钠进行干燥2h以上。滤去硫酸钠，滤液减压除去溶剂，得到淡黄色固体，将此固体进行硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝80:1)，得到无色固体产品13.56g(86％)。ESI-MS(m/e):513[M+H]+。
实施例4 制备HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl
称取5.04g(9.84mmol)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl加入到250mL茄瓶中，加入10mL无水乙酸乙酯，使其完全溶解，于冰盐浴(-10℃)下加入50mL 4N氯化氢的乙酸乙酯溶液，继续在冰浴下搅拌反应。TLC(二氯甲烷/甲醇＝30:1)显示反应完成后用水泵将反应液减压浓缩，将残留物用无水乙酸乙酯复溶后再减压浓缩，反复3次，得黄色油状物，用无水乙醚浸润后再减压浓缩，反复3次，得淡黄色油状产物4.09g(93％)。
实施例5 制备Boc-Arg-Gly-OBzl
将10.56g(38.54mmol)Boc-Arg加入到500mL茄瓶中用250mL无水四氢呋喃将其部分溶解，混悬于反应液中，于冰浴(0℃)下加入4.23g(31.33mmol)HOBt及7.75g(37.62mmol)DCC，活化15min。有大量DCU析出。将7.65g(37.96mmol)HCl·Gly-OBzl溶解于100mL无水四氢呋喃中，将其于冰浴下加入反应液中，用NMM调节Ph值到8～9，在室温下搅拌反应5h后TLC(二氯甲烷/甲醇＝20:1)监测反应进程，原料点消失，滤除DCU，将滤液减压除去溶剂，残留物用100mL二氯甲烷溶解，滤去不溶的DCU，滤液分别用饱和Na2CO3溶液(40mL×3)，饱和NaCl溶液(40mL×3)洗涤，二氯甲烷相用无水硫酸钠进行干燥4h以上。滤去硫酸钠，滤液减压除去溶剂，得到淡黄色固体产物13.51g(92％)。ESI-MS(m/e):440[M+H]+。
实施例6 制备Boc-Arg-Gly
称取6.51g(14.83mmol)Boc-Arg-Gly-OBzl于250mL茄瓶中，加入少量甲醇将其溶解，在冰浴(0℃)下用2N NaOH水溶液调节pH值至12，搅拌反应约4h，用饱和KHSO4溶液调节pH值至7，减压浓缩除去甲醇与水，加入无水乙醇100mL，滤除析出的盐，滤液减压除去溶剂，用石油醚磨洗，过滤，减压浓缩得到无色固体5.05g(96％)。
实施例7 制备Boc-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl
将4.98g(14.27mmol)Boc-Arg-Gly加入到500mL茄瓶中用250mL无水四氢呋喃将其部分溶解，混悬于反应液中，于冰浴(0℃)下加入1.88g(13.93mmol)HOBt及3.45g(16.75mmol)DCC，活化30min。有大量DCU析出。将5.58g(12.44mmol)HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl溶解于100mL无水四氢呋喃中，将其于冰浴下加入反应液中，用NMM调节pH值到8～9，在室温下搅拌反应8h后TLC(二氯甲烷/甲醇＝20:1)监测反应进程，原料点消失，滤除DCU，将滤液减压除去溶剂，残留物用二氯甲烷溶解，滤去不溶的DCU，滤液分别用饱和Na2CO3溶液(40mL×3)，饱和NaCl溶液(40mL×3)洗涤，二氯甲烷相用无水硫酸钠进行干燥4h以上。滤除硫酸钠，滤液减压除去溶剂，得到淡黄色固体，将此固体进行硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝10:1)，得到无色固体产品6.63g(66％)。ESI-MS(m/e):726[M+H]+。
实施例8 制备HCl·Arg-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl
称取1.09g(1.50mmol)Boc-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl于250mL茄瓶中，加入5mL无水乙酸乙酯，使其完全溶解，于冰盐浴(-10℃)下加入10mL 4N氯化氢的乙酸乙酯溶液，继续在冰浴下搅拌反应。TLC(二氯甲烷/甲醇＝20:1)检测反应进程，原料点消失，用水泵将反应液减压浓缩，将残留物用无水乙酸乙酯复溶后再减压浓缩，反复3次，得黄色油状物，用无水乙醚浸润后再减压浓缩，反复3次，得淡黄色油状残留物0.95g(96％)。
实施例9 制备Boc-Asp(OBzl)-Ser-OBzl
将10.11g(30.96mmol)Boc-Asp(OBzl)加入到500mL茄瓶中用250mL无水四氢呋喃将其溶解，于冰浴(0℃)下加入4.18g(30.96mmol)HOBt及7.65g(37.13mmol)DCC，活化30min。有大量DCU析出。将7.32g(31.23mmol)HCl·Ser-OBzl溶解于150mL无水四氢呋喃中，将其于冰浴下加入反应液中，用NMM调节pH值到8～9，在室温下搅拌反应9h后TLC(二氯甲烷/甲醇＝20:1)监测反应进程，原料点消失，滤除DCU，将滤液减压除去溶剂，残留物用100mL乙酸乙酯溶解，滤去不溶的DCU，滤液分别用饱和Na2CO3溶液(40mL×3)，饱和NaCl溶液(40mL×3)，饱和KHSO4溶液(40mL×3)，饱和NaCl溶液(40mL×3)，饱和Na2CO3溶液(40mL×3)，饱和NaCl溶液(40mL×3)洗涤，乙酸乙酯相用无水硫酸钠进行干燥2h以上。滤去硫酸钠，滤液减压除去溶剂，得到淡黄色固体7.02g(90％)。ESI-MS(m/e):501[M+H]+。
实施例10 制备HCl·Asp(OBzl)-Ser-OBzl
称取5.17g(10.34mmol)Boc-Asp(OBzl)-Ser-OBzl于250mL茄瓶中，加入20mL无水乙酸乙酯，使其完全溶解，于冰盐浴(-10℃)下加入50mL 4N氯化氢的乙酸乙酯溶液，继续在冰浴下搅拌反应。TLC(二氯甲烷/甲醇＝20:1)监测反应进程，原料点消失，用水泵将反应液减压浓缩，将残留物用无水乙酸乙酯复溶后再减压浓缩，反复3次，得黄色油状物，用无水乙醚浸润后再减压浓缩，反复3次，得淡黄色油状残留物4.43g(98％)。
实施例11 制备Boc-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl
将5.25g(15.04mmol)Boc-Arg-Gly加入到500mL茄瓶中用250mL无水四氢呋喃将其部分溶解，混悬于反应液中，于冰浴(0℃)下加入1.93g(14.92mmol)HOBt及3.71g(15.03mmol)DCC，活化30min。有大量DCU析出。将6.16g(14.11mmol)HCl·Asp(OBzl)-Ser-OBzl溶解于30mL无水四氢呋喃中，将其于冰浴下加入反应液中，用NMM调节pH值到8～9，在室温下搅拌反应9h后TLC(二氯甲烷/甲醇＝10:1)监测反应进程，原料点消失，滤除DCU，将滤液减压除去溶剂，残留物用100mL二氯甲烷溶解，滤去不溶的DCU，滤液分别用饱和Na2CO3溶液(40mL×3)，饱和NaCl溶液(40mL×3)洗涤，二氯甲烷相用无水硫酸钠进行干燥5h以上。滤去硫酸钠，滤液减压除去溶剂，得到淡黄色油状物，将此淡黄色油状物进行硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝8:1)，得到无色固体产品5.22g(49％)。ESI-MS(m/e):714[M+H]+。
实施例12 制备HCl·Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl
称取1.11g(1.46mmol)Boc-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl于250mL茄瓶中，加入适量无水乙酸乙酯，使其完全溶解，于冰盐浴(-10℃)下加入10mL 4N氯化氢的乙酸乙酯溶液，继续在冰浴下搅拌反应。TLC(二氯甲烷/甲醇＝10:1)监测反应进程，原料点消失，用水泵将反应液减压浓缩，将残留物用无水乙酸乙酯复溶后再减压浓缩，反复3次，得黄色油状物，用无水乙醚浸润后再减压浓缩，反复3次，得淡黄色油状残留物0.98g(97％)。
实施例13 制备Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
将10.23g(31.67mmol)Boc-Asp(OBzl)加入到500mL茄瓶中用250mL无水四氢呋喃将其溶解，于冰浴(0℃)下加入4.18g(30.96mmol)HOBt及7.65g(37.14mmol)DCC，活化30min。有大量DCU析出。将12.22g(28.61mmol)Tos·Phe-OBzl溶解于150mL无水四氢呋喃中，将其于冰浴下加入反应液中，用NMM调节pH值到8～9，在室温下搅拌反应9h后TLC(二氯甲烷/甲醇＝35:1)监测反应进程，原料点消失，滤除DCU，将滤液减压除去溶剂，残留物用100mL乙酸乙酯溶解，滤去不溶的DCU，滤液分别用饱和Na2CO3溶液(40mL×3)，饱和NaCl溶液(40mL×3)，饱和KHSO4溶液(40mL×3)，饱和NaCl溶液(40mL×3)，饱和Na2CO3溶液(40mL×3)，饱和NaCl溶液(40mL×3)洗涤，乙酸乙酯相用无水硫酸钠进行干燥2h以上。滤去硫酸钠，滤液减压除去溶剂，得到淡黄色固体7.52g(87％)。ESI-MS(m/e):561[M+H]+。
实施例15 制备HCl·Asp(OBzl)-Phe-OBzl
称取5.14g(9.17mmol)Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl于250mL茄瓶中，加入适量无水乙酸乙酯，使其完全溶解，于冰盐浴(-10℃)下加入50mL 4N氯化氢的乙酸乙酯溶液，继续在冰浴下搅拌反应。TLC(二氯甲烷/甲醇＝35:1)监测反应进程，原料点消失，用水泵将反应液减压浓缩，将残留物用无水乙酸乙酯复溶后再减压浓缩，反复3次，得白色固体，用无水乙醚浸润后再减压浓缩，反复3次，得淡黄色油状残留物4.53g(99％)。
实施例16 制备Boc-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
将5.56g(15.93mmol)Boc-Arg-Gly加入到500mL茄瓶中用250mL无水四氢呋喃将其溶解，混悬于反应液中，于冰浴(0℃)下加入2.15g(15.92mmol)HOBt及3.45g(16.75mmol)DCC，活化30min。有大量DCU析出。将7.91g(15.93mmol)HCl·Asp(OBzl)-Phe-OBzl溶解于50mL DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中，将其于冰浴下加入反应液中，用NMM调节pH值到8～9，在室温下搅拌反应9h后TLC(二氯甲烷/甲醇＝10:1)监测反应进程，原料点消失，滤除DCU，将滤液减压除去溶剂，残留物用100mL二氯甲烷将溶解，滤去不溶的DCU，滤液分别用饱和Na2CO3溶液(40mL×3)，饱和NaCl溶液(40mL×3)洗涤，二氯甲烷相用无水硫酸钠进行干燥5h以上。滤去硫酸钠，滤液减压除去溶剂，得到淡黄色固体，将此淡黄色固体进行硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝10:1)，得到无色固体产品6.90g(56％)。ESI-MS(m/e):774[M+H]+。
实施例17 制备HCl·Arg-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
称取1.04g(1.35mmol)Boc-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl于250mL茄瓶中，加入10mL无水乙酸乙酯，使其完全溶解，于冰盐浴(-10℃)下加入10mL 4N氯化氢的乙酸乙酯溶液，继续在冰浴下搅拌反应。TLC(二氯甲烷/甲醇＝10:1)监测反应进程，原料点消失，用水泵将反应液减压浓缩，将残留物用无水乙酸乙酯复溶后再减压浓缩，反复3次，得无色固体，用无水乙醚浸润后减压浓缩，反复3次，得无色固体产物0.94g(98％)。
实施例18 制备华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl
将1.09g(2.97mmol)华法林-4-O-乙酸加入到100mL茄瓶中用30mL无水四氢呋喃将其溶解，于冰浴(0℃)下加入0.37g(2.74mmol)HOBt及0.68g(3.30mmol)DCC，活化30min。有大量DCU析出。将1.93g(2.96mmol)HCl·Arg-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl溶解于30mL无水四氢呋喃中，将其于冰浴下加入反应液中，用NMM调节pH值到8～9，在室温下搅拌反应8h后TLC(二氯甲烷/甲醇＝20:1)监测反应进程，原料点消失，滤除DCU，将滤液减压除去溶剂，残留物用50mL二氯甲烷溶解，滤去不溶的DCU，滤液分别用饱和Na2CO3溶液(40mL×3)，饱和NaCl溶液(40mL×3)，饱和KHSO4溶液(40mL×3)，饱和NaCl溶液(40mL×3)，饱和Na2CO3溶液(40mL×3)，饱和NaCl溶液(40mL×3)洗涤，二氯甲烷相用无水硫酸钠干燥2h以上。滤去硫酸钠，滤液减压除去溶剂，得到淡黄色固体，进行硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝10:1)，得到无色固体1.80g(65％)。ESI-MS(m/e):974[M+H]+；1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝8.48～8.38(m,3H),8.27(d,J＝9.0Hz,1H),8.17(d,J＝6.0Hz,1H),7.89(t,J＝9.0Hz,2H),7.64(t,J＝6.0Hz,1H),7.40(t,J＝9.0Hz,2H),7.34(m,12H),7.25(t,J＝6.0Hz,2H),7.16(t,J＝9.0Hz,1H),5.08(m,4H),4.91(t,J＝9.0Hz,1H),4.80(m,1H),4.61(s,2H),4.44(m,1H),4.20(m,1H),3.76(t,J＝6.0Hz,2H),3.44(t,J＝6.0Hz,2H),3.17(d,J＝6.0Hz,2H),2.75(dd,J1＝3.0Hz,J2＝15.0Hz,1H),2.59(dd,J1＝9.0Hz,J2＝15.0Hz,1H),2.13(s,3H),2.05(m,1H),1.77(m,1H),1.65(m,3H),0.84(d,J＝6.0Hz,6H)。
实施例19 制备华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl
将1.03g(2.81mmol)华法林-4-O-乙酸加入到100mL茄瓶中用30mL无水四氢呋喃将其溶解，于冰浴(0℃)下加入0.37g(2.74mmol)HOBt及0.68g(3.30mmol)DCC，活化30min。有大量DCU析出。将1.90g(2.92mmol)HCl·Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl溶解于30mL无水四氢呋喃中，将其于冰浴下加入反应液中，用NMM调节pH值到8～9，在室温下搅拌反应8小时后TLC(二氯甲烷/甲醇＝20:1)监测反应进程，原料点消失，滤除DCU，将滤液减压除去溶剂，残留物用50mL二氯甲烷溶解，滤去不溶的DCU，滤液分别用饱和Na2CO3溶液(40mL×3)，饱和NaCl溶液(40mL×3)，饱和KHSO4溶液(40mL×3)，饱和NaCl溶液(40mL×3)，饱和Na2CO3溶液(40mL×3)，饱和NaCl溶液(40mL×3)洗涤，二氯甲烷相用无水硫酸钠干燥2h以上。滤去硫酸钠，滤液减压除去溶剂，得到淡黄色固体，进行硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝10:1)，得到无色固体1.20g(43％)。ESI-MS(m/e):962[M+H]+；1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝8.53～8.35(m,2H),8.29(d,J＝6.0Hz,2H),7.90(t,J＝6.0Hz,2H),7.62(t,J＝6.0Hz,1H),7.49～7.08(m,16H),7.17(d,J＝6.0Hz,1H),5.11(s,2H),5.07(m,2H),5.01(m,1H),4.91(t,J＝6.0Hz,1H),4.80(m,1H),4.61(s,2H),4.45(m,1H),4.40(m,1H),3.76(m,2H),3.75～3.68(m,2H),3.45(d,J＝6.0Hz,2H),3.18(m,2H),2.85～2.74(m,1H),2.64～2.58(m,1H),2.13(s,3H),1.77(m,1H),1.59(m,3H)。
实施例20 制备华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl
将1.12g(3.06mmol)华法林-4-O-乙酸加入到100mL茄瓶中用30mL无水四氢呋喃将其溶解，于冰浴(0℃)下加入0.37g(2.74mmol)HOBt及0.68g(3.30mmol)DCC，活化30min。有大量DCU析出。将2.08g(2.93mmol)HCl·Arg-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl溶解于30mL无水四氢呋喃中，将其于冰浴下加入反应液中，用NMM调节pH值到8～9，在室温下搅拌反应8h后TLC(二氯甲烷/甲醇＝20:1)监测反应进程，原料点消失，滤除DCU，将滤液减压除去溶剂，残留物用50mL二氯甲烷溶解，滤去不溶的DCU，滤液分别用饱和Na2CO3溶液(40mL×3)，饱和NaCl溶液(40mL×3)，饱和KHSO4溶液(40mL×3)，饱和NaCl溶液(40mL×3)，饱和Na2CO3溶液(40mL×3)，饱和NaCl溶液(40mL×3)洗涤，二氯甲烷相用无水硫酸钠干燥2h以上。滤去硫酸钠，滤液减压除去溶剂，得到淡黄色固体，进行硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇＝8:1)，得到无色固体1.94g(66％)。ESI-MS(m/e):1022[M+H]+；1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝8.42(m,4H),8.24(d,J＝9.0Hz,1H),7.91(t,J＝6.0Hz,2H),7.62(t,J＝9.0Hz,2H),7.28(m,21H),5.05(m,4H),4.90(t,J＝9.0Hz,1H),4.74(m,1H),4.61(s,2H),4.51(m,2H),3.76(m,2H),3.47(m,2H),3.17(m,2H),3.00(m,2H),2.62(m,2H),2.12(s,3H),1.76(m,1H),1.58(m,3H)。
实施例21 制备华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val(华法林-4-O-乙酰-RGDV)
将1.05g(1.08mmol)华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl溶于50mL甲醇中，加入100mg Pd/C，搅拌下于水泵中抽去空气，通入氢气，如此操作重复进行3次，通入氢气室温下搅拌反应约10h。TLC(二氯甲烷/甲醇＝10:1)监测反应进程，原料点消失，将Pd/C过滤除去，滤液减压除去溶剂，用石油醚将其固化成无色固体，利用无水乙醚进行反复磨洗的方式将其纯化，得到无色固体产品635mg(78％)。Mp:148-150℃；
Figure BDA0001015501180000091
Figure BDA0001015501180000092
ESI-MS(m/e):794[M+H]+；IR(cm-1):3325,3197,3063,2939,2163,1965,1650,1610,1530,1494,1453,1397,1354,1272,1226,1198,1165,1147,1102,1018,911,893,756,699；1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝8.51～8.44(m,2H),8.36(d,J＝7.5Hz,1H),7.96(m,2H),7.91(dd,J1＝3.9Hz,J2＝6.6Hz,1H),7.74(d,J＝8.4Hz,1H),7.63(t,J＝7.2Hz,1H),7.43～7.34(m,5H),7.28(m,3H),7.17(t,J＝7.2Hz,2H),4.94(t,J＝7.2Hz,1H),4.65(m,3H),4.44(m,1H),4.11(dd,J1＝6.0Hz,J2＝8.1Hz,1H),3.77(m,2H),3.46(d,J＝7.5Hz,2H),3.13(s,1H),3.12(m,2H),2.73～2.46(m,2H),2.14(s,3H),2.05(m,1H),1.81(m,1H),1.71～1.54(m,3H),0.84(d,J＝6.6Hz,6H)。
实施例22 制备华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser(华法林-4-O-乙酰-RGDS)
将1.06g(1.10mmol)华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl溶于50mL甲醇中，加入100mg Pd/C，搅拌下于水泵中抽去空气，通入氢气，如此操作重复进行3次，通入氢气室温下搅拌反应约10h。TLC(二氯甲烷/甲醇＝10:1)监测反应进程，原料点消失，将Pd/C过滤除去，滤液减压除去溶剂，用石油醚将其固化成无色固体，利用C18柱层析方式将其纯化，得到无色固体产品560mg(69％)。Mp:156-158℃；
Figure BDA0001015501180000101
ESI-MS(m/e):780[M-H]-；IR(cm-1):3325,3062,2940,1656,1608,1565,1525,1494,1453,1394,1354,1274,1227,1198,1165,1146,1102,1070,1019,911,893,756,699,602；1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝10.22(s,1H),8.71～8.65(m,3H),7.92(d,J＝8.1Hz,1H),7.63(t,J＝8.1Hz,1H),7.39(t,J＝8.1Hz,2H),7.36(d,J＝18.6Hz,2H),7.28～7.11(m,6H),4.94(t,J＝6.6Hz,1H),4.68(s,2H),4.42(m,1H),4.34(m,1H),3.90(m,1H),3.82(m,1H),3.64(dd,J1＝5.1Hz,J2＝16.8Hz,2H),3.52(m,2H),3.46(m,2H),3.00(m,2H),2.58(dd,J1＝3.9Hz,J2＝15.9Hz,1H),2.21(dd,J1＝4.8Hz,J2＝11.4Hz,1H),2.13(s,3H),2.03(m,1H),1.73(m,1H),1.56(m,2H)。
实施例23 制备华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe(华法林-4-O-乙酰-RGDF)
将1.13g(1.10mmol)华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl溶于50mL甲醇中，加入110mg Pd/C，搅拌下于水泵中抽去空气，通入氢气，如此操作重复进行3次，通入氢气室温下搅拌反应约10h。TLC(二氯甲烷/甲醇＝10:1)监测反应进程，原料点消失，将Pd/C过滤除去，滤液减压除去溶剂，用石油醚将其固化成无色固体，利用无水乙醚进行反复磨洗的方式将其纯化，得到无色固体产品626mg(76％)。Mp:141-143℃；
Figure BDA0001015501180000102
Figure BDA0001015501180000103
ESI-MS(m/e):842[M+H]+；IR(cm-1):3326,3062,2939,2831,1650,1609,1565,1526,1494,1453,1397,1354,1272,1198,1226,1165,1146,1102,1019,910,893,756,699,603；1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝8.48(dd,J1＝8.1Hz,J2＝12.0Hz,1H),8.39(m,1H),8.28(d,J＝7.5Hz,1H),7.95(d,J＝7.5Hz,1H),7.90(dd,J1＝3.9Hz,J2＝6.6Hz,2H),7.63(t,J＝7.8Hz,1H),7.41(t,J＝7.5Hz,2H),7.35(d,J＝7.8Hz,3H),7.28～7.17(m,10H),4.91(t,J＝7.2Hz,1H),4.64(s,2H),4.58(m,1H),4.45(m,1H),4.35(m,1H),3.76(d,J＝4.8Hz,2H),3.45(m,2H),3.11(m,2H),3.00～2.87(m,2H),2.63(dd,J1＝5.1Hz,J2＝16.5Hz,1H),2.45(dd,J1＝8.1Hz,J2＝17.1Hz,1H),2.13(s,3H),1.76(m,1H),1.65～1.53(m,3H)。
实施例24 评价华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe的抗动脉血栓形成的作用
实验材料：
乌拉坦(氨基甲酸乙酯，CAS：51-79-6，国药集团化学试剂有限公司)、肝素钠(CAS：9041-08-1，百灵威科技有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)。
实验动物：
SD品系大鼠，雄性，200±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
实验方法：实验采用动静脉旁路血栓形成模型。
旁路插管的准备：
旁路插管由三段组成，将内径1.0mm，外径2.0mm的聚乙烯管受热拉成一端为斜口的细管，定长为10.0cm，分别为右颈静脉和左颈动脉插管，位于旁路插管的两端；中段由内径3.5mm的聚乙烯管构成，定长为8.0cm；将表面毛糙的丝线定长为6.0cm，选用重4.0±0.1mg且毛糙程度相同的丝线。
三段聚乙烯管内壁均用1％的硅醚溶液(1％硅油的乙醚溶液)进行硅烷化，在完全晾干后，将丝线于颈动脉插管方向置于中段聚乙烯管中，利用封口膜将三段聚乙烯管组装并固定，插管前需在管中充满肝素。
分组及给药剂量：
本发明化合物华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe剂量为0.1μmol/kg；阳性对照阿司匹林剂量为167μmol/kg和16.7μmol/kg，阴性对照为生理盐水
所用试剂配制：
麻醉剂为用生理盐水配制的20％的乌拉坦水溶液，抗凝剂为用生理盐水配制的42mg/100mL的肝素钠水溶液。
实验操作：
以0.3mL/100g体重的剂量分别对大鼠进行灌胃给药，给药30min后腹腔注射20％的乌拉坦溶液进行麻醉(0.7mL/100g)。仰卧位将大鼠固定于大鼠固定板上，剪开颈部皮肤，分离右颈总动脉及左颈外静脉，分别将右颈总动脉和左颈外静脉的远心端用手术线进行结扎，于暴露的左颈外静脉剪一V字型小口，将上面制好的旁路插管的静脉端斜口插入左颈外静脉开口的近心端，插管处用手术线将血管与聚乙烯管固定，以0.1mL/100g体重的剂量通过旁路插管准确注入肝素钠水溶液，注射器不撤离聚乙烯管。用动脉夹夹住右颈总动脉近心端，在暴露的动脉上剪一V字型小口，将聚乙烯管的尖端从注射器取下，将管插入右颈总动脉的近心端，用手术线将动脉血管与聚乙烯管固定，松开动脉夹，建立体外循环旁路。
维持大鼠体温及旁路插管中血流通畅，体循环15min后先将静脉端插管剪断观察血液循环是否顺畅，从插管的动脉端取出血栓线，在滤纸上吸去丝线上的浮血后称量并记录其湿重，代表抗动脉血栓活性。数据采用t检验进行统计。
实验结果：
数据列入图2。结果表明0.1μmol/kg华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe治疗的大鼠的血栓重(18.74±6.75mg、25.71±4.35mg和22.55±5.38mg)显著小于生理盐水治疗的大鼠血栓重(30.42±3.49mg，p<0.05)，说明化合物0.1μmol/kg华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe表现出抗动脉血栓活性。并且0.1μmol/kg剂量下华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val治疗大鼠的血栓重(18.74±6.75mg)与167μmol/kg剂量下阿司匹林治疗大鼠的血栓重(19.87±3.91mg)没有显著差异，而16.7μmol/kg剂量下的阿司匹林并没有抗动脉血栓的活性，说明化合物华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val的抗动脉血栓活性比阿司匹林至少强1670倍，华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe的抗动脉血栓活性比阿司匹林至少强167倍。这是意想不到的技术效果。
实施例25 评价华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe的抗静脉血栓作用
实验材料
乌拉坦(氨基甲酸乙酯，CAS：51-79-6，国药集团化学试剂有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)华法林钠(CAS：129-06-6，百灵威科技有限公司)。
实验动物
SD品系大鼠，雄性，250±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
实验方法实验采用大鼠下腔静脉结扎模型。
分组及给药剂量：
本发明的化合物华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe剂量为0.1μmol/kg，阳性对照华法林的剂量为4.87μmol/kg，阴性对照为生理盐水。
试剂配制
麻醉剂为生理盐水配制的20％的乌拉坦溶液。
实验操作：
大鼠在手术前适应环境并禁食一天，以0.3mL/100g体重的剂量对大鼠进行灌胃给药。给药30min后于手术前2min用20％乌拉坦溶液腹腔给药麻醉。将大鼠固定于大鼠固定板上，从颈动脉取血2mL，用于血液相关指标的测定。将大鼠腹部备皮且消毒，然后沿腹白线打开腹腔，下至凝固腺，上至露出肝脏一角即可。移开腹腔内小肠等器官并用浸润过生理盐水的纱布包裹。钝性分离血管周围结缔组织，暴露下腔静脉及其分支，在肾静脉下方将腹主动脉和下腔静脉剥离开，然后用生理盐水浸湿的缝合线在下腔静脉与左肾静脉交汇处将下腔静脉结扎，按解剖位置将肠等器官移回腹腔，用缝合线逐层缝合腹腔。
术后将大鼠置于25～28℃的环境中循环4小时，打开腹腔后，逐个将其分支结扎，从下腔静脉与左肾静脉的交汇处的结扎处开始取出2cm下腔静脉，从中取出血栓。血栓称重并利用t检验的方式统计结果。手术以每组两只交替进行。实验数据见图3。
实验结果：
结果表明，在1μmol/kg、0.1μmol/kg和0.01μmol/kg剂量下华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser的抗静脉血栓活性存在剂量依赖关系。1μmol/kg剂量华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser治疗的大鼠的栓重(8.76±2.89mg和9.44±1.47mg)显著小于4.87μmol/kg剂量华法林治疗的大鼠的栓重(13.16±3.13mg，p<0.01)。0.1μmol/kg华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser治疗的大鼠的栓重(12.12±3.23mg和12.31±3.43mg)与4.87μmol/kg华法林治疗的大鼠的栓重(13.16±3.13mg，相比p>0.05)没有显著差异。并且0.01μmol/kg华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser仍具有抗静脉血栓活性。0.1μmol/kg剂量华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe治疗的大鼠的栓重(16.26±3.03mg)显著小于生理盐水治疗的大鼠的栓重(22.93±5.03mg，p<0.01)。可见，华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe的抗静脉血栓活性比华法林至少强48.7倍。这是意想不到的技术效果。
实施例26 评价华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe对PAF、TH及ADP诱导的血小板聚集的抑制作用
实验材料
柠檬酸钠(CAS：68-04-2，国药集团化学试剂有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)、凝血酶(TH，CAS:506-32-1，SIGMA试剂公司)、二磷酸腺苷(ADP，CAS:58-64-0，SIGMA试剂公司)、血小板活化因子(PAF，CAS:74389-68-7，SIGMA试剂公司)。
实验仪器血小板聚集仪：MODEL 700，CHRONO-LOG
实验用血新鲜猪颈动脉血
实验分组
本发明的化合物华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe，阴性对照为生理盐水。
试剂配制
抗凝剂为生理盐水配制的3.8％柠檬酸钠溶液，血小板活化剂为生理盐水配制的50U/mL的TH溶液、生理盐水配制的1mM ADP溶液、生理盐水配制的5×10-5mM PAF溶液。诱导剂的最终浓度是TH为1U/mL、ADP为20μM、PAF为1×10-6mM。
实验方法
在提前一天硅烷化并晾干的取血瓶中加入50mL柠檬酸钠水溶液(与血比例1:9)。取得新鲜猪颈动脉血后轻轻摇匀，迅速于1000rpm的转速离心10min，收集上清液，得到富血小板血浆(PRP)，剩下的血于3500rpm的转速离心10min，收集上清液，得到贫血小板血浆(PPP)。
在血小板聚集仪上将500μLPPP加入小玻璃管的PPP孔中，将480μLPRP加入小玻璃管的PRP孔中。PRP于37℃温育10min后测量。在仪器开始运行、加入转子并调零之后，先向PRP中加入10μL生理盐水或华法林-4-O-乙酰-RGD四肽水溶液，再向PRP中加入10μL血小板活化剂。记录透光率的变化，计算华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe对血小板聚集的抑制率。实验结果见表1。
实验结果：
表1 华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser和华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe抑制由PAF、TH、ADP诱导的血小板聚集抑制率(X±SD％)
Figure BDA0001015501180000141
n＝3；化合物终浓度：2×10-5mol/L，诱导剂的最终浓度为：TH：1U/mL、ADP：20μmol/L、PAF：1×10-6mmol/L。
实验结果表明，华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe可抑制由PAF、TH及ADP诱导的血小板聚集。对PAF诱导的血小板聚集的抑制率为51.8％、9.1％及40.6％，对TH诱导的血小板聚集的抑制率为24.8％、21.4％及28.9％；对ADP诱导的血小板聚集的抑制率为50.3％、26.3％及54.4％。由于华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe体外能够抑制血小板聚集，所以它不是前药。这是意想不到的技术效果。
实施例27 评价华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe降低体内GPⅡb/Ⅲa含量的作用
实验材料：
柠檬酸钠(CAS：68-04-2，国药集团化学试剂有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)、蒸馏水；
实验样本：
实施例24华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe体循环后大鼠颈动脉血
实验方法：
采用大鼠血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)酶联免疫试剂盒来进行检测。
标准品的配制：
从试剂盒中取出一只标准品，于6000-10000rpm离心30s，用1mL样本稀释液溶解，并用枪头对准冻存管底部反复吸打5次以助溶解，充分混合得到标准品S7，取7个1.5mL的离心管依次排列，各加入250μL样本稀释液，吸取250μL标准品S7于S6离心管中，吹打混匀，依次配得S6-S1，S0为样本稀释液。标准品浓度分别为：S7(400ng/mL)、S6(200ng/mL)、S5(100ng/mL)、S4(50ng/mL)、S3(25ng/mL)、S2(12.5ng/mL)、S1(6.25ng/mL)、S0(0ng/mL)。
样本的采集：
用3.8％的柠檬酸钠溶液为抗凝剂，采集华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe治疗大鼠抗动脉血栓循环后的颈动脉血，与30min内于4℃1000rpm离心15min，取上清液(血浆)作为样品进行检测。
样本检测：
将各种试剂移至室温(18-25℃)平衡至少30min，分别设标准品孔、待测样本孔。在预包被的酶标板的每孔分别加入标准品或待测样本100μL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃温育2h。弃去液体，甩干，每孔加入生物素标记抗体工作液100μL，覆上新的板贴，37℃温育1h。弃去液体，甩干，洗板3次，每次浸泡2min，200μL/每孔，甩干。每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μL，覆上新的板贴，37℃温育1h。弃去液体，甩干，洗板5次，依序每孔加底物溶液90μL，37℃避光显色15-30min，依序每孔加终止溶液50μL，终止反应。在5min内用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。根据标准品的OD值绘制标准曲线，计算样本出样本浓度，数据列入图4。
实验结果：
从图4的数据可以看出，0.1μmol/kg华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe治疗的大鼠的GPⅡb/Ⅲa含量显著低于生理盐水治疗大鼠的GPⅡb/Ⅲa含量(p<0.05)，即在0.1μmol/kg的剂量下华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe可降低大鼠体内GPⅡb/Ⅲa含量，并且与167μmol/kg阿司匹林治疗大鼠的体内GPⅡb/Ⅲa含量相当。可见，华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe降低大鼠体内GPⅡb/Ⅲa含量的活性比阿司匹林强1670倍。这是意想不到的技术效果。
实施例28 评价华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe降低大鼠体内维生素K含量的作用
实验材料
柠檬酸钠(CAS：68-04-2，国药集团化学试剂有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)、蒸馏水。
实验样本
实施例25给华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe后大鼠颈动脉血。
实验方法
采用大鼠维生素K1酶联免疫分析试剂盒来进行检测。
样品采集
用3.8％柠檬酸钠溶液为抗凝剂，采集0.1μmol/kg华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe治疗的大鼠颈动脉血，30min内于4℃1000rpm离心15min，取上清液作为样品进行检测。
标准品配制
从试剂盒中取出标准品，用150μL标准品稀释液稀释150μL原倍标准品，充分混合得到标准品S5，取4个1.5mL的离心管依次排列，各加入150μL样本稀释液，吸取150μL标准品S5于S4离心管中，吹打混匀，依次配得S5-S1标准品。标准品浓度分别为S5(6ng/mL)、S4(3ng/mL)、S3(1.5ng/mL)、S2(0.75ng/mL)、S1(0.375ng/mL)和S0(0ng/mL)。
分别设空白孔、标准孔、待测血清孔。在酶标包被板加50μL标准品，待测血清孔中先加40μL样品稀释液，再加10μL待测血清，轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置37℃温育30min。小心揭掉封板膜，弃去液体，洗板5次。空白孔除外每孔加入50μL酶标试剂，37℃温育30min，洗涤，每孔先加50μL显色剂A，再加50μL显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min。每孔加50μL终止液终止反应，在15min内空白孔调零，450nm波长测量各孔的吸光度(OD值)。根据标准品的OD值绘制标准曲线，计算血清样本浓度，数据列入图5。
实验结果
从图5的数据可以看出，0.1μmol/kg华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe治疗的大鼠的维生素K含量显著低于生理盐水治疗大鼠的维生素K含量(p<0.05)，即在0.1μmol/kg的剂量下华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe可降低大鼠体内维生素K含量，并且与4.87μmol/kg华法林治疗大鼠的体内维生素K含量相当。可见，华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe降低大鼠体内维生素K含量的活性比华法林强48.7倍。这是意想不到的技术效果。
实施例29 评价华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe降低大鼠体内凝血因子Ⅱ含量的作用
实验材料
柠檬酸钠(CAS：68-04-2，国药集团化学试剂有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)。
实验样本
实施例25给华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe后大鼠颈动脉血
实验方法
实验采用大鼠FⅡ酶联免疫分析试剂盒来进行检测。
样品的采集
用3.8％的柠檬酸钠溶液为抗凝剂，采集0.1μmol/kg华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe治疗的大鼠的颈动脉血，与30min内于4℃1000rpm离心15min，取上清液(血浆)作为样品进行检测。
标准品的配制
从试剂盒中取出标准品，用150μL标准品稀释液稀释150μL原倍标准品，充分混合得到标准品S5，取4个1.5mL的离心管依次排列，各加入150μL样本稀释液，吸取150μL标准品S5于S4离心管中，吹打混匀，依次配得S5-S1标准品。标准品浓度分别为S5(6ng/mL)、S4(3ng/mL)、S3(1.5ng/mL)、S2(0.75ng/mL)、S1(0.375ng/mL)和S0(0ng/mL)。
分别设空白孔、标准孔、待测血清孔。在酶标包被板加50μL标准品，待测血清孔中先加40μL样品稀释液，再加10μL待测血清，轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置37℃温育30min。小心揭掉封板膜，弃去液体，洗板5次。空白孔除外每孔加入50μL酶标试剂，37℃温育30min，洗涤，每孔先加50μL显色剂A，再加50μL显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min。每孔加50μL终止液终止反应，在15min内空白孔调零，450nm波长测量各孔的吸光度(OD值)。根据标准品的OD值绘制标准曲线，计算血清样本浓度，数据列入图6。
实验结果
从图6的数据可以看出，0.1μmol/kg华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe治疗的大鼠的FII含量显著低于生理盐水治疗大鼠的FII含量(p<0.05)，即在0.1μmol/kg的剂量下华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe可降低大鼠体内FII含量，并且与4.87μmol/kg华法林治疗大鼠的体内FII含量相当。可见，华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe降低大鼠体内FII含量的活性比华法林强48.7倍。这是意想不到的技术效果。
实施例30 华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser连续给药6天大鼠100％存活
实验材料
乌拉坦(氨基甲酸乙酯，CAS：51-79-6，国药集团化学试剂有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)华法林钠(CAS：129-06-6，百灵威科技有限公司)。
实验动物
SD品系大鼠，雄性，250±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
实验方法实验采用大鼠下腔静脉结扎模型。
实验分组和剂量
本发明的华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser的剂量为0.1μmol/kg，阳性对照华法林的剂量为4.87μmol/kg，阴性对照为生理盐水。
试剂配制
麻醉剂为生理盐水配制的20％的乌拉坦溶液。
大鼠实验
实验大鼠适应环境1天，以0.3mL/100g体重的剂量对大鼠灌胃，连续给药6天，最后一天给药30min后于手术前2min用20％乌拉坦溶液腹腔给药麻醉。将大鼠固定于大鼠固定板上，从颈静脉取2mL血，用于血液相关指标的测定。利用下腔静脉结扎法进行抗静脉血栓活性评价，称血栓重，用t检验统计结果。手术以每组两只交替进行。大鼠生存率见图7，连续给药后化合物抗静脉血栓活性结果见图8。
实验结果
图7表明，0.1μmol/kg华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser连续给药6天，大鼠生存率为100％。4.87μmol/kg华法林连续给药5天大鼠开始死亡，连续给药6天全部死亡。尸体解剖表明，导致死亡的原因是其颅内出血、皮下出血及胸腔出血。华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser治疗大鼠并没有观察到出血现象。
图3表明，0.1μmol/kg华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser的抗静脉血栓活性与4.87μmol/kg华法林的抗静脉血栓活性没有显著差异。图8表明，0.1μmol/kg华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser连续给药6天仍然具有抗静脉血栓活性。可见，华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser不仅抗静脉血栓活性强，而且无出血致副作用。这是意想不到的技术效果。
实施例31 华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser连续给药6天对大鼠出血时间无影响
实验材料
乌拉坦(氨基甲酸乙酯，CAS：51-79-6，国药集团化学试剂有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)、华法林钠(CAS：129-06-6，百灵威科技有限公司)。
实验动物
SD品系大鼠，雄性，250±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
实验方法
大鼠连续6天给药，采用鼠尾出血模型评价。4.87μmol/kg华法林或0.1μmol/kg华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser连续给药6天，在最后一天给药30min后用乌拉坦溶液将大鼠麻醉，在大鼠的距鼠尾4cm处的腹侧动脉处用手术刀开一个1mm的创口，然后开始计时，每15s用滤纸将血拭去，在滤纸上不能看到任何血迹的时候停止计时，所记的时间为其出血时间，当出血时间超过30min时记录为30min。实验结果见图9。
实验结果
图9的结果表明，0.1μmol/kg华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser连续给药6天，大鼠腹侧动脉的出血时间与生理盐水治疗大鼠腹侧动脉的出血时间无显著差异(p>0.05)。4.87μmol/kg华法林连续给药5天，大鼠腹侧动脉的出血时间明显长于生理盐水治疗大鼠腹侧动脉的出血时间，明显表现出血风险。
实施例32 华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser连续给药6天对大鼠凝血酶原时间无影响
实验材料
凝血酶原时间(PT)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)、柠檬酸钠(CAS：68-04-2，国药集团化学试剂有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)。
实验方法
取2mL实验例30大鼠的颈静脉血与3.8％柠檬酸钠水溶液以9:1均匀混合，以2500rpm离心15min，收集上层血浆，在2h内完成检测。
将凝血酶原试剂于37℃预热20min，取50μL待测血浆于硅烷化的1mLEP管中预热3min，加入100μL预热的凝血酶原试剂，立即混匀，开始计时，记录血浆凝固的时间，并用t检验的方法进行统计分析。数据见图10。
实验结果
图10的结果表明，0.1μmol/kg华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser连续给药5天，大鼠的PT与生理盐水治疗大鼠的PT无显著差异(p>0.05)。4.87μmol/kg华法林连续给药5天，大鼠的PT明显长于生理盐水治疗大鼠的PT，明显表现出血风险。

Claims (6)

1.结构式如下的华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe，
Figure FDA0002886057130000011
2.制备权利要求1所述的华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe的方法，该方法包括：
(1)合成华法林-4-O-乙酸苄酯；
(2)合成华法林-4-O-乙酸；
(3)采用二环己基碳二亚胺(DCC)为缩合剂，1-羟基苯并三氮唑(HOBt)为催化剂的液相缩合的方法，合成HCl·Arg-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl、HCl·Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl、HCl·Arg-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl；
(4)采用DCC为缩合剂，HOBt为催化剂的液相缩合的方法，华法林-4-O-乙酸与HCl·Arg-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl、HCl·Arg-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl、HCl·Arg-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl缩合；
(5)合成华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe。
3.权利要求1所述的华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe在制备抗动脉血栓形成药物中的应用。
4.权利要求1所述的华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe在制备抗静脉血栓形成药物中的应用。
5.权利要求1所述的华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe在制备抑制血小板聚集药物中的应用。
6.权利要求1所述的华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Val、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Ser、华法林-4-O-乙酰-Arg-Gly-Asp-Phe在制备降低体内GPⅡb/Ⅲa含量的药物中的应用。
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