CN113754724B - 二甲基二氧六环-四氢-β-咔啉-3-甲酰-RGDS的合成,生物活性和应用 - Google Patents

二甲基二氧六环-四氢-β-咔啉-3-甲酰-RGDS的合成,生物活性和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了下式的(3S)‑1‑(2,2‑二甲基‑1,3‑二氧六环‑5‑基)‑1,2,3,4‑四氢‑β‑咔啉‑3‑甲酰‑Arg‑Gly‑Asp‑Ser,公开了它的合成方法和抗动脉血栓活性和抗静脉血栓活性,公开了它对静脉血栓的靶向作用。因而本发明公开了它在制备抗动脉血栓药物和靶向抗静脉血栓药物中的应用。

Description

二甲基二氧六环-四氢-β-咔啉-3-甲酰-RGDS的合成,生物活 性和应用
技术领域
本发明涉及一种(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser化合物,涉及它的合成方法和抗动脉血栓活性和抗静脉血栓活性,涉及它对静脉血栓的靶向作用。因而本发明涉及它在制备抗动脉血栓药物和靶向抗静脉血栓药物中的应用。本发明属于生物医药领域。
背景技术
血栓性疾病目前已经成为危害人类健康的主要疾病之一。根据发生部位和机制可分为动脉血栓和静脉血栓。血栓可给机体造成严重危害。动脉血栓可导致暂时性脑缺血,急性冠状动脉综合症,心肌梗塞和房颤。在静脉血栓中,下肢深静脉血栓,肺栓塞和脑卒中对病人生活质量有严重影响。因病因不同,在传统观念下静脉血栓和动脉血栓被看作两种不同的疾病。在流行病学研究中,静脉血栓和动脉血栓的关联性难以割断,并归结于它们的风险因子相互重叠。这些知识,使发明人格外重视具有抗动脉血栓和抗静脉血栓双重作用的药物研究。
临床上,口服抗凝药是治疗血栓性疾病的普遍策略。尽管口服抗凝剂对血栓性疾病的疗效确切,但是都有出血副作用。例如在有效的口服剂量下,阿司匹林可诱发消化道出血或颅内出血。华法林也存在致命性出血风险。这些知识,使发明人格外重视不改变凝血时间及不改变出血时间的抗血栓药物研究。
经过大量的创造性研究,发明人发现下式的(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸具有抗动脉血栓和抗静脉血栓双重作用,不改变凝血时间及出血时间,降低血浆P-选择素及GPIIb/IIIa水平。可是靶向性研究表明,它既没有动脉血栓靶向作用,也没有静脉血栓靶向作用。这种状况驱动了(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸的结构修饰。经过反复探索,发明人发现下式的(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser虽然没有动脉血栓靶向作用,但有静脉血栓靶向作用。根据这种认识,发明人提出了本发明。
发明内容
本发明的第一个内容是提供下式的(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser。
本发明的第二个内容是提供(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser的合成方法,该方法包括:
(A)合成(3S)-1,1-二羟甲基-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯；
(B)合成(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯；
(C)合成(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸；
(D)用二环己基碳二亚胺为缩合剂,1-羟基苯并三唑为催化剂,通过逐步接肽法从N端向C端液相合成Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl；
(E)用二环己基碳二亚胺为缩合剂,1-羟基苯并三唑为催化剂将(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸与Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl偶联制备(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl；
(F)将(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl脱保护制备(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser。
本发明的第三个内容是评价(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser的抗动脉血栓活性。
本发明的第四个内容是评价(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser的抗静脉血栓活性。
本发明的第五个内容是评价(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser对血浆P-选择素及GPIIb/IIIa的影响。
本发明的第六个内容是评价(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser对凝血时间及出血时间的影响。
本发明的第七个内容是评价(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser对静脉血栓的靶向作用。
附图说明
图1(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser的合成路线:i)三氟醋酸,1,3-二羟基丙酮；ii)H2SO4,丙酮,MgSO4；iii)Pd/C,H2,甲醇；iv)二环己基碳二亚胺(DCC),1-羟基苯并三唑(HOBt),N-甲基吗啉,无水四氢呋喃(THF)；v)2N NaOH,甲醇；vi)氯化氢的乙酸乙酯溶液(4M)。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明,下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的,它们仅用来对本发明进行具体描述,不应当理解为对本发明的限制。
实施例1制备(3S)-1,1-二羟甲基-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯(1)
将1.0g(3.6mmol)L-色氨酸苄酯与10mL二氯甲烷充分搅拌使其溶解。冰浴冷却下,向得到的溶液中先缓慢滴加0.5mL三氟乙酸,再加0.39g(4.3mmol)1,3-二羟基丙酮。反应混合物室温搅拌7小时,TLC显示L-色氨酸苄酯消失(二氯甲烷:甲醇,30:1)。冰浴冷却下,向反应混合物中加入30mL饱和NaHCO3水溶液,分离出二氯甲烷层。然后,先用饱和NaHCO3水溶液洗(30mL×2),再用饱和NaCl水溶液洗(30mL×3)。将分离到的二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥12小时。减压过滤,滤液减压浓缩得到1.01g(81％)标题化合物,为黄色粉末。1H NMR(DMSO-d6,300MHz):δ/ppm＝2.52(m,2H),3.00(dd,J1＝15Hz,J2＝3Hz,1H),3.56(m,3H),3.77(m,1H),4.03(m,1H),4.81(s,2H),5.23(m,2H),6.98(dt,J1＝27Hz,J2＝6Hz,2H),7.40(m,7H),10.57(s,1H)。
实施例2制备(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯(2)将0.8g(2.2mmol)(3S)-1,1-二羟甲基-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯(1)溶于16mL丙酮。在冰浴冷却下,先向得到的溶液中缓慢滴加400μL浓硫酸,再加316mg(2.6mmol)无水MgSO4。反应混合物室温搅拌8小时,TLC显示化合物1消失(石油醚:乙酸乙酯,4:1)。过滤,滤液在冰浴冷却下用饱和NaHCO3水溶液调节pH值至7,减压浓缩去除丙酮,残留物用乙酸乙酯萃取(20mL×3),合并乙酸乙酯层并用饱和NaCl水溶液洗(40mL×3)。乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥12h。过滤,滤液经减压浓缩,残留物经硅胶柱层析分离(石油醚:乙酸乙酯,4:1)得到0.33g(37％)标题化合物,为无色粉末。1H NMR(DMSO-d6,300MHz):δ/ppm＝1.38(s,3H),1.62(s,3H),2.72(m,1H),3.04(m,1H),3.52(d,J＝12Hz,1H),3.85(d,J＝12Hz,1H),3.99(m,2H),4.46(d,J＝12Hz,1H),5.26(s,2H),7.03(dt,J1＝30Hz,J2＝7.5Hz,2H),7.40(m,7H),11.05(s,1H)。13C NMR(DMSO-d6,75MHz):δ/ppm＝19.3,25.6,29.1,51.8,63.8,66.5,68.8,98.1,108.7,111.7,118.3,119.1,121.7,126.7,128.3,128.6,129.0,133.2,136.5,136.6,172.9。ESI-MS(m/e):407[M+H]+。
实施例3制备(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(3)
向5mL甲醇中加入285mg(0.7mmol)(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯(2)和30mg钯碳。室温通氢气反应12小时,TLC显示化合物2消失(石油醚:乙酸乙酯,4:1)。过滤,滤液减压浓缩,残留物用乙醚磨洗,得到201mg(91％)标题化合物,为无色粉末。1H NMR(DMSO-d6,300MHz):δ/ppm＝1.40(s,3H),1.63(s,3H),2.67(m,1H),3.02(dd,J1＝15Hz,J2＝3Hz,1H),3.56(d,J＝12Hz,1H),3.83(m,2H),4.03(d,J＝12Hz,1H),4.48(d,J＝12Hz,1H),7.04(dt,J1＝30Hz,J2＝7.5Hz,2H),7.40(dt,J1＝24Hz,J2＝9Hz,2H),11.07(s,1H)。13C NMR(DMSO-d6,75MHz):δ/ppm＝19.5,25.6,29.1,51.8,52.0,63.8,68.7,98.2,109.2,111.7,118.3,119.1,121.7,126.7,133.0,136.7,174.3.FT-ICR-MS(m/e):315.13382[M-H]-(理论值:315.13393)。HPLC纯度99.4％。
实施例4制备Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl
将960mg(3.0mmol)Boc-Arg(NO2)悬浮于30mL无水四氢呋喃中。冰浴下往悬浮液中加入450mg(3.3mmol)1-羟基苯并三唑(HOBt),再加751mg(3.6mmol)二环己基碳二亚胺(DCC),搅拌30分钟得到反应液A。冰浴下先将1.11g(3.3mmol)Gly-OBzl用10mL无水四氢呋喃溶解,再用N-甲基吗啉将溶液的pH调至8,得到反应液B。将反应液B加入到反应液A中,撤去冰浴,室温搅拌12h。TLC监测反应反应完成(CH2Cl2/CH3OH,20/1),减压浓缩。残留物用少量乙酸乙酯溶解,滤除不溶物。滤液依次用饱和NaHCO3水溶液洗(30mL×3),饱和NaCl水溶液洗(30mL×3),5％KHSO4水溶液洗(30mL×3),饱和NaCl水溶液洗(30mL×3),饱和NaHCO3水溶液洗(30mL×3),饱和NaCl水溶液洗(30mL×3)洗涤。乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥12h。过滤,滤液减压浓缩,得到的淡黄色油状物在30mL二氯甲烷中结晶,得到1.23g(88％)标题化合物,为无色固体。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝8.482(s,1H),8.260(t,J＝5.4Hz,1H),7.352(m,5H),6.872(d,J＝8.2Hz,1H),5.121(s,2H),3.888(m,3H),3.105(m,2H),2.448(m,2H),1.501(m,4H),1.378(s,9H)。
实施例5制备Boc-Asp(OBzl)-Ser-OBzl
采用实施例4的操作从3.878g(12.0mmol)Boc-Asp(OBzl)和3.056g(13.2mmol)Ser-OBzl得到5.901g(98％)标题化合物,为无色油状物。1H NMR(DMSO-d6,300MHz):δ/ppm＝1.38(s,9H),2.61(m,1H),2.75(m,1H),3.66(m,1H),3.78(m,1H),4.46(m,1H),5.12(d,J＝6Hz,4H),7.26(m,11H),8.16(d,J＝9Hz,1H)。
实施例6制备Boc-Arg(NO2)-Gly
将935mg(2.0mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl先用10mL甲醇溶解,再在冰浴下用浓度为2摩尔的NaOH水溶液将溶液的pH值调节为12,搅拌4h,TLC监测反应完成。在冰浴下将反应混合物用5％KHSO4调节pH至7,减压浓缩除去甲醇。在冰浴下将残留物用稀盐酸调节pH至2,用乙酸乙酯萃取(30mL×3),用饱和NaCl水溶液洗(30mL×3),用无水硫酸钠干燥12h。过滤,滤液减压浓缩,得到635mg(84％)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):375[M-H]-。
实施例7制备Asp(OBzl)-Ser-OBzl
在冰浴下将2.01g(4.0mmol)Boc-Asp(OBzl)-Ser-OBzl用10mL浓度为4摩尔的氯化氢的乙酸乙酯溶液缓慢溶解。溶液搅拌4h,TLC监测反应完成(石油醚/乙酸乙酯,3/1)。减压浓缩,残留物用5mL干燥过的乙酸乙酯溶解。溶液减压浓缩,残留物用5mL干燥过的乙酸乙酯溶解。溶液再减压浓缩,残留物用5mL无水入乙醚反复洗,得1.71g(97％)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):401[M+H]+。
实施例8制备Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl
采用实施例4的操作从941mg(2.5mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly和1.18g(2.7mmol)Asp(OBzl)-Serl-OBzl得到1.54g(81％)标题化合物,为无色粉末。1H NMR(DMSO-d6,300MHz):δ/ppm＝1.37(s,9H),1.58(m,4H),2.57(m,1H),2.77(m,1H),3.12(m,2H),3.72(m,4H),3.94(m,1H),4.38(m,1H),4.79(m,1H),5.10(m,5H),6.98(d,J＝6Hz,1H),7.34(m,10H),8.07(s,1H),8.26(t,J＝6Hz,1H),8.49(s,1H)。
实施例9制备Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl
采用实施例7的操作从531mg(0.7mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl得402mg(82％)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):659[M+H]+。
实施例10制备(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl(4)
采用实施例4的操作从63mg(0.2mmol)(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸和153mg(0.2mmol)Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl得到0.155g(81％)标题化合物,为无色粉末。1H NMR(DMSO-d6,300MHz):δ/ppm＝1.39(s,3H),1.68(m,7H),2.63(m,2H),2.79(dd,J 1＝15Hz,J 2＝3Hz,1H),3.03(m,1H),3.18(m,2H),3.40(s,2H),3.63(m,2H),3.78(m,2H),3.99(d,J＝9Hz,1H),4.28(m,2H),4.39(m,2H),4.67(m,1H),4.78(m,1H),5.10(m,4H),6.98(t,J＝7.5Hz,1H),7.08(t,J＝7.5Hz,1H),7.36(m,12H),8.03(d,J＝6Hz,1H),8.32(m,2H),8.54(d,J＝9Hz,1H),10.93(s,1H)；13C NMR(DMSO-d6,75MHz):δ/ppm＝20.2,20.9,26.3,28.3,29.6,36.7,42.4,49.5,51.5,51.7,52.6,52.9,55.4,63.1,64.6,66.2,66.9,68.5,98.1,109.0,111.8,118.2,119.1,121.6,126.7,128.2,128.3,128.4,128.6,128.8,128.9,133.7,136.1,136.4,136.5,169.2,169.5,170.2,170.6,171.1,172.3,173.3。
实施例11制备(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser(5)
向5mL甲醇中加入20mg(0.02mmol)(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl(4)和15mg钯碳。搅拌,通入氢气48h,TLC显示化合物4消失(CH2Cl2/CH3OH,10/1)。过滤,滤液经减压浓缩。残留物用乙醚磨洗,得到14mg(84％)标题化合物,为无色粉末。1H NMR(DMSO-d6,300MHz):δ/ppm＝1.40(s,3H),1.65(m,7H),2.05(m,1H),2.33(m,1H),2.59(m,2H),3.02(m,2H),3.22(m,1H),3.50(m,1H),3.56(m,2H),3.64(m,1H),3.68(m,1H),3.77(s,1H),3.81(s,1H),3.91(m,2H),3.99(m,2H),4.38(m,2H),6.98(t,J＝7.5Hz,1H),7.07(m,1H),7.20(s,1H),7.27(d,J＝6Hz,1H),7.37(d,J＝6Hz,1H),7.43(d,J＝9Hz,1H),8.11(d,J＝6Hz,1H),8.66(m,1H),10.08(s,1H),,10.93(s,1H)；13C NMR(DMSO-d6,75MHz):δ/ppm＝20.5,25.2,26.2,28.2,30.5,38.1,42.9,50.2,50.3,51.5,52.8,55.3,55.8,62.7,64.7,68.5,98.1,109.1,111.7,118.2,119.1,121.5,126.7,133.9,136.5,157.7,169.1,171.0,173.0,173.1,173.4,175.2；ESI(+)-FT-ICR-MS(m/e):732.25709[M+H]+。HPLC纯度97.85％。
实施例12评价抗动脉血栓活性
雄性SD品系大鼠(250±20g),购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
本发明的化合物(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser的口服剂量为0.1μmol/kg,阳性对照阿司匹林的口服剂量为167μmol/kg,阴性对照为生理盐水。
用大鼠动静脉旁路循环丝线法抗栓模型评价抗动脉血栓活性。大鼠在手术前适应环境并禁食一天,将雄性SD大鼠随机分为生理盐水组(3mL/kg)(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser组(0.1μmol/kg)和阿司匹林组(167μmol/kg)。大鼠给药30分钟后,大鼠用20％乌拉坦溶液麻醉(7mL/kg,腹腔)。充分麻醉后,剪开颈部皮肤,分离其右颈动脉和左颈静脉。在聚乙烯管中,加入精确称重的长度为6cm的丝线。将该聚乙烯管填充肝素钠的生理盐水溶液(50IU/mL),其末端分别插入左颈静脉和右颈动脉,使血液通过聚乙烯管流动15分钟。最后,从聚乙烯管中取出丝线称重计算丝线重量的增加量以得到血栓重量,并留样供测定动脉血栓靶向作用。大鼠的血液留样,供测定血浆P-选择素及GPIIb/IIIa水平用。为避免手术时间对实验结果的影响,手术以每组三只交替进行。
测定的抗动脉血栓活性见表1。表1各组血栓重量表明,在0.1μmol/kg口服剂量下(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser可有效抑制大鼠的动脉血栓。可见,本发明有突出的技术效果。
表1抗动脉血栓活性
a)与生理盐水比P<0.01；化合物5代表(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser；n＝12.
实施例13评价动脉血栓大鼠血浆P-选择素浓度
取4mL接受抗动脉血栓活性测定的大鼠血液,加EDTA抗凝,1000g离心15分钟,取上清血浆备用。采用大鼠P-选择素酶联免疫试剂盒(rat P-selectin ELISA kit,CSB-E08776r,Cusabio Biotech,USA)测定生理盐水(3mL/kg)及(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser(0.1μmol/kg)治疗的动脉血栓大鼠的血浆中P-选择素的浓度。将试剂盒中检测试剂在室温下平衡30分钟,配置各浓度下的标准溶液,检测试剂及洗涤液,设置标准品各3个复孔,待测样品组取5个样本,每个样本设2个复孔,按照说明加样,孵育,检测及处理数据。表2的数据说明,在0.1μmol/kg口服剂量下(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser治疗的动脉血栓大鼠的血浆中P-选择素的浓度显著低于生理盐水治疗的动脉血栓大鼠的血浆中P-选择素的浓度。可见,本发明有突出的技术效果。
表2动脉血栓大鼠血浆的P-选择素浓度
a)与生理盐水比P<0.01；化合物5代表(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser；n＝12.
实施例14评价动脉血栓大鼠血浆GPIIb/IIIa浓度
取4mL接受抗动脉血栓活性测定的大鼠血液,加EDTA抗凝,1000g离心15分钟,取上清血浆备用。采用大鼠P-选择素酶联免疫试剂盒(rat GPIIb/IIIa ELISA kit,CSB-E08776r,Cusabio Biotech,USA)测定生理盐水(3mL/kg)及(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser(0.1μmol/kg)治疗的动脉血栓大鼠的血浆中GPIIb/IIIa的浓度。将试剂盒中检测试剂在室温下平衡30分钟,配置各浓度下的标准溶液,检测试剂及洗涤液,设置标准品各3个复孔,待测样品组取5个样本,每个样本设2个复孔,按照说明加样,孵育,检测及处理数据。表3的数据说明,在0.1μmol/kg口服剂量下(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser治疗的动脉血栓大鼠的血浆中GPIIb/IIIa的浓度显著低于生理盐水治疗的动脉血栓大鼠的血浆中GPIIb/IIIa的浓度。可见,本发明有突出的技术效果。
表3动脉血栓大鼠血浆的GPIIb/IIIa浓度
a)与生理盐水比P<0.01；化合物5代表(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Val；n＝12.
实施例15评价抗静脉血栓活性
雄性SD品系大鼠(250±20g),购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
本发明的化合物(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser的口服剂量为0.1μmol/kg,阳性对照华法林的口服剂量为4.87μmol/kg,阴性对照为生理盐水。
用大鼠下腔静脉结扎模型评价抗静脉血栓活性。大鼠在手术前适应环境并禁食一天,将雄性SD大鼠随机分组,每组12只。给药30min后,大鼠腹腔注射20％乌拉坦溶液(V/V)麻醉。完全进入麻醉状态的大鼠仰卧位固定于固定板上,腹部备皮并消毒,沿腹白线打开腹腔,下至凝固腺,上至露出肝脏一角即可。移开腹腔内小肠等器官,将腹腔脏器轻轻拖出,放于干净的用生理盐水湿润的纱布中。钝性分离血管周围结缔组织,暴露下腔静脉及其分支,然后用生理盐水浸湿的缝合线在下腔静脉与左肾静脉交汇处将下腔静脉结扎。按解剖位置将小肠等器官移回腹腔,用缝合线逐层缝合腹腔。
术后将大鼠置于25-28℃的环境中循环4小时。乙醚麻醉后,打开腹腔后,逐个结扎分支。从下腔静脉与左肾静脉的交汇处的结扎处取出2cm下腔静脉,从中取出血栓并称重。血栓留样供评价靶向作用之用。为避免手术时间对实验结果的影响,手术以每组三只交替进行。各组大鼠的静脉血栓并重见表4。
表4的数据说明,在0.1μmol/kg的口服剂量下(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser可有效抑制大鼠的静脉血栓,活性与4.87μmol/kg口服剂量的华法林的活性没有显著性差异,即等于华法林活性的48.7倍。可见,本发明有突出的技术效果。
表4抗静脉血栓活性
a)与生理盐水比P<0.01,与4.87μmol/kg华法林比P>0.05；化合物5代表(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser；n＝12.
实施例16评价静脉血栓大鼠的尾出血时间
用于评价抗静脉血栓活性的大鼠在25-28℃的环境中循环4小时,乙醚麻醉,打开腹腔取静脉血栓前剪去0.5厘米尾尖,开始计时。用滤纸吸去从伤口渗出的血液,当没有血液从伤口渗出时停止计时。从开始计时到停止计时花去的时间,就是大鼠尾出血时间。表5的数据说明,在4.87μmol/kg口服剂量下华法林明显地延长了静脉血栓大鼠的尾出血时间,也就是说华法林有出血风险。相反,在0.1μmol/kg的口服剂量下(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser不延长静脉血栓大鼠的尾出血时间,也就是说它没有出血风险。没有华法林样的出血风险,说明本发明有突出的技术效果。
表5静脉血栓大鼠的尾出血时间
a)与生理盐水比P>0.05,与华法林相比P<0.01；化合物5代表(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser；n＝12.
实施例17评价静脉血栓大鼠的凝血时间
用于评价抗静脉血栓活性的大鼠在25-28℃的环境中循环4小时,乙醚麻醉,打开腹腔取静脉血栓的同时,往洁净的玻璃板上滴一滴静脉血并开始计时。用针尖刺激血滴,当血滴形成粘稠的膜时停止计时。从开始计时到停止计时花去的时间,就是大鼠凝血时间。表6的数据说明,在4.87μmol/kg口服剂量下华法林非常明显地延长了静脉血栓大鼠的凝血时间,也就是说华法林有出血风险。相反,在0.1μmol/kg的口服剂量下(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser不延长静脉血栓大鼠的凝血时间,也就是说它没有出血风险。没有华法林样的出血风险,说明本发明有突出的技术效果。
表6静脉血栓大鼠的凝血时间
a)与生理盐水比P>0.05,与华法林相比P<0.01；化合物5代表(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser；n＝12.
实施例18评价静脉血栓靶向作用
将生理盐水和0.1μmol/kg口服剂量(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser治疗的静脉血栓大鼠的静脉血栓样本,置于5mL离心管中,加入1mL色谱甲醇,用钢铲将血栓组织碾碎,超声30min,静置后吸取上清液于离心管中,将残留物用乙酸乙酯浸泡24小时并超声30分钟,收集乙酸乙酯上清液。残留物加3mL乙酸乙酯,超声30分钟后收集上清液,如此反复3次。合并乙酸乙酯相,减压浓缩除乙酸乙酯,残留物用1mL色谱甲醇溶解,溶液接受ESI(+)-FT-ICR-MS分析。结果表明,(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser治疗的静脉血栓大鼠的静脉血栓样本的ESI(+)-FT-ICR-MS谱在732.25721处出现了(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser的分子离子加H的峰,在317.14761处出现了(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸的分子离子加H的峰。生理盐水治疗的静脉血栓大鼠的静脉血栓样本的ESI(+)-FT-ICR-MS谱中既没有(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-SEr的分子离子加H的峰,也没有(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸的分子离子加H的峰。
按照上面的操作将0.1μmol/kg口服剂量(3S)-1-(1,1-二甲基-1,3-二氧六环-6-螺)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser治疗的静脉血栓大鼠的心,肝,脑,脾,肺和肾制备匀浆萃取样本,接受ESI(+)-FT-ICR-MS分析。结果表明,它们的ESI(+)-FT-ICR-MS谱中既没有(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser的分子离子加H的峰,也没有(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸的分子离子加H的峰。
可见,(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser只进入大鼠静脉血栓,而不进入大鼠的器官。很明显,这是静脉血栓靶向性。
需要声明的是，上述发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换、或改进。

Claims (6)

1.一种(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser化合物，结构式如下:
2.权利要求1所述的(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser的合成方法,该方法包括:
(A)合成(3S)-1,1-二羟甲基-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯；
(B)合成(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯；
(C)合成(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸；
(D)用二环己基碳二亚胺为缩合剂,1-羟基苯并三唑为催化剂,通过逐步接肽法从N端向C端液相合成Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl；
(E)用二环己基碳二亚胺为缩合剂,1-羟基苯并三唑为催化剂将(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸与Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl偶联制备(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl；
(F)将(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl脱保护制备(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser。
3.权利要求1所述的(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Val在制备抗动脉血栓药物中的应用。
4.权利要求1所述的(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser在制备靶向抗静脉血栓药物中的应用。
5.权利要求1所述的(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser在制备P-选择素抑制剂中的应用。
6.权利要求1所述的(3S)-1-(2,2-二甲基-1,3-二氧六环-5-基)-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-甲酰-Arg-Gly-Asp-Ser在制备GPIIb/IIIa抑制剂中的应用。
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