CN107474030B - 华法林-阿司匹林缀合物，其合成，抗血栓活性和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种华法林‑阿司匹林缀合物,公开了它的制备方法,公开了它的抗动脉血栓活性，公开了它的抗静脉血栓活性，公开了它降低体内维生素K含量的活性，公开了它降低体内凝血因子Ⅱ含量的活性，公开了它抑制血小板聚集的活性，公开了它没有华法林样出血风险的优势。因而本发明公开了它在制备抗动脉血栓药物中的应用、在制备抗静脉血栓药物中的应用、在制备抑制血小板聚集药物中的应用、在制备维生素K拮抗剂中的应用和在制备凝血因子II拮抗剂中的应用。

Description

华法林-阿司匹林缀合物，其合成，抗血栓活性和应用

技术领域

本发明涉及一种新型华法林-阿司匹林,涉及它的制备方法,涉及它的抗动脉血栓活性，涉及它的抗静脉血栓活性，涉及它降低体内维生素K的含量的作用，涉及它降低体内凝血因子Ⅱ的含量的作用，涉及它抑制血小板聚集的作用，涉及它没有降低华法林样出血风险的优势。因而本发明涉及它在制备抗动脉血栓药物中的应用、在制备抗静脉血栓药物中的应用、在制备抑制血小板聚集药物中的应用、在制备维生素K拮抗剂中的应用和在制备凝血因子II拮抗剂中的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

动脉血栓和静脉血栓两种病症已成为当下发病率高和死亡率高的疾病。其中静脉血栓症，包括深静脉血栓和肺栓塞的患者数超过了心肌梗塞和中风发病的总人数，而且比乳腺癌和艾滋病所引起死亡的总人数高。由于动脉血栓和静脉血栓两种病症的发病率随年龄增长呈指数态增加，所以两种病症对我国这样的老龄化国家的人民健康的威胁尤其严重。如果把人口基数考虑进去，两种病症对我国国计民生的绝对负面影响尤其严重。于是，动脉血栓和静脉血栓两种病症的预防及治疗一直是医药领域的关注重点。虽然华法林1941年就用于临床，但是它的安全窗口窄。剂量低会导致肺栓塞，剂量高会导致致命性出血。过去的50多年对华法林进行了大量结构改造，却都没有能够得到抗静脉血栓活性强和出血副作用低的类似物。与传统的思维不同，发明人修饰华法林结构的目标是，将华法林转化为具有抗动脉血栓和抗静脉血栓双重活性的类似物。不过，也一直未能如愿。阿司匹林是具有100多年历史的解热镇痛药。由于能够抑制血小板环氧化酶而抑制血小板聚集，过去的30多年间被广泛应用于抗动脉血栓症。后来慢慢出现的阿司匹林耐药现象，吸引了很多实验室对阿司匹林进行结构修饰，却都没有能够得到抗动脉血栓活性更强的类似物。与传统的思维不同，发明人修饰阿司匹林结构的目标是，将阿司匹林转化为具有抗动脉血栓和抗静脉血栓双重活性的类似物。不过，也一直未能如愿。之后，又经过5年探索，发明人发现华法林与阿司匹林直接共价键合，生成华法林-阿司匹林缀合物在体外抗血小板聚集模型上显示优秀的抗血小板聚集活性。显然，华法林-阿司匹林缀合物既不是华法林的前药，也不是阿司匹林的前药。华法林-阿司匹林缀合物的抗动脉血栓活性比阿司匹林强167倍，抗静脉血栓活性比华法林强487倍，而且没有华法林样出血副作用。可见，本发明具有显著的技术进步。于是，发明人提出本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供下面结构的华法林-阿司匹林缀合物。

本发明的第二个内容是提供华法林-阿司匹林缀合物的合成方法，该方法包括在二环己基碳二亚胺(DCC),和4-二甲氨基吡啶(DMAP)的催化下按标准方法制备。

本发明的第三个内容是评价华法林-阿司匹林缀合物抗动脉血栓的作用。

本发明的第四个内容是评价华法林-阿司匹林缀合物抗静脉血栓的作用。

本发明的第五个内容是评价华法林-阿司匹林缀合物抑制由血小板活化因子(PAF)、凝血酶(TH)及二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集的作用。

本发明的第六个内容是评价华法林-阿司匹林缀合物降低体内维生素K含量的作用。

本发明的第七个内容是评价华法林-阿司匹林缀合物降低体内凝血因子Ⅱ含量的作用。

本发明的第八个内容是记录连续给药5天后的生存率，出血时间和凝血酶原时间，评价华法林-阿司匹林缀合物降低华法林出血风险的作用。

附图说明

图1.华法林-阿司匹林的合成路线：催化剂为DCC和DMAP,溶剂为四氢呋喃。

图2.华法林-阿司匹林的抗动脉血栓活性,n＝10。

图3.华法林-阿司匹林的抗静脉血栓活性,n＝10。

图4.华法林-阿司匹林对PAF、TH及ADP诱导的血小板聚集的抑制作用,n＝3。

图5.华法林-阿司匹林对大鼠体内维生素K含量的影响,n＝5。

图6.华法林-阿司匹林对大鼠体内FⅡ含量的影响,n＝5。

图7.华法林-阿司匹林连续给药5天大鼠的生存率,n＝7。

图8.华法林-阿司匹林连续给药5天抗静脉血栓的活性,n＝5。

图9.华法林-阿司匹林连续给药5天对大鼠出血时间的影响,n＝5。

图10.华法林-阿司匹林连续给药5天对大鼠凝血酶原时间的影响,n＝5。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备华法林-阿司匹林

冰浴下0.51g(2.7mmol)阿司匹林溶于10mL无水四氢呋喃中，加入0.02g(0.11mmol)DMAP，混合均匀，得到反应液1。将0.98g(2.7mmol)华法林用10mL无水四氢呋喃中溶解，加入反应液1中搅拌5min，得到反应液2。冰浴下将0.73g(3.4mmol)DCC用10mL无水四氢呋喃中溶解并滴加到反应液2中，搅拌2小时反应结束。搅拌中有二环己基脲(DCU)析出。反应结束后滤除去DCU。滤液减压浓缩除去四氢呋喃，残留物用二氯甲烷溶解，滤除DCU，滤液减压浓缩，层析法纯化，得0.91g(70％)华法林-阿司匹林，为无色固体。Mp：69-70℃。

ESI-MS(m/e):493[M+Na]⁺；IR(cm^-1):3295,3062,2930,1573,1533,1491,1451,1380,1327,1276,1188,1123,1065,1015,912,874,822,715,698； ¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ/ppm＝8.26(d,J＝6.9Hz,1H),7.90(td,J₁＝1.2Hz,J₂＝7.2Hz,1H),7.64(m,2H),7.49～7.35(m,4H),7.28～7.164(m,5H),4.73(t,J＝7.2Hz,1H),3.49(m,1H),3.24(m,1H),2.18(s,3H),2.12(s,3H)。

实施例2评价华法林-阿司匹林的抗动脉血栓作用

实验材料

乌拉坦(国药集团化学试剂有限公司)、肝素钠(百灵威科技有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)。

实验动物

SD品系大鼠，雄性，200±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

旁路插管

旁路插管由三段组成，将内径1.0mm，外径2.0mm的聚乙烯管加热拉成一端为斜口的细管，长10.0cm，分别为右颈静脉和左颈动脉插管，位于旁路插管的两端；中段由内径3.5mm的聚乙烯管构成，长8.0cm；表面毛糙的丝线长6.0cm，重4.0±0.1mg。

三段聚乙烯管内壁均用1％硅醚溶液(1％硅油的乙醚溶液)硅烷化，完全晾干后，将丝线于颈动脉插管方向置于中段聚乙烯管中，利用封口膜将三段聚乙烯管组装并固定，插管前需在管中充满肝素。

大鼠分组及给药剂量

本发明的化合物华法林-阿司匹林剂量为0.1μmol/kg，阳性对照阿司匹林剂量为16.7和167μmol/kg，阴性对照为生理盐水。

试剂配制

麻醉剂为生理盐水配制的20％的乌拉坦溶液，抗凝剂为生理盐水配制的42mg/100mL的肝素钠溶液。

实验操作

以0.3mL/100g体重的剂量分别对大鼠进行灌胃给药，给药30min后腹腔注射20％的乌拉坦溶液进行麻醉(0.7mL/100g)。仰卧位将大鼠固定于板上，剪开颈部皮肤，分离右颈总动脉及左颈外静脉，分别将右颈总动脉和左颈外静脉的远心端用手术线进行结扎，于暴露的左颈外静脉剪一V字型小口，将上面制好的旁路插管的静脉端斜口插入左颈外静脉开口的近心端，插管处用手术线将血管与聚乙烯管固定，以0.1mL/100g体重的剂量通过旁路插管准确注入肝素钠水溶液，注射器不撤离聚乙烯管。用动脉夹夹住右颈总动脉近心端，在暴露的动脉上剪一V字型小口，将聚乙烯管的尖端从注射器取下，将管插入右颈总动脉的近心端，用手术线将动脉血管与聚乙烯管固定，松开动脉夹，建立体外循环旁路。

维持大鼠体温及旁路插管中血流通畅，体循环15min后先将静脉端插管剪断观察血液循环是否顺畅，从插管的动脉端取出血栓线，在滤纸上吸去丝线上的血后称量并记录血栓重，代表抗动脉血栓活性。数据采用t检验进行统计。

实验结果

数据列入图2。结果表明华法林-阿司匹林治疗的大鼠的血栓重(26.18±2.72mg)显著小于生理盐水治疗的大鼠的血栓重(30.42±3.49mg，p<0.050)，说明华法林-阿司匹林表现出抗动脉血栓活性。在16.7μmol/kg剂量下阿司匹林没有抗动脉血栓活性，说明华法林-阿司匹林的抗动脉血栓活性比阿司匹林至少强167倍。这是意想不到的技术效果。

实施例3评价华法林-阿司匹林的抗静脉血栓作用

实验材料

乌拉坦(氨基甲酸乙酯，CAS：51-79-6，国药集团化学试剂有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)华法林钠(CAS：129-06-6，百灵威科技有限公司)。

实验动物

SD品系大鼠，雄性，250±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

实验方法实验采用大鼠下腔静脉结扎模型。

分组及给药剂量：

本发明的化合物华法林-阿司匹林剂量为0.1μmol/kg，阳性对照华法林的剂量为4.87μmol/kg，阴性对照为生理盐水。

试剂配制

麻醉剂为生理盐水配制的20％的乌拉坦溶液。

实验操作：

大鼠在手术前适应环境并禁食一天，以0.3mL/100g体重的剂量对大鼠进行灌胃给药。给药30min后于手术前2min用20％乌拉坦溶液腹腔给药麻醉。将大鼠固定于大鼠固定板上，从颈动脉取血2mL，用于血液相关指标的测定。将大鼠腹部备皮且消毒，然后沿腹白线打开腹腔，下至凝固腺，上至露出肝脏一角即可。移开腹腔内小肠等器官并用浸润过生理盐水的纱布包裹。钝性分离血管周围结缔组织，暴露下腔静脉及其分支，在肾静脉下方将腹主动脉和下腔静脉剥离开，然后用生理盐水浸湿的缝合线在下腔静脉与左肾静脉交汇处将下腔静脉结扎，按解剖位置将肠等器官移回腹腔，用缝合线逐层缝合腹腔。

术后将大鼠置于25～28℃的环境中循环4小时，打开腹腔后，逐个将其分支结扎，从下腔静脉与左肾静脉的交汇处的结扎处开始取出2cm下腔静脉，从中取出血栓。血栓称重并利用t检验的方式统计结果。手术以每组两只交替进行。实验数据见图3。

实验结果

结果表明，在0.1μmol/kg、0.01μmol/kg和0.001μmol/kg剂量下华法林-阿司匹林的抗静脉血栓活性存在剂量依赖关系。0.1μmol/kg剂量华法林-阿司匹林治疗的大鼠的栓重(6.92±1.28mg)显著小于4.87μmol/kg剂量华法林治疗的大鼠的栓重(13.16±3.13mg，p<0.01)。0.01μmol/kg华法林-阿司匹林治疗的大鼠的栓重(13.63±3.71mg)与4.87μmol/kg华法林治疗的大鼠的栓重(13.16±3.13mg，相比p>0.05)没有显著差异。并且0.001μmol/kg华法林-阿司匹林仍具有抗静脉血栓活性。可见，华法林-阿司匹林的抗静脉血栓活性比华法林至少强487倍。这是意想不到的技术效果。

实施例4评价华法林-阿司匹林对PAF、TH及ADP诱导的血小板聚集的抑制作用

实验材料

柠檬酸钠(CAS：68-04-2，国药集团化学试剂有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)、凝血酶(TH，CAS:506-32-1，SIGMA试剂公司)、二磷酸腺苷(ADP，CAS:58-64-0，SIGMA试剂公司)、血小板活化因子(PAF，CAS:74389-68-7，SIGMA试剂公司)。

实验仪器血小板聚集仪：MODEL 700，CHRONO-LOG

实验用血新鲜猪颈动脉血

实验分组

本发明的化合物华法林-阿司匹林，阴性对照为生理盐水。

试剂配制

抗凝剂为生理盐水配制的3.8％柠檬酸钠溶液，血小板活化剂为生理盐水配制的50U/mL的TH溶液、生理盐水配制的1mMADP溶液、生理盐水配制的5×10^-5mMPAF溶液。诱导 剂的最终浓度是TH为1U/mL、ADP为20μM、PAF为1×10^-6mM。

实验方法

在提前一天硅烷化并晾干的取血瓶中加入50mL柠檬酸钠水溶液(与血比例1:9)。取得新鲜猪颈动脉血后轻轻摇匀，迅速于1000rpm的转速离心10min，收集上清液，得到富血小板血浆(PRP)，剩下的血于3500rpm的转速离心10min，收集上清液，得到贫血小板血浆(PPP)。

在血小板聚集仪上将500μLPPP加入小玻璃管的PPP孔中，将480μLPRP加入小玻璃管的PRP孔中。PRP于37℃温育10min后测量。在仪器开始运行、加入转子并调零之后，先向PRP中加入10μL生理盐水或华法林-阿司匹林水溶液，再向PRP中加入10μL血小板活化剂。记录透光率的变化，计算华法林-阿司匹林对血小板聚集的抑制率。实验结果见图4。

实验结果

实验结果表明，华法林-阿司匹林可抑制由PAF、TH及ADP诱导的血小板聚集。对PAF诱导的血小板聚集的抑制率为43.4％，对TH诱导的血小板聚集的抑制率为7.3％；对ADP诱导的血小板聚集的抑制率为22.5％。由于华法林-阿司匹林体外能够抑制血小板聚集，所以它不是前药。这是意想不到的技术效果。

实施例5评价华法林-阿司匹林降低大鼠体内维生素K含量的作用

实验材料

柠檬酸钠(CAS：68-04-2，国药集团化学试剂有限公司)、NS(石家庄四药有限公司)、蒸馏水。

实验样本

实施例3的大鼠颈动脉血。

实验方法

采用大鼠维生素K1酶联免疫分析试剂盒来进行检测。

样品采集

用3.8％柠檬酸钠溶液为抗凝剂，采集0.1μmol/kg华法林-阿司匹林治疗的大鼠颈动脉血，30min内于4℃1000rpm离心15min，取上清液作为样品进行检测。

标准品配制

从试剂盒中取出标准品，用150μL标准品稀释液稀释150μL原倍标准品，充分混合得到标准品S5，取4个1.5mL的离心管依次排列，各加入150μL样本稀释液，吸取150μL标准品S5于S4离心管中，吹打混匀，依次配得S5-S1标准品。标准品浓度分别为S5(6ng/mL)、S4(3ng/mL)、S3(1.5ng/mL)、S2(0.75ng/mL)、S1(0.375ng/mL)和S0(0ng/mL)。

分别设空白孔、标准孔、待测血清孔。在酶标包被板加50μL标准品，待测血清孔中先加40μL样品稀释液，再加10μL待测血清，轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置37℃温育30min。小心揭掉封板膜，弃去液体，洗板5次。空白孔除外每孔加入50μL酶标试剂，37℃温育30min，洗涤，每孔先加50μL显色剂A，再加50μL显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min。每孔加50μL终止液终止反应，在15min内空白孔调零，450nm波长测量各孔的吸光度(OD值)。根据标准品的OD值绘制标准曲线，计算血清样本浓度，数据列入图5。

实验结果

从图5的数据可以看出，0.1μmol/kg华法林-阿司匹林治疗的大鼠的维生素K含量显著低于生理盐水治疗大鼠的维生素K含量(p<0.05)，即在0.1μmol/kg的剂量下华法林-阿司匹林可降低大鼠体内维生素K含量，并且与4.87μmol/kg华法林治疗大鼠的体内维生素K含量相当。可见，华法林-阿司匹林降低大鼠体内维生素K含量的活性比华法林强48.7倍。这是意想不到的技术效果。

实施例6评价华法林-阿司匹林降低大鼠体内凝血因子Ⅱ含量的作用

实验材料

柠檬酸钠(CAS：68-04-2，国药集团化学试剂有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)。

实验样本

实施例3大鼠颈动脉血

实验方法

实验采用大鼠FⅡ酶联免疫分析试剂盒来进行检测。

样品的采集

用3.8％的柠檬酸钠溶液为抗凝剂，采集0.1μmol/kg华法林-阿司匹林治疗的大鼠的颈动脉血，与30min内于4℃1000rpm离心15min，取上清液(血浆)作为样品进行检测。

标准品的配制

从试剂盒中取出标准品，用150μL标准品稀释液稀释150μL原倍标准品，充分混合得到标准品S5，取4个1.5mL的离心管依次排列，各加入150μL样本稀释液，吸取150μL标准品S5于S4离心管中，吹打混匀，依次配得S5-S1标准品。标准品浓度分别为S5(6ng/mL)、S4(3ng/mL)、S3(1.5ng/mL)、S2(0.75ng/mL)、S1(0.375ng/mL)和S0(0ng/mL)。

分别设空白孔、标准孔、待测血清孔。在酶标包被板加50μL标准品，待测血清孔中先加40μL样品稀释液，再加10μL待测血清，轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置37℃温育30min。小心揭掉封板膜，弃去液体，洗板5次。空白孔除外每孔加入50μL酶标试剂，37℃温育30min，洗涤，每孔先加50μL显色剂A，再加50μL显色剂B，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min。每孔加50μL终止液终止反应，在15min内空白孔调零，450nm波长测量各孔的吸光度(OD值)。根据标准品的OD值绘制标准曲线，计算血清样本浓度，数据列入图6。

实验结果

从图6的数据可以看出，0.1μmol/kg华法林-阿司匹林治疗的大鼠的FII含量显著低于生理盐水治疗大鼠的FII含量(p<0.05)，即在0.1μmol/kg的剂量下华法林-阿司匹林可降低大鼠体内FII含量，并且与4.87μmol/kg华法林治疗大鼠的体内FII含量相当。可见，华法林-阿司匹林降低大鼠体内FII含量的活性比华法林强48.7倍。这是意想不到的技术效果。

实施例7华法林-阿司匹林连续给药5天大鼠100％存活

实验材料

乌拉坦(氨基甲酸乙酯，CAS：51-79-6，国药集团化学试剂有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)华法林钠(CAS：129-06-6，百灵威科技有限公司)。

实验动物

SD品系大鼠，雄性，250±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

实验方法实验采用大鼠下腔静脉结扎模型。

实验分组和剂量

本发明的华法林-阿司匹林的剂量为0.1μmol/kg，阳性对照华法林的剂量为4.87μmol/kg，阴性对照为生理盐水。

试剂配制

麻醉剂为生理盐水配制的20％的乌拉坦溶液。

大鼠实验

实验大鼠适应环境1天，以0.3mL/100g体重的剂量对大鼠灌胃，连续给药5天，最后一天给药30min后于手术前2min用20％乌拉坦溶液腹腔给药麻醉。将大鼠固定于大鼠固定板上，从颈静脉取2mL血，用于血液相关指标的测定。利用下腔静脉结扎法进行抗静脉血栓活性评价，称血栓重，用t检验统计结果。手术以每组两只交替进行。大鼠生存率见图7，连续给药后化合物抗静脉血栓活性结果见图8。

实验结果

图7表明，0.1μmol/kg华法林-阿司匹林连续给药5天，大鼠生存率为100％。4.87μmol/kg华法林连续给药4天大鼠开始死亡，连续给药5天全部死亡。尸体解剖表明，导致死亡的原因 是其颅内出血、皮下出血及胸腔出血。华法林-阿司匹林治疗大鼠并没有观察到出血现象。

图3表明，0.01μmol/kg华法林-阿司匹林的抗静脉血栓活性与4.87μmol/kg华法林的抗静脉血栓活性没有显著差异。图8表明，0.1μmol/kg华法林-阿司匹林连续给药5天仍然具有抗静脉血栓活性。可见，华法林-阿司匹林不仅抗静脉血栓活性强，而且无出血致副作用。这是意想不到的技术效果。

实施例8华法林-阿司匹林连续给药5天对大鼠出血时间无影响

实验材料

乌拉坦(氨基甲酸乙酯，CAS：51-79-6，国药集团化学试剂有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)、华法林钠(CAS：129-06-6，百灵威科技有限公司)。

实验动物

SD品系大鼠，雄性，250±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

实验方法

大鼠连续5天给药，采用鼠尾出血模型评价。4.87μmol/kg华法林或0.1μmol/kg华法林-阿司匹林连续给药5天，在最后一天给药30min后用乌拉坦溶液将大鼠麻醉，在大鼠的距鼠尾4cm处的腹侧动脉处用手术刀开一个1mm的创口，然后开始计时，每15s用滤纸将血拭去，在滤纸上不能看到任何血迹的时候停止计时，所记的时间为其出血时间，当出血时间超过30min时记录为30min。实验结果见图9。

实验结果

图9的结果表明，0.1μmol/kg华法林-阿司匹林连续给药5天，大鼠腹侧动脉的出血时间与生理盐水治疗大鼠腹侧动脉的出血时间无显著差异(p>0.05)。4.87μmol/kg华法林连续给药5天，大鼠腹侧动脉的出血时间明显长于生理盐水治疗大鼠腹侧动脉的出血时间，明显表现出血风险。

实施例9华法林-阿司匹林连续给药5天对大鼠凝血酶原时间无影响

实验材料

凝血酶原时间(PT)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)、柠檬酸钠(CAS：68-04-2，国药集团化学试剂有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)。

实验方法

取2mL实验例7大鼠的颈静脉血与3.8％柠檬酸钠水溶液以9:1均匀混合，以2500rpm离心15min，收集上层血浆，在2h内完成检测。

将凝血酶原试剂于37℃预热20min，取50μL待测血浆于硅烷化的1mLEP管中预热3min，加入100μL预热的凝血酶原试剂，立即混匀，开始计时，记录血浆凝固的时间，并用 t检验的方法进行统计分析。数据见图10。

实验结果

图10的结果表明，0.1μmol/kg华法林-阿司匹林连续给药5天，大鼠的PT与生理盐水治疗大鼠的PT无显著差异(p>0.05)。4.87μmol/kg华法林连续给药5天，大鼠大鼠的PT明显长于生理盐水治疗大鼠的PT，明显表现出血风险。

Claims (7)

1.一种华法林-阿司匹林缀合物，结构式如下：

2.制备权利要求1华法林-阿司匹林缀合物的方法，该方法包括以下步骤：

(1)冰浴下0.51g阿司匹林溶于10mL无水四氢呋喃中，加入0.02g DMAP，混合均匀得到反应液1；

(2)将0.98g华法林用10mL无水四氢呋喃中溶解，加入反应液1中搅拌5min，得到反应液2；

(3)冰浴下将0.73g DCC用10mL无水四氢呋喃中溶解并滴加到反应液2中，搅拌2小时反应结束，搅拌中有二环己基脲析出，反应结束后滤除去二环己基脲，滤液减压浓缩除去四氢呋喃，残留物用二氯甲烷溶解，滤除二环己基脲，滤液减压浓缩，层析法纯化，得0.91g华法林-阿司匹林。

3.权利要求1的华法林-阿司匹林缀合物在制备抗动脉血栓药物中的应用。

4.权利要求1的华法林-阿司匹林缀合物在制备抗静脉血栓药物中的应用。

5.权利要求1的华法林-阿司匹林缀合物在制备抑制血小板聚集药物中的应用。

6.权利要求1的华法林-阿司匹林缀合物在制备维生素K拮抗剂中的应用。

7.权利要求1的华法林-阿司匹林缀合物在制备凝血因子II拮抗剂中的应用。

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