CN104862275A - 一种细胞冻存与复苏的方法及其制备的细胞制剂 - Google Patents

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陈晓波
洪敬欣
韩洪起
武文杰
靳霞
王雪莲
张宇光
韩俊领
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Abstract

本发明公开了一种细胞冻存与复苏的方法及其制备的细胞制剂，将一份单个核细胞分别以单个核细胞与初步诱导的未成熟DC细胞方式于-196℃液氮冻存的方法，以及将冻存的单个核细胞复苏并直接诱导为CIK、将冻存的未成熟的DC细胞复苏并诱导为成熟DC细胞的方法，既能避免每次采集的单个核细胞浪费，保证细胞的活性、数量等指标，又能满足DC-CIK细胞治疗临床应用与规模化储存服务。

Description

一种细胞冻存与复苏的方法及其制备的细胞制剂
技术领域
本发明涉及一种细胞冻存与复苏的方法及其制备的细胞制剂。
背景技术
在分子生物学及生物工程技术飞速发展的推动下，以免疫细胞治疗为基础发展而来的生物治疗日益受到重视，逐步成为现代恶性肿瘤治疗中继放、化疗及手术后的第四大治疗模式。目前临床应用治疗效果较好的是DC-CIK免疫细胞治疗，也是国内细胞治疗的主流。为解决免疫细胞治疗中患者需要多次采血的问题，以及保障治疗疗程，临床上大多采用冻存外周血单个核细胞后进行免疫细胞诱导的方法，或直接CIK冻存免疫细胞的方法，一定程度上满足了临床需求。但是，这些方法也都存在各自的缺陷：第一，目前大多将每次采集的单个核细胞以单一细胞种类冻存，不能实现一次采集单个核细胞满足DC-CIK免疫细胞治疗中对DC、CIK细胞数的要求；第二，由冻存的单个核细胞直接诱导DC细胞存在诱导效率低的问题，而直接冻存诱导成熟的DC细胞则会导致细胞裂解，破坏细胞均不能满足临床对DC细胞数的要求；第三，每次采集的单个核细胞在CIK在诱导过程中不断增殖的特性，使其远远超出临床对其109细胞数量级的要求，若为节省CIK细胞制备成本就会浪费部分单个核细胞，若直接将采集的单个核细胞都进行CIK细胞诱导并冻存，则会增加冻存成本，占据液氮罐的冻存空间，近而造成浪费，不利于规模化储存服务。因此，需要一种新的冻存方法，既能避免每次采集的单个核细胞浪费，保证细胞的活性、数量等指标，又能满足DC-CIK细胞治疗临床应用与规模化储存服务。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种将一份单个核细胞分别以单个核细胞与初步诱导的未成熟DC细胞方式于-196℃液氮冻存的方法，以及将冻存的单个核细胞复苏并直接诱导为CIK、将冻存的未成熟的DC细胞复苏并诱导为成熟DC细胞的方法及其制备的细胞制剂。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种细胞冻存与复苏的方法，包括以下步骤：
A.冻存步骤
(1)离心分离外周血单个核细胞使其数量级达到109以上，并按照一定比例分装到第一离心管和第二离心管；
(2)配制单个核细胞冻存液并加入到第一离心管，程控降温后放入-80℃冰箱；
(3)将淋巴细胞培养基加入到第二离心管，混匀后将其转移到T-175培养瓶中并继续加入淋巴细胞培养基、DC细胞诱导细胞因子GM-CSF、IL-4，CO2细胞培养箱中诱导培养；
(4)将步骤(2)获得的DC细胞在-20℃冰袋放置9～11min后拍打至细胞全部悬浮，并转移到离心管离心；
(5)配制DC细胞冻存液，并加入到第二离心管混匀、分装，程控降温后放入-80℃冰箱；
(6)将冻存24～48h的单个核细胞、DC细胞转移至-196℃液氮灌保存；
B.复苏步骤
(7)将液氮冻存的单个核细胞复苏后转移到T-175培养瓶，并按照一定比例添加CIK细胞诱导培养基，于CO2培养箱培养；
(8)将液氮冻存的DC细胞复苏后转移到T-175培养瓶，并按照一定比例添加DC细胞诱导培养基，于CO2培养箱培养，并与复苏后的DC细胞混合。
所述步骤(1)按照2：1的比例分装第一离心管和第二离心管。
所述步骤(3)DC细胞诱导因子GM-CSF的添加量为终浓度1000u/ml、IL-4的添加量为终浓度1000u/ml，CO2培养箱中培养时间为3天。
所述步骤(2)单个核细胞冻存液组成为：体积比为60％预冷的1640培养基、20％的胎牛血清、20％细胞冻存保护剂。
所述步骤(5)DC细胞冻存液组成为：体积比为60％预冷的1640培养基、20％的胎牛血清和20％细胞冻存保护剂。
单核核细胞和DC细胞冻存保护剂组成为：DMSO：右旋糖苷：ddH2O按照质量比11:1:8配制。
所述DC细胞冻存浓度为(1～2)x107/ml。
所述单个核细胞冻存浓度为(2～5)x107/ml。
上述细胞冻存与复苏的方法制备的细胞制剂。
所述的细胞制剂，包括细胞数(1～9)×107的成熟DC细胞与细胞数为(1～9)×109的CIK细胞。
与现有技术相比，本发明的方法具有以下有益效果：第一，将单份外周血单个核细胞分别以单个核细胞、初步诱导DC细胞的方式分别冻存，解决了冻存后的单个核细胞向DC细胞诱导效率低的问题，提高了DC细胞的纯度，为临床应用提供了更高质量的DC细胞；第二，避免了冻存CIK细胞造成的冻存成本高、冻存空间浪费的问题；第三，可以根据患者DC-CIK细胞治疗的临床需求，进行DC、CIK的混合培养，保障了DC-CIK细胞治疗中对DC、CIK细胞数量级的要求；第四，将单个核细胞初步诱导成未成熟细胞后进行冻存，避免了冻存成熟DC细胞造成细胞裂解；第五，冻存的单个核细胞、DC细胞的复苏后，为除掉造成细胞毒性的DMSO，分别采用添加CIK诱导培养基、DC细胞诱导培养基的方法稀释DMSO，使其终浓度控制在10％以内，而不采用直接清洗细胞的方法，避免细胞渗透压高造成的细胞损伤；第六，本方法使用适合单个核细胞、DC细胞液氮冻存的复合的细胞冻存剂配置成最终的细胞冻存液，从而更好地保证冻存与复苏的存活率；第七，本方法在细胞冻存过程中采取了程控降温法冻存细胞，并且最终将细胞转移到气象液氮罐中进行长期保存，最大限度的提高了细胞的存活率和保存期限。
附图说明
图1是本发明分离获得的的PBMC的流式检测结果(CD3+CD4+:52.13％；CD3+CD8+:30.69％；CD3+CD56+:8.85％；CD3+CD56-:13.49％)。
图2是培养3天后的DC种子细胞流式检测结果(CD1a+：8.68％；CD83+：0.57％；CD86+：33.23％；CD14+：0.76％；CD19+：1.57％；CD11b+：29.88％)。
图3是CIK细胞诱导16天流式检测结果(CD3+CD56+；30.69％)。
图4是诱导成熟DC细胞流式检测图(检测成熟DC细胞表面标志物的表达情况：CD1a为75％；CD83为79％；CD86为89％)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
本发明提供了一种高效的长期保存免疫细胞的种子细胞的方法。本发明书中FBS如无特别说明，均是指体积百分数。本说明书中使用的其他百分数，如无特别说明，则依从本领域惯常使用的含义。
实施例1
1.使用淋巴细胞分离液从外周血单采机采集的新鲜细胞中分离外周血单个核细胞(PBMC)：
1)使用外周血单采机采集细胞6*109个细胞，以生理盐水稀释至300ml体积并加入肝素钠注射液至终浓度为20u/ml。
2)在两个250ml离心管中各加入75ml Ficoll淋巴细胞分离液，将300ml PBMC悬液平均分成两份分别加入到离心管中的Ficoll上层(操作轻柔以保持明显分层)。在离心机中离心，参数为：500g、19度、23分钟、启动和刹车1(本专利中所使用的离心机为THERMO公司生产的LEGEND RT+型台式离心机，所有相关参数参阅离心机说明书)。
3)离心结束后轻轻取出离心管观察液体出现明显分层，以10ml刻度吸管将两个离心管中淋巴细胞层(液体中的白膜层)分别取出至1个新的250ml离心管中并加入生理盐水至终体积200ml。在两个离心管中个取出200ul细胞悬液进行细胞计数，最终共获得2.3*109个细胞。
2.DC细胞的初步诱导分化：
1)将细胞再次离心，离心参数：300ɡ、19度、10分钟。离心结束后以50ml刻度吸管尽量吸弃全部上清后加入46ml淋巴细胞培养基重悬细胞并将2个离心管中的细胞混合至同一个中使得细胞的浓度为5*107/ml。
2)取出7.2*108个平均加入到6个T-175细胞培养瓶中并分别加入50ml淋巴细胞培养基并加入DC细胞诱导所需细胞因子GM-CSF以及IL-4。将细胞培养瓶放入CO2细胞培养箱中诱导培养。
3.CIK细胞种子细胞的冻存：
1)免疫细胞冻存液的配制：40ml预冷的1640培养基中加入14ml的胎牛血清和14ml的预冷的细胞冻存保护液(DMSO:右旋糖苷:ddH2O按照质量比11:1:8配制)混合均匀。
2)将剩余的细胞再次离心并取出5*106个细胞进行流式细胞检测(图1)，离心参数：300ɡ、19度、10分钟。离心后以50ml刻度吸管尽量吸弃全部上清后以刚刚配制的免疫细胞冻存液重悬细胞至细胞浓度2.5*107/ml并轻柔的混合均匀。
3)将细胞悬液按照4ml/支分装到4.5ml细胞冻存管中(每管共有1*108个细胞)，标记好细胞信息后将全部冻存管放入已经预冷至4℃的程序降温冻存盒中并放入-80℃冰箱中。
4.DC细胞种子细胞的回收和冻存：
1)DC细胞诱导培养3天后取出细胞培养瓶在-20℃冰袋上放置10min，然后大力拍击细胞培养瓶的细胞生长面至细胞几乎全部悬浮。
2)将6瓶细胞悬液平均转移至2个250ml离心管中，然后在每个细胞培养瓶中加入30ml预冷至4℃的生理盐水冲洗培养瓶后也加入到2个离心管中(2个250ml离心管中每管约有240ml细胞悬液)离心并取出200ul细胞悬液进行细胞计数，离心参数：300ɡ、19度、10分钟。然后取出5*106个细胞进行流式细胞检测(图2).
3)免疫细胞冻存液的配制：16ml预冷的1640培养基中加入4ml的胎牛血清和4ml的预冷的细胞冻存保护液(DMSO和右旋糖酐按照质量比10:1配制)混合均匀。
4)离心后的细胞以50ml刻度吸管尽量吸弃全部上清后以刚刚配制的免疫细胞冻存液重悬细胞至细胞浓度2.5*107/ml并轻柔的混合均匀。将细胞悬液按照4ml/支分装到4.5ml细胞冻存管中，标记好细胞信息后将全部冻存管放入已经预冷至4℃的程序降温冻存盒中并放入-80℃冰箱中。
5)24-48h后将全部冻存的CIK种子细胞和DC细胞全部转移至液氮中保存
5.复苏冻存的CIK种子细胞并按照生产流程诱导CIK细胞：
1)从液氮中取出1支冻存6个月的CIK种子细胞在37℃水浴中快速复苏后加入到1个T-175细胞培养瓶中并在培养瓶中加入50ml CIK细胞诱导培养基(基础培养基中加入血清、IL-2、IFN-r以及CD3单抗)，取出200ul细胞悬液进行细胞计数(细胞总数为9.3*107)后将细胞放入CO2培养箱中培养。
2)18-24h后将全部细胞悬液转移至1个250ml离心管中离心，离心参数：300ɡ、19度、10分钟。
3)离心后的细胞以50ml刻度吸管尽量吸弃全部上清后加入50ml新鲜的CIK细胞诱导培养基(基础培养基中加入血清、IL-2、IFN-r以及CD3单抗)，将细胞放入CO2培养箱中培养。
4)从接种后的第3天开始按照每2天倍增培养体系的扩增方法进行诱导培养至第13天(培养体系1600ml，在细胞培养袋中培养)将细胞混合均匀后细胞计数为2.0*106/ml，共获得2.6*109个细胞
5)流式细胞检测收获的细胞中CD3+CD56+细胞群的比例(图3)。
6)以诱导的CIK细胞对Hela细胞进行杀伤实验，最终的杀伤率为58％.
6.复苏DC细胞继续进行诱导培养：
1)从液氮中取出1支冻存的DC种子细胞在37℃水浴中快速复苏后接种至T-175细胞培养瓶中，并加入50ml DC细胞诱导培养基(基础培养基中加入血清、IL-4和GM-CSF)。取出200ul细胞悬液进行细胞计数(细胞总数为8.9*107)后将细胞放入CO2培养箱中培养。
2)18-24h后将全部细胞悬液转移至1个250ml离心管中离心，离心参数：300ɡ、19度、10分钟。
3)离心后的细胞以50ml刻度吸管尽量吸弃全部上清后加入50ml新鲜的DC细胞诱导培养基(基础培养基中加入血清、IL-4和GM-CSF)后将细胞放入CO2培养箱中培养。
4)细胞培养后第3天加入DC细胞成熟诱导因子TNF-a后再继续培养2天后收获所有细胞进行细胞计数共获得7.8*107个细胞流式细胞检测收获细胞中成熟DC细胞表面标志物(图4)。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (10)

1.一种细胞冻存与复苏的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.冻存步骤
(1)离心分离外周血单个核细胞使其数量级达到109以上，并按照一定比例分装到第一离心管和第二离心管；
(2)配制单个核细胞冻存液并加入到第一离心管，程控降温后放入-80℃冰箱；
(3)将淋巴细胞培养基加入到第二离心管，混匀后将其转移到T-175培养瓶中并继续加入淋巴细胞培养基、DC细胞诱导细胞因子GM-CSF、IL-4，CO2细胞培养箱中诱导培养；
(4)将步骤(2)获得的DC细胞在-20℃冰袋放置9～11min后拍打至细胞全部悬浮，并转移到离心管离心；
(5)配制DC细胞冻存液，并加入到第二离心管混匀、分装，程控降温后放入-80℃冰箱；
(6)将冻存24～48h的单个核细胞、DC细胞转移至-196℃液氮灌保存；
B.复苏步骤
(7)将液氮冻存的单个核细胞复苏后转移到T-175培养瓶，并按照一定比例添加CIK细胞诱导培养基，于CO2培养箱培养；
(8)将液氮冻存的DC细胞复苏后转移到T-175培养瓶，并按照一定比例添加DC细胞诱导培养基，于CO2培养箱培养，并与复苏后的DC细胞混合。
2.根据权利要求1所述的细胞冻存与复苏的方法，其特征在于，所述步骤(1)按照2：1的比例分装第一离心管和第二离心管。
3.根据权利要求1所述的细胞冻存与复苏的方法，其特征在于，所述步骤(3)DC细胞诱导因子GM-CSF的添加量为终浓度1000u/ml、IL-4的添加量为终浓度1000u/ml，CO2培养箱中培养时间为3天。
4.根据权利要求1所述的细胞冻存与复苏的方法，其特征在于，所述步骤(2)单个核细胞冻存液组成为：体积比为60％预冷的1640培养基、20％的胎牛血清、20％细胞冻存保护剂。
5.根据权利要求1所述的细胞冻存与复苏的方法，其特征在于，所述步骤(5)DC细胞冻存液组成为：体积比为60％预冷的1640培养基、20％的胎牛血清和20％细胞冻存保护剂。
6.根据权利要求1所述的细胞冻存与复苏的方法，其特征在于，单核核细胞和DC细胞冻存保护剂组成为：DMSO：右旋糖苷：ddH2O按照质量比11:1:8配制。
7.根据权利要求5或6所述的细胞冻存与复苏的方法，其特征在于，所述DC细胞冻存浓度为(1～2)x107/ml。
8.根据权利要求4或6所述的细胞冻存与复苏的方法，其特征在于，所述单个核细胞冻存浓度为(2～5)x107/ml。
9.一种如权利要求1～8任一项所述细胞冻存与复苏的方法制备的细胞制剂。
10.根据权利要求9所述的细胞制剂，其特征在于，包括细胞数(1～9)×107的成熟DC细胞与细胞数为(1～9)×109的CIK细胞。
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