CN109762785A - 一种高效应用于人nk细胞非滋养层体外培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法，该方法将NK细胞培养分成三个阶段，三个阶段分别为激活阶段、扩增阶段和维持培养阶段。每一段采用不同的细胞因子和抗体组合，并对相应细胞因子和抗体做了不同处理，在不同阶段对细胞密度做出了一定要求。在激活阶段采用了细胞因子包板的方式，模拟滋养层细胞与NK细胞的接触方式，加入NovoNectin增强对NK细胞的吸附；并采用MICA‑Ig重组蛋白和4‑1BBL。本发明克服了滋养层细胞的外源细胞系污染，同时提高了NK培养的效率和稳定性，培养出NK细胞纯度高，适应性高。
Description
技术领域
本发明属于分子和细胞生物学领域，特别涉及NK细胞。
背景技术
NK(natural killer，自然杀伤)细胞是一种先天免疫系统中至关重要的毒性淋巴细胞，能对病毒感染迅速做出反应，同时对肿瘤细胞有作用。不同于其他杀伤性免疫细胞，NK细胞不需要抗体或MHC(majorhistocompatibility complex，主要组织相容性复合体)就可以快速识别并对受压细胞做出免疫反应，在这一点上是独一无二的。近年来，CAR-T(Chimeric antigen receptors-T cell，嵌合抗原受体-T细胞)成为研究的热点，可以有效的治疗血液癌，但是高风险的副作用以及实体瘤中作用有限，成为CAR-T发展的限制条件。近期的几项研究表明，CAR-NK(Chimeric antigen receptors-T cell，嵌合抗原受体-NK细胞)具有更低的毒性，在实体瘤的早期研究中展示出作用，同时由于NK细胞本身不具备特异性，所以异体NK更容易被接受且更具备产业化的基础。
NK细胞由于其广谱性和高杀伤力，具有很高的应用前景，但是原代NK细胞在PBMC(peripheral bloodmononuclear cell，外周血单核细胞)中的比例较低，约5-10％，且体外扩增培养一直是个难题。目前效率最高的方法是灭活的K562滋养层细胞，经过2-3周培养NK阳性率可达到90％以上，但是灭活的滋养层细胞难以去除，很难做到治疗级别。近两年，市面上也出现了一些重组细胞因子的培养方案，大部分能稳定的做到40-50％左右的阳性率，会有大量T细胞残余，影响后续的使用效果并可能带来GVHD的风险；做到80％以上阳性率的方案，或者扩增效率一般，或者个体差异严重，高效稳定的NK非滋养层培养方案一直是难题，使得依赖于NK的治疗方案大多都处于早期研发阶段，对临床试验造成了很大的限制。
发明内容
为了解决上述现有各种方法的不足，本发明一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法。
本发明克服了滋养层细胞的外源细胞系污染，同时提高了NK培养的效率和稳定性，培养出NK细胞纯度高(85％以上)，适应性高(在一些实施例中4个志愿者两个批次均有很好的效果)。
本发明其中一方面提供了一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法，该方法将NK细胞培养分成三个阶段，三个阶段分别为激活阶段、扩增阶段和维持培养阶段。
每一段采用不同的细胞因子和抗体组合，并对相应细胞因子和抗体做了不同处理，在不同阶段对细胞密度做出了一定要求。
本发明其中一方面提供了一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法，在激活阶段采用了细胞因子包板的方式，模拟滋养层细胞与NK细胞的接触方式，加入NovoNectin增强对NK细胞的吸附；并采用MICA-Ig重组蛋白和4-1BBL。
MICA-Ig是NK细胞重要的激活因子，可以与NK细胞表面的NKG2D结合，激活NK细胞，同时该蛋白融合了IgG1FC，可以与NK表面的Fc受体结合，起到双重激活的作用；4-1BBL是很多免疫细胞的激活剂，可以起到辅助NK细胞活化的作用。
本发明其中一方面提供了一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法，在扩增阶段采用了多种因子的组合，其中使用IL15RA&IL15-Ig融合蛋白。
使用IL15RA&IL15-Ig而不是使用传统的IL-2，是为了避免4-1BBL和IL-2的搭配导致大量T细胞扩增，IL15RA和IL15的融合，提前将IL-15锚定在其中一个受体上，模拟IL15可以一端连接抗原递呈细胞，另外一端连接NK，更大程度上增强了NK的扩增。
本发明其中一方面提供了一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法，维持培养阶段使用IL-2。
维持培养阶段更换成更为廉价的IL-2，降低成本可以满足大规模扩增NK的需求。
本发明其中一方面提供了一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法，MICA-Ig以肿瘤细胞表面的人类MICA蛋白和人免疫球蛋白IgG1的Fc段融合；MICA-Ig氨基酸序列如SEQ ID No.6。
SEQ ID NO.6：
MGLGPVFLLLAGIFPFAPPGAAAEPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLTEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETEEWTMPQSSRAQTLAMNVRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWQIEGREPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
三字母形式如下：
MetGlyLeuGlyProValPheLeuLeuLeuAlaGlyIlePheProPheAlaProProGlyAlaAlaAlaGluProHisSerLeuArgTyrAsnLeuThrValLeuSerTrpAspGlySerValGlnSerGlyPheLeuThrGluValHisLeuAspGlyGlnProPheLeuArgCysAspArgGlnLysCysArgAlaLysProGlnGlyGlnTrpAlaGluAspValLeuGlyAsnLysThrTrpAspArgGluThrArgAspLeuThrGlyAsnGlyLysAspLeuArgMetThrLeuAlaHisIleLysAspGlnLysGluGlyLeuHisSerLeuGlnGluIleArgValCysGluIleHisGluAspAsnSerThrArgSerSerGlnHisPheTyrTyrAspGlyGluLeuPheLeuSerGlnAsnLeuGluThrGluGluTrpThrMetProGlnSerSerArgAlaGlnThrLeuAlaMetAsnValArgAsnPheLeuLysGluAspAlaMetLysThrLysThrHisTyrHisAlaMetHisAlaAspCysLeuGlnGluLeuArgArgTyrLeuLysSerGlyValValLeuArgArgThrValProProMetValAsnValThrArgSerGluAlaSerGluGlyAsnIleThrValThrCysArgAlaSerGlyPheTyrProTrpAsnIleThrLeuSerTrpArgGlnAspGlyValSerLeuSerHisAspThrGlnGlnTrpGlyAspValLeuProAspGlyAsnGlyThrTyrGlnThrTrpValAlaThrArgIleCysGlnGlyGluGluGlnArgPheThrCysTyrMetGluHisSerGlyAsnHisSerThrHisProValProSerGlyLysValLeuValLeuGlnSerHisTrpGlnIleGluGlyArgGluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGluMetThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys。
本发明其中一方面提供了一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法，其中4-1BBL工作浓度1～10ug/ml，NovoNectin工作浓度5～50ug/ml，MICA-Ig重组蛋白工作浓度2～20ug/ml。
本发明其中一方面提供了一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法，其中扩增阶段还使用IL-18、anti-HER2和Anti-CD16。
本发明其中一方面提供了一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法，其中IL-18工作浓度10～500ng/ml，anti-HER2工作浓度0.1～10ug/ml，Anti-CD16工作浓度0.1～10ug/ml，IL15RA&IL15融合蛋白工作浓度10～500ng/ml。
本发明其中一方面提供了一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法，其中IL-2工作浓度10ng/ml。
本发明其中一方面提供了一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法，方法步骤为：
激活阶段
取人的血液，用分离PBMC，细胞计数后调整细胞密度，将细胞加入到预先用4-1BBL、NovoNectin和MICA-Ig包板的孔板中；
扩增阶段
加入培养因子IL-18、IL15RA&IL15融合蛋白、anti-HER2和Anti-CD16培养，每次补液都含上述培养因子IL-18、IL15RA&IL15融合蛋白、anti-HER2和Anti-CD16，维持细胞密度在2X106/ml，7～9天；
维持阶段
将培养因子更换为IL-2工作浓度调整细胞密度，继续培养至细胞表型检测为经典NK表型CD3阴性CD56阳性的细胞群。
本发明的MICA-Ig为重组MICA-Ig蛋白，或称MICA-Ig重组蛋白。
附图说明
图1、为本发明其一个实施例中MICA-Ig纯化最终成品图。
图2、为本发明其一个实施例中两次NK细胞培养扩增曲线图；
图3、为本发明其中一个实施例中两次NK细胞培养表型检测图；
图4、为本发明其中一个实施例中NK介导的肿瘤细胞杀伤实验。
具体实施方式
下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。下面将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1：重组MICA-Ig真核表达载体的构建与表达纯化
一、重组MICA-Ig真核表达构建方案设计
在本发明中，以肿瘤细胞表面的人类MICA(MHC class I polypeptide-relatedsequence A，组织相容性复合体I多肽相关序列A)蛋白和人免疫球蛋白IgG1的Fc段融合为重组MICA-Ig蛋白，为使重组MICA-Ig蛋白在哺乳细胞中进行分泌表达，使用了人类MICA自身信号肽第1-23位氨基酸帮助其分泌表达，构建将人类MICA蛋白的第1-308位氨基酸与人免疫球蛋白IgG1的第99-330位氨基酸通过柔性连接肽IEGR相连。
以下序列如无特别说明皆为5’至3’。
具体地，人类MICA信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
ATGGGGCTGGGCCCGGTCTTCCTGCTTCTGGCTGGCATCTTCCCTTTTGCACCTCCGGGAGCTGCTGCT
具体地，人类MICA蛋白(1-308)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
ATGGGGCTGGGCCCGGTCTTCCTGCTTCTGGCTGGCATCTTCCCTTTTGCACCTCCGGGAGCTGCTGCTGAGCCCCACAGTCTTCGTTATAACCTCACGGTGCTGTCCTGGGATGGATCTGTGCAGTCAGGGTTTCTCACTGAGGTACATCTGGATGGTCAGCCCTTCCTGCGCTGTGACAGGCAGAAATGCAGGGCAAAGCCCCAGGGACAGTGGGCAGAAGATGTCCTGGGAAATAAGACATGGGACAGAGAGACCAGAGACTTGACAGGGAACGGAAAGGACCTCAGGATGACCCTGGCTCATATCAAGGACCAGAAAGAAGGCTTGCATTCCCTCCAGGAGATTAGGGTCTGTGAGATCCATGAAGACAACAGCACCAGGAGCTCCCAGCATTTCTACTACGATGGGGAGCTCTTCCTCTCCCAAAACCTGGAGACTGAGGAATGGACAATGCCCCAGTCCTCCAGAGCTCAGACCTTGGCCATGAACGTCAGGAATTTCTTGAAGGAAGATGCCATGAAGACCAAGACACACTATCACGCTATGCATGCAGACTGCCTGCAGGAACTACGGCGATATCTAAAATCCGGCGTAGTCCTGAGGAGAACAGTGCCCCCCATGGTGAATGTCACCCGCAGCGAGGCCTCAGAGGGCAACATTACCGTGACATGCAGGGCTTCTGGCTTCTATCCCTGGAATATCACACTGAGCTGGCGTCAGGATGGGGTATCTTTGAGCCACGACACCCAGCAGTGGGGGGATGTCCTGCCTGATGGGAATGGAACCTACCAGACCTGGGTGGCCACCAGGATTTGCCAAGGAGAGGAGCAGAGGTTCACCTGCTACATGGAACACAGCGGGAATCACAGCACTCACCCTGTGCCCTCTGGGAAAGTGCTGGTGCTTCAGAGTCATTGGCAG
所选用的柔性连接肽IEGR的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：
ATCGAGGGCCGC
人免疫球蛋白IgG1(99-330)的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：
GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCCCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
二、重组MICA-IgG1Fc真核表达载体构建
本发明重组MICA-Ig的构建与表达，选用哺乳细胞蛋白瞬时表达载体pcDNA3.1(购自上海英骏生物科技有限公司)。为构建重组蛋白分别设计了如表1所示引物，所有引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，扩增所需基因模板由南京一道生物科技有限公司合成。
针对pcDNA3.1-MICA-Ig的克隆构建，首先使用引物pcDNA3.1-MICA-F和MICA-R扩增出人类MICA基因片段，然后分别利用引物MICA-IEGR-IgG1Fc-F和pcDNA3.1-IgG1Fc-R扩增出IEGR连接肽和人类IgG1Fc基因片段。扩增完毕后，利用PCR一步定向克隆试剂盒(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)拼接MICA-Ig全长基因序列并无缝克隆至经EcoRI和HindIII线性化处理的pcDNA3.1表达载体上，转化大肠杆菌DH5，利用菌落PCR进行阳性克隆鉴定，鉴定为阳性的重组子(重组质粒)进行测序鉴定。随后将测序正确的重组子(重组质粒)安排质粒中抽，用于HEK 293F细胞的转染。
经测序获知，MICA-Ig全长基因序列正确，均与预期相符。
具体地，MICA-Ig的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示
ATGGGGCTGGGCCCGGTCTTCCTGCTTCTGGCTGGCATCTTCCCTTTTGCACCTCCGGGAGCTGCTGCTGAGCCCCACAGTCTTCGTTATAACCTCACGGTGCTGTCCTGGGATGGATCTGTGCAGTCAGGGTTTCTCACTGAGGTACATCTGGATGGTCAGCCCTTCCTGCGCTGTGACAGGCAGAAATGCAGGGCAAAGCCCCAGGGACAGTGGGCAGAAGATGTCCTGGGAAATAAGACATGGGACAGAGAGACCAGAGACTTGACAGGGAACGGAAAGGACCTCAGGATGACCCTGGCTCATATCAAGGACCAGAAAGAAGGCTTGCATTCCCTCCAGGAGATTAGGGTCTGTGAGATCCATGAAGACAACAGCACCAGGAGCTCCCAGCATTTCTACTACGATGGGGAGCTCTTCCTCTCCCAAAACCTGGAGACTGAGGAATGGACAATGCCCCAGTCCTCCAGAGCTCAGACCTTGGCCATGAACGTCAGGAATTTCTTGAAGGAAGATGCCATGAAGACCAAGACACACTATCACGCTATGCATGCAGACTGCCTGCAGGAACTACGGCGATATCTAAAATCCGGCGTAGTCCTGAGGAGAACAGTGCCCCCCATGGTGAATGTCACCCGCAGCGAGGCCTCAGAGGGCAACATTACCGTGACATGCAGGGCTTCTGGCTTCTATCCCTGGAATATCACACTGAGCTGGCGTCAGGATGGGGTATCTTTGAGCCACGACACCCAGCAGTGGGGGGATGTCCTGCCTGATGGGAATGGAACCTACCAGACCTGGGTGGCCACCAGGATTTGCCAAGGAGAGGAGCAGAGGTTCACCTGCTACATGGAACACAGCGGGAATCACAGCACTCACCCTGTGCCCTCTGGGAAAGTGCTGGTGCTTCAGAGTCATTGGCAGATCGAGGGCCGCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCCCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
表1.MICA-Ig基因克隆中使用的引物
实施例2：重组MICA-Ig的表达与纯化
一、重组MICA-Ig的表达
1.1.HEK 293F细胞(购自Thermo Fisher Scientific公司)转染前1天传代密度为0.5～0.6×106/ml；
1.2.转染当天进行细胞密度统计，当密度为1～1.4×106/ml、活力>90％时，可用于质粒转染；
1.3.转染复合物配制：
需准备两个离心管/培养瓶，以20ml为例，分别放置，取实施例1中所制备重组质粒：
管①中加入600μl PBS，20μg重组质粒，混匀；
管②中加入600μl PBS，20ul FreeStyleTMMAX Transfection Reagent(购自Thermo Fisher Scientific公司)，混匀；
1.4.将稀释后的转染试剂，加入至稀释后的重组质粒中，混合均匀，配制成转染复合物；
1.5.转染复合物静置15～20min后，单滴匀速加入细胞培养物中；
1.6.于37℃，CO2浓度8％，摇床转速130rpm条件下进行转染后细胞培养，5天后收集培养上清进行目的蛋白表达检测。
二、重组MICA-Ig的纯化
2.1样品预处理
取上述转染后细胞培养上清20ml，加入缓冲液20mM PB，200mM NaCl调节pH至7.5；
2.2Protein A亲和层析柱纯化
蛋白纯化层析柱：Protein A亲和层析柱(购自GE Healthcare公司，柱体积1.0ml)
缓冲液A(Buffer A)：PBS，pH7.4
缓冲液B(Buffer B)：0.1M Glycine,pH3.0
缓冲液C(Buffer C)：0.1M Glycine,pH2.7
纯化过程：采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(购自GE Healthcare公司)，用Buffer A预处理Protein A亲和层析柱，取培养上清上样，收集流出液。上样完毕后，用至少1.5ml Buffer A平衡层析柱，平衡后分别用Buffer B和Buffer C洗脱，收集目的蛋白洗脱液(洗脱液的收集管需要预先加入1％的1M Tris,pH8.0来中和洗脱液pH值，Tris终浓度约为10mM)，最后浓缩透析至缓冲液PBS中。
最终纯化的MICA-Ig重组蛋白经SDS-PAGE分析，还原和非还原条件下电泳图如图1所示。从图中可以看出，经ProteinA亲和层析柱纯化后，MICA-IgG1Fc重组蛋白的纯度均>95％：重组MICA-IgG1Fc蛋白的理论分子量为59.4kDa，由于糖基化的影响，还原条件下，目标蛋白条带迁移至60-90kDa，由于IgG1Fc的融合非还原条件下，目标蛋白呈现二聚体的形式(图1)，说明两个蛋白分子可通过IgG1铰链区形成二硫键相互连接，因此呈现二聚体形式。
此外，纯化的重组蛋白样品经N/C末端序列分析，结果表明所表达的重组蛋白样品均读框无误，与理论N/C末端氨基酸序列一致，质谱分析进一步确认MICA-Ig重组蛋白为二聚体形式。
因此，可得知，MICA-Ig重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示
MGLGPVFLLLAGIFPFAPPGAAAEPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLTEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETEEWTMPQSSRAQTLAMNVRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWQIEGREPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
三字母形式如下：
MetGlyLeuGlyProValPheLeuLeuLeuAlaGlyIlePheProPheAlaProProGlyAlaAlaAlaGluProHisSerLeuArgTyrAsnLeuThrValLeuSerTrpAspGlySerValGlnSerGlyPheLeuThrGluValHisLeuAspGlyGlnProPheLeuArgCysAspArgGlnLysCysArgAlaLysProGlnGlyGlnTrpAlaGluAspValLeuGlyAsnLysThrTrpAspArgGluThrArgAspLeuThrGlyAsnGlyLysAspLeuArgMetThrLeuAlaHisIleLysAspGlnLysGluGlyLeuHisSerLeuGlnGluIleArgValCysGluIleHisGluAspAsnSerThrArgSerSerGlnHisPheTyrTyrAspGlyGluLeuPheLeuSerGlnAsnLeuGluThrGluGluTrpThrMetProGlnSerSerArgAlaGlnThrLeuAlaMetAsnValArgAsnPheLeuLysGluAspAlaMetLysThrLysThrHisTyrHisAlaMetHisAlaAspCysLeuGlnGluLeuArgArgTyrLeuLysSerGlyValValLeuArgArgThrValProProMetValAsnValThrArgSerGluAlaSerGluGlyAsnIleThrValThrCysArgAlaSerGlyPheTyrProTrpAsnIleThrLeuSerTrpArgGlnAspGlyValSerLeuSerHisAspThrGlnGlnTrpGlyAspValLeuProAspGlyAsnGlyThrTyrGlnThrTrpValAlaThrArgIleCysGlnGlyGluGluGlnArgPheThrCysTyrMetGluHisSerGlyAsnHisSerThrHisProValProSerGlyLysValLeuValLeuGlnSerHisTrpGlnIleGluGlyArgGluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGluMetThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys
具体地，所选用信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示
MGLGPVFLLLAGIFPFAPPGAAA
三字母如下：
MetGlyLeuGlyProValPheLeuLeuLeuAlaGlyIlePheProPheAlaProProGlyAlaAlaAla
所表达人MICA的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示
MGLGPVFLLLAGIFPFAPPGAAAEPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLTEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETEEWTMPQSSRAQTLAMNVRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWQ
三字母形式如下：
MetGlyLeuGlyProValPheLeuLeuLeuAlaGlyIlePheProPheAlaProProGlyAlaAlaAlaGluProHisSerLeuArgTyrAsnLeuThrValLeuSerTrpAspGlySerValGlnSerGlyPheLeuThrGluValHisLeuAspGlyGlnProPheLeuArgCysAspArgGlnLysCysArgAlaLysProGlnGlyGlnTrpAlaGluAspValLeuGlyAsnLysThrTrpAspArgGluThrArgAspLeuThrGlyAsnGlyLysAspLeuArgMetThrLeuAlaHisIleLysAspGlnLysGluGlyLeuHisSerLeuGlnGluIleArgValCysGluIleHisGluAspAsnSerThrArgSerSerGlnHisPheTyrTyrAspGlyGluLeuPheLeuSerGlnAsnLeuGluThrGluGluTrpThrMetProGlnSerSerArgAlaGlnThrLeuAlaMetAsnValArgAsnPheLeuLysGluAspAlaMetLysThrLysThrHisTyrHisAlaMetHisAlaAspCysLeuGlnGluLeuArgArgTyrLeuLysSerGlyValValLeuArgArgThrValProProMetValAsnValThrArgSerGluAlaSerGluGlyAsnIleThrValThrCysArgAlaSerGlyPheTyrProTrpAsnIleThrLeuSerTrpArgGlnAspGlyValSerLeuSerHisAspThrGlnGlnTrpGlyAspValLeuProAspGlyAsnGlyThrTyrGlnThrTrpValAlaThrArgIleCysGlnGlyGluGluGlnArgPheThrCysTyrMetGluHisSerGlyAsnHisSerThrHisProValProSerGlyLysValLeuValLeuGlnSerHisTrpGln
所表达的连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示
IEGR
三字母如下：
IleGluGlyArg
所融合的人IgG1Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
三字母如下：
GluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProIleGluLysThrIleSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGluMetThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys
如图1所示的MICA-Ig纯化最终成品图(纯化的MICA-Ig SDS-PAGE分析图)其中MK：分子量蛋白Marker；R：还原性MICA-Ig；NR：非还原性MICA-Ig.
实施例5 NK细胞体外扩增培养
取2支健康志愿者的血液，用Ficoll(购自GE)分离PBMC，细胞计数后将细胞密度用X vivo 15(购自Lonza公司)培养基调整到2X106/ml，将细胞加入到预先用4-1BBL工作浓度1-10ug/ml(货号：CS18，购自上海近岸科技有限公司)、NovoNectin工作浓度5-50ug/ml(货号：CH38，购自上海近岸科技有限公司)和MICA-Ig(使用上述实施例1～4方法自制)工作浓度2-20ug/ml包板的孔板中，根据孔板的大小来决定的(例如24孔板就是0.5ml，6孔板就是2ml)。加入培养因子IL-18工作浓度10-500ng/ml(货号：CD72，购自上海近岸科技有限公司)、IL15RA&IL15融合蛋白(自制)工作浓度10-500ng/ml、anti-HER2工作浓度0.1-10ug/ml(货号：GMP-A062，购自上海近岸生物科技有限公司)和Anti-CD16工作浓度0.1-10ug/ml(货号：GMP-A091，购自上海近岸生物科技有限公司)培养，每次补液都含上述培养因子，维持细胞密度在2X106/ml，7-9天后，将培养因子更换为IL-2工作浓度10ng/ml(货号：CD66，购自上海近岸科技有限公司)调整细胞密度到1X106/ml继续培养到21天，统计细胞增殖倍数和细胞表型，细胞表型检测经典NK表型CD3阴性CD56阳性的细胞群。另取2支健康志愿者的血重复该实验，验证实验的稳定性。
结果如图2和3显示，第一批实验志愿者1和志愿者2培养21天的纯PBMC扩增倍数分别是401和463倍，NK比例(CD3-CD56+)分别是87.66％和86.12％；第二批志愿者3和志愿者4培养21天的纯PBMC的扩增倍数分别是601和488，NK比例(CD3-CD56+)分别是91.5％和87.74％。PBMC的扩增21天均超过400倍，纯NK细胞的比例均达到85％以上，而且结果可以重复。
图2中志愿者1和2为第一次实验样本，志愿者3和4为重复试验样本，细胞培养21天，在第0、3、7、9、11、14、16、18和21天取样计数。
细胞培养21天，检测表型结果如图3；图3-A：志愿者1检测的表型图；图3-B：志愿者2检测的表型图；图3-C：志愿者3检测的表型图；图3-D：志愿者4检测的表型图。
实施例5 NK细胞体外杀伤肿瘤细胞
取1X106/ml的人淋巴瘤细胞系Raji-GFP(实验室自制Raji带有绿色荧光蛋白的稳定细胞株)作为靶细胞加入24孔板中，每孔500ul，加入500ul上述培养的志愿者1培养21天的NK细胞作为效应细胞，调整效靶比分别为0：1、0.25：1、0.5：1和1：1，将混合细胞放入培养箱中培养24h，流式检测剩余GFP阳性的细胞，计算细胞杀伤效率。培养基选择适合Raji-GFP生长的90％RPMI 1640+10％FBS完全培养基。
结果显示，杀伤24h后，效靶比1：1基本上没有了GFP阳性的细胞，而只加肿瘤细胞并没有自己死亡的情况，代入杀伤效率计算公式：
杀伤效率(％)＝总死亡的肿瘤细胞数/总加入的肿瘤细胞数X100％
总死亡的肿瘤细胞数＝总加入的肿瘤细胞数-总加入的细胞数X荧光细胞比例
计算得杀伤效率：效靶比为0.25：1时，杀伤效率为56.75％；效靶比为0.5：1时，杀伤效率为87.55％；效靶比为1：1时，杀伤效率为98.6％。
如图4：NK介导的肿瘤细胞杀伤实验图所示；图4-A：纯Raji-GFP细胞；图4-B：效靶比0.25：1时细胞的流式检测结果；图4-C：效靶比0.5：1时细胞的流式检测结果；图4-D：效靶比1：1时细胞的流式检测结果。
上述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。
序列表
<110> 吴江近岸蛋白质科技有限公司
<120> 一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法
<130> 2018
<141> 2018
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 69
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atggggctgg gcccggtctt cctgcttctg gctggcatct tcccttttgc acctccggga 60
gctgctgct 69
<210> 2
<211> 924
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atggggctgg gcccggtctt cctgcttctg gctggcatct tcccttttgc acctccggga 60
gctgctgctg agccccacag tcttcgttat aacctcacgg tgctgtcctg ggatggatct 120
gtgcagtcag ggtttctcac tgaggtacat ctggatggtc agcccttcct gcgctgtgac 180
aggcagaaat gcagggcaaa gccccaggga cagtgggcag aagatgtcct gggaaataag 240
acatgggaca gagagaccag agacttgaca gggaacggaa aggacctcag gatgaccctg 300
gctcatatca aggaccagaa agaaggcttg cattccctcc aggagattag ggtctgtgag 360
atccatgaag acaacagcac caggagctcc cagcatttct actacgatgg ggagctcttc 420
ctctcccaaa acctggagac tgaggaatgg acaatgcccc agtcctccag agctcagacc 480
ttggccatga acgtcaggaa tttcttgaag gaagatgcca tgaagaccaa gacacactat 540
cacgctatgc atgcagactg cctgcaggaa ctacggcgat atctaaaatc cggcgtagtc 600
ctgaggagaa cagtgccccc catggtgaat gtcacccgca gcgaggcctc agagggcaac 660
attaccgtga catgcagggc ttctggcttc tatccctgga atatcacact gagctggcgt 720
caggatgggg tatctttgag ccacgacacc cagcagtggg gggatgtcct gcctgatggg 780
aatggaacct accagacctg ggtggccacc aggatttgcc aaggagagga gcagaggttc 840
acctgctaca tggaacacag cgggaatcac agcactcacc ctgtgccctc tgggaaagtg 900
ctggtgcttc agagtcattg gcag 924
<210> 3
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221>
<223> 柔性连接肽
<400> 3
atcgagggcc gc 12
<210> 4
<211> 696
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420
gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 600
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggccct gcacaaccac 660
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 696
<210> 5
<211> 1635
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221>
<223> 根据本发明NK细胞培养方法需要设计
<400> 5
atggggctgg gcccggtctt cctgcttctg gctggcatct tcccttttgc acctccggga 60
gctgctgctg agccccacag tcttcgttat aacctcacgg tgctgtcctg ggatggatct 120
gtgcagtcag ggtttctcac tgaggtacat ctggatggtc agcccttcct gcgctgtgac 180
aggcagaaat gcagggcaaa gccccaggga cagtgggcag aagatgtcct gggaaataag 240
acatgggaca gagagaccag agacttgaca gggaacggaa aggacctcag gatgaccctg 300
gctcatatca aggaccagaa agaaggcttg cattccctcc aggagattag ggtctgtgag 360
atccatgaag acaacagcac caggagctcc cagcatttct actacgatgg ggagctcttc 420
ctctcccaaa acctggagac tgaggaatgg acaatgcccc agtcctccag agctcagacc 480
ttggccatga acgtcaggaa tttcttgaag gaagatgcca tgaagaccaa gacacactat 540
cacgctatgc atgcagactg cctgcaggaa ctacggcgat atctaaaatc cggcgtagtc 600
ctgaggagaa cagtgccccc catggtgaat gtcacccgca gcgaggcctc agagggcaac 660
attaccgtga catgcagggc ttctggcttc tatccctgga atatcacact gagctggcgt 720
caggatgggg tatctttgag ccacgacacc cagcagtggg gggatgtcct gcctgatggg 780
aatggaacct accagacctg ggtggccacc aggatttgcc aaggagagga gcagaggttc 840
acctgctaca tggaacacag cgggaatcac agcactcacc ctgtgccctc tgggaaagtg 900
ctggtgcttc agagtcattg gcagatcgag ggccgcgagc ccaaatcttg tgacaaaact 960
cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 1020
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 1080
gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 1140
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 1200
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1260
tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1320
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1380
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1440
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1500
ttcttcctct atagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1560
tcatgctccg tgatgcatga ggccctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1620
tctccgggta aatga 1635
<210> 6
<211> 544
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221>
<223> 根据本发明NK细胞培养需求设计
<400> 6
Met Gly Leu Gly Pro Val Phe Leu Leu Leu Ala Gly Ile Phe Pro Phe
1 5 10 15
Ala Pro Pro Gly Ala Ala Ala Glu Pro His Ser Leu Arg Tyr Asn Leu
20 25 30
Thr Val Leu Ser Trp Asp Gly Ser Val Gln Ser Gly Phe Leu Thr Glu
35 40 45
Val His Leu Asp Gly Gln Pro Phe Leu Arg Cys Asp Arg Gln Lys Cys
50 55 60
Arg Ala Lys Pro Gln Gly Gln Trp Ala Glu Asp Val Leu Gly Asn Lys
65 70 75 80
Thr Trp Asp Arg Glu Thr Arg Asp Leu Thr Gly Asn Gly Lys Asp Leu
85 90 95
Arg Met Thr Leu Ala His Ile Lys Asp Gln Lys Glu Gly Leu His Ser
100 105 110
Leu Gln Glu Ile Arg Val Cys Glu Ile His Glu Asp Asn Ser Thr Arg
115 120 125
Ser Ser Gln His Phe Tyr Tyr Asp Gly Glu Leu Phe Leu Ser Gln Asn
130 135 140
Leu Glu Thr Glu Glu Trp Thr Met Pro Gln Ser Ser Arg Ala Gln Thr
145 150 155 160
Leu Ala Met Asn Val Arg Asn Phe Leu Lys Glu Asp Ala Met Lys Thr
165 170 175
Lys Thr His Tyr His Ala Met His Ala Asp Cys Leu Gln Glu Leu Arg
180 185 190
Arg Tyr Leu Lys Ser Gly Val Val Leu Arg Arg Thr Val Pro Pro Met
195 200 205
Val Asn Val Thr Arg Ser Glu Ala Ser Glu Gly Asn Ile Thr Val Thr
210 215 220
Cys Arg Ala Ser Gly Phe Tyr Pro Trp Asn Ile Thr Leu Ser Trp Arg
225 230 235 240
Gln Asp Gly Val Ser Leu Ser His Asp Thr Gln Gln Trp Gly Asp Val
245 250 255
Leu Pro Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Ala Thr Arg Ile
260 265 270
Cys Gln Gly Glu Glu Gln Arg Phe Thr Cys Tyr Met Glu His Ser Gly
275 280 285
Asn His Ser Thr His Pro Val Pro Ser Gly Lys Val Leu Val Leu Gln
290 295 300
Ser His Trp Gln Ile Glu Gly Arg Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
305 310 315 320
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
325 330 335
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
340 345 350
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
355 360 365
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
370 375 380
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
385 390 395 400
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
405 410 415
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
420 425 430
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
435 440 445
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
450 455 460
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
465 470 475 480
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
485 490 495
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
500 505 510
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
515 520 525
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
530 535 540
<210> 7
<211> 23
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Met Gly Leu Gly Pro Val Phe Leu Leu Leu Ala Gly Ile Phe Pro Phe
1 5 10 15
Ala Pro Pro Gly Ala Ala Ala
20
<210> 8
<211> 308
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221>
<223> 根据需求设计
<400> 8
Met Gly Leu Gly Pro Val Phe Leu Leu Leu Ala Gly Ile Phe Pro Phe
1 5 10 15
Ala Pro Pro Gly Ala Ala Ala Glu Pro His Ser Leu Arg Tyr Asn Leu
20 25 30
Thr Val Leu Ser Trp Asp Gly Ser Val Gln Ser Gly Phe Leu Thr Glu
35 40 45
Val His Leu Asp Gly Gln Pro Phe Leu Arg Cys Asp Arg Gln Lys Cys
50 55 60
Arg Ala Lys Pro Gln Gly Gln Trp Ala Glu Asp Val Leu Gly Asn Lys
65 70 75 80
Thr Trp Asp Arg Glu Thr Arg Asp Leu Thr Gly Asn Gly Lys Asp Leu
85 90 95
Arg Met Thr Leu Ala His Ile Lys Asp Gln Lys Glu Gly Leu His Ser
100 105 110
Leu Gln Glu Ile Arg Val Cys Glu Ile His Glu Asp Asn Ser Thr Arg
115 120 125
Ser Ser Gln His Phe Tyr Tyr Asp Gly Glu Leu Phe Leu Ser Gln Asn
130 135 140
Leu Glu Thr Glu Glu Trp Thr Met Pro Gln Ser Ser Arg Ala Gln Thr
145 150 155 160
Leu Ala Met Asn Val Arg Asn Phe Leu Lys Glu Asp Ala Met Lys Thr
165 170 175
Lys Thr His Tyr His Ala Met His Ala Asp Cys Leu Gln Glu Leu Arg
180 185 190
Arg Tyr Leu Lys Ser Gly Val Val Leu Arg Arg Thr Val Pro Pro Met
195 200 205
Val Asn Val Thr Arg Ser Glu Ala Ser Glu Gly Asn Ile Thr Val Thr
210 215 220
Cys Arg Ala Ser Gly Phe Tyr Pro Trp Asn Ile Thr Leu Ser Trp Arg
225 230 235 240
Gln Asp Gly Val Ser Leu Ser His Asp Thr Gln Gln Trp Gly Asp Val
245 250 255
Leu Pro Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Ala Thr Arg Ile
260 265 270
Cys Gln Gly Glu Glu Gln Arg Phe Thr Cys Tyr Met Glu His Ser Gly
275 280 285
Asn His Ser Thr His Pro Val Pro Ser Gly Lys Val Leu Val Leu Gln
290 295 300
Ser His Trp Gln
305
<210> 9
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221>
<223> 根据需求设计
<400> 9
Ile Glu Gly Arg
1
<210> 10
<211> 232
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221>
<223> 根据需求设计
<400> 10
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 11
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
gtgctggata tctgcagaat tcgccgccac catggggctg ggcccggtct tc 52
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
ctgccaatga ctctgaagca c 21
<210> 13
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
gtgcttcaga gtcattggca gatcgagggc cgcgagccca aatcttgtga caaaac 56
<210> 14
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
ctgatcagcg gtttaaactt aagctttcat ttacccggag acagggagag 50
Claims (10)
1.一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法，其特征在于，所述方法将NK细胞培养分成三个阶段，所述三个阶段为激活阶段、扩增阶段和维持培养阶段。
2.根据权利要求1所述的一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法，其特征在于，所述激活阶段采用了细胞因子包板的方式，模拟滋养层细胞与NK细胞的接触方式，加入NovoNectin增强对NK细胞的吸附；并采用MICA-Ig重组蛋白和4-1BBL。
3.根据权利要求1所述的一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法，其特征在于，所述扩增阶段采用了多种因子的组合，其中使用IL15RA&IL15-Ig融合蛋白。
4.根据权利要求1所述的一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法，其特征在于，所述维持培养阶段使用IL-2。
5.根据权利要求2所述的一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法，其特征在于，所述MICA-Ig以肿瘤细胞表面的人类MICA蛋白和人免疫球蛋白IgG1的Fc段融合；所述MICA-Ig氨基酸序列如SEQ ID No.6。
6.根据权利要求2所述的一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法，其特征在于，所述4-1BBL工作浓度1～10ug/ml，所述NovoNectin工作浓度5～50ug/ml，所述MICA-Ig重组蛋白工作浓度2～20ug/ml。
7.根据权利要求3所述的一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法，其特征在于，所述扩增阶段还使用IL-18、anti-HER2和Anti-CD16。
8.根据权利要求7所述的一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法，所述IL-18工作浓度10～500ng/ml，所述anti-HER2工作浓度0.1～10ug/ml，所述Anti-CD16工作浓度0.1～10ug/ml，所述IL15RA&IL15融合蛋白工作浓度10～500ng/ml。
9.根据权利要求4所述的一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法，所述IL-2工作浓度10ng/ml。
10.根据权利要求1～9所述的任意一种高效应用于人NK细胞非滋养层体外培养的方法，所述方法步骤为：
激活阶段
取人的血液，用分离PBMC，细胞计数后调整细胞密度，将细胞加入到预先用4-1BBL、NovoNectin和MICA-Ig包板的孔板中；
扩增阶段
加入培养因子IL-18、IL15RA&IL15融合蛋白、anti-HER2和Anti-CD16培养，每次补液都含上述培养因子IL-18、IL15RA&IL15融合蛋白、anti-HER2和Anti-CD16，维持细胞密度在2X106/ml，7～9天；
维持阶段
将培养因子更换为IL-2工作浓度调整细胞密度，继续培养至细胞表型检测为经典NK表型CD3阴性CD56阳性的细胞群。
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