CN115381849A - 抗口腔肿瘤药物活性成分及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于治疗/预防口腔肿瘤药物的活性成分及其用途。所述的活性成分从SEQIDNO.1～SEQIDNO.6出发，可以为SEQIDNO.1～SEQIDNO.6的衍生物等，上述活性成分可参与调节基因的表达，具有治疗/预防口腔肿瘤的作用；这些活性miRNA可能调节免疫细胞的早期发育，影响免疫细胞发育及分化；活性miRNA可能参与免疫功能的调控，对口腔肿瘤具有治疗/预防作用。本发明提出的活性miRNA在脂质体中的转染效率高，转染后的抗肿瘤效果显著。

Description

抗口腔肿瘤药物活性成分及其用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及相关的活性成分在制备治疗/预防口腔肿瘤药物上的用途。
背景技术
口腔肿瘤(Oral Cancer)是一种较为常见、严重危及健康和生存质量的恶性肿瘤，高发于亚洲地区。根据GLOBOCAN在2020年做的统计，口腔肿瘤的全球新增病例为37713例，其中亚洲人口占65.8％，2020年全球口腔肿瘤患者死亡率为177757例，其中亚洲占74％。口腔肿瘤的治疗主要包括外科手术切除、放射治疗、化学治疗或几种抗癌疗法的结合。近年来，尽管口腔肿瘤在影像学诊断、手术技术、放化疗以及全身疗法等方面取得了长足的进步，但口腔肿瘤患者的5年内生存率仍不理想。特别需要关注的是，在过去的三十年间口腔肿瘤的生存率一直未能得到改善。其中主要的原因之一是用于治疗口腔肿瘤的一线化疗药物在使用后会诱导使肿瘤出现耐药性，而耐药口腔肿瘤不仅对抗癌治疗有更强的抵抗力，其增殖、侵袭的能力也随之上升，导致癌灶向邻近组织浸润甚至发生远处转移。临床上通常使用多药联用的方法来克服肿瘤细胞对单一药物的耐药性。然而，肿瘤多药耐药性的出现显著削弱了联合治疗策略的收益。因此，寻找具有抗口腔肿瘤作用的新型活性成分和开发新型药物对口腔肿瘤的临床治疗及患者预后至关重要。 miRNA作为治疗包括肿瘤在内的多种人类疾病的候选药物类型之一，是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，其在人体内具有多种重要的调节作用，采用miRNA单独及联合治疗有望缓解或克服棘手的肿瘤的耐药问题。目前已有相关的临床研究，但只局限于淋巴瘤、黑色素等少量癌种。
自然杀伤细胞(Natural Killer cells，NK细胞)来源于骨髓淋巴样干细胞，可以诱导病毒感染的细胞和肿瘤细胞的细胞溶解活性(无需预先敏化或活化)。NK-92是生长、增殖依赖于IL-2的人源性NK细胞株，NK-92MI是源自NK-92 细胞株、经基因转染得到的IL-2非依赖性NK细胞株。两株人源性NK细胞株可以方便和经济地实现稳定、大量、长期扩增，并已被证实对很多恶性肿瘤具有细胞毒性。
细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)是由细胞释放的各种具有膜结构的囊泡的统称。科学家们最早于1983年从绵羊网织红细胞中分离出携带亲本细胞成分的细胞外囊泡，并且广泛存在于体液中。由于外泌体携带有核酸、脂质等重要生物分子，因此其在癌症的早期诊断、预后和治疗中具有巨大的临床应用潜力。此外，外泌体作为miRNA和治疗剂转移至靶细胞的药物递送载体，与合成载体相比，这些纳米囊泡具有更高的安全性和稳定性，这为癌症治疗中的靶向药物输送提供了可能。
本发明利用两种人源性NK细胞株NK-92和NK-92MI作为获取NK细胞分泌的细胞外囊泡的来源。
发明内容
鉴于上述背景技术，本发明的目的是提供一种活性成分及其在制备治疗/ 预防口腔肿瘤药物上的用途。
经研究，本发明提供如下技术方案：一种用于制备抗口腔肿瘤药物的活性成分，选自以下之一：
(a)序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.6任一项所示的miRNA-X，或所述 miRNA-X的任意组合，或经修饰的miRNA-X衍生物；
SEQ ID NO.1(bta-miR-2478-L-2):ATCCCACTTCTGACACCA；
SEQ ID NO.2(hsa-miR-1260a):ATCCCACCTCTGCCACCA；
SEQ ID NO.3(hsa-miR-197-3p):TTCACCACCTTCTCCACCCAGC；
SEQ ID NO.4(hsa-miR-296-5p):AGGGCCCCCCCTCAATCCTGT；
SEQ ID NO.5(hsa-miR-339-5p):TCCCTGTCCTCCAGGAGCTCACG；
SEQ ID NO.6(hsa-miR-223-3p):TGTCAGTTTGTCAAATACCCCA
(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的 miRNA-X；
(c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体 miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；
(d)表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的miRNA-X的微小RNA、或 (b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；
(e)所述(a)中所述的微小RNA的激动剂。
经试验研究发现，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示的miRNA-X的联合使用，对于口腔肿瘤细胞具有更为显著的抑制作用：
具体的，激动剂选自下组：促进miRNA-X表达的物质、提高miRNA-X 活性的物质。
本发明还提供上述一种活性成分的用途，所述的活性成分用于制备一药物，所述药物用于治疗/预防口腔肿瘤。所述的药物还可以含有上述活性成分，和药学上可接受的载体。
具体的，所述的药物的制剂形式为冻干粉针、微针、注射剂、片剂、贴剂、胶囊、口服混悬液、或介入栓塞用微球。
具体的，所述药物的递送方法有：转载法、装载药物法、直接裸RNA 注射法、脂质体包裹RNA直接注射法和纳米材料组装法等阳离子材料复合物递送，以及细菌携带质粒表达RNA法、病毒包装表达RNA法等递送方式。
本发明的有益效果在于：本发明首次对NK-92细胞、NK-92MI细胞分泌的细胞外囊泡进行三级分离，获得两组包括大中小三种尺寸的细胞外囊泡，然后利用NK-92细胞、NK-92MI细胞的miRNA序列和两组细胞外囊泡的 miRNA序列组成的大样本进行活性筛选，获得对口腔肿瘤细胞杀伤力强的活性miRNA。通过本发明获得的活性miRNA可参与调节基因的表达，在治疗 /预防口腔肿瘤中具有一定的优势，尤其是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3联合使用时优势更为显著；这些活性miRNA可能调节免疫细胞的早期发育，影响免疫细胞发育及分化；活性miRNA可能参与免疫功能的调控，对口腔肿瘤具有治疗/预防作用。本发明提出的活性miRNA在脂质体中的转染效率高，转染后的抗肿瘤效果显著。
附图说明
图1NK-92和NK-92MI两种细胞株提取不同尺寸细胞外囊泡的流程图；
图2NK-92和NK-92MI细胞株分泌的不同尺寸细胞外囊泡的电镜图；
图3NK-92和NK-92MI细胞株分泌的不同尺寸细胞外囊泡的粒径图；
图4NK-92和NK-92MI细胞株的抗口腔肿瘤效果图；
图5NK-92和NK-92MI细胞株的miRNA生信分析图；
图6NK-92和NK-92MI细胞株分别分泌的不同尺寸细胞外囊泡抗口腔肿瘤效果图；
图7NK-92和NK-92MI细胞株分别分泌的不同尺寸细胞外囊泡miRNA 生信分析图；
图8活性miRNA-X mimics(模拟物)及miRNA-X inhibitors(抑制剂) 转染效果图；
图9活性miRNA-X的mimics(模拟物)及miRNA-X inhibitors(抑制剂)转染后抗口腔肿瘤的效果图；
图10活性miRNA-X的mimics(模拟物)联合转染后抗口腔肿瘤的效果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照试剂制造厂商所建议的条件进行。
实施例1.活性miRNA-X筛选
本实施例中，使用的细胞株均为人源性细胞株，全部购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(National Collection of Authenticated Cell Cultures，国家模式与特色实验细胞资源库)。
人免疫细胞株NK-92所使用的培养液成分为：添加12.5％马血清(Gibco， CA，USA)和12.5％胎牛血清(Gibco，CA，USA)的MEM-α(Hyclone， UT，USA)，以及0.2mM肌醇(Sigma，DA，DE)，0.1mMβ巯基乙醇 (Sigma，DA，DE)，0.02mM叶酸(Sigma，DA，DE)和200U/mL重组 IL-2(Novoprotein，SHH，CN)。
人免疫细胞株NK-92MI的培养液成分与上述NK-92细胞株的培养液成分相似，但不含重组IL-2。
人口腔肿瘤细胞株KB在含有10％正常胎牛血清和1％青霉素-链霉素 (Yeasen，SHH，CN)的DMEM培养基(Gibco，CA，USA)中培养。
所有细胞株在保持37℃、含有5％CO2及湿润环境的细胞培养箱 (Thermo FisherScientific，MA，USA)中进行培养。
1.1细胞外囊泡(EVs)的分离、获取及纯化
无外泌体的培养液制备：将血清(含有1:1混合的马血清和胎牛血清) 与MEM-α培养液按1:4体积比混合后，平均分装到超速离心管(规格：25× 89mm)中并配平，将超速离心管放入超速离心机中在4℃条件下以离心力 120000g离心16h(超离转子：SW32 Ti，Beckman，CA，USA)，离心结束后收集到的上清液即为无外泌体的培养液。
NK-92和NK-92MI细胞株分别在上述无外泌体的培养液(无EVs的培养液)中培养2-3天，随后分别进行下述三部分实验操作，以分别获取细胞外囊泡LEV(LargeExtracellular Vesicle)、细胞外囊泡EXO(Exosome)及细胞外囊泡SEV(SmallExtracellular Vesicle)。
1.1.1细胞外囊泡LEV的分离与获取：①分别收集两株细胞培养2-3天后的培养液，在4℃条件下以离心力400g离心10min，收集上清液；②将上清液在4℃条件下以离心力2000g离心20min，弃去底部的沉淀(沉淀为细胞和碎片)，收集上清液；③将获得的上清液在4℃条件下以离心力10000g 离心30min，然后将离心获得的沉淀用磷酸盐缓冲液(PBS)在4℃条件下以离心力10000g离心30min以洗涤沉淀，最后获得的沉淀分别为来源于两株免疫细胞株的LEV，即NK-92LEV和NK-92MI LEV(如图2；图3)；④分别用50-100μL PBS轻轻吹打、溶解和混匀LEV沉淀，并存放于-80℃。
1.1.2细胞外囊泡EXO的分离与获取：①将1.1.1.实验操作③中以在4℃条件下离心力10000g离心30min后得到的上清液用直径为0.22μm的无菌过滤器进行过滤，分别收集过滤后的液体；②在4℃条件下以离心力110000g 将过滤后收集的液体分别离心70min(超离转子：SW32 Ti)，分别收集获得的沉淀；③将获得的沉淀分别用PBS重新洗涤悬浮，在4℃条件下以离心力110000g离心和洗涤70min，并重复该PBS重悬及洗涤的实验操作1-2 次，最终获得沉淀为来源于两株免疫细胞株的EXO，即NK-92EXO和 NK-92MI EXO(如图2；图3)；④分别用50-100μL PBS轻轻吹打、溶解和混匀EXO沉淀，并存放于-80℃。
1.1.3细胞外囊泡SEV的分离与获取：①将1.1.2.实验操作①过滤后收集的液体在4℃条件下以离心力110000g离心70min，在1.1.2.实验操作②收集沉淀用于分离和获得细胞外囊泡EXO的同时，分别收集上清液；②将获得的上清液分别在4℃条件下以167000g的转速离心16h，分别收集获得的沉淀；③将获得的沉淀分别用PBS重新洗涤悬浮，在4℃条件下以离心力167000g 离心和洗涤4h，并重复该PBS重悬及洗涤的实验操作2-3次，最终获得沉淀为来源于两株免疫细胞株的SEV，即NK-92SEV和NK-92MI SEV(如图 2；图3)；④分别用50-100μL PBS轻轻吹打、溶解和混匀EXO沉淀，并存放于-80℃。
上述不同类型细胞外囊泡分离、获取的流程汇总如图1所示，所得到的细胞外囊泡的透射电镜及粒径表征分别如图2、图3所示。
采用上述实验方法分离并获得两组、共6种细胞外囊泡后，进一步通过下列实验流程去除囊泡表面吸附的RNA：将获得的各种EVs分别用PBS重悬，加入适量的RNA酶(RNase A，Ambion，TX，USA)，使RNase A最终浓度为1U/mL，随后将含有RNase A的各种细胞外囊泡溶液在37℃水浴锅(JingHong，SHH，CN)中孵育20min。本实验步骤遵循国际细胞外囊泡协会(International Society for Extracellular Vesicles，ISEV)的指南规范操作。
1.2人源细胞株NK-92和NK-92MI及其分泌的细胞外囊泡的miRNA测序及生物信息学分析
1.2.1 NK-92和NK-92MI细胞株的miRNA测序
我们用总RNA纯化试剂盒(Norgen Biotek Corp，Thorold，ON，Canada) 分别提取NK-92和NK-92MI培养细胞样本的总RNA(包括所有miRNA和小分子RNA)；使用Bioanalyzer2100(Agilent，CA，USA)分析获得的RNA 的质量和数量，并确保RIN值>7.0；分别从两种细胞株提取的RNA样本中取1μg总RNA，使用TruSeq小分子RNA样品制备试剂盒(Illumina，SD，USA)制备小分子RNA文库；按照Illumina HiSeq 2500(Hanyu，SHH，China) 的制造商提供的操作说明，委托联川生物有限公司(LC Sciences，HZ，CN) 对上述两种细胞株样本中的miRNA分别进行50bp单端测序。
1.2.2两组细胞外囊泡的miRNA测序
为了去除1.1中添加的RNA酶，并同步纯化细胞外囊泡，我们按照1.1 中获取和纯化相应细胞外囊泡的步骤重新进行超离和洗涤；采用与1.2.1中相同的方法提取各种细胞外囊泡的总RNA、制备小分子RNA文库，并对各种细胞外囊泡样本中的miRNA分别进行50bp单端测序。
1.2.3 miRNA测序结果的生物信息学分析
首先，使用ACGT101-miR分析软件(LC Sciences，TX，USA)对人源细胞株及其分泌的细胞外囊泡的miRNA测序数据进行生物信息学分析。该软件的主要分析流程如下：原始数据经过质控处理后得到clean reads，将clean reads去除3’接头并进行长度筛选，保留碱基长度在18-26nt的序列；其后将剩余序列与RNA数据库序列进行比对，如mRNA数据库、RFam数据库 (包含rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA等)及Repbase数据库(重复序列数据库)，并进行过滤。
其次，基于测序数据及生物信息学分析软件，对具有潜在重要生物学功能的miRNA进行筛选。主要筛选方法及流程：①基于DESeq2(V 1.26.0) (R语言软件包)，对两种细胞株的miRNA测序结果，以及两组细胞外囊泡的miRNA测序结果进行差异表达分析，将其中符合log2 Fold Change>1.25 及统计分析p值<0.05的miRNA作为差异表达miRNA并进行聚类分析，从两种细胞株的测序数据中筛选出15条表达量高且差异显著(NK92相比 NK92-MI显著下调)的miRNA(图5及表1)，同时从细胞外囊泡的测序数据中筛选出50条(图7及表2)共同表达量高的miRNA；②基于具有功能的miRNA应该在表达水平上具有优势的假设，对细胞株及细胞外囊泡的 miRNA的平均表达量分别进行计算，并基于平均表达量的高低对上述差异表达miRNA进行排序；③根据①筛选出的miRNA的表达量及变化倍数，最终从上述15条细胞株中初步筛选获得的miRNA中遴选出在NK-92MI中表达显著高于NK-92的4条目标miRNA(我们率先通过实验研究发现NK-92MI 细胞株的抗口腔肿瘤效果优于NK-92细胞株，结果如图4，用GraphPad Prism 软件One-way ANOVA进行分析；*，P<0.05，**，P<0.01)，包括1条未知的miRNA(bta-miR-2478_L-2)(差异倍数最明显)和3条已知的miRNA (hsa-miR-1260a，hsa-miR-197-3p，hsa-miR-296-5p)(图5)。同时，从上述50条细胞外囊泡miRNA中初步筛选获得的miRNA中遴选出在EXO中表达显著高于LEV和SEV的2条目标miRNA(我们率先通过实验研究发现 EXO抗口腔肿瘤效果显著优于LEV和SEV，结果如图6，用GraphPad Prism 软件One-wayANOVA进行分析；*，P<0.05，**，P<0.01，***，P<0.001)，包括已知的hsa-miR-339-5p和hsa-miR-223-3p(图7)。
以上6条目标miRNA即为本申请所述的活性miRNA，标识为miRNA-X。
表1 NK-92/NK-92MI两细胞株之间表达水平变化显著的前15条miRNA测序结果
Figure RE-GDA0003896008120000091
表2 NK-92/NK-92MI中EVs共同表达量高的50条miRNA测序结果
Figure RE-GDA0003896008120000092
Figure RE-GDA0003896008120000101
Figure RE-GDA0003896008120000111
实施例2.活性miRNA-X表达载体构建
2.1活性miRNA-X单用表达载体构建
本实施例采用Lipofectamine 3000脂质体进行表达载体构建，设定 miRNA-Xmimic和mimic对照的浓度为60nM，实验在96孔板中进行，每孔总体系为200μL。具体操作如下：
①取0.6μL miRNA-X mimic和等量的mimic NC(NC是一个线虫 miRNA的序列)分别加入到9.4μL opti-MEM中；
②取0.3μL Lipofectamine 3000加入到9.7μL opti-MEM中，加完后静置5min；
③将①加入到②中，轻轻吹打后静置15min，得到表达miRNA-X的 Lipofectamine3000脂质体和表达mimic NC的Lipofectamine 3000脂质体。
2.2活性miRNA-X联用表达载体构建
本实施采用Lipofectamine300脂质体进行联用表达载体构建，设定 miRNA-Xmimic和mimic对照的浓度为60nM，实验在96孔板中进行，每孔总体系为200μL。具体操作如下：
①取0.6μL miRNA-X1 mimics，miRNA-X2 mimics和mimic NC，分别加入到10μLopti-MEM中。其中，mimic NC用相同配方及方法准备两份；
②准备两份脂质体溶液：取0.6μL Lipofectamine 3000加入到20μL opti-MEM中，加完后静置5min。用相同配方及方法准备两份脂质体溶液；
③其中一份脂质体溶液中加入①中配制的miRNA-X1 mimics和 miRNA-X2 mimics溶液，另一份脂质体溶液中加入两份①中配制的mimic NC；轻轻吹打后静置15min。
上述2.1和2.2构建获得的miRNA-X表达载体以及miRNA-X1 mimics 和miRNA-X2mimics表达载体，事实上是miRNA应用的代表性剂型，为后续制备各种基于活性miRNA-Xmimics单用或者联合使用的药物提供一种思路。后续可制备含有上述一种或多种活性miRNA-X mimics联合及其激活剂/ 抑制剂的脂质体药物，给药方式为外敷或注射。
实施例3.活性miRNA-X转染效率测试
为验证实施例1筛选的6种miRNA-X在口腔肿瘤细胞中的转染效率，我们进行了体外转染实验。首先，选用实施例1筛选出的6个活性miRNA-X 相同的miRNA-X mimics(RiboLife Science，JS，CN)与人口腔肿瘤细胞株 KB共孵育，具体实验步骤为：
①接种KB细胞：将处于对数生长期的KB细胞按1×105～5×105个/孔接种到6孔板中。
②将实施例2.1构建获得的表达miRNA-X的Lipofectamine 3000脂质体加入到KB细胞中。
③转染4h后换液，继续培养48h后收集KB细胞，利用RT-PCR实验检测转染效率。
通过RT-PCR实验检测KB口腔肿瘤细胞内活性miRNA-X的表达水平，我们证实转染miRNA-X mimics后，6种miRNA-X的表达水平都显著上升(图 8)。
为进一步验证实施例1筛选的6种miRNA-X的抑制剂的转染效率，我们将相应的6种miRNA-X inhibitors(Ribo Life Science，JS，CN)与人口腔肿瘤细胞株KB共孵育，具体实验步骤为：将处于对数生长期的KB细胞按 1×105～5×105个/孔接种到6孔板中；设定miRNA-X inhibitor和inhibitor对照的浓度为120nM，具体操作如下：
①取12μL miRNA-X inhibitor和inhibitor对照，分别加入到88μL opti-MEM中；
②取7.2μL Lipofectamine 3000加入92.8μL opti-MEM中，加完后静置5 min；
③随后将①加入到②中，轻轻吹打后静置15min。然后加入到KB细胞中。转染4h后换液，继续培养48h后收集KB细胞，利用RT-PCR实验检测转染效率；
通过RT-PCR实验检测KB口腔肿瘤细胞内活性miRNA-X的表达水平，我们证实转染miRNA-X inhibitor后，6种miRNA-X的表达水平都显著下降 (图8)。
由上述miRNA-X mimics和inhibitors转染实验可知：我们筛选获得的 miRNA-X借助上述方法构建的载体系成功转染到口腔肿瘤细胞中，并在肿瘤细胞中分别对miRNA-X的表达产生符合预期、理想的调节效应。
实施例4.活性miRNA-X的抗口腔肿瘤活性测试
为了进一步验证miRNA-X具有抗口腔肿瘤的作用，我们将活性 miRNA-X mimics/inhibitors与KB人口腔肿瘤细胞株共孵育。具体实验步骤为：
将miRNA-X mimics/inhibitors转染至KB人口腔肿瘤细胞中，转染步骤如实施例3中所述；转染4h后给转染体系换液，继续培养48h后加入3-(4， 5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(简称MTT，Sigma，DA，DE)以检测KB细胞的存活率，用于评价miRNA-X mimics/inhibitors对KB细胞的抗肿瘤效果。
实验结果表明6种miRNA-X mimics对KB口腔肿瘤细胞都起到了显著的抑制肿瘤增殖的作用，而miRNA-X inhibitors没有抑制KB肿瘤细胞增殖的作用(图9，用GraphPadPrism软件One-way ANOVA进行分析。**,P<0.01；***,P<0.001。)。
由此可知，过表达6种miRNA-X中的任意一种均能够显著抑制口腔肿瘤细胞的增殖和发挥抗口腔肿瘤的作用。本领域技术人员可以预见，基于6 种miRNA-X开发的活性成分亦能够显著抑制口腔肿瘤细胞的增殖和发挥抗口腔肿瘤的作用，包括但不限于：①对miRNA-X进行修饰的miRNA-X衍生物；②能在宿主内加工成前述6种miRNA-X的前体miRNA；③能被宿主转录形成②中所述的前体miRNA的多核苷酸；④含有miRNA-X或①中所述 miRNA-X衍生物的表达载体、或②中所述前体miRNA的表达载体、或③中所述的多核苷酸的表达载体(如实施例2)；⑤促进miRNA-X表达和/或提高miRNA-X活性的激动剂。
实施例5.活性miRNA-X联合治疗的抗口腔肿瘤活性测试
为了进一步验证miRNA-X联合治疗具有抗口腔肿瘤的作用，我们将2.2 中构建的联合表达载体与人口腔肿瘤细胞株KB共孵育，具体实验步骤为：
①接种KB细胞：将处于对数生长期的KB细胞按1×103～5×103个/ 孔接种到96孔板中；
②将实施例2构建获得的表达miRNA-X1 mimics和miRNA-X2 mimics 的Lipofectamine 3000脂质体加入到KB细胞中；
③继续培养48h后加入3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(简称MTT)以检测KB细胞的存活率，用于评价miRNA-X mimics联合治疗对KB细胞的抗肿瘤效果。
实验结果表明，不同miRNA-X的联用均能够对KB细胞产生良好的抑制/杀伤效果。例如，三个miRNA联用组与NC对照组的癌细胞存活率均存在统计学显著差异(图10，用GraphPad Prism软件One-way ANOVA进行分析。*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001)。另一方面，不同miRNA-X 联用组合的抗口腔癌效果存在差异，特定联用组合能更有效地抑制/杀伤KB 细胞。例如，bta-miR-2478-L-2与hsa-miR-197-3p联用，相比于 bta-miR-2478-L-2、hsa-miR-197-3p分别单独使用，其抗口腔癌活性得到了显著提高：与bta-miR-2478-L-2单用相比提高了100.98％(P<0.001)，与 hsa-miR-197-3p单用相比提高了38.12％(P<0.01)。
与bta-miR-2478-L-2与hsa-miR-197-3p的联用效果不同， bta-miR-2478-L-2与hsa-miR-339-5p联用，其抗癌活性高于hsa-miR-339-5p 单用的抗癌活性(P<0.05)，而与bta-miR-2478-L-2单用抗癌活性相近； hsa-miR-339-5p与hsa-miR-223-3p的联用，其抗癌活性高于hsa-miR-339-5p 单用的抗癌活性(P<0.05)，而与hsa-miR-223-3p单用抗癌活性相近。
以上抗癌活性的增强或减弱程度通过如下公式计算：(单用组平均抗癌效果—联用组平均抗癌效果)/单用组平均抗癌效果×100％。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>浙江大学
<120>抗口腔肿瘤药物活性成分及其用途
<160>6
<170>SIPOSequenceListing1.0
<210>1
<211>14
<212>DNA/RNA
<213>未知(Unknown)
<400>1
acccaccgacacca14
<210>2
<211>18
<212>DNA/RNA
<213>未知(Unknown)
<400>2
atcccacctctgccacca18
<210>3
<211>22
<212>DNA/RNA
<213>未知(Unknown)
<400>3
ttcaccaccttctccacccagc22
<210>4
<211>21
<212>DNA/RNA
<213>未知(Unknown)
<400>4
agggccccccctcaatcctgt21
<210>5
<211>23
<212>DNA/RNA
<213>未知(Unknown)
<400>5
tccctgtcctccaggagctcacg23
<210>6
<211>22
<212>DNA/RNA
<213>未知(Unknown)
<400>6
tgtcagtttgtcaaatacccca22

Claims (7)

1.一种用于治疗/预防口腔肿瘤药物的活性成分，其特征在于，所述的活性成分至少选自以下之一：
(a)序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6任一项所示的miRNA-X，或所述miRNA-X的任意组合，或经修饰的miRNA-X的衍生物；
(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的miRNA-X；
(c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的miRNA；
(d)表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的miRNA-X的miRNA、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；
(e)所述(a)中所述的miRNA的激动剂。
2.根据权利要求1所述的活性成分，其特征在于，所述miRNA-X的组合为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示的miRNA-X的组合。
3.如权利要求1或2所述的活性成分，其特征在于，激动剂选自下组：促进miRNA-X表达的物质、提高miRNA-X活性的物质。
4.如权利要求1或2所述的活性成分的用途，所述的活性成分用于制备一药物，所述药物用于治疗/预防口腔肿瘤。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的药物含有权利要求1或2所述的活性成分，和药学上可接受的溶媒或者载体。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的药物的制剂形式为冻干粉针、微针、注射剂、片剂、贴剂、胶囊、口服混悬液或介入栓塞用微球等。
7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物的递送方法有：转载法、装载药物法、直接裸RNA注射法、脂质体包裹RNA直接注射法和纳米材料组装法等阳离子材料复合物递送法，以及细菌携带质粒表达RNA法、病毒包装表达RNA法等递送方式。
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