KR101649489B1

KR101649489B1 - ｍｉＲ－１５０의 발현을 조절하여 자연살해세포의 세포독성을 증가시키는 방법

Info

Publication number: KR101649489B1
Application number: KR1020140028734A
Authority: KR
Inventors: 최인표; 김태돈
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2014-03-12
Filing date: 2014-03-12
Publication date: 2016-08-19
Also published as: KR20150106543A

Abstract

본 발명은 miR-150의 발현을 억제하는 단계를 포함하는 자연살해세포의 세포독성 증가방법 또는 miR-150 결여된 자연살해세포의 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 miR-150은 Prf1 mRNA의 3'UTR과 상보적으로 결합하여 자연살해세포의 Prf1 단백질의 발현을 억제하여, miR-150의 발현을 억제하는 단계를 포함하는 자연살해세포의 세포독성을 증가시키는 방법과, miR-150 결여된 자연살해세포를 이용한 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

ｍｉＲ－１５０의 발현을 조절하여 자연살해세포의 세포독성을 증가시키는 방법 {A method of increasing cytotoxicity of NK cell by regulating the expression of miR-150}

본 발명은 miR-150의 발현을 억제하여 자연살해세포의 세포독성을 증가시키는 방법과 이를 이용한 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

면역체계를 구성하는 세포들 중 특히, NK 세포(natural killer 세포, 이하 NK 세포라 약칭함)는 비특이적으로 암세포를 살상할 수 있는 능력이 밝혀지면서 많은 연구가 진행되었으며, NK 세포의 분화와 활성의 결함은 유방암(Breast Cancer Res. Treat., 66: 255-263, 2003), 흑색종암(Melanoma Res., 13: 349-356, 2003), 폐암(Lung Cancer, 35: 23-18,2002) 등 다양한 질병들과 관련 되어 있음이 밝혀졌다. 이러한 연구들을 바탕으로 암 치료에 NK 세포를 이용하는 NK 세포 치료법이 대두되고 있다. 현재까지는 주로 프라이밍(priming), 활성화(activation), 면역 시냅스 형성(immune synapse formation), 트래피킹(trafficking)과 같은 다양한 과정에서의 신호전달 기작의 이해와 이를 조절하는 기술을 개발하는 데 초점이 맞추어졌다. NK 세포를 이용한 효율적인 면역세포치료는 기존의 기술뿐만이 아니라, NK 세포 세포독성을 조절하는 새로운 메커니즘을 규명하고, 이를 조절하는 새로운 분자들을 탐색하는 것이 절실한 상황이다.

NK 세포는 숙주에 감염된 병원균 또는 암에 대항하기 위한 선천성 면역 반응(Innate immune response)과 사이토카인 분비를 통한 후천성 면역 반응(Adaptive immune response)에 중요한 역할을 한다(Nat Immunol., 9: 495-502, 2008; Nat Immunol., 9: 486-494, 2008 ; Annu Rev Immunol., 22: 405-429, 2004; Immunity 26: 798-811, 2007). NK 세포가 표적 세포를 살상하는데 사용하는 주된 메커니즘은 퍼포린(Perforin) 및 그랜자임 B(Granzyme B, GrzmB)와 같은 세포 용해성 과립(lytic granule)을 면역 시냅스(immune synapse)를 통하여 표적 세포에 분비하는 것이다(Immunity 26: 798-811, 2007). 분비된 퍼포린은 표적 세포벽에 구멍을 만들고, 구멍을 통하여 표적 세포 내로 들어간 그랜자임은 표적 세포의 아폽토시스(apoptosis)를 일으키게 된다(I Voskoboinik et al., Nat Rev Immunol., 6:940-952, 2006). 또한, NK 세포는 IFN-γ를 생성하여 분비하는 능력을 갖고 있다. IFN-γ는 대식세포를 활성화시키는 중요한 역할을 담당하고, 선천성 면역반응에서 후천성 면역반응으로의 연결 역할을 담당하며, 암세포와 바이러스에 감염된 세포의 증식을 억제시키는 사이토카인이다(CA Biron et al., Annu Rev Immunol., 17:189-220, 1999). NK 세포가 이러한 능력을 갖추기 위해서는 표적 세포를 만나기 전 분화 자극(priming)이 필요하다. 그렇기 때문에 마우스와 사람에게서 분리해낸 초대배양 NK 세포는 암세포 살상 능력과 IFN-γ 생성능력이 현저히 감소되어 있다. 이러한 NK 세포의 능력을 극대화시켜줄 수 있는 분화 자극 사이토카인으로 IL-2와 IL-15이 있으며, 그 중에서 IL-15이 NK 세포의 활성에 있어서 필수적인 사이토카인으로 보고되어 있다(M Lucas et al., Immunity, 26:503-517, 2007). 그러므로, NK 세포의 세포독성(Cytotoxicity)에 필수적인 이펙터(effector) 분자인 Prf1 및 Gzms의 발현을 조절하는 분자를 탐색하는 것은 중요하다.

마이크로알엔에이(MicroRNA)는 세포질 내 Dicer1과 핵 내 Drosha라고 불리는 두 종류의 리보뉴클레아제(ribonuclease)의해 만들어지는 프라이머리(primary) miRNA로서 작은 비번역 RNA(19-22 nt)이다. 동물세포에서 성숙된 miRNA는 특이적인 표적 mRNA의 3' 비번역부위(UTR)에 RNA-유도 사일런싱 복합체를 만들어 표적 mRNA 분해 또는 표적단백질의 번역 억제(translational suppression)로 인해 유전자 발현을 감소시킨다(Nat Rev Immunol., 8: 120-130, 2008 ; 세포 136: 26-36, 2009; J Exp Med., 205: 585-594, 2008).

조혈줄기세포로부터 유래된 면역반응과 면역세포분화에서 miRNA와의 관련성은 Argonaute(Genes Dev., 21: 1999-2004, 2007), Drosha(Exp Med., 205: 2005-2017, 2008), Dicer(J Exp Med., 203 : 2⁵¹9-2527, 2006 ; J Exp Med., 202: 261-269, 2005 ;J Exp Med., 205 : 1993-2004, 2008)과 같은 miRNA 합성에 관련된 분자의 결핍 또는 특이적 miRNA 수준의 조절을 통해 널리 확인되었다. 상기 결과는 miRNA가 면역세포 분화 및 기능에 중요한 역할을 하고 있음을 뒷받침하고 있다(Nat Rev Immunol., 8: 120-130, 2008 ; 세포 136: 26-36, 2009; NatImmunol., 9: 839 145, 2008). 최근에, NK 세포에서 miRNA의 생물학적 중요성이 밝혀지고 있는 추세이다(Front Immunol., 4: 44, 2013; Blood, 118: 5476-5486, 2011). NK 세포를 이용한 치료법을 적용함에 있어 NK 세포의 세포독성(cytotoxicity)을 조절하는 새로운 표적분자의 발견이 대두되어 오고 있다(Nat Immunol., 9: 486-494, 2008; Nat Rev Immunol., 7: 329-339, 2007).

이에, 본 발명자들은 NK 세포의 세포독성을 조절하는 새로운 표적분자를 찾기 위해 노력한 결과, 마우스와 인간의 microRNA-150 (miR-150)이 NK 세포의 세포독성(cytotoxicity)과 밀접한 Prf1의 3'UTR 염기서열에 특이적으로 결합하여 표적 단백질 발현량을 감소시키고, 실제적으로 암을 인위적으로 이식한 모델 마우스에서 miR-150가 결여된 NK 세포의 주입으로 인해 암의 크기와 전이가 급격히 감소하는 것을 확인함으로써, miR-150 억제제를 통해 NK 세포를 활성화 시키고, 이를 이용해 암을 치료할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 miR-150의 발현을 억제하여 자연살해세포의 세포독성을 증가시키는 방법과 이를 이용한 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 miR-150의 발현을 억제하여 자연살해세포의 세포독성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 miR-150 결여된 자연살해세포를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 miR-150 결여된 자연살해세포를 유효성분으로 함유하는 암의 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 miR-150에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(Short hairpin RNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 miR-150의 억제제를 유효성분으로 함유하는 자연살해세포 활성용 키트를 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) miR-150을 발현하는 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 처리된 세포에서 miR-150의 발현량을 측정하는 단계; 및

3) 대조군과 비교하여 상기 단계 2)에서 miR-150의 발현량이 감소된 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서는 miR-150의 발현을 억제제를 통해 억제하거나 녹아웃(Knock-out, KO)시킨 마우스의 자연살해세포에서 Prf1 단백질의 발현이 증가하여 in vitro 뿐만 아니라 in vivo에서도 자연살해세포의 활성이 증가되고, miR-150이 prf1 mRNA의 3'UTR부분에 특이적으로 결합하여 Prf1의 발현을 증가시키며, miR-150 결여 자연살해세포는 암의 성장과 전이를 억제하는 효과가 있어, 상기 miR-150 결여 자연살해세포는 세포독성이 증가하여 암의 치료 및 암의 전이 억제에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a은 야생형(wild type)과 miR-150 KO 마우스의 NK 세포를 분리한 후 마우스 IL-15 (25ng/ml)이 포함된 배지로 활성화 시킨 뒤 Prf1과 GzmB 단백질 발현양을 면역 블롯(immunoblotting)을 통해 도식화한 도이고 (상단), 세미-qPCR로 Prf1과 GzmB 엠알엔에이(mRNA)의 수준을 확인한 도이고 (하단),
도 1b는 도 1a에 도식화된 Prf1의 단백질 발현 비율을 실선그래프로 나타내고, miR-150의 발현을 TaqMan 실시간 PCR으로 확인한 후 야생형에 대비한 KO의 발현을 실선그래프로 나타낸 도이며,
도 1c는 인간의 제대혈에서 분리한 프라이머리 NK 세포에 IL-15 (30 ng/ml)을 처리한 다음, Prf1 과 GzmB 단백질 발현양을 면역 블롯(immunoblotting)을 통해 도식화하고 (상단), 실시간 qPCR로 Prf1과 GzmB mRNA의 수준을 확인한 도이고 (하단),
도 1d는 도 1c에 도식화된 Prf1 단백질 발현 비율을 실선그래프로 나타내고 (하단), miR-150의 발현을 TaqMan 실시간 PCR으로 확인한 후 야생형에 대비한 KO의 발현을 실선그래프로 나타낸 도이다 (상단).
도 2a는 야생형과 miR-150 KO 마우스의 NK 세포를 분리한 후 마우스 IL-15 (25ng/ml)이 포함된 배지로 활성화 시킨 뒤 Prf1 단백질 발현량을 면역 블롯(immunoblotting)을 통해 도식화하고 (상단), 실시간 qPCR로 Prf1 mRNA의 수준을 확인한 도이고 (하단),
도 2b는 야생형과 miR-150 KO 마우스의 NK 세포를 분리한 후 마우스 IL-15 (25ng/ml)이 포함된 배지로 2일 배양 후 NK세포를 회수하여 Cr release assay를 통해 세포독성을 측정하여 꺽은 선 그래프화한 도이며,
도 2c는 야생형과 miR-150 KO 마우스의 NK 세포를 분리한 후 마우스 IL-15 (25ng/ml)이 포함된 배지로 활성화 시킨 뒤 Prf1 단백질 발현량을 형광세포분석(flow cytometry)을 통해 확인한 도이고 (하단), mean fluorescence intensity (MFI)를 막대그래프로 나타낸 도이다 (상단).
도 3a는 야생형과 miR-150 KO 마우스의 NK 세포를 분리한 후 마우스 IL-15가 포함된 배지로 48h 활성화시킨 뒤 세포막 수용체의 발현 수준을 형광세포분석(flow cytometry)한 것을 나타낸 도이고,
도 3b는 야생형과 miR-150 KO 마우스의 NK 세포를 분리한 후 마우스 IL-15가 포함된 배지로 48h 활성화 시킨 NK 세포에 anti-NKp46 항체를 전 처리한 다음 Prf1분비 마커인 CD107a의 수준을 형광세포분석(flow cytometry)한 도이며,
도 3c는 야생형과 miR-150 KO 마우스의 NK 세포를 분리한 후 마우스 IL-15가 포함된 배지로 48h 활성화시킨 뒤 세포막의 자살 리간드인 FasL, TRAIL의 수준을 형광세포분석(flow cytometry)한 도이고,
도 3d는 야생형과 miR-150 KO 마우스의 NK 세포를 분리한 후 마우스 IL15가 포함된 배지로 48h 활성화 시킨 다음 Prf1분비 마커인 CD107a의 수준을 형광세포분석(flow cytometry)한 도이다.
도 4a는 pcAANAT 리포터 벡터(reporter vector)를 도식화 한 도이고,
도 4b는 miR-150의 표적단백질인 Prf1의 3' UTR 부분에 결합하는 miR-150의 염기서열과 돌연변이(mutant)된 염기서열을 모식화 한 도이며,
도 4c는 miR-150의 표적단백질인 인간 Prf1과 GzmB의 3' UTR 부분에 결합하는 miR-150의 염기서열과 돌연변이(mutant)된 염기서열을 모식화 한 도이고,
도 4d는 HEK293T 세포s에 pcAANAT 리포터 벡터(reporter vector)에 결합된 마우스 Prf1 과 GzmB의 3'-UTR 부분에 miR-150이 안정하게 결합하는 부위(야생형)와 miR-150과 mutant miR-150을 동시에 형질주입(transfection) 시킨 다음, 리포터 유전자(reporter gene)인 AANAT의 발현양을 보기위해 면역 블롯(Immunoblotting)을 통해 AANAT와 actin 단백질 발현양을 도식화 한 도이고(상단), 실시간 qPCR을 통해 AANAT mRNA 발현양을 막대그래프로 나타낸 도이며 (하단),
도 4e는 HEK293T 세포s에 pcAANAT 리포터 벡터(reporter vector)에 결합된 인간 Prf1 과 GzmB의 3'-UTR 부분에 miR-150이 안정하게 결합하는 부위(야생형)와 miR-150과 mutant miR-150을 동시에 형질주입 시킨 다음, 리포터 유전자(reporter gene)인 AANAT의 발현양을 보기위해 면역 블롯(Immunoblotting)을 통해 AANAT와 actin 단백질 발현양을 도식화 한 도이고 (상단), 실시간 qPCR을 통해 AANAT mRNA 발현양을 막대그래프로 나타낸 도이다 (하단).
도 5a는 miR-150을 과발현하는 lentivirus를 마우스 NK 세포에 도입하여 48시간 후에 면역 블롯(immunoblotting)으로 표적 유전자인 Prf1의 발현이 저해됨을 보여준 도이고,
도 5b는 상기 도 5a의 마우스 NK 세포에서 세포 독성을 Cr release assay로 보여준 도이며,
도 5c는 인간의 시험관내에서 분화된 mNK세포와 세포주인 NK92MI에서 miR-150의 발현을 실시간 qPCR로 비교한 도이고,
도 5d는 miR-150이 낮게 발현 되어 있는 인간 세포주 NK92MI에 miR-150을 과발현하는 lentivirus를 도입하여 miR-150의 발현이 증가함을 실시간 qPCR로 보여준 도이며,
도 5e는 상기 도 5d와 같은 조건에서 miR-150의 표적인 Prf1의 단백질 발현을 면역 블롯(immunoblotting)으로 보여준 도이고,
도 5f는 상기 도 5e와 같이 lentivirus로 miR-150을 과발현시킨 NK세포의 세포독성을 Cr release assay로 나타낸 도이다.
도 6a는 면역세포가 결여된 Rag2-/-rC-/- 마우스에 야생형/miR-150 KO NK를 IL-15 (100 ng/ml)로 활성화 한 후 꼬리 정맥에 주사한 후, B16/F10 흑색종을 피하주입하여 암의 성장을 측정한 도이고,
도 6b는 면역세포가 결여된 Rag2-/-rC-/- 마우스에 야생형/miR-150 KO NK를 IL-15 (100 ng/ml)로 활성화 한 후, 꼬리 정맥에 주사하고 B16/F10 흑색종을 정맥주사한 후, 암의 전이와 성장을 허파에 형성된 암의 군체 수로 측정한 도이다.
도 6c는 면역세포가 결여된 Rag2-/-rC-/- 마우스에 야생형/miR-150 KO NK를 IL-15 (100 ng/ml)로 활성화 한 후, 꼬리 정맥에 주사하고 B16/F10 흑색종을 정맥주사한 후, 허파에 형성된 암의 상태를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 분리된 자연살해세포에 있어서, miR-150의 발현을 억제하는 단계를 포함하는 자연살해세포의 세포독성 증가 방법을 제공한다.

본 발명에 사용된 용어 "miR-150"은 인간을 포함한 포유류에서 발견되는 microRNA 전구체 패밀리 중 하나로서, aca-miR-150(Accession No. MI0018761), bta-miR-150(Accession No. MI0005058), cfa-miR-150(Accession No. MI0007998) dre-miR-150(Accession No. MI0002016), eca-miR-150(Accession No. MI0012762), ggo-miR-150(Accession No. MI0020764), hsa-miR-150(Accession No. MI0000479), ipu-miR-150(Accession No. MI0024515), mdo-miR-150(Accession No. MI0012504), mml-miR-150(Accession No. MI0007641), mmu-miR-150(Accession No. MI0000172), oan-miR-150(Accession No. MI0006840), oar-miR-150(Accession No. MI0025255), ppy-miR-150(Accession No. MI0014840), ptr-miR-150(Accession No. MI0008550), rno-miR-150(Accession No. MI0000920), sha-miR-150(Accession No. MI0019633), ssc-miR-150-1(Accession No. MI0022133), ssc-miR-150-2(Accession No. MI0022134), xtr-miR-150(Accession No. MI0004846) 중 하나 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, Prf1 mRNA와 상보적으로 결합할 수 있는 유사한 서열 까지를 모두 포함할 수 있고, 뉴클레오티드 길이는 20~25개 일 수 있으나, prf1 mRNA와 상보적으로 결합할 수 만 있다면 어떤 길이든지 포함될 수 있다.

상기 자연살해세포는 마우스 또는 인간의 자연살해세포인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 miR-150의 발현을 억제하는 단계는 miR-150에 상보적으로 결합하는 안티센스, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(Short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 자연살해세포에 형질전환 시키는 방법으로 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 miR-150의 발현을 억제하는 단계는 miR-150의 돌연변이를 일으켜 기능을 억제시키는 방법으로 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 방법에 있어서, 자연살해세포에서 Prf1 단백질의 발현이 증가되었는지 여부를 확인하는 단계를 추가로 포함 할 수 있다.

상기 Prf1 단백질의 발현이 증가되었는지 여부는 면역 블롯, 면역 블롯 방법 등으로 확인 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 당업계에 알려진 모든 공지의 방법을 통해 이루어질 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 자연살해세포 활성이 증가되었는지 여부를 확인하는 단계를 추가 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 자연살해세포 활성이 증가되었는지 여부를 확인하는 단계에는 자연살해세포에 IL-15자극을 주었을 때, 대조군과 비교하여 실험군의 IFN-γ생성이 증가되었는지 확인하는 방법, 또는 대조군과 비교하여 실험군의 표적세포 살상능이 증가되었는지 확인하는 방법을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용된 용어 "자연살해세포 세포독성 증가" 또는 "자연살해세포 활성 증가"는 자연살해세포의 활성을 촉진하거나, 자연살해세포의 세포독성을 촉진하거나, 자연살해세포의 Prf1의 발현이 증가되거나, 자연살해세포의 세포 GzmB의 발현이 증가되거나, IFN-γ의 발현이 증가되거나, miR-150의 발현이 억제된 것을 의미할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 NK세포에서 Prf1의 발현이 miR-150와 반대 패턴을 보인다는 것을 확인하기 위해 야생형 마우스와 miR-150 KO 마우스의 NK 세포를 얻어 여기에 IL-15를 처리하여 NK 세포를 활성화 시키고 Prf1과 GrzmB의 mRNA의 양과 miR-150의 양을 실시간-PCR로 측정하였고, Prf1과 GzmB 단백질의 발현양을 면역 블롯 측정하였는데, 마우스 Prf1과 GzmB 단백질의 발현이 급격히 증가되는 것을 확인 할 수 있었고 (도 1a 상단), 마우스 GzmB mRNA의 발현은 증가되었으나 Prf1 mRNA의 발현은 거의 변화가 없었으며 (도 1a 하단), miR-150은 마우스 Prf1의 발현과 반대 패턴으로 Prf1의 수준이 낮은 때 증가되어 있고, Prf1이 급격히 증가할 때에는 급격히 감소하는 것을 확인하였다 (도 1b).

또한, 본 발명자들은 인간 자연살해세포를 분리하여 IL-15로 활성화 시킨 후 Prf1 단백질의 양을 면역 블롯으로 측정한 결과, Prf1 mRNA의 수준은 거의 변하지 않았으나 Prf1 단백질이 급격히 증가함을 확인하였고 (도 1c), Prf1단백질의 발현 패턴은 miR-150의 발현과 반대 패턴을 보여주고 있음을 확인하였다 (도 1d).

또한, 본 발명자들은 miR-150 결여 NK 세포는 Prf1의 발현이 증가하고 동시에 세포독성이 증가함을 확인하기 위해 면역 블롯 및 형광세포분석으로 Prf1의 발현을 측정하고, ⁵¹Cr-release 분석방법으로 표적세포 살상능을 직접 측정하는 방법으로 세포독성(cytotoxicity)을 측정한 결과, 야생형 마우스의 NK 세포에 비해 miR-150 결여 NK 세포가 증가된 Prf1 단백질 발현양과 (도 2a, 2c), 세포독성을 보임을 확인하였다 (도 2b).

또한, 본 발명자들은 NK 세포의 높은 활성이 Prf1 단백질의 발현 증가에 기인한다는 것을 확인하기 위해, 야생형 NK세포와 miR-150 결여 NK세포의 수용체 및 리간드의 발현과 이펙터(effector) 단백질의 분비량을 형광세포분석법으로 측정한 결과, 야생형과 miR-150결여 NK 세포간의 세포막 수용체의 발현량에 큰 차이가 없음을 확인 하였고 (도 3a), Prf1의 분비마커인 CD107a의 수준도 차이가 없음을 확인할 수 있었으며 (도 3b, 3d), 세포사멸수용체(death receptor)의 수준도 거의 차이가 없음을 확인함으로써 (도 3c), miR-150 결여 마우스의 높은 NK 세포 활성이 Prf1 단백질의 발현이 증가된 것에 기인한다는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 miR-150이 Prf1 mRNA의 3'UTR부분에 특이적으로 결합하여 prf1 단백질의 발현을 억제함을 밝히기 위하여 리포터 시스템(reporter system) (도 4a)에 miR-150의 표적단백질인 Prf1의 3' UTR 부분을 형질전환 하였고 (도 4b, 4c), 그 결과 대조군인 돌연변이 miR-150을 과발현하였을 경우에는 리포터 유전자의 발현을 억제하지 않는다는 것을 확인함으로써 (도 4d, e), miR-150이 Prf1 mRNA 3’UTR 에 특이적으로 결합하여 발현을 억제한다는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 miR-150의 과발현시스템을 사용하면 자연살해세포의 Prf1 단백질 발현 및 세포살상능이 억제되는지 확인하기 위해 miR-150을 과발현하는 lentivirus를 NK 세포에 도입하여 면역 블롯(immunoblotting)으로 Prf1의 발현을 확인 하였고, 감염된 NK 세포는 miR-150을 과발현하여 NK 세포의 Prf1의 단백질 발현이 감소하여 있고 (도 5a, 5e) 이에 부합하여 세포독성도 떨어져 있음을 확인하였다 (도 5b, 5f).

따라서 miR-150이 Prf1 단백질의 발현 및 NK 세포의 세포독성을 조절하며, miR-150의 발현량을 조절하면 NK 세포의 세포독성 활성을 조절할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 miR-150 결여 자연살해세포를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 사용된 용어 "치료"는 암 세포가 사멸하는 것뿐만 아니라 암 성장의 감소, 재발의 감소, 암 세포에 대한 면역계 항암 활성 면역 기억 또는 개체에게 감소된 독성을 갖는 암 세포의 항암 활성 등, 암 세포가 더 이상 악화 되지 않는 모든 효과를 의미하며, 이에 한정 되는 것은 아니다.

본 발명의 miR-150 결여 자연살해세포(NK 세포)는 miR의 발현이 억제되거나 miR이 낙아웃(knock-out)된 자연살해세포, 또는 상기 miR-150의 발현을 억제하는 단계를 거친 자연살해세포를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

또한, 본 발명의 miR-150 결여 자연살해세포는 miR-150이 낙아웃된 개체로부터 분리한 자연살해세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 miR-150 결여 자연살해세포를 제공하기 위한 miR-150을 억제시키는 벡터 및 이를 자연살해세포에 형질전환 하는 것을 제공한다.

본 발명에 사용된 용어 "벡터"는 선형 DNA, 플라스미드 DNA, 선형 RNA, 플라스미드 RNA, 또는 재조합 바이러스성 벡터를 포함할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기에 기재된 암은 폐암, 간암, 위암, 대장암, 방광암, 전립선암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 갑상선암, 흑색종 및 혈액암일 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.

또한, 본 발명은 상기 miR-150 결여 자연살해세포를 유효성분으로 함유하는 암 전이 억제용 약학적 조성물 제공한다.

본 발명에 사용된 용어 "전이"는 어느 하나의 장기에서 발생한 암 세포가 혈관 또는 림프를 따라 다른 조직으로 퍼져 나간 것을 의미하며 진단 가능한 것뿐만 아니라 그렇지 않은 경우도 포함한다.

또한, 본 발명은 miR-150의 억제제를 유효성분으로 함유하는 자연살해세포 활성용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 상기 miR-150 억제제는 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(Short hairpin RNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

또한 본 발명은,

1) miR-150을 발현하는 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;

상기 피검화합물은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것 일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 miR-150의 발현량을 측정하는 단계에는, RT-PCR, 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(quantitative or semi-quantitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 실시간 PCR(quantitative or semi-quantitative real-time PCR), 노던 블롯(northern blot) 및 DNA 또는 RNA 칩(chip)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법을 수행하여 확인하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 miR-150 결여 마우스의 NK 세포가 실제로 암세포의 성장과 전이를 억제함을 확인하기 위하여, 면역세포가 결여되어 있는 마우스에 활성화한 miR- 150 KO NK 세포를 주입 후 다시 암세포를 주입하여 암세포의 성장과 전이를 관찰한 결과, miR-150 결여 마우스의 NK세포가 암의 성장을 급격히 감소시켰음을 확인하였고 (도 6a), miR-150 결여 마우스의 NK세포가 암의 전이 또한 급격히 감소시켰음을 확인하였다 (도 6b, 6c). 상기와 같은 결과는 in vivo에서, miR-150이 결여되어 있는 NK 세포의 세포독성이 야생형에 비해 뛰어나다는 것을 나타낸다.

따라서 miR-150 결여 NK 세포는 세포독성이 증가되는 효과가 있어 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제 등이 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부외용 또는 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 피부외용으로 사용한다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 삼백초 추출물의 양을 기준으로 0.01 내지 1000 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 30 내지 500 ㎎/㎏이고, 더욱 바람직하게는 50 내지 300 ㎎/㎏이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> NK 세포에서 인간과 마우스의 Prf1과 miR-150 발현관계의 확인

본 발명자들은 NK세포에서 인간과 마우스의 Prf1의 발현이 miR-150와 반태 패턴을 보인다는 것을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

<1-1> 마우스 NK 세포에 마우스 IL-15를 처리한 때 Prf1 및 GzmB 단백질 발현 및 mRNA 양의 확인

본 발명자들은 마우스 Prf1이 miR-150에 의해 조절된다는 것을 확인하기 위해, 먼저 활성화된 NK 세포를 얻어 마우스 prf1 단백질, prf1 mRNA (서열번호1) 및 마우스 GzmB 단백질, 마우스 GzmB mRNA (서열번호2) 발현양을 확인하였다.

구체적으로, 유전자형분석(Genotyping)이 끝난 8 ~ 12주령의 수컷 야생형 마우스와 miR-150 Knock out(KO) 마우스 에서 지라(spleen)를 적출한 뒤, Ack 버퍼를 이용해 적혈구를 제거하고 완전한 지라세포(total splenocyte)를 얻었다. 이들 중 B 세포을 제거하기 위해 문질러진(scrubbed) 나일론(nylon) 섬유(fiber)로 걸러낸 후, 성숙한 마우스 NK 세포를 NK 분리키트(isolation kit) II (MACS)으로 분리하였다. 이들을 마우스 IL-15이 포함된 RPMI 1640 (10% fetal bovine serum)에 시간대별로 활성화시킨 후 사용하였다.

야생형과 miR-150 KO 마우스의 NK 세포를 분리한 후 마우스 IL-15 (25ng/ml)이 포함된 배지로 활성화 시킨 뒤 Prf1과 GzmB 단백질 발현양을 안티-퍼포린(abcam)과 다클론-안티그랜자임B(polyclonal anti-granzymeB)를 사용한 면역 블롯을 통해 확인하였고, mRNA 발현양을 세미-qPCR로 확인하였다.

구체적으로, 면역 블롯(Immunoblotting) 분석은 1차 항체로서 항-퍼포린(anti-perforin) (abcam), 다클론 항-그랜자임A와 B(polyclonal anti-granzymeA 와 B) (SantaCruz Biotechnology), 다클론(polyclonal) 항-AANAT (gift from Dr. Klein DC), 단클론(monoclonal) 항-Erk, 항-phospho Erk (세포 Signaling), 단클론(monoclonal) 항-다이서1(Dicer1) (abcam), 단클론(monoclonal) 항-GAPDH (Ab FRONTIER)을 이용하였다. 2차 항체는 Immobilon Western kit (MILLIPORE)을 이용하여 시각화하였고, 세미-qPCR은 Trizol 시약(Reagent) (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 분리한 총 RNA 1 μg을 몰로니 쥐형 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus, M-MLV) 역전사 효소(reverse transcriptase) (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)와 올리고-dT를 이용하여 매뉴얼에 따라 42 ℃에서 1시간 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 이용한 세미-양적(semi-quantitative) PCR은 95°C에서 30 초, 55°C 에서 30 초, 72°C 에서 30 초의 조건으로 22 사이클 수행하였으며, 부가된 연장을 위한 조건은 72°C 에서 5 분을 수행하였다. PCR 생성물은 전기영동하여 EtBr(ethidium bromide)염색으로 확인하였다. 합성된 cDNA를 이용한 실시간 PCR은 Prf1에 대한 프라이머쌍(서열번호3, 4) 또는 GzmB에 대한 프라이머 쌍(서열번호5, 6)을 사용하여 SYBR 프리믹스(Premix) Ex Taq (Takara Bio, Tokyo, Japan)을 이용하여 Dice TP800 유전자 증폭기(Thermal Cycler) (TakaraBio)에서 수행하였다. mRNA 수준은 GAPDH mRNA에 상대적인 값으로 나타내었다. miRNA의 정량적인 실시간 PCR은 TaqMan MicroRNA 분석 키트(Assay kit) (Applied Biosysems)의 매뉴얼에 따라 수행하였다. miRNA 발현은 U6 소핵리보핵산(small nuclear RNA, snRNA)의 상대적인 값으로 나타내었다.

그 결과, 마우스 Prf1과 GzmB의 발현이 day 3에 급격히 증가되는 것을 확인 할 수 있었다 (도 1a 상단). 또한 GzmB mRNA의 수준은 day 3에 급격히 증가하여 단백질의 증가와 비슷한 패턴을 보여주고 있으나, Prf mRNA 수준은 변화가 없음을 확인 할 수 있었다. (도 1a 하단).

<1-2> 마우스 NK 세포에 마우스 IL-15를 처리한 때 miR-150 양의 확인

본 발명자들은 활성화된 NK 세포의 Prf1과 GzmB 발현양이 높을 때 miR-150의 발현양을 확인하기 위해, 상기 실시예 <1-1>에서와 같은 TaqMan 실시간 PCR로 miR-150의 발현양을 확인하는 실험을 수행하였다.

그 결과, 마우스 Prf1의 발현과 반대 패턴으로 Prf1의 수준이 낮은 Day 1에서 증가되어 있고, Prf1이 급격히 증가하는 Day 2,3에는 급격히 감소하였다 (도 1b).

<1-3> 인간 NK 세포에 IL-15를 처리한 때 Prf1 단백질 및 mRNA발현과 miR-150 수준의 확인

본 발명자들은 상기와 같은 현상이 인간에게도 일어나는지 확인하기 위하여 제대혈로부터 프라이머리 NK세포를 분리하여 IL-15로 활성화 시킨 후 인간 Prf1 단백질 및 인간 Prf1 mRNA (서열번호7) 발현양과 miR-150발현양을 측정하였다.

구체적으로, 인간 프라이머리(primary) NK 세포는 ACCUSPIN System-HISTOPAQUE-1077 (sigma-aldrich)를 사용하여 UCB(full name)로부터 얻었다. NK 세포는 MACS NK 세포 분리 키트(isolation KIT) 매뉴얼에 따라 음성선택(negative selection)에 의해 분리되었다. 이때, NK 세포 군집은 CD56⁺/CD3^-세포 93% 이상이고, CD3⁺5% 미만이었다.

그 결과, mRNA의 수준은 큰 차이를 보이지 않고 있으나 단백질이 Day 2, 3에서 급격히 증가함을 확인하였다 (도 1c). 또한 Prf1단백질의 발현 패턴은 miR-150의 발현과 반대 패턴을 보여주고 있음을 확인하였다 (도 1d). 상기와 같은 결과는 인간과 마우스의 Prf1 단백질 발현이 공통적으로 miR-150에 의해 전사 후 조절을 받고 있다는 것을 나타낸다.

<실시예 2> miR-150 결여 마우스의 NK 세포의 Prf1 단백질 발현과 세포 독성 증가 확인

본 발명자들은 miR-150의 결여로 인해 Prf1의 단백질 발현이 증가하고, 또 NK세포의 세포 독성이 증가됨을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

<2-1> miR-150 결여 마우스의 NK 세포의 Prf1 단백질 발현 증가

본 발명자들은 야생형과 miR-150 KO 마우스의 NK 세포를 IL-15로 활성화 한 후 miR-150의 발현을 상기 실시예 <1-1>과 같은 면역 블롯(immunobloting)과 하기의 형광세포분석(flow cytometry)를 통해 분석하였다.

구체적으로 형광세포분석(flow cytometry)의 경우, 형광세포분석을 위한 모든 항체는 Becton, Dickinson and Company 와 BD Pharmingen으로부터 구매하였다. NK 세포는 염색버퍼(staining buffer, phosphate-buffered saline[PBS] containing 1% fetal bovine serum[FBS]와 0.01% NaN3)로 4°C에서 20분간 지정된 항체로 염색되었다.

그 결과, miR-150이 결여된 마우스의 NK 세포는 IL-15에 의해 활성화되기 전과 후에서 야생형에 비해 증가된 Prf1 단백질의 수준을 보여주나, Prf1의 mRNA 수준에는 큰 차이를 보이지 않음을 확인할 수 있었다. (도 2a). 또한 형광세포분석(flow cytometry)으로도 miR-150이 결여된 마우스의 NK 세포는 야생형에 비해 증가된 Prf1단백질을 세포질에 함유하고 있음을 확인할 수 있었다 (도 2c).

<2-2> miR-150 결여 마우스의 NK 세포의 세포 독성 증가효과 확인

본 발명자들은 miR-150 결여 마우스의 NK 세포의 세포독성을 확인하기 위해, 이로부터 분리한 NK 세포를 세포독성 분석(assay)을 수행하였다.

구체적으로, NK 세포 세포독성(cytotoxicity)은 ⁵¹Cr-release 분석방법으로 수행하였다. 마우스 NK 세포의 표적세포는 YAC1으로 사용하였으며, 인간 NK세포의 표적세포로는 K562를 사용하였다. 그리고 제대혈세포로부터 분리되거나 또는 분화된 NK 세포와 형질주입 된 NK 세포를 회수하였다. 살아있는 NK 세포수는 트리판블루 색소배제법(trypan blue dye exclusion)을 사용하여 계산되었다. 살아있는 NK 세포의 동일한 수를 이용하여 ⁵¹Cr release 분석을 위한 반응기(effector) 세포로 사용되었다. YAC1, K562 표적 세포는 1.5 의 ⁵¹Cr로 37°C 세포배양기에서 1시간동안 반응시켰다. 표지된 YAC1, K562 표적 세포는 두 번 세척하고, 96-well 플레이트(plate)에 well 당 10000 개 세포가 되도록 분주하였다. 반응기(effector)와 표적(target) 세포의 비율 (E:T)이 5:1에서 1.5:1까지 되도록 분주한 다음 37℃, 5% CO₂가 공급되는 환경의 세포 배양기에서 4시간동안 반응시켰다. 반응이 완료되면, 상층액을 회수하여 증가된 방사능(radioactivity)을 신틸레이션계수기(scintillation counter, RACTOBETA; LKB Instruments)로 측정하였다.

그 결과, 본 발명에 따른 miR-150결여 NK 세포는 야생형에 비해 약 2배 증가하는 세포독성을 보임을 확인할 수 있었다 (도 2b). 상기와 같은 결과는 높은 수준으로 존재하는 Prf1 mRNA는 miR-150에 의해서 억제되어 있고, miR-150이 결여되면 Prf1의 발현이 급격히 증가하고 세포독성도 증가함을 나타낸다.

<실시예 3> miR-150 결여 마우스와 야생형 NK 세포의 수용체 및 리간드의 발현과 effector 단백질 분비 확인

본 발명자들은 NK 세포의 높은 활성이 Prf1 단백질의 발현 증가에 기인한다는 것을 확인하기 위해, 야생형 NK세포와 miR-150 결여 NK세포의 수용체 및 리간드의 발현과 이펙터(effector) 단백질의 분비량을 상기 실시예 2 와 같은 형광세포분석법으로 확인하였다.

구체적으로, 야생형과 miR-150 결여 마우스의 NK 세포를 분리한 후 마우스 IL-15가 포함된 배지로 48시간동안 활성화 시킨 뒤 세포막 수용체의 발현수준을 형광세포분석으로 분석하고, 야생형과 miR-150 결여 마우스의 NK 세포를 분리한 후 마우스 IL-15가 포함된 배지로 48시간동안 활성화 시킨 뒤 항-NKp46 항체를 전 처리한 다음 Prf1 분비 마커인 CD107a의 수준을 형광세포분석으로 분석하고, 야생형과 miR-150 결여 마우스의 NK 세포를 분리한 후 마우스 IL-15가 포함된 배지로 48시간동안 활성화 시킨 뒤 세포막의 세포사멸리간드인 fasL, TRAIL의 수준을 형광세포분석으로 분석하고, 야생형과 miR-150 결여 마우스의 NK 세포를 분리한 후 마우스 IL-15가 포함된 배지로 48시간동안 활성화 시킨 뒤 Prf1 분비 마커인 CD107a의 수준을 형광세포분석 하였다.

그 결과, 야생형과 miR-150결여 NK 세포간의 세포막 수용체의 발현량에 큰 차이가 없음을 확인 하였고 (도 3a), Prf1의 분비마커인 CD107a의 수준에도 차이가 없음을 확인할 수 있었다 (도 3b, 3d). 또한 세포사멸수용체(death receptor)의 수준도 거의 차이가 없음을 확인할 수 있었다 (도 3c). 상기와 같은 결과는 miR-150 결여 마우스의 높은 NK 세포 활성이 Prf1 단백질의 발현이 증가된 것에 기인한다는 것을 나타낸다.

<실시예 4> miR-150의 인간과 마우스의 Prf1 mRNA에 대한 직접적인 억제확인

본 발명자들은 miR-150이 인간과 마우스의 prf1 mRNA의 3'UTR부분에 특이적으로 결합하여 prf1 단백질의 발현을 억제함을 밝히기 위하여 리포터 시스템(reporter system)을 사용하여 억제여부를 알아보는 실험을 수행하였다.

구체적으로, 리포터 시스템(reporter system) (도 4a)인 pcAANAT에 miR-150의 표적단백질인 마우스와 인간 GzmB와 Prf1의 3' UTR 부분을 결합하고 클로닝하였다 (도 4b, c). 플라스미드 pcAANAT 제작시, PCR 기법을 이용하여 원하는 유전자 부분을 증폭하였다. cDNA 증폭은 Pfu 중합효소 (SolGent)로 수행되어 서열분석기법으로 염기서열을 확인하였다. 또한 특정 프라이머를 이용하여 Prf1 과 GzmB 의 3′UTRs 부위와 리포터 단백질의 결합 플라스미드인 pcAANAT를 제작하였다.

다음으로 HEK293T 세포에 상기 pcAANAT 리포터 벡터(reporter vector)와, 이와 결합된 인간과 마우스 Prf1 과 GzmB의 3'-UTR 부분에 안정하게 결합하는 야생형 miR-150 또는 돌연변이 miR-150을 동시에 형질주입 시킨 다음, 리포터 유전자(reporter gene)인 AANAT의 발현양을 보기 위해 면역 블롯(immunoblotting)을 통해 AANAT와 액틴(actin) 단백질 발현양을 확인하였다.

HEK293T 세포에 리포터 디엔에이(reporter DNA)와 microRNA 미믹(mimics) (ThermoFisherScientific) 형질주입(transfection)은 Metafectene (Biontex)의 매뉴얼에 따라 수행하였다.

상기 <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 단백질 정제 및 면역 블롯(immunoblotting) 분석시, NK 세포의 세포질 용해는 1% NP-40과 완전한 단백질분해효소 억제제(complete proteinase inhibitor) (Roche)가 포함된 PBS (phosphate-buffer saline)로 이루어졌다.

그 결과, 마우스와 인간의 GzmB 발현에는 miR-150이 관여하고 있지 않으나, 인간과 마우스의 Prf1 3‘UTR은 reporter gene의 단백질 발현을 급격히 억제하였으며, mutant miR-150을 과발현하였을 경우에는 리포터 유전자의 발현을 억제하지 않는다는 것을 확인하였다 (도 4d, e). 상기와 같은 결과는 miR-150이 인간과 마우스의 Prf1 mRNA 3’UTR에 특이적으로 결합하여 발현을 억제한다는 것을 나타낸다.

<실시예 5> miR-150의 과발현과 Prf1 단백질의 발현 및 세포독성의 관계 확인

<5-1> miR-150의 과발현과 마우스 Prf1 단백질의 발현 및 세포독성의 관계 확인

본 발명자들은 miR-150 결여 NK 세포에서 세포독성이 증가되는 결과를 바탕으로, miR-150의 과발현시스템을 사용하면 반대 효과가 나타나는지 확인하기 위한 실험을 하였다.

구체적으로는 대조군 (pMIRNA1-GFP control, SBI System Biosciences)과 miR-150을 과발현하는 lentivirus pMIR-150 (SBI System Biosciences) 를 마우스 NK 세포에 도입하여 48시간 후에 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 면역 블롯(immunoblotting)을 수행하여 표적 유전자인 Prf1의 발현을 확인 하였다.

그 결과, 급격히 Prf1의 단백질 발현이 감소하여 있고 (도 5a) 이에 부합하여 세포독성도 떨어져 있음을 확인하였다 (도 5b).

<5-2> miR-150의 과발현과 인간 Prf1 단백질의 발현 및 세포독성의 관계 확인

본 발명자들은 miR-150 결여 마우스의 NK 세포가 Prf1단백질의 증가와 세포독성의 증가를 수반하고 Prf1 mRNA 3‘UTR을 직접적으로 표적한다는 관찰을 바탕으로, 인간의 성숙한 NK 세포에서도 miR-150이 마우스내에서와 같은 역할을 하는지 확인하기 위하여 상기 <실시예 1-1>과 동일한 방법으로 면역 블롯을 수행하여 Prf1의 발현양을 확인하였다.

구체적으로, in vitro 에서 CD34⁺ 세포로부터 성숙한(mature) NK (mNK) 분화를 위해서 인간의 탯줄로부터 유래된 제대혈 (umbilical cord blood, UCB)로부터 Ficoll-Hypaque를 이용한 원심분리법을 이용하여 단핵구세포 (mononuclear cells,MNCs)가 추출되었다. CD56⁺,CD3⁺,CD14⁺,CD19⁺,CD2⁺,CD11b⁺,CD15^+,CD123⁺를 가진 세포는 lineage cell depletion kit (MiltenyiBiotec)를 이용하여 MNC로부터 제거한 다음, CD34⁺세포는 CD34 cell isolation kit (MiltenyiBiotec)를 사용하여 lineage negative 세포로부터 분리되었다. 분리된 CD34⁺세포의 순도(purity)는 FACS로 측정하여 97% 이상이 되었다. CD34⁺세포가 mNK 세포로 분화되는 과정을 간단히 설명하면, 분리된 CD34⁺세포는 10⁶M 로 녹여진 HC(Sigma), SCF(30ng/ml), FL(50ng/ml), IL-7(5 ng/mL)가 포함된 MyeloCult H5100 (Stem Cell Technologies)으로 37℃, 5% CO₂가 공급되는 환경의 세포 배양기에서 14일 동안 배양하였다. 완전한 mNK 세포로 분화시키기 위해서는 인간에서 유래된 IL-15 (30 ng/ml, R&DSystems)를 첨가하여 2주간 더 배양하였다. CD56⁺/CD3^-세포의 순도는 FACS분석을 통해 90% 이상이 되었다.

세포주 NK92-MI는 상대적으로 in vitro 분화를 통해 얻어진 성숙 NK 세포에 비해 miR-150 level이 급격히 떨어져 있음을 관찰하였고 (도 5c), 이 세포주에 miR-150의 과발현 방법으로 miR-150의 역할을 확인하였다.

구체적으로, NK92-MI 세포주는 10% FBS, 1 % 스트렙토마이신(streptomycin)/페니실린(penicillin)이 포함된 알파(alpha)-MEM 배지에서 배양하였다.

그 결과, lentivirus를 처리한 4일에 miR-150 수준이 급격히 증가하며 동시에 Prf1 단백질이 급격히 떨어지고 동시에 세포독성이 떨어지는 것을 확인하였다 (도 5d, 5e, 5f). 상기와 같은 결과는 miR-150이 인간과 마우스의 Prf1발현을 공통적으로 저해하는 일반적인 발현 저해 인자임을 제시한다.

<실시예 6> miR-150 결여 마우스의 NK세포의 암의 성장과 전이를 억제효과 확인

본 발명자들은 miR-150 결여 마우스 (Jackson Laboratory) 의 NK 세포가 실제로 암세포의 성장과 전이를 억제함을 확인하기 위하여 면역세포가 결여되어 있는 마우스에 활성화한 miR- 150 KO NK 세포를 주입 후, 다시 암세포를 주입하였고 암세포의 성장과 전이를 관찰하였다.

구체적으로 miR-150에 의해 조절되는 NK 세포의 활성이 암의 성장에 어떠한 영향을 주는지 알아보기 위하여 면역세포 (B, T, NK) 가 결여되어 있는 Rag2-/-rC-/- 마우스 (Jackson Laboratory) 에 야생형/miR-150 KO NK를 IL-15 (100 ng/ml)로 활성화 하고 꼬리 정맥에 주사한 후, B16F10 흑색종을 피하주입하고 암의 성장을 관찰 하였다.

다음으로는 암의 전이에 있어서 miR-150이 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 Rag2-/-rC-/- 마우스에 야생형/miR-150 KO NK를 IL-15 (100 ng/ml)로 활성화 하고 꼬리 정맥에 주사한 후, B16F10 흑색종을 정맥주사하고 암의 전이를 허파에 형성된 군체 수로 측정하였다.

그 결과, miR-150결여 마우스의 NK세포가 암의 성장을 급격히 감소시켰음을 확인하였고 (도 6a), miR-150결여 마우스의 NK세포가 암의 전이 또한 급격히 감소시켰음을 확인하였다 (도 6b, 6c).

상기와 같은 결과는 in vitro에서와 동일하게 miR-150이 결여되어 있는 NK 세포에서 세포독성이 야생형에 비해 뛰어나다는 것을 제시하고 있으며, miR-150을 NK 세포를 이용한 항암세포치료제로의 응용에 중요한 표적분자로 제시할 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A method of increasing cytotoxicity of NK cell by regulating the expression of miR-150 <130> 2014P-02-55 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2054 <212> RNA <213> Mus musculus perforin 1 (pore forming protein) (Prf1), mRNA <400> 1 cgtcttggtg ggacttcagc tttccagagt ttatgactac tgtgcctgca gcatcatggc 60 cacgtgcctg ttcctcctgg gccttttcct gctgctgcca cgacctgtcc ctgctccctg 120 ctacactgcc actcggtcag aatgcaagca gaagcacaag ttcgtgccag gtgtatggat 180 ggctggggaa ggcatggatg tgactaccct ccgccgctcc ggctccttcc cagtgaacac 240 acagaggttc ctgaggcctg accgcacctg caccctctgt aaaaactccc taatgagaga 300 cgccacacag cgcctacctg tggcaatcac ccactggcgg cctcacagct cacactgcca 360 gcgtaatgtg gccgcagcca aggtccactc cacggagggt gtggcccggg aggcagctgc 420 taatatcaat aacgactggc gtgtggggct ggatgtgaac cctaggccag aggcaaacat 480 gcgcgcctcc gtggctggct cccactccaa ggtagccaat tttgcagctg agaagaccta 540 tcaggaccag tacaacttta atagcgacac agtagagtgt cgcatgtaca gttttcgcct 600 ggtacaaaaa cctccactcc accttgactt caaaaaggcg ctcagagccc tcccccgcaa 660 ctttaacagc tccacagagc atgcttacca caggctcatc tcctcctatg gcacgcactt 720 tatcacggct gtggacctcg gtggccgcat ctcggtcctt acagccctgc gtacctgtca 780 gctgaccctg aatgggctca cagctgatga ggtaggagac tgcctgaacg tggaggccca 840 ggtcagcatc ggtgcccaag ccagcgtctc cagtgaatac aaagcttgtg aggagaagaa 900 gaaacagcac aaaatggcca cctctttcca ccagacctac cgtgagcgtc acgtcgaagt 960 acttggtggc cctctggact ccacgcatga tctgctcttc gggaaccaag ctacaccaga 1020 gcagttctca acctggacag cctcactgcc cagcaaccct ggtctggtgg actacagcct 1080 ggagcccctg cacacattac tggaagaaca gaacccgaag cgggaggctc tgagacaggc 1140 tatcagccat tatataatga gcagagcccg gtggcagaac tgtagcaggc cctgcaggtc 1200 aggccagcat aagagtagcc atgattcatg ccagtgtgag tgccaggatt caaaggtcac 1260 caaccaggac tgctgcccac gacagagggg cttggcccat ttggtggtaa gcaatttccg 1320 ggcagaacat ctgtggggag actacaccac agctactgat gcctacctaa aggtcttctt 1380 tggtggccag gagttcagga ccggtgtcgt gtggaacaat aacaatcccc ggtggactga 1440 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sapiens perforin 1 (pore forming protein) (PRF1), mRNA <400> 7 gaagugaugu gagugguggc uggugcaagg agccacagug ggcugccugg ggggcugaug 60 ccaccauucc aggagccucg gugaagagag gauauccauc uguguagccg cuucucuaua 120 cgggauucca gcuccauggc agcccgucug cuccuccugg gcauccuucu ccugcugcug 180 ccccugcccg ucccugcccc gugccacaca gccgcacgcu cagagugcaa gcgcagccac 240 aaguucgugc cuggugcaug gcuggccggg gagggugugg acgugaccag ccuccgccgc 300 ucgggcuccu ucccagugga cacacaaagg uuccugcggc ccgacggcac cugcacccuc 360 ugugaaaaug cccuacagga gggcacccuc cagcgccugc cucuggcgcu caccaacugg 420 cgggcccagg gcucuggcug ccagcgccau guaaccaggg ccaaagucag cuccacugaa 480 gcuguggccc gggaugcggc ucguagcauc cgcaacgacu ggaaggucgg gcuggacgug 540 acuccuaagc ccaccagcaa ugugcaugug ucuguggccg gcucacacuc acaggcagcc 600 aacuuugcag cccagaagac ccaccaggac caguacagcu ucagcacuga cacgguggag 660 ugccgcuucu acaguuucca ugugguacac acucccccgc ugcacccuga cuucaagagg 720 gcccucgggg accugcccca ccacuucaac gccuccaccc agcccgccua ccucaggcuu 780 aucuccaacu acggcaccca 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gucugguucc caugagguga gaugcaaccu gaaucauggc 1680 caccuaaaau uccgcuauca ugccaggugc uugccccacc ugggaggagg caccugccug 1740 gacuaugucc cccaaaugcu ucugggggag ccuccaggaa accggagugg ggccgugugg 1800 ugagaacagu gagcuuggaa aggaccagua ugcuuggacu gaagggguuc ucacaguggg 1860 agccagggcu gucuucguau ucccauuaga ccaagcuugu ccaacccgag gcccgcaugc 1920 ggcccaggau ggcuuugaau gcggcccaac gcaaauucgc aaacuuucuu aaaacauuau 1980 gaguuucuuu uugcuauuuu uuuuuuuuuu uuagcucauc ggcuaucguu agugcuagug 2040 gauuuuacau guggcccaac acaauucuuc uuccaacgug gcccagagaa gccaaaagau 2100 uggauacgca ucagacagau ggaaaaggga gauucagacu guuuuucagg gagguggcug 2160 gguuuacacg cuaaucccga uucacccugu ccaaacugcc uaagcccucc gccauucuca 2220 agcccugcag ucacagcuac acagaucaca gcuucagcca ggagcugggc agaaggccaa 2280 gaggcuguuc ccaccaggcu gcucagggcu ggucuuuuag gacccuuccc uugagcccuc 2340 uauggugugg caaagccuuc auugccuuaa cuggagcccc aucagcucca gcugcucugu 2400 cuucuuugcc cacaaugcuu ugccccugag acaaauggag gccuguccug accugucuca 2460 ccauguacau agcuugauaa agggccaaua aauaugaugu uauggugaaa aaaaaaaaaa 2520 aaaaaaaaa 2529

Claims

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miR-150이 결여되어 Prf1 또는 GzmB의 발현이 증가된 자연살해세포를 유효성분으로 함유하는 암 전이 억제용 약학적 조성물로서,
상기 miR-150이 결여되어 Prf1 또는 GzmB의 발현이 증가된 자연살해세포는 야생형 자연살해세포에 비해 향상된 암 전이 억제 활성을 나타내고,
상기 암 전이는 폐암, 간암, 위암, 대장암, 방광암, 전립선암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 갑상선암 및 흑색종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 암이 다른 조직으로 전이되는 것인 암 전이 억제용 약학적 조성물.
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